Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуносупрессорные свойства синтетического пептидного фрагмента интерферона альфа-2 человека

*****

( <1

РСЮСксКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

" ' НАУЧНО-]5ССЛЕЯ0ВА ТЕЛЬКИЙ ИНСТИТУТ

ШИДЕШОЛОГИЙ Й ИШУНОЛОГЙИ . ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАШЛЕИ

На правах рукописи ®ЕЗЕ Кяряяя Вадаякям

В5.!УНОСУПРЕССОРНЬЕ СВОЙСТВА СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДНОГО ФРАГМЕНТА ИНТЕРФЕРОНА «-2 ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискагае ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1994

/г- ^

Работу выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунолог

Биологического факультета МГУ им. У.В.Ломоносова Руководитель:

профессор М.В.Гусев Научный консультант:

канд. физ.-мат. наук Т.В.Вуларгина Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, А.Н.Наровлянсгаш доктор биологических наук,

профессор, академик РАЕН • А.А.Ярилин

Ведущая организация: Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Защита состоится " // " ^Л. 1994 г. в часов на заседании Специализированного Совета К 001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидеыио и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, д.18).

С диссертацией мата о ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

УА £/

Автореферат разослан "1_" '_ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. шуапьиость проблема. Явление клеточной пролиферации лежит в зве клональной экспансии антигенраспознающих лимфоцитов в от-на антигенную стимуляцию. Селективная регуляция пролиферации яичных категорий иммунокомпетентных клеток представляет собой у из основных задач иммунокорригирующей терапии.

Одной из областей применения иммунорегуляторных препаратов зется трансплантология. Трансплантация органов и тканей обыч-триводит к отторжению донорской ткани, несущей чужеродные для 1пиента антигены гистосовместимости. Предотвращение отторже-пересаженной ткани возможно с помощью агентов, подавляющих ^кцию и проявление иммунного ответа на аллоантигены. Лействие зшинства таких веществ - иммуносупрессантов. используемых в мческой практике, опосредовано их способностью угнетать про-грацию лимфоцитов. Однако такие препараты имеют ряд недостат-связанных, в частности, с токсичностью и недостаточной спетостью действия. В этой связи поиск веществ, способных про-ггь иммуносупрессорную активность является, весьма актуальным.

Ранее нами было показано, что синтетический пептид -мент интерферона а-2 человека (ИФН), включающий в себя юкислотные остатки с 124-ого по 138-ой (2438): ингибирует щированный поликлональными активаторами 'пролиферативный !Т лимфоцитов периферической крови человека in vitro lilkovlch eti. al., 1992). Синтетический пептид 2438 в отличие юлекулы ИФН не проявляет антивирусной активности (Шевалье и 1990) и не влияет на активность естественных киллерных -ок. т.е. оказывая негативное влияние на пролиферативную фазу •иного ответа, в то же время обладает более узким, чем ИФН ;тром биологической активности.

race было обнаружено, что пептид.2438 специфически взаимо-:твует с рецепторными структурами, экспонируемыми на плазма-юкой мембране лимфоцитов крови человека (Danllkovlch et.

1991). Весьма возможно, что благодаря такому специфическому модействию и реализуется биологический эффект пептида 2438.

Механизмы действия многих иммуносупрессорных препарате несмотря на их широкое применение в клинической практш остаются недостаточно -изученными. В „настоящее вр< предполагается, что некоторые иэ таких препаратов cnocol угнетать ранние этапы активации лимфоцитов, блокируя, та; образом,' их пролиферации. В этой связи, актуальными являю исследования,' в сравнительном аспекте, вдия антипролиферативных агентов на ранние биохимические марк активации Г-лимфоцитов.

Цела исследования. Целью настоящей работы было изуче иымуносупрессорной активности и молекулярных механизмов дейст синтетического пептида - фрагмента С-концевой области моле!< интерферона at-2 человека в модельной системе In vitro лимфоцитах периферической крови здоровых доноров и чел'овечес клеточных линий лимфовдкого и шелоидного происхождения.

Задачи исследования штщали s себя:

1.) Изучить влияние пептида 2438 на пролиферации лимфощ человека в ответ на аллоантигены в реакции смешанной куль1 лимфоцитов (СКЛ) и в реакции бласттрансформации под дейст: полигонального митогена ФРА и сравнить действие пептида 243 действием другого,, широко применяемого в клинике имнуносуп сайта пептидной природы - циклоспорина А.

2.) Изучить влияние пептида 2438 на тирозин-специфиче фосфоршшрование и изменение концентрации двухвалентного Са2 цитоплазме мононуклеарных клеток периферической крови челове

3.) Изучить экспрессию рецепторов пептида 2438 на кле человеческих опухолевых линий, культивируемых in vitro, эритроцитах человека, а также определялись к'екоэ характеристика; свявывалил пептида с такими рецепторами.

- 3 -

íayrvmx новизна исследования.

Впервые было обнаружено, что синтетический пептид 2438, 1гмент аминокислотной последовательности интерферона а-2 чело-са способен угнетать не только пролиферативный ответ лимфоци-$ человека на митогенную стимуляцию, но и оказывать угнетающее ¡ствие на пролиферацию в ответ на антигены гистосовместимости ¡мешанной культуре лимфоцитов. Пептид 2438 способен in vitro иивать специфическую иммуносулрессорную активность широко ис-тьзуемого в клинической практике препарата - Циклоспорина А, ) позволяет достичь максимального иммуносупрессорного действия гестах in vi tro при минимальной токсичности препарата. Также было подтверждено ранее выдвинутое предположение о том, ) пептид 2438 угнетает ранние по времени этапы активации лимитов. При исследовании механизмов действия пептида 2438 впер; было показано его угнетающее влияние на'индуцированное кито-юм увеличение содержания фосфотирозина в фосфолротеине с мо-сулярной массой 36 кД (ррЗб). Другие агенты, угнетающие проли-зацию лимфоцитов - интерферон а-2 и иммуносупрессант даклоспо-i А также вызывают снижение уровня фосфорилирования ррЗб. 5 то яе время влияние иммуносупрессанта Циклоспорина А и nenia 2438 на митоген-индуцированный подъем концентрации свободно Са2* в цитоплазме было различным. Циклоспорин А вызывал 1ъем [Саг*3j в цитоплазме в среднем на 20 нИ и полностью бло-зовал ответ на митоген. В противоположность синтетический пеп-3 2438 не индуцировал изменений ни базального уровня [Саг*)) вызывал угнетения Са2*-ответа'на митоген. Таким образом, было выявлено, что пептид 2438 оказывает угне-зщее действие на ранние этапы активации лимфоцитов. 1ри изучении взаимодействия пептида .2438 с клетками было пока-ю. что клетки опухолевых линий лимфобластоидного и миеломоно-гарного происхождения, в отличии от эритроцитов крови челове-несут мембранные рецепторные структуры, специфически связы-зщие пептид 2438. . '

- 4 -

Теоретическая л прозаическая значилось рабош.

Полученные результаты давт возможность предположить, что г тид 2438 может рассматриваться, как потенциальный иммуносущ сивный препарат в трасплантологии и при терапии аутоиммунных •болеваний.

Дальнейшее изучение активности синтетических фрагментов а-2 человека может быть полезным не только для выяснения ст{ турно-функциональных особенностей организации молекулы ИФН, такке для исследования молекулярных механизмов активации paзJ них категорий иммунокомпетентных клеток» но и для разработки вых селективных ' иммунорегуляторных препаратов для клиничес! применения.

Апробация. Материалы диссертации апробированы на Конфере! по иммунологии репродукции под эгидой Всемирной Организг Здравоохранения (17-18 июня, 1992. Москва), I Съезде кммунода России (23-27 июль 1992 г., Новосибирск, Россия), на 22°® Ки ренции Федерации Европейских Биохимических Обществ (23-27 I 1993 г. Стокгольм, Швеция).

Спрушура и объем работ. Материалы диссертации, изложение 117 страницах машинописного текста (включая 5 таблиц и 16 ] сункоз), состоят разделов Введение . Список использованных < ращений, Обзор литературы. Материалы и методы. Результаты глав). Обсуждение результатов,' Заключение, Выводы (в числе Список цитированной литературы (содержит 148 источников).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Материалы и методы.

Материалы.

Синтез пептидного фрагмента молекулы интерферона а-2 челов состоящего из аминокислотных остатков 124-ЕХТЬУЬКЕККУЗРС(Аси)А описан ранее в работе Шевалье (Шеваль Др., 1990).

В работе использовались: рекомбинантный ИФН а-2 человека С ферон, государственный концерн "Биопрепарат"), кальций-чувс тельный флуоресцентный индикатор 1ига-2 (ацетоксиметиловый Гига-2 (Рига-2/АМ) "СаШосПеи". Швейцария), циклоспорин А (

1ая марка Sandimmune) производства "Sandoz Pharma" (Швейца-I).

1спользовались реактивы для культивирования клеток: среда PRM LO.' сыворотка плода коровы. L-глутамин все производств : :gma" (США), пластиковая посуда производства MÜNK (Дания). Ис-тьзовались также фитогемагглютинин П (ФГА) - "Difco" (США) и псанавалин A (Pharmacia, Швеция). •

Зстальные использованные в работе реактивы были получены от )м Sigrea (США) и Serva (ФРГ). В работе использовали радиоэк-зно меченные реактивы фирмы Amersham (Англия). Лоточником клеток крови человека служила свежая лейкоцитарная зса. получаемая с Московской некагегорийной станции переливая крови. В работе использовались Г-лимфоидные клеточные линии И. МТ-4. Jurkat, Jurkat (клон TAT). HUT-78, любезно предостав-нные заведующей лабораторией клеточной инженерии Института ви-сологии им. Ивановского А.А. Кущ. Использовалась также миеломо-цитарная клеточная линия Н1-60.

Методы.

Выделение клеток. Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в ступенча-м градиенте фиколла-верографина по общепринятой методике oyum, 1968). Выделение моноцитов из фракции мононуклеарних ;еток проводили сорбцией на пластиковых чашках Петри. Т-лимфо-¡тн выделяли из не сорбирующейся на пластике суспензии клеток i колонке с нейлоновой ватой по методу Аман (Aman et. al., >84).

Определение пролиФеративкой активности лимфоцитов.

Пролиферативный ответ лимфоцитов в реакции бласттрансформации [ределяли микрометодом в 96-ти луночных планшетах для.культиви->вания клеток, и пролиферативный ответ лимфоцитов оценивали по шючению радиоактивно-меченного 3Н~тимидина, причем число число )вторностей в каждом опыте было не ниже трех (Danilkovich et. ;., 1992). Пролиферацию клеток оценивали как по сравнению зна-ший включения радиоактивной метки в импульсах в минуту, так и

по формуле:

Уровень - Включение тимидина (имп/мин) в опыте.

пролифе- = -:-х 100%

рации Включение тимидина (имп/мин) в контроле

, В качестве контроля использовали нестимулированные поликт нальными 'активаторами клетки я стимулированные, но не обработе ные синтетическим пептидом или ЦсА.

Аллогеииая смешанная культура лимфоцитов.

Для проведения этой реакции использовали популяцию клеток г риферической крови человека, обогащенную Т-лимфоцитами. В * честве отвечающих клеток использовали лимфоциты одного донора, в качестве стимулирующих - моноциты другого донора. Для одноне равленного прохождения реакции клетки-стимуляторы были предваг тельво обработаны митоиицином С. Определение пролиферативной £ тивности клеток проводили как указано выше.

В качестве контроля использовали клетки не обработанные син' таческим пептидом 2438, ЦсА и ЛФН. Число экспериментов состав.] ло 12.

Аутологичнзя смешанная культура лимфоцитов.

Данную реакцию проводили так не, как описано в разделе "ал. генная смешанная культура лимфоцитов", но в этом случае как качестве стимулирующих, так и в'качествё отвечающих, использо! ли клетки одного и того же донора. Популяция моноцитов.исполь: валась как клетки-стимуляторы, а популяция Т-лимфоцитов перю рической крови - в качестве отвечающих клеток.

Определение уровня фосборилировакня эндогенных " субстратов тирозиновых пгютеникиназ.

Для изучения уровня тирозкн-специфического фосфорилирова эндогенных субстратов ТПК использовались иммунохимическ&ч дет ция фосфотирозин-содержащих полипептидов на нитроцеллюлоз .реплике после разделения белков клеточных лизатов в полиакри ыидноы геле (ЬаегптИ, 1970). В качестве специфического зонда фосфотирозин использовались фермент-меченные моноклональные . ,титела. . распознающие ;. фосфотирозин как гаптен (Харитоненко

., 1991). После проведения хромогенной реакции, окрашенные зо-сканировали и сравнивали значения оптической плотности. Для энки достоверности различий использовали t-критерий Стъюдента. цее количество экспериментов - 9.

Измерение концентрации свободного Са2—в цитоплазма иомонутмеарных клеток периферической крови человека. Измерения свободного Саг* в цитоплазме клеток проводили по ме-цике, описанной ранее (Grynklevlcz et. al., 1985). с использо-пием хелатирущего флуоресцентного кальциевого индикатора га-2. Общее количество экспериментов составляло 6.

Определение параметров связывания пептида 2438 с клетками линий шмбобластоидного и ниелоидного происхождения

раг^олаганякым методом. Лечение пептида 2438 проводили радиоактивным На125I в присутс-«и иодогена как ранее описано (Salaslnskl et. al.. 1981). эльная активность радиоактивно-меченного пептида 2438 состав-па при использовании различных партий Na125I от 1х107 та/мин)/мкг до ЗхЮ7 (иш/мин)/мкг. Величины констант диссоци-т и число экспрессируемых на клетке участков связывания иеп-ца определяли по методу Скетчарда (Munson et. al.. 1980). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Пролийеративкые тесты. Известно, что способность угнетать пролиферацию и накопление гагенраспознавдих Т-лимфоцитов - важнейшее свойство иммуносуп-зсантов, широко используемых в клинике для предотвращения от-ржения трансплантата, терапии аутоиммунных заболеваний и неко-эых форм аллергических состояний,.

1ам представлялось интересным сравнить действие пептида 2438 и зестных иммуносупрессантов в различных модельных системах. Для авнения был взят Циклоспорин А с внедрением которого в широкую 1ктику связывают начало новой эры в транплантологии WDIMMUN. Practical Guide. 1990).

1ролиферация Т-лимфоцитов in vivo запускается в ответ на антй-т гистосовместимости как в случае реакции отторжения транс-

плантата. так и в случае реакции трансплантат против хозяи Известно, что Т-лимфоциты. культивируемые ln vttro. спосо пролиферировать при взаимодействии с клетками несущими антиг гистосовместимооти и такая экспериментальная система носит к •вание смешанной культуры лимфоцитов. Пролиферация в ответ на тагены гистосовместимооти отмечается как в случае аллогеш так и в аутологичной системе.

Синтетический пептид 243В, также как и ранее известные интс торы пролиферативного ответа на аллоантигены Циклоспорин А и терферон, обладал способностьи угнетать реакцию аллогенной (Рис 1 А.) В аутологичной системе, т. е. в случае когда и отв< ювде и стимулирующие клетки брались от одного и того же дош угнетающее пролиферацию действие пептида выявлялось сшп (Рис. i Б).

Антипролиферативное действие пептида 2438 было слабее по тенсивности, чем действие циклоспорина А, используемого в ксй-же концентрации, но в то же время'достоверным и воспрои димым. Необходимо отметить, что угнетение пролиферации пепт 2438 в аутологичной системе на 15% сильнее по сравнению с а Генной системой. 'Расхождение результатов в аутологичной и а генной системах могут.быть вызваны различиями в популяцио составе клеток, пролиферирущих в ответ на собственные или ч родные антигены гистосовместимооти (Kawamura et.ál., 1991).

В результате, проведенных экспериментов была выявлена спс ность пептида 2438 дозозависимо угнетать пролиферацию Т-'лимо тов как в аллогенной, так и в аутологичной системе. Концентр онная зависимость ингибирования пролиферации Т-лимфоцитов пе дом 2438 показывает, что при концентрации порядка 2 мг/л i М)' происходит достижение максимального уровня проявления ai ролифератавного действия (Рис 2)'.

. Ранее т обнаружили, что предварительная инкубация монон: арних клеток (или Т-лимфоцитов) крови человека с ФГА (или д] ми поликлональными активаторами) в течение 18-24 часов блок: антипролиферативное действие как пептида 2438, так и ИФ.

Рисунок 1 А.

игнетеяне пролиферапии в аллогенной СКЛ пеитвдом 243В и ЦсА

ияйш/д) . ' , , lua (л1мг/д5~

итз (Еваио s»/*) ПСА 0 кг/ж)

Рисунок 1 Б.

Umerg^e ngwmipe

2438 (2 кг/*) HCl (OJnr/л)

ИФЕ (1ПХЮО0 Ех/х)

ПсА (I иг/л)

- ю -

Риеунсж 3.

Угнетение пролиферации лимфоцитов в зависимости от времени добавления антипролиферативного агента

Пролиферация (в % ст контроля)

-в -и в I» а о «о

(шгнуты)

^ ^ „ ¿Т

1 - Циклоспорин А

2 - пептид 2438

3 - интерферон С?-2

1 4 7 ■ 1в 13 1в . 19 .

(часы)

.Время

ВО

о & 60 и о а

и70 о

Ч м-

•л

и

■ рз 30

Рисунок 2:

Угнетение пролиферагивного ответа в аутогеогичной СКл пептшюмг 243В

60.....-......-—

оа

0.25 0Л 1 25 б

. Концентрация 2433 (ыг/л)

10

- Ii -

(Danllkovich et. al., 1992). В то »e время культивирование клеток в присутствии митогена не приводит к исчезновению мембранных рецепторов. ответственных за связывание пептида 2438 (Danllkovich et. al., 1991). Поэтому резистентность к антипроли-феративному действию пептида 2438 не может быть связана с нарушением рецепции 2438.

Одной из целей работы было выяснение зависимости уровня пролиферации от времени добавления вещества ингибирующего пролиферации. С этой целью к клеткам добавлялись пептид 2438, и циклоспорин А в различные моменты времени как до, так и после добавления митогена КонА. (Рис. 3). Характерным для пептида 2438 является .то, что максимальное, по силе, проявление его действия выявляется только на ранных, по времени, этапах активации клеток. Взятые вместе, факты хорошо согласуются со сделанным ранее предпо-' лоаением. что пептид 2438 влияет предпочтительно на ранние этапы активации Т-клеток. Данные последних лет дают возможность пред. половить, что антипролкферагавная активность циклоспорина А так-se связана с его способностью оказывать негативное влияние на ранние этапы активации Т-лимфоцитов (Lin et. al.. 1991; Schreiber et. al.. 1992).

В настоящее время даяе фирмой-производителем признается, что ЦсА обладает заметной токсичностью по отношению к органам и клеткам различного происхождения (Bennett et. al., 1991; Me 1 ach 1 ал et. al.. 1991; (SANDIMMUN. Practical Guide, 1990). Для снижения токсического действия ЦсА добиваются усиления его специфического действия при комбинировании с другими препарата!.® и проводят частые определения уровня его концентрации в. крови (Lindholm. 1991). Такого рода усилия не всегда являются успешными по ряду причин. - Во-первых,, фармакокинетика ЦсА в силу его гидрофобности и обилия токсичных и биологически активных метаболитов носит довольно слогана характер (Freed et. al., 1991; Avollo et. al., 1991: Klra et. al., 1990). Во-вторых, препараты, применяемые в комплексной терапии с ЦсА (корти'костероиды, азатй-оприн), обладают собственной токсичностью (Salaman, 1988). В

связи о' этим остается актуальным изучение возможности комбинирования ■■ циклоспорина А с другими антищгалиферативными агентами. Целью, при комбинировании циклоспорина А с другими иммуносупрес-сантами, является достижение максимального подавления иммунного' .ответа при минимальном цитотоксическом действии веществ.

Эксперименты т vitro по определению способности пептида 2438 усиливать специфическое действие ЦсА проводились на модели пролиферации?- лимфоцитов под действием митогена КонА. В таких экс. периментах использовали различные концентрации Циклоспорина А и постоянную концентрацию пептида 2438. Жизнеспособность клеток оценивали по тесту исключения красителя трипанового синего. Уро-; вень пролиферации и жизнеспособность клеток отражены на оДНоы графике (Рио. 4). Левая ось У соответствует пролиферация в процентах от контроля, а правая ось У процентному количеству вышв-ших клеток. . - "

При этом было выявлено, что заметная цитотоксичность при использовании одного только ЦсА проявляется при концентрации выше 1 мг/л , а антипролиферативное действие при концентрации выще О.б.мг/л (выделенная штриховая линия), т.е, усиление его иммуно-. ' супрессорного действия происходит в основном за счет усиления токсичности. - ' . *

, При комбинировании двух этих йеществ было выявлено, что пептид ' 2438 способен усиливать специфическое ' иммуносупрессорное дейс- ■ твие ЦсА без изменения негативного влияния последнего на жизнеспособность клеток. Добавление 0.1 цг/л пептида снижает порог проявления циклоспорином антипролиферагивного действия до 0. г мг/л, не изменяя порога токсичности. Причем суммарный' йнгибитор-ный эффект при использовании смеси веществ был сильнее, чем при использовании любого из них в отдельности (выделенная сплошная кривая). При этом, при использовании низких концентраций Циклоспорина А в комбинации с постоянной концентрацией пептида 2438 цитотоксическое действие не циклоспорина не усиливалось (тонкие кривые). Таким образом, комбинируя два'агента, обладающих антип-; ролиферативныы дейстрием. Циклоспорин Д й пептид 2438, удается

1чь выраженного антипролиферативного эффекта при отсутствии гного цитотоксического действия в культуре лимфоцитов чело-tn vitro.

зучеше мвхашзмон действия аитагсршм^еративных агентов. Влияние ингибиторов пролийерашш на индуцированное нитогеном изменение уровня тнаозпи-спгзтбического йосйюрилирования пли митогенной стимуляция лимфоцитов. ючевая роль в событиях, непосредственно следующих за распоз-нием антигена, принадлежит фосфорилированию белков по амино-отным остаткам тирозина. Ранее было показано, что стимуляция мфоцитов поликлоналыпаш активаторами приводит к усилению орилирования эндогенных субстратов ТПК: X Uei™ CD3> а также пептидов с молекулярными весами 120, 80, 40 кДа (Schwinzer al., 1992) и 110, 90, 80 кДа (Albefola-ila et.'al.. 1992) . ¡ханизмы действия многих иммуносупрессорных агентов, несмотря [х широкое применение в клинической.практике, остаются плохо [енными-. Можно предположить, что действие по крайней мере не-¡рых из них могут быть опосредованы регуляцией тирозин-специ-гского фосфорилирования. -

ши по себе ни пептид 2423, ни Циклоспорин А ни интерферон не шали достоверных изменений и. в различных экспериментах, зодили как к незначительному усилению так и снижению содержа_-фосфотирозина (<102 от базального уровня) в индивидуальных эгенных субстратах ТШ (Рис 0). Митогенная стимуляция вызыва-значительное повышение, по сравнении с контролем, содержания фотйрозина в ряде эндогенных субстратов тирозиновых протеин-аз, причем наиболее значительные, изменения наблюдались для ипептида, мигрирующего с молекулярной массой порядка 36 кДа 36). Совместная обработка клеток митогеном в комбинации с ан-ролиферативными агентами - пептидом 2438, ЦсА и ИФН вызывает трое снижение тирозинспецифического фосфорилирования ррЗб .читальное ниже исходного базального уровня. Такие изменения и быстрыми по времени и достигали своего максимума по истече-[ одной минуты обработки (Рис.5. 6). В то ке время влияние ве-

Рисунок 4.

Усиление иммуносупрессорного действия ЦсА в присутствии пептида 2438 §

■100 Я

1 1 1 Концентрация ЦсА (иг/л)

Я

1 - пролпферасшя в присутствии Циклоспорина А

2--"- в присутствен Циклоспорина А п пептида 2438

3 — жиэнеспосэБиостъ с присутствии Циклоспорина А

4 — -"— п присутствии Ишшюспорина А к пептида 2438

5 - Пролиферация а присутствии только пептида 243В

- 15 -Рисунок 5.

Изменение содержания фосфотирозина в фосфоггротекне ррЗб при ыитогешюй стимуляции и под дейстшгец спктетичесгсого пептида 2433 интерферона и циклоспорина А

Оптическая

ПЛОТНОСТЬ 0.4

т е I is ii u a it и

1 - КонА 3 - КонЛ+843а

2 - КонА+ИФН 4 - КонА+ЦсА

Время (мин)

"ТТ- -т-т--

v', V

Я 55 §

а 3

я ' «г

й а

о г

у ива

» с* са

ся».-^ с»

Рисунок 6. уноблот после разделения бел-клеточных лизагов электрофо-ом по Лэмши в 10% полиакри-идном геле. Клетки в инкуопали присутствии синтетическо-пептида 2438 (10"s М). ИФН ЮО ЕД мл) или ЦсА (1 мкг/мл) присутствии или в отсутствии IA (2 мкг/мл). В качестве [троля использовались необра-•анные клетки. Время инкубации ¡тавляло 15 мин. (бозначения соответствуют: itrol - контроль: СопА - КонА; f - ИФН; 2438 - пептид 2438; L - ЦсА.

Р56Ф ^^ «г* —«у* !)> м в Я

lifoMKn

- м

w

. .. . '<пгко

f fc&iKD

-JLl лл

'■¿йёШ 6 7 О

1 2 3 4 3

Рисунок 7.

Иммуноблот после разделения белков клеточных лизатов электрофорезом по Лэммли в градиентном (7.5-12.5%) полиакриламидном геле. Клетки в инкубировали присутствии .синтетического пептида 2438 (10~6 М), ИФН (1000 ЕЛ МЛ) или ЦсА (1 мкг/мл) в присутствии или в отсутствии КонА (2 мкг/мл). В качестве -.сонтроля использовались необработанные клетки. Время инкубации составляло 1 час.

Обозначения соответствуют: I -ИФН: 2 - пептид 2438; ИФН t 2438; 4 - КонА; 5 - КонА + ДОЯ; 6 - КонА + 2438; 7 - КонА ♦ '¡ВД + 2438; 8 - контроль; . .

I 4 6

9

цаств было стойким и сохранялось, по крайней мере, в теченш са (Рис. 7).

Хотя полученные результаты не позволяют однозначно утверг о вовлечении фосфорилирования ррЗб в процесс передачи актш онного сигнала и в обеспечение антипролиферативного дейс; тем не менее однонаправленность в регуляции фосфорилирова} пролиферации может косвенно свидетельствовать о возможной тирозин-специфического фосфорилирования в проявлении ангищ феративного действия пептида 2438. ЦсА и ИФН.

Измерение кдошмрованиых иитогеиом мзмев1ениЯ концентрации Са— в цитоплазма клеток.

Из данных литературы известно, что усиление тирозинспециф! кого фосфорилирования приводит к активации системы втор! мессендкеров, в частности, изменению концентрации свободны: нов Сав* в цитоплазме. Такие изменения являются прямым следс ем гидролиза инозитоловых фосфолипидов фосфолипазой С с В1 вождением диацилглицерина. (ДАТ), и инозит 1.4,5-трифо< (ИФ ), который вызывает высвобождение двухвалентного Са£ внутриклеточных депо и приток Са2* из внеклеточного прост] тва. Мокно предположить, что изменения тирозинспецифичес •фосфорилирования в результате обработки клеток антапролиферг ными агентами может затрагивать и вызываемый кктогеноы пр1 ССаг+]1 в цитоплазме Т-лимфоцитов.

Базальный уровень в цитоплазме свезхевыделенных клеток со< лял 100 нМ. Митоген КонА вызывал прирост [Саг*]} в среднем I нМ в течении 3 мин с характерным пиком и выходом на плато (1 А и Б). Дальнейшее прибавление пептида 2438 к клеткам не дг изменений (Рис. 8 А). Циклоспорин А, добавленный после Кон; зывал незначительный подъем [Саг*]1 в цитоплазме (на 5-10 н! случаях, когда последовательность добавления веществ к кл< была другой (Рис. 9 А и Б), выявлялось, что.Циклоспорин А, по себе, вызывал незначительный подъем ЕСаг*]1 в цитоплазм! 5-ю нМ), но полностью блокировал дальнейший ответ на ми: (Рис. 9 Б). В то не время, синтетический пептид 2438 не ищ

- 21 .Рисунок 10.

Вааныопейетвза £438 с клети Связывание в координатах (

аогот

0 12 3 4

ав 1.5 а® 3.5 Связанный (пИ)

Рисунок 12.

Свяаыашпе а Еооргшзатах Скйтчэрда

2 4 0

1 3 в

Связанный (пМ)

Рисунок 11.

Ьаимояейстгве 2438 с клетками СЕМ зшзырагня & координатах Скетчарда

10 20 го 40 ВО 6 16 25 35 46 Связанный (пЫ)

Рисунок 13.

Шпиыолесетвзе £453 с клетками ЛЛ1К4Т Свдзьшйвзг в координатах Скетчарда

0.01 г 0.011

а4 о.з 0.2 0.6 1 Связанный (пМ)

Рисунок 14,

Скгтываяяе пмггаш с .и.г ^ьЬ-Т^Т о Еойрдйват« скетга^ла

а в ю

Связанный (пИ)

Рисунок 15.

ГЪааьго-зейетвтг 2433 с »рягроцатвыа Связывание а координатах Скетчарда 0.020т-

о 0.2 о.4 0.6 аа 01 0.3 • 05 07 Связанный (пИ)

- 22 -Рисунок 16.

Взаимодействие 2438 с клетками Ш.-60 Связывание в координатах Скетчарда

' 0.100 0.090 0.080 И 0.070

о 0.060

\ 0.050 § 0.040

¿3 о.озо 0.020 0.010 0.000

1 3 5 7 0

Связанный (пМ)

Таблица 1.

Параметры связывашя синтетического пептида 2438 с клеткаш культивируемых линий и эритроцитами человека1

. Клеточная линия Константа дассовд -ации для "высокоаффинного" связывания К,, (М) Число сайтов связывания для "высокоаффинного" связывания И, Константа диссоци - . ации для "низко-аффикного" связывания Число сайтов! связывания для "низкоаффинного" связывания *ш

ЛШКАТ 6. 33X10" 9 11784 9.3X10"7 244852

СЕМ 8.51x10*® 107471 1.37x10"® 4133925

НЬ-60 1.6X10"8 37326 4.0x10" 7 338894

ЛШКАГ(1а1) 9. 93x10" 45970 1.93x10"® 2315561

Н1ГГ-78 4. 7.9x10" 9 41188 1.02X10" 6 1343787

НГ-4 1.03X10" 8 28837 3.22x10"® 1721064

Эритроциты не определяется не определяется 5.1x10"7 34251

зптида 2438.

Интересно отметить, что связывание пептида 2438 с эритроцитами роисходит■существенно слабее и, кроме того, отсутствует высоко-ффинный компонент. Характер взаимодействия пептида 2438 с эрит-оцитами позволяет сделать предположение, что взаимодействие оп-еделяемое ранее как "низкоаффинное", возможно, соответствует еспецифическому взаимодействию. Для проверки этого утверждения еобходимы дополнительные эксперименты.

Выводы.

1. Синтетический пептид 2438 - фрагмент интерферона а-2 дозо-ависиио ингибирует пролиферацию Т-клеток человека в смешанной :ультуре лимфоцитов, как в" аллогенной, так и в аутологичной сис-•еме.

2. Синтетический пептид 2438 усиливает in vitro иммуносупрес-:орное действие низких концентраций Циклоспорина А. не усиливая токсичность Циклоспорина А для Т-лимфоцитов.

3. Синтетический пептид 2438 оказывает угнетающее действие на )анние по времени этапы активации Т-лимфоцитов человека конкана-¡алином А.

4. Стимуляция т-клеток митогеном конканавалином А индуцирует 5ыстрое фосфорилирование по аминокислотным остаткам тирозина по-ипептида с молекулярной массой 36 кДа. Синтетический пептид 2438 - фрагмент интерферона а-2. а также рекомбинантный интерферон а-2 и иммуносупрессивный препарат Циклоспорин А снижают уро-зень фосфорилирования эндогенного субстрата тирозиновых протеин-киназ с молекулярной кассой 36 кДа в клетках стимулированных митогеном.

5. В отличие от Циклоспорина А синтетический пептид 2438 не угнетает индуцированный конканавалином А подъем концентрации Са»* в цитоплазме Т-лимфоцитов и не изменяет базальный уровень концентрации Сай+.

5. Опухолевые клеточные линии лимфоидного происхождения СЕМ, Jurkat. МТ-4. 'гШТ-78 и клетки миеломоноцитарной линии HL-60 зкс-прессаруат два типа рецепторных сайтов для пептида 2438, отлича-

- 24 -.

ющихся по своему сродству к пептиду. Константы диссоциации для высокоаффиннного связывающего сайта составляют величины от 4.79хЮ"9 М до 1.6Х10"8 М . а для низкоафффинного от 4. ОхЮ"7 М до 3.22x10"6 М. Число высокоаффинных сайтов связывания на клетках разный линий колеблется от 11000 до 101000, и низкоаффинных 250000 до 4100000 на одну клетку.

7. Эритроциты периферической крови человека не. экспрессируют высокоаффинных рецепторов для пептида 2438, число низкоаффинных сайтов с константой диссоциации ,0,5 мкм не превышает 35000.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. А.V.Danllkovlch, K.V.Freze, • A.F.Shevalier, V.V.Samukov, A.F.Klrkln, . M.V.Gusev. Synthetic peptide vlth antiproliferative activity, a short C-terminal fragment of human interferon a-2 molecule. //'Immunology Letters - 1992 - V.31. N. 1 - P.- 15-20.

2. A. V. Danllkovlch, A. I.Kharitonenkov, K.V.Freze, A. F. Shevaller, 0. V.Kolosova, T.V.Bulargina, A.F.Klrkln, M.V.Gusev.. Interaction of synthetic peptide • of the interferon a-2. C-terminal part with human blood leukocytes. I. Binding to peripheral blood mononuclear cells. // FEBS Letters - 1991 - V. 295 N. 1,2.3, - P. 70-72.

-3. A. V. Danllkovlch, A.I.Kharltonenkov. K. V.Freze. A.F. Shevalier, 0.V.Kolosova. T.V.Bulargina, A.F.Klrkln. M.V. Gusev. Interaction of synthetic peptide of the Interferon a-2 C-termlnal part with human blood leukocytes.II. Effect of protein tyrosine phosphorylation.// FEBS Letters - 1992 - V. 296, N. 3 - P. 271-273.

4. E.И.Асташкин,. А.Б.Ходорова. A.M. Сурин. К.В.Фрезе. М.М.Лит-' вина, Н.Ф.Нйконова. Изучение влияния моноклональных антител против СОЗ-кластера, коклюшного токсина и конканавалина А на концентрацию свободных ионов Са2+ в цитоплазме клеток Jurkat. 7/ Биол.мембраны - 1992 - Т. 9,10-11 - С. 1018-1021.

5. Berezhnova J.A., Danllkovlch А.V.. Freze K.V., Skurnlk A.R., Klrjuschenkov P.A.. Sukhlkh G.T. Studying in vitro functional activity of lymphocytes In normal pregnancy and In prone to

spontaneous abortion - Abstracts and stend report In "Immunological aspects of reproductive health1', Symposium on the occasion of the WHO Special Program of Research, Development and Research training in Human Reproduction, (Moscow, June 17-18), 1992 p. 48.

5. K.B.Фрезе, А.В.Дашикович, Ю.А. Береянова . А.Ф.Шевалье, А.Ф.Киркин, М.В.Гусев. Лнгибирование ответа на адлоантигены синтетическим пептидом - Фрлгыепгоы интерферона ачьфа-2. Тезисы, 1ЫЙ Съезд иммунологов России (Новосибирск, 23-27 июля, 1992).

7. A.Y.Danilkovich, K.Y.Freze, A. I. Kharitonenkov, А. М. Surln, А.В. Khodorova, T.Y. Bularglna, Е. I. Astashkin. Synthetic peptide - fragment of•interferon alpha-2 affects early events of lymphocyte activation. Abstract at 22nd FEBS Meeting (Stockholm, -July 4-9), 1903.