Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Фенотипические, функциональные и внутриядерные характеристики иммунокомпетентных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях

Актуальность проблемы. Фундаментальные исследования в области биологии ж медицины способствовали разработке Программы по ©щенке иммунной системы человека /181, 359-362/. Центральное шест© эксперты Всемирной Организации Здравоохранения отводят характеристике иммунокомпетентных клеток: их , налышм свойствам, продукции и секреции биологически активных факторов, участвующих в механизмах стоянный поиск наиболее компетентных клеток и иение актуальных статусе й системы в целом направлен жа ренаучных знаний о нормальном способов ишунодиагноетикЕ и иммунокор-рекции состояний, обусловленных иммунологической недостаточнос

ТВ0

К наиболее ти относят лейкозы и жм#ош.

Иммуно-шш лимфопролиферативные заболевания выделены в самостоятельную группу заболеваний шшунжой системы /18, 193, 103, $ «и^/ что^развитие злокачественного поражения сиорганов сопровождается нарушением процессов пролиферации и дифференвдровки иммуиокомпетёнтннх клеток, появлением клона опухолевых клеток и угнетением нормального ге-мопоэза /29-33, 142, 233 , 294/. В результате лимфопролифератив-ные заболевания можно рассматривать в 2-х взаимосвязанных аспектах;

- в качестве вторичных иммунодефицитов; в качестве системы. трансс клеток имо позиции чательно неустановленной этиологии этих заболеваний и эпидемиологического анализа. При острых лейкозах у рование шка заболеваемости и смертности отмечается в возрастной группеот 2 д© 4 лет , причем показатель смертности в разных регионах составляет 1,5-8/100 ООО населения /7/. Частота заболеваг-емости при неходжшшских лимфомах, включая хронический лимфо~ составляет 2,6-6,8, показатель смертности 0,9^-28/100 000 Однако несмотря на все усилия ж© оптимизации способов диагностики и лечения лимфопролеферативннх заболеваний (ЛПЗ), показатели заболеваемости носят проблемы. Клеточное ф' поз*" этой волило нуюклетву, определить природу клеточного клона при и 1^шм#©вдт@в, X « и «вариантов Х^шей С системы был выявлен цит, а лимфопролиферативнне заболевания определены как

24, 122, 157, 179, 213, 220, 225 , 270 , 298 » 335/ с этим стал© очевидным, что клетки больных ЛПЗ ж© вполне сопоставимы с лимфоцитами здоровых лиц и больных другими формами иммунологической недостаточности (рис.1): это клон фенотищчески незрелых клеток* экспрессврущих стадиослецифические дифференцировочные антигены /1*-6, 13, 14, 37, , 86, 89, 113, 122, 143, 144, 190, 196, 209, 221, это клетки, же способные к распознаванию антигена, пере** даче сигналов внутриклеточно, активации , и дйфференвдровке» что в конечном итоге обусловливает их ональную несостоятельность /24, 25, 70 , 86, 176 , 224, 236, 329/; в целом ряде случаев это неклассифивдруемне формы, природу клеточного клона которых можно установить лишь по реаранжи-ровкё 1<ргенов ж Д-цепи TcR (ï-клеточного рецептора), характерной для раннего В- или Т-клеточного онтогенеза /78, 185, 248, 249 , 275 , 276, 299 , 346 , 356/; для них характерна дерегуляция продукции цитокинов с ауто-кринным механизмом синтеза, что поддерживает и усиливает опухо-* левый роет /5, 19, 48, 215, 28®/;

- их отличает нарушение кинетики клеточной пролиферации: удлинение фаз клеточного цикла /28 , 48 , 202/; шперпродузадея и одновременно редукция гибели клеток /202 , 349/, дефекты рециркуляции в системе лимфоидный орган (ткань) - периферическая кровь /15, 138/. цит при лейкозах живущей (пул "вне торой может гибель клетки клетки при несет признаки цикла") и малигнизированной клетки, гибель ко* в интерфазе, что описано как "интерфазная причины нарушения нормального механизма фопролиферативных заболеваниях остаются

Между тем, фиксируемые изменения лимфоидннх клеток могут отражать перестройку системы функционирования генома. Все это предполагает актуальность разработки нового подхода к оценке им-мунокомпетентшх клеток, основанного на анализе внутриядерных характеристик! включая рефляцию синтеза гистонов и ДЕК, актив*ности систем ферментов, участвующих в кислот /100» 128, Ш* 354/.

Изучение молекулярных ©снов лейкозогенеза продемонстрировало ряд признаков нестабильности генома злокачественно трансформированных клеток. К началу наших исследований был установлен факт снижения интенсивности Са, lj-зависимого ДНК-эщфнуклеоли за в изолированных ядрах лимфоидных клеток крупного рогатого скота при лимфолейкозе /167/, описан феномен иншбирования ДЙК-эндонук-леолиза у больных хроническим лимфолейкозом /155/. Эти данные вызвали интерес в связи с концепцией об участии Са, М^-зависимой (СИ) в реаранжировке Iq-генов /94/. Наряду е

Activationмеханизм аионтоза v^^r , индуцированная активацией запрограмв последние года Induced Cell Beth, шрованная гибель клеток) t который биохимически опосредован активацией Сайзашсшшх эндонуклеаз с последующей фрагментацией ДНК /184, 305, 366/. Полагают, что в основе элиминации отвечающего клона активированных СД4+ «клеток при СПИДе и процесса клональной селекции в Т-клеточных шбридомах л ежить механизм ак4 тивации ДН&*ферментов (Са-зависимых нукяеаз) с последующей фраз**» ментацией ДНК /336 , 337, 340/. Отсюда можно было предположить, что изучение активности Cat Mj-зависимой эндо-ДЕКазы будет способствовать раскрытию причин нарушения нормального механизма ги-клеток при

Ш каеался изучения фракций гистоновых белков человека /115-117/, других новообразованиях

Однако ш не встретиж в научноГ пределении фракций гистонов, -ти Са, М^зашошшх шдо-ДНКаэн в данных о рас-и активное«* клетках ббльнйх с разными клинически® формами лимфопрожферативных заболеваний. Отсутствовала информация о допустимых значениях физиологической нормы, диагностически значимых уровнях, а также о возможности использования указанных параметров для контроля за коррекцией лимфопролиферативных заболеваний. Сопоставления анализа клеточных ядер и выраженности иммунного дефекта, как правило, не проводили.

Согласно известной концепции академика Р.В^Петрова, иммунная система функционирует равноценно с другими системами органов; важно не только выявить нарушенное звено системы, но и научиться ее лечить /107-109/, Исходя из предположения, что иммунный дефека при 1Ш реализуется не только на клеточном уровне , но и ассоциирует с нарушением ядерного аппарата^ мы попытались наметить перспективу новых подходов к иммунодиагностике и коррекции

0 помэд&вг количественных (усиление экспрессии иммунологических маркеров) и функциональных тестов (ответ на штогены) были получены научные обоснования для использования тактивина (прелая из тищуса, фракция У£) в комплексном лечении детей с клеточных ядер вносило существенные дополнения клеток, что в дальнейшем позволило использование других групп иммунокорриструвдих средств, включая интерферон (автор, ©вид. I 1628702)«

1р решении вопросов, имеющих прикладное значение, был использован принцип исследования в одной пробе периферической крой» ж уровня фракций шстонов, ДНК, активности Са, М^-зависимого ДНК-эндонуклеазы с одновременным определением выраженности ного дефекта до лечения и в период ремиссии больных mm Q ** заболеваниями с диагнозом остры! лимфолейкоз, саркома, или неходккинская лимфома, лимфогранулематоз (лети); хронический лимфолейкоз», неходжкинская лимфома, множественная шелома, грибовидный микоз, синдром Се зари (взросли© лица).

В плане фундаментальных исследований значительный интерес представлял вопрос © нарушении механизма клеточной гибели при опосредован усилением активности

Цель работы. Цель исследования заключалась в разработке нового подхода к оценке иммунокомпет ентных клеток в норме и при лимфопролиферативных заболеваниях, основанного на анализе феноти-пических, функциональных, а также внутриядерных характеристик» включая уровень фракций гистонов, содержание ДНК/лимфоцит, актива ность Са, М^-зависимой ДйК-эндонуклеазы в изолированных клеточных ядрэх» достижения цели пред« полагалось решить следующие задачи:

I, Исследовать характеристики идаунокошетентных клеток здоровых лиц (дети, доноры зсрож)-;" Для этой цели использовать обще«, принятые метода фенотипирования (уровень ишунорегуляторных клеток) , оценки функциональной активности (ответ на митогены §ГА и лаконоса), определения концентрации 1| и тимического фактора в сыворотке крови, а также метода внутриядерного анализа (спектро-фотометрия, электрофорез), позволяющие измерять содержание фракций гистонов, ДНЕ ж уровень интенсивности Са, Независимого •эндонуклеаза, и на основании полученных данных разработать

2. Изучить фенотипичееже, функциональные и клеток болышх фераг» с клиническим диагнозом острый лимфолейкоз. множественная шелома, микоз, анализхарактеристик иммунокомпетентннх клеток цри процессах относительно нормы и других фор® статочности бактериальная инфекция) и на основании полученных данных разработать критерии оценки иммунокомпетентных клеток при разных клиник ческах формах лшафоиролжферативных заболеваний!

Ш' Определить степень внутриядерных изменений иммунокоше*-тентных клеток в период ремиссии лимфоцролиферативных заболеваний: распределение фракций шстонов, содержание ЦЩ/лимфоцит^ уровень активности Са, М^-зависимой эндонуклеазы.

4* На основании данных анализа фенотшшческих, функциональных и внутриядерных характеристик разработать карту оценка им-системы больных лимфоцролиферативными заболеваниями; SI ©ценить действие отечественных иммунокорригирувдих npena»

- тактивина-на экспрессию иммунологических циопальную активность лимфоидных клеток;

- реаферона ¡» на усиление активности Са, ДНЖазы клеточных ядер у б ннх клеток в период зом и реафероном у ваши полученных лечешещ тактивином у детей волосатоклеточным лейкозом и на осно-разработать критерии контроля за ю

Научная новизна и практическая значимость -работа I. Разработаны ноше критерии оценки нормальных петентных клеток, основанные на анализе внутриядерных стик: определения уровня фракций гистонов, содержания вдт, активности Са, ¡Независимой ДНК-эндонуклеазы.

Впервые установлено, что иммунокомпетентные разных клинических формах лимфопролиферативн рактеризуются внутриядерными изменениями: » перераспределением фракций гистонов с на; клетки жри заболеваний ха

4 снижением уровня активности Са* М^-зашсимой шдо^ШКазж^ что коррелирует с количественным и функциональным том, достоверно отличаясь от норда и других ской недостаточности*

На основании порученных данных была разработана карта оценки иммунной системы больных лимфопролжферативными заболеваниями.

3« Установленный факт снижения уровня активности Са, ¡^зависимой эндонуклеазн у болшых лимфопролиферативными заболеваниями позволил сформулировать новую концепцию Неэффективного апоптоза" : неспособность малишизированных клеток в условиях активации ±оYJ.tr© к усилению активности эндо-ДЕКазы с последующей фрашентавдей ДНК может быть обусловлена нарушением нормального механизма клеточной гибели, что. ассоциирует- е появлением клона долгоживущих лимфоцитов.

4? Предложены новые критерии оценки иммунного статуса организма в период ремиссии лимфопролиферативных заболеваний» Устаг-новлено, что кжнико-гематологическая ремиссия сопровождается частичным или полным восстановлением уровня фракций гистонов, соотношения лизин/аршнин~богатых белков» содержания ДНК, активности Са, М^зависишго ДОйщдон^клеожза, что ассоциирует с процессом элиминации неопластических клеток и обновления лимфо-цитарного пула«:

5« Впервые установлен факт усиления ДЙК^эндонуклеолиза лимфоцитов при добавлении реаферона (рекомбинантного «¿Интерферона) к изолированным ядрам иммунокомпетентных клеток больных лимфой пролифератжвннш заболеваниями* Критерии оценки иммунокомпетентных клеток на внутриядерном уровне были впервые использованы да контроля за лечением тактивином детей с лимфогранулематозом и реафероном больных во-лосатоклеточннм лейкозом«;

Новизна проведенных исследований подтверждается 5 авторски* » свидетельствами СССР, 2 патентами (Ж и Великобритании, 2 рацпредложениями отраслевого значения:

1 997298 "Способ получения полипептидов", на которое выданы патенты ШЛ4375П и Великобритании ОВ В 2086392 В; № 4086808 "Способ определения форм бактерионосительства"; № 1607572 "Способ диагностики злокачественных лимфопролифератив

В 1628702 "Способ определения индивидуальной чувствительности к жммуномодулирущим препаратам у больных злокачест* венными лимфопролиферативными заболеваниями"; $ 1633972 "Способ иммунодиагностики лимфолешшза"; № 0^2007 "Способ оценки действия иммуностимуляторов";

Л 0-2534 м крометод получения чистое суспензии

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования были использованы в клинической практике при дифференциальной диагностике , определении индивидуальной чувствительности к иммунокорригирущим средствам и контроле за лечением больных гематологических клиник Гематологического Научного Центра АШ Российской Федерации, МОНИЕИ им.М.Ф.Владимирского, Института детекой онкологии Онкологического Научного Центра и Российского Государственного медицинского университета.

На основе материалов исследования, при участии автора в качестве эксперта-иммунолога, совместно с сотрудниками кафедры медицинской кибернетики и детских болезней ш I Российского Государственного медицинского университета была построена автоматик зированная консультативная система диагностики иммунодефицитных состояний у детей с заболеваниями системы крови. Программа зарегистрирована в РНВЦ НПО "Медсоцэкономинформ" {Республиканский фонд алгоритмов и программ).

Основные положения > выносимые на зашту

I. Иммунокодаетентные клетка здоровых лиц, детей и взрослых, обладают не только определенным фенотипом, функциональными свой» етвами, но ж внутриядерными характеристиками, включая соотноше** нже фракций гистонов (Н1-, Н2В-, К2Ь-ЕЗ->Ш) , содержанием ДНК, способностью к проявлению активности Са, М^-завиеимой эндо-ДНКазы при инкубации клеточных ядер в условиях активации ДНК-фермента, ' 2,' Для лимфопролиферативных заболеваний характерны внутри«» ядерные изменения ишунокомпетентннх клеток

- перераспределение фракций гистонов с дефицитом И-гистона;

- увеличение содержания ДНК;

- ингибирование активности Са, Мо-сависимой эндонуклеазы.

3. В период ремиссии лимфопролиферативных заболеваний, оси провождаемый элиминацией клона неопластических клеток и обновления лимфовдтарного пула, отмечается частичное или полное восстановление показателей оценки внутриядерных характеристик имму-нокомпетентных клеток,

41 Данные о снижении активности эндо-ДНКазы и ингибирования фрагментации ДНК указывают на возможнее нарушение нормального механизма клеточной гибели при лимфопролиферативных заболеваниях,

5, Установленный в данном исследовании факт усиления 0а, М^-зависимого ДЕШ-эндонуклеолиза при добавлении к изолированным ядрам лимфоцитов реаферона, рекомбинантного оЦ -интерферона позволяет определить индивидуальную чувствительность больного к действию иммунокорригирувдего препарата!

6, Исследование продемонстрировало эффективность использования показателей внутриядерных характеристик для контроля за терапией тактивином в комбинированном лечении детей с лимфогранулематозом ж реафероном у больных волоеатоклеточным лейкозом.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 266. страницах машинописи, включая 38 таблиц, 23 рисунка; состоит из Введения, Обзора литературы, Глав собственных исследований, Обсуждения, Выводов, Библиограй фия содержит 369 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.

ФАЗ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

Т— и шш

PEAPAÏ» РОБКА

Ig- и

TCR

ГЕНОВ

ЮРЕ

ВШЕ АГ I

ПЕРЩАЧА СИГНАЛОВ I

АКГИВАВДЯ I

ЩРОВКА I

НАРУШЕНИЯ

СОД ФР/ ШСТОЙОВ, ДНК

Рис»1. Характеристика иммунокомпетентных клеток при лимфоиролиферативных заболеваниях. обзор л iт i р а т f р h штштш ноншзыж ж иажшзированных ишшш*

В ПРООЕССЕ РЕШ

ШЕОМПЕГЕНТНЫХ КЛЕТОК В и

1*1. Развитие клеток системы в эмбриогенезе система как система контроля за сохранением инда* видуальности ж целостности организма эволюционно представлена тремя основными филогенетическими уровнями :

- квазииммунным распознаванием» а именно, алло« ж ксено-генных элементов! примитивным клеточным иммунитетом с элементами специфичен ского распознавания и иммунологической памяти ; интегрированным клеточным и гуморальным иммунитетом /77/. Регуляция высшего уровня развития иммунитета осуществляется центральными и периферическими органами иммунной системы, попудя* циями и субпопуляцияш иммунокомнетентных клеток, наконец, цито» винами и биологически активными факторами, или гормонами иммунной системы /76, 107, 108, 147, 148, 169, 177, 188 , 244/.

В эмбриогенезе большинство органов иммунной системы развиваются из энтодермы (вилочковая железа,фабривдева сумка) или мезодермы (селевенка), но не из эктодермы. 1 человека на ражшх стадиях онтогенеза» в период эмбрионального развития, лимфоидные стволовые клетки мигрируют из желточного мешка или печени плода и заселяют вилочковую железу, костный мозг* Предшественники лимуже в кровяных островках желточного мешка, периоде источником клеток^предшественников служат гемопоэтические стволовые клетки костного мозгам

Процесс созревания и дифференцировки лимфоидных клеток включает антиген^завиеимую и антиген-независимую стадии» В пер« вом случае речь идет о лимфопоэзе в центральных органах иммунной системы. В периферических органах иммунной системы - лимфатических узлах» селезенке, миндалинах, ассоциированной е кишечником и бронхами лимфоидной ткани лимфопоэз осуществляется лишь при наличии антигенной стимуляции.

Вилочковая железа у человека окончательно формируется как орган на 20®й неделе внутриутробного развития. Уже к 14-15 неделям тимовдты человека способны к блаоттршеформации в культуре ±п тИа?© при стимуляции митогеном §ГА. Первичное включение "%^тимидина совпадает по времени с окончанием клеточной диффе-ренцировка вилочковой железы и миграции Т-клеток в периферическую кровь. Секреторная гранула, содержащаяся в цитоплазме клетки тимуса, служит* источником синтезируемых "тимических факторов" , как известно, изтращих значительную роль в Т-клеточной дифференцировке.

О начале синтеза иммуноглобулинов, относящихся к компетенции организма ребенка^ свидетельствует присутствие плазматических клеток в крови месячных детей.

На 10-й неделе внутриутробного развития начинается гемопоэз (в ключице плода), а примерно спустя 4,5 месяца отмечают максимум его активности, в то же время гемопоэз в эмбриональной печени становится менее интенсивным. В костном мозге гемопоэз представлен предшественниками всех рядов, а лимфцциты составляют окшео 20% всех клеток костного мозга*

Подробные сведения о развитии иммунной системы собраны в ря** де обзоров /61, 77, 149, 209/.

Значительный интерес представляют молекулярные основы цро~ цессов пролиферации и дифференцировки иммунокомпетентных клеток /100, 125, 137, 139, 152 , 311/. Анализируя механизмы превращения клеток-предшественников в антителообразущие клетки (АОК), авторы обзора /148/ отмечают, что незрелые В%летш^ синтезирущие в небольших количествах вдтоплазматические или мембранные антитела, появляются уже на ранних стадиях онто- и гистогенеза. Перегруппировка Icj-генов f "включение" структурных генов иммуноглобулинов отражает определенный этап дафференцировки В^лимфецитов. Именно естественный ход дифференцировш, характерной для онтогенеза, возможен при иммунизации с последующей активацией зрелых В~кле-ток и появлением I^-синтезирующих клеток. Авторы не исключают также единый механизм превращения клеток«предшественников в АОК и запуска клеточного деления. Важная роль отводится усилению метаболических процессов, включая синтез ДНК, матричную активность хроматина, активацию генов, кодирующих синтез белков рибосом и образование полисом, определяющих формирование комплекса эндо-плазматической сети с аппаратом Гольджи* Процессам активации ан-тителогенеза и тимус-зависимого иммунитета способствуют биологии ческие эффекты цикжческих нуклеотидов и ионн Са++ и 1|++, что определяет предпосылки переключения синтеза Igl на 1ср /139,311/,

Если в качестве естественного индуктора Т-клеточной дифференцировки выступают гормоны тимуса /41, 244/, то для В^клеток эту роль может выполнять стимулятор антителопродуцентов, выявленный в культуре клеток костного мозга /55, 92, 93, 95, ПО, III/.

1.2*! Регуляция системы кроветворения

В процессе нормального кроветворения происходит постоянная смена кроветворных клонов. Отбор оптимальных но темпу пролиферации клонов способствует поддержанию динамического равновесия в кроветворной системе, что важно как мя картины стабильно!1© кроветворения, так и для ее восстановления после воздействия соответствующих стимулов /164, 222, 363/,

Родоначальницей кроветворения считают стволовую кроветворную полипотентную клетку-предшественник, которая, с одной стороны, обладает способностью к самоподдержанию, с другой, к диффе-ренцировке в зрелые иммунокомпетентные кжетки /10, 38 , 73 , 107, 108, 164/* В основе этих двух механизмов лежит система регуляции кроветворения, И хотя известно, что число кроветворных стволовых клеток, темп их пролиферации и вероятность дифференцировки находятся в организме иод строгим контролем, тем не менее возможна избыточная продукция клеток-предшественшков даже при условии отсутствия такой необходимости: феномен "неэффективного поэза", лейкопоэза в костном мозге или лимфопоэза в тимусе, гиперпродукция клеток, погибающих до достижения стадии зрелости^

Наряду с активной пролиферацией кроветворные стволовые клетки способны к интенсивной рециркуляции, что обеспечивает постоянный обмен в пределах кроветворной ткани, миграцию в жмфо-идные органы и ткани, сохранение целостности системы кроветво

Согласно предложенной модели кроветворения, самообновление стволовых клеток происходит под влиянием специального "индукто~ ра", выделяемого микроокружением кроветворных клеток /164/* Ре~ гуляция осуществляется как на уровне локального влияния микроокружения, так и на уровне не коммитированных клеток-цредшест-венников. Полагают, что каждая из стволовых клеток способна проделать по крайней мере 100 митозов, У человека общий ежедневный тт расход кроветворных клеток составляет 3.7хЮХА клеток, что соответствует 39 митозам исходной стволовой клетки. Установлено, что пролиферирующая стволовая клетка через несколько митозов переход дит в состояние покоя и начинает (функционировать другая, таким образом, смена клонов может быть обусловлена их истощением,

В кроветворной ткани человека содержатся клетки-предшественники, образующие колонии при культивировании в полутвердых средах* Метод образования колоний в агаре широко используют для определения предшественников кроветворения /25, 97/.

Жри остром и хроническом лимфолейкозе на фоне высокого содержания лимфобластов число КОЕк в костном мозге снижается вплоть до отсутствия, а в Брови значительно превышает показатель костного мозга. При ремиссии, на фоне снижения числа лимфобластов, уровень КОЕк увеличивается. Полагают, что малигнизированные клетки могут угнетать пролиферацию нормальных клеток-предшественников, в частности Ж01к /164/.

1.3. Кинетика клеточной пролиферации в норме

В организме здорового человека клеточный состав лимфоидной системы поддерживается на определенном уровне! Механизмы ауторе-гуляции координируют последствия воздействия на иммунную систему , включая антигенный стимул, влияние биохимических и гуморальных факторов.!

Известно, что в оенове нормального роста и размножения клеток лежит четкая периодичность пролиферации и покоя! Начиная с классической монографии Митчисона, были изучены характеристики фаз клеточного цикла и изменения при переходе от одной фазы к другой. Термином "время генерации" (тд) обозначают период, необ-ходимыйдая прохождения одаго клеточного цикла, однако в связи с тем, что продолжительность жизни разных клеток значительно варьирует, был предложен предпочтительный термин "интермитоти-ческое время" кинетики роста и деления нормальной клетки показало * что екороеть роста может оставаться постоянной величиной, в определенные моменты уменьшаться или возрастать, а деление приводит к появлению неодинаковых по размеру клеток, В результате уже в организме здорового человека мохут значительно варьировать дефинитивные размеры и масса клеток? Многие авторы особое внимание уделяют различиям между периодом деления и периодом, известным, как "интерфаза" (период роста между клеточными делениями): из 20-24 ч клеточного цикла лишь примерно I ч приходится на клеточное деление* Продолжительность фаз клеточного цикла в норме у человека составляет: Gj- - пресинтетический перш-од между окончанием митоза ж началом синтеза JII «* 8 4f £ - пе* риод синтеза ДНК - примерно 6 ч, Gg - премитотический период * около 5 ч, I ^ период деления Клетки, митоз -1ч шли менее*

Уже в начале 70-х годов были получены данные, что продолжи^ тельноеть клеточного цикла может удлиняться за счет ¿фазы, а суммарное время других фаз обычно величина постоянная! Было высказано предположение., что в изменчивости Gj- -фазы скрыты важные сведения о жизненном цикле клетки /28, 190, 191/s Именно в этот период решается вопрос о вступлении клетки в подготовительный период и собственно * -фазу с последующим синтезом и репликацией ДНЕ, Было установлено,, что причиной удлинения Gj -фазы служит тот факт, что в медленно цролиферирующих нормальных тканях, а также опухолях, может содержаться значительная фракция непролифержру-ющих клеток. Итак, в зависимости от характера жизненного цикла клеточная популяция додержит как - "пролиферативннй пул" * фрак» ци© роста (отношение пролиферирующих клеток к общему числу клеток в популяции), так и -"непролиферирущий пул", клетки, находящие* ся в "цролиферативном покое",

На основании опубликованных данных 0•И.Епифанова ж В,ВДер** ских сформулировали представление о существовании в клеточном цикле периодов покоя как особых физиологических состояний клетки* сохраняющей потенциал перехода в митотический цикл при действии адекватного стимула /231/. Вопросам кинетики клеточной пролифе«-рации посвящен обзор литературы /48/*

В норме, в пределах клеточной системы не встречаются фиксированные субпопуляции t пролиферирующие ш покоящиеся^ Клетка при соответствующих условиях может перейти в состояние покоя, а затем вернуться в клеточный цикл;' Однако покоящимся клеткам требуется более дательное время после окончания митоза для приближения к s -фазе по сравнению с непрерывно цролиферирущими клетками! Отсюда приобретает значение продолжительность врере* пликативного периода 4 между стимулом и началом синтеза ЖК, который сопровождается структурной перестройкой мембран, усилением транспорта низкомолекулярных веществ, синтеза негистоновых белков, матричной активности хроматина и активацией синтеза мШК. Эти изменения происходят до момента, названного пунктом огранив чения / restriction point / поеле чего клетка вступает в s -фазу и становится коммитированной к репликации ДНК. Если существует ингибитор, препятствующий вступлению клетки в s -фазу, то его действие лимитировано пунктом необратимости /point of no return/c другой стороны, представляют интерес данные о синтез зе в позднем пререпликативном периоде белков, выделенных из культуры митоген^стимулированных клеток ж принимавдих участие в инициации синтеза ДЕ!| В частности, речь идет о РС% /proliferating cell nuclear antigen / кислом белке, получившем название циклин, мол.масса = 36 К. который идентичен аукеилярному белку, участвующему в активации ДНК-полимеразы.

1»4. Иммунологические маркеры Т* и В*яслеток в онтогенезе 1»4*1^Т-клеточннй фенотип

Т-шгеточные предшественники & это клетки костномозгового происхождения , которые мигрируют в тимус , где и происходит их дифференцировка, "обучение" и созревание» Далее она заселяют периферические органы иммунной системы, локализуясь в тимус-зависимых зонах, составляя долгоживущий и активно ревдркулирущий пул Т-клеток» И хотя к настоящему времени накоплена значительная информация, точная природа претишческих клеток-предшественников неясна: ими могут быть и щультйпотентные гемопоэтичеекие стволовые клетки, и лимфоидные стволовые клетки, и коммитированные Т^клетки» 1ще в период эмбриогенеза в вилочковой железе жри участии типического эпителия создается особое шкроокружение для лим-фоидпнх клеток»: Постепенно, за счет ЬоттЛпв ^эффекта и под влиянием стромальных элементов мигрирующие в тимус лимфоциты при-' обретают способность реагировать на стимулы ¡шифоокружения, экспрессировать мембранные антигены»

Ж настоящему времени с помощью ноноклональных антител были скрыты многочисленные антигены, характерные как для стадий внут-ритишческого онтогенеза* так и для субпопулящш зрелых Т-клеток /295/» По специфичности используемые монокжоналыше антитела раз* деляют в зависимости от этапа дифференцировки Т-клеток: моноАт к антигенам тимоцитов, зрелых Т-клеток, их субпопуляций, актишро*-ванных клеток» антигенам» выявляемым на всех стадах дифференвд-ровки. К последним относят СД2 (ор 50), который идентичен "рецептору для эритроцитов барана", или Е-рецептору.

СД2 « маркер обнаруживают на зрелых Т-лимфовдтах (практичен ски на 100$ Т-клеток, составляющих ©коло 70$ лимфоцитов периферической крови), 80-100% тимоцитов и 20-30$ клеток селезенки; на большинстве тромбоцитов» а также на СДЗ~ -клетках. Метод определения: Е-розеткообразование или моноАт /303/, среди которых известны и отечественные образцы /143/. Кнастер содержит антитела, реагарувдие по крайне мере с З эпитопами антигена, причем один из них, к которому направлена большая часть антител, участвует в Е-розеткообразовании, а другой определяется только на активированных и незрелых Т-жмфоцитах; на покоящихся клетках он блокирован или слаб© выражен. Полагают, что данный маркер принимает участие в неспецифической активации Т-клеток, что важно для про** цесса созревания тимоцитов, поскольку индукция пролиферации тиши* чесни: клеток происходит до начала экспрессии антигенного Т-кле-точного рецептора (TcR), Внеказан© предположение, что аутокринная активация тимоцитов через механизм экспрессии Tel приводит к элиминации клеток в тимусе, а альтернативный путь активации через молекулу СД2 « к дифференцировке и пролиферации. В качестве лиган-да для 0Д2 называют молекулу ЕЕА*3. Альтернативный путь активации клеток наблюдают только при использовании двух видов моноАт к разным эштопам СЩ2/61/.

Среди маркеров зрелых f «лимфоцитов человека особое место принадлежит молекулярному комплексу ТЗ/& , который состоит из антигена СДЗ и Т-клеточного антигенного рецептора; МоноАт кластера СДЗ реагирует с комплексом белков, представленным -, 'За -, <ё ^цепями* % ¿цепь è этогликопротеш с мол.массой 25^29 К, полипептидная часть коюрого - 16 I, S -цепь - также гликопротеин с мол.массой 20 I и полйпептидной частью 14 К, Ъ -цепь 4 это гидрофобный белок, 19 К. Антиген СДЗ эксирессирован на мембране зрелых тимоцитов и всех Т-лимфоцитах периферической крош человека! Реагирующие е СЩЗ^антигеном моноАт оказывают целый ряд биологических эффектов на популяцию Т-клеток - от индукции прожферации покоящихся Т-клеток, подавление ответа на антигены активированными Т^клетками до угнетения эффекторной функции, осуществляемой щтотдксическиш Т^клеткаш^ Блокада комплекса ТЗ/Гс антителами антаЩЗ лишают клетку отвечать на антиген.

Другой компонент этого комплекса, Т-клеточный антигенный рецептор (TcR) 4 это гетеродимер с мол.массой 90 К, состоит из 2 полипещщных цепей с мол.массой 43 и 51 К. Обе цеш содержат вариабельный и константный участки /299/» Выявлено 3 гена Т-ре-цептора, кодирующие оС г fo ж X -Депи. В каждом из: .них определены ¥ - (вариабельный), j - (связывающий) и . (константный) сешенты. Кроме того, для fo -цепи (хромосома 7) дополнительно Д-сегмент. В онФогенезе экепрессируетея ^ ¿ген, затем Д , далее аО г В процессе экспрессии гены Т-рецешюра подвергаются перестройке, в результате которой последовательно объединяются Д* 3 , Т'.* и СР©егменты| В мех^зме генной реаранжировке участи вуют определенные типы ШК, а также ДНК-ферменты, в частности эндонуклеазы! ^аранжировка г^ов ^ -цепи Т-рецептора может быть ассоциирована с реаранжировкой Ij-генов /78/^ В связи с этим f ^ не может служить маркером при установлении линейной принадлежности клетокщ но позволяет опредежть жх клонажьность /306/. Установлено, что в тимоцитах содержится значительное количество иРНК д~цеш, Было доказано также существование дельта-цепи рецептора, 40 К, которая присутствует в составе нековалентно связанного димера с £ -цепью. В периферической крови циркужруют Т^клетжи с антигенными рецепторами, состоящими из и пей, до Ь% клеток экспрессируют рецептор типа ос -Д ж ¿"-дельта^

К штигенам, выявляемым не зрелых Т-клетках, относят Щ5 /14, 61, 256/. Это шикопротеин с мол.массой 67 К, который определяется на мембране тимоцитов, причем на поздних стадиях даффе* ренцировки клеток в тимусе. Наряду с этим маркер экспрессируется в незначительном количестве эти клетки присутствуют в лимфатических узлах /210/. Физиологическая роль Щ5 обсуждается; увеличевета /256/.

На зрелых Т«*клетках с разной степенью выраженности (до 85%) определяется СД7-антиген. Его мол. масса, измеренная разными методами, соответствует показателям 40 и 41 К, что характеризует антиген как дисульфидно^связанный димер. Его присутствие доказано на тимоцитах, причем, что следует подчеркнуть, это наиболее ранний маркер Т^клеточного онтогенеза. Наряду с протимоцитами и Тэдютзшш моно&т к СД7 реагируют с клеткаш фенотипа ни-Т/ни~В. В делом, детальный иммуношорфолошческий анализ лимфождвой ткани человека продемонстрировал ограниченность СД7~эксирессии клеткаш Т*ряда Д4, 61/.

Представляется интересным факт, что в онтогенезе СД7 экспресс сируется до реаранжировки генов Д-цепи Т-клеточного рецептора, что может ассоциировать с нарушением процесса пролиферации и дафференцировки Т^аимфоцитов /295/.

Значительная роль в фенотипическом репертуаре нормальных Т-клеток принадлежит антигенам СД4 ж СД8, с помощью которых идеи«* тифищруют клетки иммунорегуляторного звена хелперы/жндукторн и супрессоры/цитотоксические клетки /302/. Соответствующие сведения суммированы в обзорах литературы /14, 61/. В онтогенезе СЩ4-анти-ген, мол* масса 55 К, эксггрессируется на всех лимфоцитах, однако верхностннх внявлен в эибрйетальвой селезенке, что, как пола* гают процесс становления иммуяокомпетентности плода* Кроме того, затем на части клеток утрачивается и сохраняется на клетках с фенотипом СДб"*, Его обнаруживают примерно на 2/3 Т-лимфоцитов периферической крови здоровых лиц. Наряду с этим в норме на единичных Т-клетках периферической Крови и костного мозга экспрес-сируются одновременно оба маркера. При изучении структуры СЩ4-маркера было установлено, что внеклеточный участок состоит из 4 последовательно соединенных сегментов, кодирующие гены которых относятся к ауперсемейству 1^-генов, При контакте с антиген» презентирущей клеткой СД4-маркер служит участком связывания не» полиморфных детерминант белков главного комплекса шстосовмести-шоети II класса (1а-Аг). Ген, контролирующий продукцию антигена СД4, локализован на хромосоме 12. Данные указывают на то, что одним структурным геном контролируется экспрессия эпитопов антигена СД4 на; лимфоцитах и моноцитах, однако в последнем случае экспрессия выражена довольно слабо. Клетки-хелперы могут быть определены с даишда, отечественных Фбразцов ноноАт ИЮ-49 1рп<шша, которые обладают отличительными свойствами от известных моноАт к СД4 /13, 14/.

СД8-маркер представлен двумя цепями, 33 К и 33 К, соединенными дисульфидно! связью. Внеклеточный участок образован двумя доменами, гены которых гомологичны генам У и С-доменов иммуноглобулинов. Антиген СД8 экспреесируетея примерно на 1/3 Т-клеток периферической 1ф0ви. При контакте с клеткой-мишенью маркер служит в качестве рецептора неполиморфных детерминант белков главного комплекса шстосовместимоети класса I (ЕМ* А,В,С). Антиген СД8 обнаружен также на 80% тимоцитов, кортикальных и частично медуллярных /143 , 322/. Учитывая гетерогенность популяции СД8+-кле-ток, были предприняты попытки разделить лимфоциты по их функциональной принадлежности * супрессоры от цитотоксических клеток. Это удалось с помощью моноАт 9.3. Если почти все СД4+-клетки были 9.3-положительныши, то СД8+ «популяция представлена 9.3+ и 9.3" -субпопуляциявд, последняя из которых включает предшественники супрессорных Т-клеток.

Среди маркеров ранней фазы созревания тимоцитов определен* ное место занимает СД1, состоящий из нековалентно связанных оС-*цепи и 2'""шкРогло^Улина /295/. По мол. массе различают 3 варианта ос «цепи: СД1а (|р49), СД1в (<^р47) и СД1с (|р43) . Доказана гомология аминокислотной последовательности ос-цепей СД1 с продуктами ГШ? класса X (ИМ -А,В,С) и в меньшей степени класса II ШМ - ДЫ - Д&).

Ранее описанный как Тас**антиген, СД25-маркер, представляет собой гликоцротеин с мол. массой 55 К и известен как низкоаффинный рецептор 11г*2. В сочетании с белкш мол; массы 75 Е СД25 образует высокоаффинный рецептор 11-2. Его экспрессию выявляют на активированных Т-лимфоцитах /226/, а также в меньшей степени В-лимфоцитах. € мембраны последний, пс^вщдимому, рецептор может освобождаться и присутствовать в сыворотке в растворимой форме (белок с мол. массой 45 К). Рецептор обнаружен и на моноцитах, обработанных ¿'-интерфероном.

Первоначально известный как маркер Т-клеток (Т 10) антиген СД 38, мол. масса 45 К, относят и к маркерам В-клеток, поскольку его выявляют как на 15$ Т-лимфоцитов периферической крови, 70$ тимоцитов, так и в цитоплазме плазматических клеток.

Следует отметить, что активированные Т-лимфоциты несут целый ряд поверхностны»структур, отсутствующих иж слабо выраженных на покоящихся клетках. В частности, для стимулированных клеток характерна экспрессия рецепторов да 11-2, транеферрина (ОКГ 9), НЬА-ДН, инсулина; Подробныйанализ имщунолошчееких маркеров

Т-клеток представлен в обзорах /14» 61, 295/."

1.4.2. В^клеточный фенотип

В онтогенез© клетки ^клеточного ряда генерируют в печени плода и, как полагают, селезенке. В раннем эмбриогенезе, на 8~й неделе внутриутробного развития в печени обнаруживают предшественники В^клеток, составляю^® более лимфоидных элементов. 1а 8^15 неделе плода в печени формируются пре-пре-В ж пре-В^клет-ш. О 15^16 недели развития функцию дифференвдровки В-лимфоцитов выполняет костный мозг, хотя существуют указания, что данный процесс происходит и в селезенке 16-21-недельного плодам

Созревающие В-лимфоциты мигрируют из костного мозга в периферические органы иммунной системы, где при контакте с антигеном завершается процесс дифферейцировки В-^клеток сначала в плазмоцид тоидную и окончательно в плазматическую клетку , секретирувдую иммуноглобулины. Примечателен факт, что до контакта с антигеном дифференцировка Вадеток приостанавливаетсш на клеточной мембране - это отференвдровки пре-В в В^клетку служит перераспределение генов тяжелых цепей иммуноглобулинов.1 Структуре генетических локусов Ij в онтогенезе |i зрелых В-тслеток посвящено значительное число обзоров и с.штей /44 , 61, 130, 131, 221, 275, 276).

В период онтогенеза происходит 2 последовательных слияния отдельных сегментов генов Т<| : V -Д ♦ J генов Коцепей, а затем

V -J «»генов I* -цепей. На этом же этапе объединяются 7 сегменты Нецелей с различными типами Со -генов -С tf ,С & С у ж ¿дельтаР <3 3* соС. Подобные перестройки происходят в генах с^т и ¡fr-<тжеЖ Т^клеточного рецептора и, что вызывает ©ео4 бый интерес, при "инверсии фаз" у сальмонелл;

На В^коммитированных клетках экспрессированы 1а?*подобные антигены именно на этой стадии дифференцировки из фрагментов формируется ген Н-цепи /276/^ Далее экепрессируетея сОШ-антиген с последующим появлением JA «щеш 1| в цитоплазме пре*-В-клеток /353/* Экспрессия поверхностного 1<р*рецёптора на незрелых В~лимфоцтах предполагаем синтез Н-цепи в мембранной форме, включающей 41 аминокислотную последовательность (гидрофобный "хвост")* При этом контроль осуществляется фрагментом уц -гена» а регуляция на уровне сплайсинга про мРНК /2/,

Л результате антиген-не зависимой дифференцировки генерируют В-клетки, которые определяются как покоящиеся, с фазой клеточного цикла <30, Контакт с антигеном елушт стимулом к переходу в фазу , усиленному синтезу нуклеиновых кислот, экспрессии рецепторов к факторам роета и дифференцировки В-клеток.

Широко иепользуешм маркером В^лимфоцитов остается комплекс ЕАС, выявляющий клетки, несущие рецепторы к СЗ-компоненту комплемента. Речь идет о СИ (для СЗв) и CS2 (дш C3d) рецептов pax, которые также идентифицируют с помощью моноклональных антител: Е II, ЗА9, То5 или В2, НВ5, ABI, АВ2, АВЗ, ÄB5, ВИЗ, соответственно Д13, 24С, 347/* ПоЩгченм данные, чт о ОЩ выявляв етея на пре-В, , —4 : as. грз-Б, а на антиген-зависимнх стадиях дифференцировки /ИЗ, 246, 348/. положительные В^лимфоциты здоровых лиц несут рецепторы аналогичные ны для моштитов, макрофагов, гранулоцитов и части /160 , 292, 302/. На ^К-клетках и гранулоцитах определяется Wc у-рецептор для агрегированного 1<р* Информация о моноАт к этому рецептору ( bemll, TEPI3, В 73.1, 3<*Е, IIa, IIb) представлена в обзоре /14/. всех периферических довлвххах$ а также на предшествен* шках в костном мозге присутствует антиген СД 19» высокомолеку** лярный гликопротеин с мол, массой 95 К* Это один из ранних мар* керов, позволяющий отнести лимфоцит к В^клеточному ряду« Он появляется даже раньше СД 10, которого считает ток, ж до появления щтоплазматического

1а зрелых Вэдшмфоцитах и их предшественниках ОД 24 ¿антиген» состоящий из -géx цепей с мол. массой и

65 Ж ■'■".

Антиген , выявляемый моноАт группы ОД 20 , позволяет идентифицировать В^клетки периферической крови. В онтогенезе он появляется на более поздних сроках дифференцировки чем СД 19 и СД 10. Это негликозилированный фосфопротеин, мол. масса 35 К, его связно вание е моно Ат анти**СД 20, как полагают , может повышать чувствительность покоящихся В^лимфоцитов к факторам роста и привести к стищуляции пролиферации или способно имитировать действие лек-тинов и иривеетж к фшфорилированию р 35. Вероятно, СД 20 -анти* ген представляет субстрат для протеинкиназы С и, по мнению ряда авторов, участвует в передаче сигнала от мембранных антигенных рецепрторов к ядру клетки. Антиген ассоциирован с mlg.

Экспрессия СД 37, мол. масса 40«*45 К, более выражена на В^клетках, чем на других лейкоцитах. В онтогенезе этот антиген появляется позже, чем СД 19 и Щ 10.

Антиген СД 22 присутствует на В-клетках перферической крови, выявляется на большинстве, но не на всех непролиферирущих В-лимфоцитах и утрачивается при активации клеток in vivo и in vitro . в онтогенезе этот антиген, состоящий из двух суб-единиц с мол. массой 130 Ж ж 140 К, появляется только на поздних стадиях дифференцировки пре-В. Данные указывают на то, что обраг ботка антителами анти-СД 22 усиливает анти«1 ^¿антител на непролиферирущие В^клетки, а роль поминает аналогичную антигена СД 3 на Т-клеткахг активированных В-клеток), СД 39, £Щет40, СД38. 1»5»

22 на?"* селекции и клеточной гибели в онтогенезе

В последние года значительное внимание уделяется механизмам клональной селекции и клеточной гибели в онтгенезе. I таким механизмам относят алоптоз, индуцированную активацией запрограммированную гибель клеток, А1СД /184,366/.

Адоптоз действует в эмбриогенезе, при регрессии опухоли, элиминации аутореактивных Т-клеток в тимусе. Биохимически данный феномен описан как процесс фрагментации ДНК Саг-зависимыми эндо-нуклеазами. Это послужило основанием считать» что алоптоз - общая форма клеточной гибели эукариот /305/.

Вероятно, в норме генерирует зрелая, функционально активная иммунокомпетентная клетка с ограниченным сроком жизни, которая через активаци© погибает,чт@ етосредуется механизмом апоптоза. Такая клетка способна к распознаванию антигена, активации, усилен нию активности ДЕ1*энд®нуклеаз»1е исключено^ что нарушение нор^ шального процесса пролиферации и дифференцировки, неспособность клетки к активации и усилению активности ДНЕ^фермента могут отменить или "отсрочить" апоптоз, сделать его "неэффективным". В этом плане вызывают интерес "вечно живые" лейкозше клетки, экспресси-рувщие дифференцировочные антигены. Однако щ не встретили в доступной нам литературе подобных данных:»

0 другой стороны, всаженному или ускоренному апоптозу подвержены иммунокомпетентные клетки» опосредующие иммунный ответ ж атакующие опухолевые клетки или

-клет» образом, в процессе регулируемой пролиферации и диффе-ренцировки иммунокомпетентная клетка генерирует в фенотипичееки зрелую, функционален© активную, способную к активации и конечном итоге запрограммированную на гибель через активацию с последующей фрагментацией ДНК. Полагают , что интерфазная гибель лимфой йдвдх клеток « это активный, генетически зацрозтрамшрованный процесс /Ш/% и дифференцировки, появление в периферической крови фенотипичееки незрелых клеток, экспрессжрущих эмбриональные антигены, функционально неактивных* неспособных к активации может отражать изменение на внутриядерном уровне, в частности, дерегуляцию системы эндонуклеаз, ответственных за

2. ХАРАКТЕРИСТИКА. ИМУНОКОМГМЕНТНЫХ КЛЕТОК ШН ностей кинетика клеточной заболеваниях отмечают ряд особен«? й клетки : удлинение времени генерации, необходимое для одного клеточного цикла; нарушение смены фаз клеточного цикла;

2.1. Еиперпродуквдя и редуцированная гибель клеток

Известно, что при лейкозах я лимфомах показатель продукции лимфоидннх клеток превосходив показатель их гибели:. Если допустить, что появление злокачественно трансформированных клеток влечет за собой усиление процесса клеточной гибели, чем продукции, то в конечном итоге опухолевые клетки должны элиминировать. Ве4 роятно, высокий уровень продукции малигнизированных клеток при ЛЗ Ф это один из факторов, епоеобных противостоять важному механизму регуляций клеточной пролиферации и клональной селекции, или апоптозу; Феномен "пролиферативного самоубийства", активности суицидальных факторов /202/ получил в последние годы более широкий резонанс в связи с явлением индунзарованной активацией запрос граммированной гибели клеток, ЖЕОД, изученным на клетках больных СПИДом и Т**клеточныхШбридомах /273 , 337/.

Основываясь на публикациях, посвященных А1СД, да предположили , что другим фактором, способствующим "клеточное бессмертию" при ЖЕЗ может быть нарушение в системе функционирование генома, в частности, снижение активности Са-зависимой эндонук-леази, опосредующей апоптоз.

Гиперпродукция малигнизированных иммунокомпетентных клеток может ассоциировать с разными вариантами нарушений кинетики пролиферации:

1 - нормальная продукция и редуцированная гибель клеток;

2 & увеличенная продукция и редуцированная гибель клеток;

3 увеличенная продукция и нормальный показатель клеточной гибели$

4 «¿ значительно увеличенная продукция и увеличенный показатель клеточной гибели.

Полагают, что вариант 2 характерен для ХМ, НХ1, И,

3 « дая с низкой степенью выраженности малжгнизации,

4 '4 для лимфомы Веркитта погибших клетог) ¿ вариант I для НХЛ с нодулярным типом пролиферации. Не исключено, что возможен переход от менее в более выраженную стадию малжгнизации сопровождаемую изменением кинетики клеточной пролиферации, например, переход от 1,2*3 вариантов в 4 /202/, Показатели га-перпродукции лимфоцитов при НХЛ указаны в таблице I. увеличенной продукции у больных 1X1 и III (обзор, клеток

1. Клеточный состав лшм» фоидной сиетемн

2, Процент крупных клеток л/у

3* Общее число крупных "блаетов"

4, дэ^есуточное поступление в кровь вновь клеток

II

Д2 ю

15

13

В среднем 24 ч

300-1500/мкл больные лимфоплазмацитоидной и хроническим лимфолейкозом|

Число вновь продуцируемых клеток в определенной мере зависит от размеров пролиферирущего пула, известного как ^фракция роста". Обычно эта популяция составляет 1-5% клеток лимфатических узлов ж варьирует в зависимости от степени их активации /349/. При ЛПЗ фракция роста в своих размерах колеблется от нор«» шальных пределов до 40$/ Изменения касаются и размеров лимфоид-ных клеток: жри ХЛ1 ж НХЛ описаны клетки преимущественно одного или двух видов в отличие от ставлен малыми (высокий уровень) , уровень) формамиНормальный лимфатический узел человека ©одер** жит ©кол© 10$ крупных базофаяыдах ; клеток^ Примерно столько же лимфобластов" в лимфатическом узле больного XII. С другой стен-роны, жри НХЛ, происходящих из клеток зародышевых центров, а также при лимфо- и ишунобластных лимфомах практически весь состав лимфатических узлов классифицируют как лимфоидные клетки средних или крупных размеров.

Несмотря на значительную степень активавди "фракции роста", деление клеток герминативных центров лимфатических узлов в конечном итоге приводит к образованию мелких клеток, обладающих ограниченной или сниженной способностью к пролиферации, 1 результате основной пул циркулирующих клеток при ШйГ в XII представлен лимфоцитами, с нфзш митотическим индексом, у которых, как полагают , "резерв11 клеточного деления исчерпан.

2.2. Удлинение времени генерации

При разных клинических формах ИЗ общее время, необходимое для прохождения одного клеточного циклам и время синтеза III варшрувз*. Так,если в норме Tg. составляет в среднем 24 ч, максимум 40 ч (от 8 до 40), то при III может достигать 96 ч, при 011 215 ч, как указано в телице 2.

Таблица 2

Показатели времени синтеза ДЕК (Ig ) и времени генерации (Тг) в норме и при ЛПЗ (обзор, 202)

Группы обследуемых вРемя синтеза ЦК: 3 Время генерации:

Т , час а * . час

Здоровые лица 10(7^12) 24(8-40)

ХМ 12(11-14) 28(22-96)

HXI 12(1014) 48(38-160)

ОМ 26(10-47) 48(17-215)

Ш 18(1-20) 57(33-156)

253» Нарушение смены фаз клеточного цикла

При некоторых клинических формах ЛПЗ в значительной мере пролонгирована Gj -фаза, достигающая нескольких месяцев или лет» При этом клетки практически находятся "вне цикла" или в состоя® нии "пролиферативного покоя" , а их гибель наступает в интерфазе (известный феномен "интерфазной гибели клетки")» Опыт клинических и экспериментальных исследований позволил сделать заключение, что опухолевые клетки могут "выходить из клеточного цикла" как на стадии Gj, так и на стадии Gg. Преобладание заблокированных на определенной стадии клеточного цикла "покоящихся" клеток дало основание разработать схему развития разных морфологических и клинических форм ЛПЗ /347/. Согласно представленным данным, лимфома, образованная малыми лимфоцитами» и XII ассоциируют с удлинением Sj *фазы, в фазе синтеза ДНК возможна трансформация малых лимфоцитов В^клеточного ряда в характерные для ряда не-ходжкинских лимфом cleaved -формы (лимфомы, образованные клетками герминативных центров)* с изменениями в Gg-фазе ассоциирует лимфогранулематоз и некоторые лимфомы» в фазе штоза » множеств венная шелома» Одновременно имеются указания на наличие в Gj-фазе преивдественно диплоидных клеток, Gg - тетранлоидных, что может иметь значение при оценке аномальной клеточной пролиферации (рис#2). Таким-образом, преобладание м циркудирувдеи пуле лимфоцитов указанных клеток, находщихея в &0-, Gj-, §2*фазах клеточного цикла, может быть харатерным цри знаком развития ЛПЗ и одновременно служить точкой отечета при оценке эффективности проводимого лечения»

Учитывая возможную ассоциацию злокачественно трансформированных лимфоцитов со статусом "покоящихся" клеток, представляет* ся целесообразным рассмотреть свойства последних» Эти вопросы

IllUUMWM ÜAPMHI'A H-KJM^m ämom c *A30fl kjjetowo ipcia

SMALL LYMPHOCYTIC LYMPHOMA

CLEAVED Fee LYMPHOMA

NON-CLEAVED Fee LYMPHOMA BÜRKITT1s LYMPHOMA HODGKIN*s DISEASE

Plasma-cell 0 s o o o o iO o

CO J3 o ¡s)

Sc S

§ W o £D a »a

J s o so •-i a

O t-3 a 05 § ^

05 S

CD

CO o rfj o • № b o immuhohlastic sarcoma (b)

MULTIPLE MYELOMA

PLASMACYTOID LYMPHOCYTIC LYMPHOMA oa

-v2 подробно освещены в обзорах /48, 190, 191/.

Метаболическое состояние "покоящейся" клетки оценивают тер** мином "активное". Считают, что отмечаемое снижение размера клеток и ядра сопряжено с уменьшением содержания ШК и белка, конденсацией митохондрий, вакуолизацией цитоплазмы и уплотнением хроматина.

Предполагают, что репликация ЦК и прирост клеточной массы находятся иод контролем разнмх факторов /191/. Покоящиеся клетки первоначально реагируют только на такие внешне сигналы, которые вызывают прирост клеточной массы. Но мере увеличения размеров клетки на ее поверхности включаются рецепторы, воспринимающие сигналы для индукции синтеза ДНК и, наконец, включается 3 группа рецепторов, которые воспринимают ежгналы дая митоза.

Полагают, что состояние покоя сопровождается сдвигом транс* - мембранного потенциала, агрегацией внутримембранных частиц, снижением текучеети липидов, изменением экспрессии антигенов. Число рецепторов для различных лигандов варьирует, тем не менее в норме покоящаяся клетка обладает готовностью к восприятию митогенно-го стимула и число рецепторов дая факторов роста может оказаться выше, чем на пролиферирующих клетках.

Структурные компоненты хроматина претерпевают некоторые изменения при переходе пролиферирующих клеток в состояние покоя. Так, регистрируемые явления направлены главным образом на конденсацию хроматина. Продолжается синтез шстоновых белков, в частности отмечается преимущественный синтез в покоящихся клетках фрако ции Н2А&гиетонов и Н1, субфракции гистона Н1, синтез Н2 и НЗ-гис-тонов стабилен и связан с нереплицирущейся ДНК.

Указывая на структурные перестройки, исследователи предполагают, что комплекс ДНК-белок может находиться в двух альтернат тивных состояниях - стабилизированном и релаксированном. Когда покоящиеся клетки получают стимул к пролиферации» их хроматин деконденсируется и его матричная активность начинает быстро возрастать,. Авторы связывают этот процесс с изменением концентрации электролитов, находящихся в клеточном ядре»

Переход клетки в состояние покоя сопровождается, с одной стороны, инактивацией генов, контролирующих пролиферацию, е другой экспрессией генов* обеспечивающих состояние дифференциров-т клеток данного типа. В покоящихся лимфоцитах человека происходит снижение екорости синтеза, процессинга и транспорта поли(А)+ мРНК, заметно снижено количество тШК, выявляются белки, специфичные для таких кжеток, в частности, белок теплового шока с мол, массой 70 I, определяемый методом блот-шбридизации РНК.

Процесс обновления белков мо'жет происходить быстрее в покоящихся клетках по сравнению с цролиферирущими. Ускоренный обмен макромолекул и наряду с этим повышение способности к экскреции некоторых продуктов метаболизма относят к характерным чертам покоящихся клеток.4 Это относится к шстоновым белкам IIA и HI , не входящим в состав нуклеосом, которые обновляются быстрее, чем шстоны нуклеосом /253/.

Известно, что покоящиеся клетки отличаются снижением интенсивности синтеза нуклеиновых кислот, одновременно снижается активность ферментов, участвующих в их метаболизме. Как было показано для различных типов клеток, в состоянии жролиферативного покоя значительно снижается активность высокомолекулярной ДВК-полимеразы оС , ответственной за 90% тотального синтеза ДНК. Увеличение активности этого фермента, участвующего в репликации Д1К, возможно при митогенной стимуляции. Активность низкомолекулярной ДНК-полимеразы, не участвующей в репликации Iii, не зависит от процесса пролиферации.

В покоящихся клетках снижается и активность тимидинкиназы, дезоксивдтидинкиназы, что контрастирует со статусом пролифериру-щей клетки. Активность пуриновнх киназ может быть снижена незначительно, что объясняют тем фактом, что эти ферменты не лимитируют скорость биосинтеза ДНК.

Особое значение в репликации ДНК придают топоизомеразам, катализирующим разрыв и восстановление фосфодиэфирных связей в молекулах ДНЕ. Топоизомеразу I, вызывающую временные одноцепо** чечные разрывы в молекулах ДНК и топоизомеразу П, вызывающую двухцепочечные разрывы, считают специфическими маркерами клеточной пролиферации. ермент полиАДР-рибозо-полимераза способен сшивать молекулы жетона I, локализованные в межнуклеосошом пространстве; способствует конденсации хроматина, которая сопровождается остановкой пролиферации клетки. Напротив, увеличение активности этого фер~ мента, предшествующее началу синтеза ДНЕ, наблюдается при ФГА-стимуляции (обзор, 48).

Следует отметить, что даже у временно непролиферирующих клеток подавляется активность основных ферментов, участвующих в биосинтезе белка, а с другой стороны, усиливается активность ферментов катаболизма и ферментов, принимающих участие в модификации хроматина. Не исключено, что аналогии могут иметь место при ЛИВ.

Вызывают определенный интерес данные о возможной ассоциации нарушений клеточного цикла при лимфопролиферативных заболеваниях и старении. Известно, что способность клеток к пролиферации и дифференцировке регулируется соотношением уровней циклических нуклеотидов цАМФ/цШФ. 7 лиц преклонного возраста резко лт , ./*оссийаи~

•^чвииоя снижено соотношение цАМФ/цГ®. Этот факт 50«кратного снижения индекса объясняется усилением активности аденилатциклазы и снижением активности гуанилатциклазы. Предполагают, что различием уровней циклических нуклеотидов обусловлено изменение фосфорили-рования гистонов в стимулированных клетках, что приводит к нарушению синтеза нуклеиновых кислот и снижению пролиферативного ответа»

У лиц преклонного возраста отмечено удлинение фазы 0| клеточного цикла, а в единичных случаях имеет место блокада в (^«фазе. В результате снижается способность клето^-предшеетаенников пролиферировать ж дифференцироваться в зрелые иммунокомпетентше клетки, совращаются размеры каждого клона, замедляется скорость созревания эффекторных клеток /23/. Нарушения клеточного цикла и внутриядерных факторов сопровождаются возрастным иммунодес

ЦИТОЩ»

2*4.

Привлекает внимание проблема рециркуляции клеток при нарушении клеточного пролиферативного цикла.

Известно, что большинство зрелых лимфоцитов являются рецир-кулирувдими; непрерывно циркулируя из лимфы и периферической крови в органы и ткани организма. При этом скорость рециркуляции в определенной мере зависит от .стадии дифференцировки данной ноустановлено в эксперименте /202/, В-клеткам, вероятно, необходим более длительный период времени, чем Т-клеткам, чтобы мигрировать из крош в рудной лимфатический проток, а рециркуляция клеток памяти может быть более интенсивной, чем других популяций.

Ревдркулирущие лимфоциты специфически связываются со стенками расположенных в лимфоидных органах носткаииллярных высоко* эндотелиальных венул. Это избирательное взаимодействие лежит в основе регуляции транспорта лимфоидных клеток. Полагают, что процесс избирательного распознавания посткадшшгрных венул имеет место на разных стадиях дифференцироввж лимфоцитов, регулируя заселение органов определенными субпопулявдями лимфоцитов. Способность распознавать и взаимодействовать с посткапиллярными вы-еокоэндотежальными венулами через специфический рецептор развивается в процессе созревания Т<* и B-клеток, которые связываются ; на поверхности венул более эффективно, чем клетки-предшественники костного мозга и тимуса*

Преобладание в периферической крови фенотишчески незрелых лимфоцитов, несущих стадиоспевдфеческые дифференцировочные антигены, указывает на нарушение способности взаимодействия е поверхностными детерминантами посткагшшярннх венул и в конечном итоге на дерегуляцию распределения клеточных популяций жри ЛШ.

При ХМ были обнаружены количественные различия лимфоцитов в крови и грудном протоке: у больных с высоким лейкоцитозом отмечена недостаточность лимфоидных клеток в грудном протоке ж, таким образом, долгоживущие лимфоциты при XU были неспособны рециркулжровать подобно долгоживущжм лимфоцитам здоровых лиц в системе кровь-лимфа-кровь. Были опубликованы данные, что 20% клеток при XII находятся в пержваскулярных пространствах /138/.

0 перераспределении популяций Т*> ж В-лимфовдтов при злокачественных неходжкинских жмфомах разного шетолошческог© варианта в лимфатических узлах ж периферической крови свидетельствуют результаты наших предыдущих исследований /160/.

При ЛМ относительное содержание 0КГ-4+ -клеток может быть значительно выше в лимфатических узлах* чем в селезенке и периферической крови больных. Если соотношение Т-хелперов/Т-сужрес-соров с фенотипом ©И? 4/8, в периферической крови больных составило 1,82, то тот же индекс жри исследовании клеток лимфатических узлов соответствовал значению 3,03 при норме 2,2+1,1, что было установлено авторами жри обследовании 20 больных ЛГМ с разными стадами процесса и 15 доноров /150/.

Таким образом, накопленная к настоящещу времени информавдя свидетельствует о выраженном нарушении кинетики клеточной пролиферации при лейкозах и жмфомах, Наряду с увеличением продукт ции клеток, удлинением фаз клеточного цикла,; перераспределением популяций и субпопуляций имщунокошетентных клеток в системе кровь-лимфоидные органы, отмечается редукция клеточной гибели и преобладание долгоживущих лимфоцитов. Это предполагает, что имеют место, с одной стороны, признаки эмбриональной пролиферации, с другой, нарушения на внутриядерном уровне, ответственные за де~ регуляцию активащи и отмену запрограшированной гибели иммуно-компетентных клеток.

3* ФШ0ТЙ1ЖЧЕСЕЙЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЙММУНО

Лшмфо- или иммунопрожферативные заболевания демонстрируют выраженное нарушение механизмов иммунорегуляции, Это дало основа« ние называть их "болезнями иммунорегуляции" /61/.

В Hoj)Me система ишунорегулявди предполагает действие сбалансированных механизмов, обеспечивающих распознавание антигена с участием рецепторных структур; * передачу еигаала внутрйклеточно через лиганд-рецептор и вторичные меееенжеры; процесс активации клетки с участием медиаторов , факторов роста; контроль за дифференщровкой и пролиферацией лимфоидных клеток; реализацию генетически контролируемого иммунного ответа /68, 69, 76/.

Имеющаяся на сегодняшний день информация свидетельствует о том, что при злокачественных формах лимфопролиферативных заболеваний нарушаются указанные выше механизмы как на клеточном, так ж на внутриядерном уровнях.

3.1. Нарушение иммунологического распознавания

Этой проблеме посвящены многочисленные фундаментальные исследования. Так, распознавание генетически чужеродных структур выражается в специфической рецепции лиганда-эдтигена лимфоцитами В^ и Т*фядов и фагоцитирующими макрофагальныш элементами. Ври этом распознавание антигена В-клетками осуществляется рецептора ми с высокой степенью структурного подобия сывороточнш иммуноглобулинам; Т-хелперами 4 с помощью рецепторов, которые структурно близки Ь-цепям и имеют в своем составе вариабельный ( У ) район, формирующий лигандсвязнваедий центр; Т-супрессора-ш - с помощью рецепторов, в формировании лигандсвязывавдего центра которых участвует район, имеющий структурное - подобие с Т «районом НАцепей В кодировании каждого из белков, участвующих в иммунном распознавании, определенная роль отводится семейству у «генов /76/.

При лейкозах и лимфомах механизм распознавания изменяется в связи с отсутствием или модификацией экспрессируемых на лимфоцитах антиген-распознащих и одновременно антигея-связыващих детерршанту Об этом в первую очередь свидетельствуют февотшш* ческже особенности клеток при ИЗ, что имеет несомненную диагноз стическу® ценность /14» 18, 61, 192, 193, 197, 198, 309, 347/.

Одно из главных нарушений * слабая выраженность антигенов зрелых Т-клеток. Антиген ОД 2, или Е-рецептор, выявляемый практически на 100% Т-лимфоцитов здоровых лиц, экснрессируется в половине случаев Т-ОЛЛ. Число СД 2+ -клеток значительно снижено при НХЛ, ХЛЛ (B-тип), а также при лимфоме Беркитта,

Антигенспецифический рецептор Т-лимфоцитов, СД 3 -комплекс, или ТЗ/Т1 , это основной функциональный маркер данной популяции. Как и СД 2, он слабо выражен при B-типе ЛШ, а также при некото** рых формах Т-клеточной природы. Частичная или полная утрата (маскировка) T3/Î& затрудняет иммунодиагностику некоторых форм неходжкинскжх лимфом или болезни Ходаина. Отсвда практическую значимость приобрели методы молекулярной биологии и детальный анализ генов TelU

Как было указано выше, Т«кпеточный рецептор (ïcR) -гетеро-димер с молекулярной массой около 90 К, состоящий из 2 пожпеп-тидных цепей (мол? масса около 40-50 I). Выявлено 3 гена Т-рецеп-тора, кодирующих oif д и ^ -цепи. В каждом из них обнаруживаются v » J » С ¿-сегменты, а дата: д -цепи еще и Д^сешент» В процессе экспрессии гены Т-рецептора подвергаются перегруппировке, в результате которой происходит последовательное слияние Д, jr и С-сегментов. Каждой стадии перестройки соответствует определена ный тип РНК. Это дает возможность с помощью методов блот-гибри-дизации выявить гены, находящиеся на различных стадиях перегруппировки ШШ, Н1Л),и установить линейную принадлежность транс*-формированных клеток и их клональность.

Следует учитывать тот факт, что реаранжровка ^ -цепи ТсЕ ассоциирует с реаранжировкой генов отсюда ряд авторов высказывают шение, что не может служить маркером при установлении линейной принадлежности клеток, но позволяет определить клональность лимфомн /249 ДЕ2/.

Перестройка #-гейа тимоцитов происходит преимущественно в 3 -сегменте, причем это явление евязывают с функциональной дифференцировкой Т-клеток /306 , 356/« С помощью уникальной ре-аранжировки ^ -цепи ТсЕ была доказана возможность распознавать клоны Т-клеток и определять Т-клеточную природу пролиферации в 50$ случаев болезни Ходжкина и во всех 14 случаях Т-клеточной лимфомн /249/.

Были получены данные (обзоры 16, 61), что перегруппировка генов д-цепи ТсЕ предшествует экспрессии ТЗ комплекса СДЗ/Н-, кроме того, во всех случаях реаранжировки Ту^-генов с опухолевыми клетками реагировали лишь анти-СД 7 моноклональные антитела ( 3 II ), СД 7 экспрессироваяся перед реаранжировкой Т^ , что дало основание предположить - СД 7 может быть триггером для указанной перестройки. В результате было рекомендовано использование моноклональных антител анти-СД 7 для идентификации Т-клеточ-ных цроцессов, так как экспрессия данного маркера происходит без предварительной перегруппировки генов д -цеш ТсК.

Моноклональные антитела к СД 5 ^антигену реагируют с клет*-ками большинства больных с Т-типом ЮЗ /143 , 261/. Однако этот адтиген, выявляемый в норме в селезенке плода и характерный для ршнего онтогенеза В-лимфоцитов довольно »часто обнаруживают при В-типе Ш. /199/.

Антиген СД 6, определяемый в норме на большинстве Т**клеток и тимоцитов, в малых количествах экспрессируется на Т-бластых

ОЛЛ, но в значительной мере при синдроме Сезари.

При ЛПЗ значительно изменено соотношение иммунорегулятор-ных клеток» выявляемых как с помощью Рс~рецепторов, так и моноАт СД 4/8. О снижении числа ОД 4+ -клеток и повышении числа СД 8+ -клеток неоднократно сообщалось при изучении фенотипа больных 1ЛЛ, НХЛ, ММ, детей с ОМ, что указывает на снижение хелперного и усилении супрессорного потенциала /7, 198, 213, 223, 270, 282» 298, 313/. С другой стороны, у больных грибовидным микозом и синдромом Сезари описано усиление хелперного потенциала с клинической картиной Т-кле точной лимфомы кожи /229, 277/.

Выраженность экспрессии B-клеточных маркеров при ЛПЗ также изменена по сравнению с нормой. Так, е высокой частотой встречается СЕ 2 -¿рецептор, а СЕ I может отсутствовать при В*типе ХМ.

Особого внимания заслуживает факт» что некоторые варианты лимфом, утратившие поверхностные и даже цитоплазматические Icj, классифицируются как В-клеточные неходжкинские лимфомы Д85» 249/. Это заключение основано на использовании методов молекулярной биологии, в частности, ДНК-гибридизации, подтверждающих наличие клональной реаранжировки I^-генов, характерной для раннего B-клеточного онтогенеза. В дополнение к рецепторным на B-клетках эксиресеируются процеесированные продукты Хугенов» которые совместно с 1а -гликопротеинами формируют структуры» распознаваемые Т-хелперами /217 , 276/.

О том, что известные нарушения синтеза В-лимфоцитами в большинстве случаев имеют клональну® природу, свидетельствуют исследования 70-80 годов /8, 122, 157, 179, 209, 220, 233, 267, 335/. При этом возможно развитие как моноклонажьного по природе, так и биклонального процесса с экспрессией 1о в форме 1л -цепей

Не случайно, что с нарушением синтеза нормальных 1| при В~типе ЛПЗ связаны многочисленные дефекты хромосом. Так, транс» локация V2; 14/и/р 13; c¡Q2/, выявленные при ХЛЛ, включают ло-кус и Н-цепей Ij, что служит причиной I^-ОС-фенотипа. Кроме того, описаны также 12,14 cjf -транслокации, трисомия 3 и нарушен ния хромосомы 6, трисомия 12, транслокация гена i-цепей хромосом 2 (ос ) или 22 (Д,) при жмфоме Беркитта! Синтез моноклональных 1| с вариантами легких цепей оС или %, ассоциирует при лимфси* ме с транслокащями t(2;8) и t (8;22), при этом наиболее часто поражаются хромосомы I (55$), 6 (27$) и Г4 (73$) /61, 114, 234, 274, 283/*

Степень выраженности В-клеточных маркеров на поверхности лимфоидных клеток может служить критерием диагностики лейкозов и лимфом. Так, выявление с помощью моноАт антигена ОД 19 позволяет, во-первых, причисжть клетку к В-ряду , поскольку это довольно ■"ранний" маркер онтогенеза (появляется ранее СД 10), во-вторых,? идентифицировать диффузный вариант мелкоклеточной неходжкинекой лжмфомы (СД 1Э+) и дифференцировать ее от крупноклеточного варианта (СД 19**).

Антиген СД 20, слабо выраженный на клетках лимфомн с крупными cieaved-ядрами (СД 20+/^), вероятно, представляет собой субстрат для протеинкиназн С и тем самым участвует в передаче спефицического сигнала от мембранных антигенных рецепторов к ядру клетки; его ассоциация с mío доказана за помощью копредапита

Антиген СД 21, характерный для относительно зрелых В-клеток, не удается обнаружить на опухолевых В-жмфоцитах. Полагают* что функционально он может служить рецептором СЗа -компонента комплемента и рецептором ЕВУ, однако участки связывания в этих случаях неидентичны, Моноклональные антитела ана:и-В2 блокируют связывание СД 21 .с. ЕВУ* подавляя пролиферацию В-клеток и синтез 1|, индуцированные этим вирусом«

Антиген СД 22, как полагают, специфичен не только для В-ти-па ОМ, но и для волосатоклеточного лейкоза /352/, Особо следует остановиться на маркерах СД 10 и ЕЖ.

СД 10, ^р 100, идентичен общему антигену, еАЫ, ассоциированному с острым лимфобластным лейкозом у детей /247/. Этот антиген четко выражен на пре-В-клетках и шеет диагностическое значение для идентификации вариантов лейкоза ни-Т/ни-В. Однако следует иметь в виду данные о возможности его экспрессии ж на гра-нулоцитах, а также на клетках некоторых Т-клеточных линий,

Вй-рецептор (комплекс фосфатидилэтанолашн в глнкопротеидом и альбумином) связывается с белками мембраны мышиных эритроцитов. Как правило, Щ-несущие клетки слабо экспрессируюту^ и <5р цепи и содержат антиген СД 5 /209* 210/. Если в; норне число ЕМ-Р0К незначительно, то при ХМ их количеств© возрастает, достигая значений 60*80$; этот факт послужил основанием включить определение ЕМ-ро зеткообразувдих клеток в список критериев иммунодиагностики В-клеточного ХМ /251, 342/.

Следует подчеркнуть, что первоначальное представление о том, что фенотип пролиферирущей клетки может соответствовать фенотипу нормальной клетки на разных стадиях дифференцировки, было в значительной мере поколеблено дальнейшими исследованиями.

Был предпринят поиск антигенов и маркеров, ассоциированных с лейкозом и лимфомой. сА1Ь долгое время оставался самым изве- ' стннм антигеном, ассоциированным с острым лейкозом у детей. Затем были получены антитела, реагирутаре как другими антигенами острого лимфолейкоза, так и антигенами миелолейкоза, а также лив®?» фом (в частности, моно Ат 3-3 и 3*40, а среди отечественных о6¿ разцов ИК0Ю2 /14/.

Среди причин этих нарушений в первую очередь следует называть дефекты характерной для иммуногенеза перегруппировки генов» контролирущих синтез поверхностных детерминант иммунокомпетент-ных клеток /44, 78/, Таким образом, отсутствие или недостаточная выраженность экспрессии штигеннзвязыващих рецепторных структур при ЖШ ассоциируют с Нарушением иммунологического распознавания.

Ъ'Ш Передача сигнала внутриклеточно цАШ и цГ№ относятся к универсальным регуляторам внутриклеточных процессов. Согласно гипотезе 80^х годов (Сутерленд,1968), цАШ & это вторичный мессенжер между первичными мессенжераш (гормонами, биологически активныии веществами) и ответными реакциями клетки;

Исходным моментом передачи сигнала служит активация аденилат-циклазы, связанной с цитоплазматической мембраной или являщейся ее компонентом. Аденилатциклаза катализирует образование цМ® , фосфодиэстереза превращает цАШ в 5* -АМ§, эти процессы зависят о. 2Аот присутствия ионов в первом случае М^ , во втором Шо^ ж

При этом действие ингибиторов фосфодиэстеразы щшводит к резкому повышению внутриклеточного содержания цШ#. Подробная информация о механизме регуляции клеточных процессов с помощью циклических нуклеотидов представлена в пубжкациях /96, 139, 279,311/

В случае, когда речь идет о пролиферативном процессе, в трансформированных и опухолевых клетках содержание внутриклеточ*-ного цА® может быть значительно снижено.4

Как считают исследователи, для сохранения определенной стадии дифференвдровки необходимо поддержание цАМ§ на достаточно вы*соком уровне. Маяигнизавдя, напротив, может ассоциировать с низким уровнем цАМФ.

Следует иметь в виду, что резкое снижение уровня цАМФ характерно и для периода митоза. Более того, оно может служить сигналом к делению клетки. Считают, что снижение уровня цШФ в период митоза обусловлено высокой активностью фовфодиэстеразы в т#фазе по сравнению с Gg -фазой. Эти данные указывают на роль цАМФ в регуляции клеточного цикла. Одновременно подтверждается факт участия циклических нуклеотидов в процессах клеточной активации;

3.3. Активация клеток

Биологическая роль циклического аденозин-З-5-монофосфата сводится не только к функции посредника действия целого ряда факторов, но и к функции регулятора активности генов, ответственных за инициацию клеточной пролиферации и дифференцировки; К настоящему времени уже раскрыты многие молекулярные механизмы регуляторых влияний внутриклеточного цАМФ на транскрипцию генов. Описаны специальные белковые рецепторы для цШ#, функционирущие в качестве ингибиторов фосфопротеинкиназ. Данные свидетельствуют о том, что циклические нуклеотиды могут стимулировать реакции фосфорилирования белков хроматина /273/. Поскольку в результате этих реакций жетоны менее эффективно подавляют процессы полимеризации нуклеиновых кислот, что было показано in vitro , то в целом процесс рассматривают как один из механизмов дерепрессии генов.

Исследования, связанные с воздействием цАШ на биосинтез ДЙЖ, ШК и пролиферацию ФГА-стисужрованных лимфоцитов, были начаты еще в 70-е годы. Были детально описаны такие события, как активация дценилатциклазы, увеличение внутриклеточного уровня о, цА®, усиление транспорта ионов Са , прямая зависимость интенсивности стимуляции пролиферации от увеличения количества эндогенного цАШ уже в начальные сроки действия митогена, вплоть до активации гистокиназ.

Опыты с использованием ФГА-стимулированных лимфо!щтов чело* века показали усиление синтеза ДНК под влиянием экзогенного цАЮ. Были получены данные об увеличений активности аденилатциклазы (2,4) и уровня внутриклеточного цАМФ (в 6 раз) спустя уже 5 минут после стимуляции лимфоцитов §ГА в дозе 50 мкл /139, 140/.

Таким образом, аденилатщклазный путь активации лимфоцитов в норме сопровождается усилением, а. при лейкозах и лимфомах снижением уровня внутриклеточного цШФ, что может быть одной из причин низкого митотическог© индекса стимулированных клеток.

Другая возможная причина отсутствия ответа на митоген недостаточная экспрессия или маскировка рецепторов для лектина, что обусловлено перестройкой или модификацией мембранных структур^ В пользу этого свидетельствуют результаты исследований /70, 173/.

Следующая предполагаемая причина низкого индекса при ФГА-стимуляции ХЛЛ- или НХЛ-клеток состоит в отсутствии перехода значительной части лимфоидных клеток из состояния "покоящихся" или "замороженных" на -фазе в состояние подготовки к синтезу ж последующему делению. Именно переход в позднюю -фазу "включает" механизм экспрессии рецепторов для фактора роста (ГЬ-2) с последующей активацией клеток. Иллюстрацией нарушения процесса активации и контроля за действием цитокинов при ЛПЗ служат многочисленные экспериментальные и клинические данные.

Наличие в периферической крови лимфоидных клеток, заблокированных на более поздних фазах клеточного цикла (например, на &9 -фазе), что характерно для клинических случаев ЛГМ» Ш

347/ может привести к запуску механизмов активации, связыванию 13^*2 и ответу на митоген.

3.4. Нарушение контроля за нормальной пролиферацией и дифференцировкой

Злокачественная трансформация иммунной системы сопряжена с неконтролируемой пролиферацией ж блокадой процесса клеточной дифференвдровки. При этом лимфоцитарный пул представлен либо идентичной стадией созревания, либо полиморфной картиной. Отсутствие в циркуляции достаточного числа зрелых клеток, явления кло-нальной экспансии все это характерные признаки злокачественных форм иммунопролиферативных процессов.

Современные иммунологические методы позволяют идентифицировать тип клеточной пролиферации. К примеру, для пролиферации В-клеточного ряда характерна реаранжировка 1о-генов, при этом выпре-В, ни-Т/ни-В при ОМ у детей; пре-В при ЗШ у детей и взрослых;

Ijr-несжнтезирувдие и 1|^несекретжрущие В-клетки при III; пре^шазматические 1^несекретирущие клетки при ВШ; плазматические клетки, секретирущие патологические, Fig,

Классификации лейкозов и лимфом с помощью иммунологических маркеров посвящены многочисленные статьи и обзоры /13, 14, 18, 22, 24, 37, 61, 63, 65, 86, 89, 113, 120, 133, 123, 143, 160, 169, 191, 237/. Однако в целом ряде случаев природу клеточного клона можно определить лишь по ре аранжировке 1| и ТсВг-генов/185, 248,

3.5. Нарушение иммунного ответа

Известные клинические формы ЛПЗ демонстрируют разные варианты иммунологической недостаточности как в плане уникального фенотипа, так и функционального иммунодефицита,' Клеточный клон, генерирувдий из трансформированной клетки, практически сохраняем направление и уровень дифференцировки клетки-хгредшественницы. Отсюда дифференвдровочные антигены представляют важные признаки и критерии классификации лейкозов и лимфом /74,85/. Клональные процессы распознают и по экспрессии вариантов легких цепей При трудно классифицируемых формах тип клеточной пролиферации устанавливают по реаранжировке 1<^-генов и ТсЦ-генов. Определенная роль в регуляции иммунного ответа принадлежит антигенам НЬг-А-сис-теда / 52, 53* 168, 169/, \ а) 011 у детей

Это клональная пролиферация лимфоидных клеток /221, 289/. В ЪЬ% случаев ОМ - это моноклональная пролиферация В-коммити-рованных клеток-предшественников /203, 225, 247/. Острый лимфо-лейкоз рассматривают как заболевание преимущественно детского возраста /7, 63, 64, 221, 314/.

Согласно ШВ^классификации в рамках сотрудничества экспертов §ранции, США и Великобритании различают 3 вида лимфобластов при ОМ (I» 1-3) на основании соотношения в системе ядро/цитоплазма, числа и размеров ядрышек и степени базофильности. Примерно в 90$ случаев блаеты больных эксцрессируют сАЬЬ-антиген I относятся к Ъ-1 типу, реже к 1-3 типу. Ь-2, как правило, встречается у взрослых больных /258/. До недавнего; времени лейкозы у детей разделяли на такие типы, как Т, В, пре-В, ранний пре-В; в последнем случае указывали на 0-тип ОМ. В дальнейшем было установлено, что для более чем 90$ неклассифицируемого ОМ (ни-Т/ни-В), а также дан менее 15$ Т-ОШ и отдельных случаев В-ОМ характерна экспрессия сАЫ. /192/,

- Как правило, сАЫ или СД 10, |р ЮОК выявляют при 011 с благ-гоприятным прогнозом /13, 27, 63, 221/.

Т-клеточныи ОМ наблюдают преимущественно у мальчиков. Обычно различают детерминанты разной степени зрелости Т-клеток. Так, описаны маркеры ранних тимоцитов, кортикальных и медуллярных тимоцитов, посттишческих прекурсоров Т-клеток и зрелых Т-клеток /14/. Властные клетки разных фенотипов могут различаться по чувствительности к лекарственным препаратам. К примеру, плотность вдтоплазматических рецепторов для глюкокортикоидов снижается в таком порядке: ранний пре-В-тип 7 ире-В> Т > В. Однако высокий уровень этих рецепторов не гарантирует ответ на терапию кортико-идаш /195/.

Важным маркером при ОМ служит высокая активность фермента тА, определяемая в нормальных тимоцитах, которая, утрачивается при дифференцировке Т-клеток /196/.

Пре-В-тип был обнаружен у 4 из 22 детей с ОМ по экспрессии Н-у^-цепи на лимфобластах костного мозга и одновременно отсутствию поверхностных (с//{+, /353/. Примерно у 25-30$ больных с пре^йРОМ выявляют цитогенетические аномалии % (1;19) (ер; <р) /212/.

Ранний пре-В-клеточныж ОМ обозначают как ""пре-В, клетки этих больных несут, как правило, сАИ.

Группа 0-0М включает 5-10$ детей с фенотипом ни-Т/ни-В, клетки которых не экепрессируют сАЫ. Некоторые сАХХ-негативные ОМ экспрессируют сДН-цеш и поэтому рассматриваются как пре-В. Причем, большинство из них экспрессируют В4 и/или НЬА-ДВ. и несут признаки реаранжировки 1<^генов.

В-тип ОМ встречается крайне редко (от 1% до 3-5%); на клетках экспрессируются 1а-антйген, ф$0 и Ва-1 /276 , 293 , 356/, Со стадией дифференцировки в процессе созревания лимфоидннх клеток при ОЛЛ связывают степень электрофоретической подвижности лимфоцитов: высокий уровень бластов ассоциирует с медженннм типом мобильности клеток в электрическом поле^

Методы оценки фенотипическжх и функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток успешно используют в клинике с диагностической целью и.для контроля за лечением детей с 011 /7, 88, 89 , 90, 120 , 365/* б) Лимфогранулематоз у детей

Оценка иммунного статуса детей с ЛГМ выявила количественный и функциональный Т-клеточный иммунодефицит как Hà уровне иммуно-регуляторного звена, так и продукции биологически активных цито-кинов /176, 180, 182 , 206 , 249 , 324/. Развитие иммунного дефекта сопровождается нарушением соотношения клеточных элементов лимфо-идной ткани, жизненного вдкла клетки /315, 347/f

ДГЙ рассматривают как болезнь злокачественных Т-клеток; доказательством служат данные клональной реаранжировки j^mjem Т-антигенного рецептора, полученные при исследовании клеток пери» фержческой крови и лимфатических узлов /249, 356/. На злокачественную трансформацию клеток при ЛШ указывает экспрессия на клетках Штернберга-Рид антигена, ассоциирующего с ходжкинской лимфо-мой и ответ нормальных лимфоцитов на этот антиген в культуре in vitro /309, 334/. Примечательно, что атипичные клетки экспреееируют 1а~антиген; высказано предположение, что они могут происходить от антиген-презентирующих ретикулярных клеток, которые обнаруживаются в тимус-зависимых зонах лимфатических узлов, где ассоциируют с СД4+ «клетками.

При ЛШ описаны нарушения реакций Т-клетонного иммунитета, включая дисбаланс иммунорегуляторных клеток, отрицательную кожную пробу с ДНХБ при тестировании на ГЗЕ, снижение функциональной активности лимфоцитов /61, 176, 182, 260, 333/.

В зависимости от стада процесс (М1 с разной степенью распространения опухолевого роста) и гистологического варианта (лимфоцитариое преобладание, смешанно-клеточный вариант, лимфо-цитарное истощение, нодулярный склероз) выраженность иммунных дефектов при ЖМ может: варьировать. Было высказано предположение, что при И1 наблюдаются последствия гиперетимуляции иммунной системы неидентифицированныш антигенами, что подтверждается увеличением уровня отдельных классов 1<|, ВДЖ, простагландинов, антител к антигенам шстосовместимости II класса /326/.

Поражение лимфатических узлов с наличием инфильтрата злокачественных ретикулярных клеток, синтезирующих ДНК, делящихся, пролиферирущих одноядерных клеток Ходжкина и мультиядерных не делящихся клеток Штернберга-КРид указывает на вовлечение в опухолевый рост как лимфоидных, так и вспомогательных клеток иммунной системы /180/.

I, наконец, болезнь Ходжкина относят к НЪ-А-зависимнм заболеваниям /52, 53/. в) Злокачественные неходжкинские жмфомы

Наряду с кжничеекой и морфологической классификациями известна классификация НХЛ с помощью иммунологических маркеров /18 , 61, 237 , 285 , 286 , 295 , 343/. Предположение! что фенотип нормальных дифференцировочных стадий может соответствовать фенотипу пролиферирущих неопластических клеток, подтвердилось лишь отчасти*

Как правило, большинство НХЛ В-клеточного типа с наличием слаб©дифференцированных форм и агрессивным характером заболевания В-клеточные НХЛ составляют 50-60$ всех случаев лимфом (<nlg+, 1а+, ВАГ*", ВГ*"). 15$ случаев HXI это Тнклеточные формы, на неклассифи-цируеШе остается 15^25% /312/,

Случаи лимфощтарной, лимфобластной, иммунобластной и плаз-моцитоидной лимфомы были описаны как вторичные иммунодефицита /18, ISl/* Сообщения о крушениях иммунной системы при НО» включая случаи лейкемизащи, как правило, касаются и хронического жмфолейкоза. г) Хронический лимфолейкоз

Целый ряд исследований 70-х годов посвящен изучению клональ-ной природы лейкозов и лимфом, включая 1X1 и XII /37, 142, 157» Ш/t

Стали классическими работы по выявлению дисбаланса популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток, определению фенотипа и функциональных свойств клеток при ХШ /172» 209 , 220 , 223 , 270, 282 , 329/, 0 циркуляции в периферической крови фенотишчески незрелых лимфоидных клеток при НХЛ и ХЛЛ было заявлено в работах по выявлению клеток с двойными маркерами /332/ и Шншаркером (клеток, связывающих на рецепторах эритроциты мнш) /251, 342/. Имеются указания на снижение активности естественных киллеров /235/, а также на возможную роль 1Ь-2 в индукции и поддержании пролиферации лвйкозных В-клеток /236, 280/. В генезе В-клеточного ряда отмечают хромосомные нарушения /61, 102 , 320/ и генетические транслокации /234 , 274 , 283/. При лейкозах встречаются аутоиммунные расстройства /60» 61/, рецидивирующие инфекции на фоне иммунодефицита /40/. д) Множественная шелома

Это клональная пролиферация В^клеточного тина» В зависимое** ти от класса синтезируемого патологического белка Pig различают и довольно в редких случаях 1^М^шелому. Заболевание получило название моноклональной гашапатии, поскольку в отличие от нормальных Ig, представленных 1® и Ь^цепями, при !И или плазмоцид томе синтезируется вторичной и третичной структурой сюда сыворотки больных ЙМ содержат в низких концентрациях нормальные определенного класса« Оценка уровня служит критерием оценки прогрессирования заболевания« G диагностической целью используют и определение экскреции с мочой L -це-ей или белка Бенс^Джожса/61/«

К нарушениям иммунного статуса при ние супреесорного потенциала, выработку активность лимфоцитов /281, 296, 298, 313, 355/« О шкоз и синдрш

Грибовидный микоз рассматривают как Т-клеточную лимфому ко» жи с пролиферацией и преобладанием Т^хелперов. 0 хелперной активности клеток при ГМ свидетельствует и анализ биожтатов пораженной кожи /193, 229, 323/.

Синдром Сёзарж называют Т^елпершй лейкоз: процесс инфильтрации кожи лимфоидными клетками и лейкемизация этими клетками периферической крови /71, 230, 277/. "

КлеточниЛг фенотип при этих заболеваниях соответствует формул г* ле Щ4+, СЩ8"\ Полагают, что диплоидный и тетраплоидный варианты клеток » это результат блока клеточной шщ ровки на разных фазах клеточного цикла. следует отнести усиле-, подавляющих

Получены доказательства как дисбаланса нммунорегуляторных клеток, так ж снижения функциональной активности лимфоцитов у больных е этими клиническими формами лимфопролиферативных заболеваний. тентнне клетки претерпевают трансформацию в фенотипически незрелые, функционально неактивные клетки, с нарушением продукции ци-токинов, синтеза и секреции иммуноглобулинов. Имеются данные о разной степени выраженности иммунного дефекта в зависимости от развития Т- или В-типа клеточной пролиферации. Результаты исследований указывают на возможные нарушения в системе функционировав ния генома. Это предполагает целесообразность рассмотрения внутриядерных изменений малигнизированных иммунокошетентных клеток.

II, 57, 135, 137/. В нормальной клетке, включая лимфоидную клетку, ДНК, гаетоновые и нешстоновже белки, в следовых количествах Ш1 и лишды входят в соетав хроматина, высокоорганизованной надмолекулярной структуры клеточного ядра.

4.1. Распределение гистоновых белков и содержание ДНК в ядрах нормальных клеток

Гистоны /I©6/ относят к основным белкам с высоким содержанием аргинина и лизина, но же содержащим триптофана. Показатель весового содержания гистонов в составе хроматина - 35-50%, молекулярная масеа варьирует от II до 21 К.

Препарат суммарного гистона раздашт на 5 основных фракций:

Н1, Н2А, 12В # НЗ, Н4. Описана гетерогенность фракций шстонов; их номенклатура включает значительное число субфракций. Аминокислотные последовательности шстонов НЗ и 14 у всех эукариот практически одинаковы, подобие аминокислотных последовательностей гистонов Н1, Н2А и Н2В разных видов выражено незначительно,

Синтез шстонов происходит в цитоплазме на полисомах, содержащих гистонову® мШЕ /230/, Скорость синтеза и количество жетонов тесно связаны с пролиферативной активностью, при этом относительные скорости синтеза отдельных фракций могут не соответствовать ©дна другой/331/,

Степень сопряжения синтеза ДНК и шстонов зависит от шпа клеток и их функционального состояния /300/, Интенсивность синтеза шстонов» жо#видйм©му, зависит: ©т фаз клеточного цикла: имеются указания на усиление синтеза в (З^-фазе, середине £ -фазы и частично в §2«фазе. Однако некоторые авторы полагают, что изменяется не скорость синтеза, а скорость транспорта этих белков из цитопяавш в ядро /250/,

ДНК, весовое содержание 35$, активно функционирующий биополимер, состоящий из 4 субъединиц - дезоксирибонуклеидов, азотистые основания которых представлены аденином, вдтозином, гуанином и тимином, Жуклеотиды связаны между собой ковалентными фосфоэфирными связями, соединящиш 5* - атом углерода одного остатка дез-оксирибозж с 3*-атомом углерода следущего остатка.

Особо следует ©становиться на вопросе взаимного расположения и соотношения фракции II с ДНК, Известны несколько уровней организации хроматина: нуклеосомная, сужерешральная и петельчатая /12, 36/, ©сновкой структурной единицей хроматина считают нуклеосому /301/, Н1-етстон не участвует непосредственно в образовании нуклеосом, однако он связан с Д1Ж в области межнуклеосомного пространства ж в области ее входа и внхода из нуклеосомы, фиксируя изгибы ДНК вокруг нуклеосомы и скрепляя ее концы. Так осуществляется структурная функция етстона Н1 в стабилизации хроматина /341/. Полагают,что гистоновые бедки могут быть неспецифическими регуляторами матричной активности ЦК,что указывает на значение ©тих структур в процессе клеточной пролиферации /125,254/.

Исследования показали, что активация хроматина осуществляется через его деконденцсацию /12/. Высказано мнение, что процесс активации хроматина связан с частичной утратой или модификацией Н1-шстона, ответственного за ограничение транскрипции на повто-рящихся Последовательностях ДНК /253. 262/.

Можно высказать сожалев но поводу отсутствия детального анализа организации ядра лимфошдной клетки на современном научном уровне* Тем не менее имеющиеся данные предполагают или доказывают непосредственное участие жетонов и ДНК в регуляции пролифератив-ного цикла»

4*2* Внутриядерные изменения клетки при канцерогенезе

Установлено, что процесс экспериментального канцерогенеза сопровождается глубокой перестройкой внутриклеточных структур, ответственных за биосинтез белка. Полагают, что по мере роста и развития опухоли происходит изменение матричной активности ядерного ДЩ в пораженных клетках* Жри этом менее плотно представлена упаковка хроматина /125/*

В опытах с использованием гепатомы Морриса было установлено, что из этих клеток экстрагируется значительно меньше лизин-бога^* того Шкгастона, чем из печени интактних крыв /284/.

Жри химическом канцерогенезе предполагают взаимодействие канцерогенов с ядерными белками; при этом канцерогены связываются с наиболее активными в плане транскрипции участками хроматина, е генной активности и в конечном итоге развитию опухоли. Изменению биосинтеза белков хроматина в тимоцитах экспериментальных животной гибелью клеток /46/.

Итак, онкогенез демонстрирует общие закономерности * ©преде* ленные изменения синтеза белков, связанных с ДНК в ДНП-комплекс, участвующих в переносе информации, пролиферативных процессах; ответа клетки или органа на различного рода воздействия.

4.3. Гистоны и ДИК в ядрах малигнизированных лимфоидних клетш

Прогресс в иммунологии и медицинской биохимии обусловил поищс новых критериев оценки малигнизированных лимфоцитов, привел к исследованию лимфопролиферативных процессов на молекулярном уровне.

Группа авторов /129/ изучала содержание и возможные соотношения ДНК и гйстоновых белков в норме и при лимфолейкозе крупного рогатого скота. С этой целью из лимфы больных и здоровых животных были выделены фракции ядер лимфоидных клеток. Однако при сравнительном анализе данных опытной ж контрольной групп не было выявлено существенных различий по выбранному критерию.

Среди работ, выполненных на ШЕническом материале, заслужи вают внимание исследования клеток периферической 1фови и костного мозга больных ЛПЗ. Известно, что эти процессы характеризуются высокой частотой встречаемости генетических дефектов. Быж ©писаны такие нарушения как шр ж гапердшошидия жри лимф©еарк©ме,@стр©м лимфолейкозе, хроническом! лимфолейкозе , множественной шеломе, ных регистрируют при микозе, гипердиплоидия и транслокации, делеции, моносомии, трисомии хромосом практически при всех известных клинических формах ЛПЗ /102, 357/.

В первую ©чередь обращает на себя внимание нарушение нормального синтеза ДНК, Увеличение количества ДНК обнаруживают в клетках периферической крови больных ХМ /127/, в измененных клетках больных волосатоклеточным лейкозом /201/, детей с острым лимфолейкозом /252/, а также с ЛГМ и неходжкинской лимфомой /351/. Измерение содержания ДНК в клетках костного мозга больных множественной шеломой показало4 что 55% клеток анэуплоидные, при этом индекс ДНК составил 2*4'С /43/*

Имеются сообщения об изменении содержания фракций шстонов при лейкозогенезе /115, 116, 117, 121, 345/; Сопоставляя фракции жетонов, выделенные из нормальных и лейкозных клеток (лимфоциты и нейтрофилы), авторы пришли к ввшоду о возможной связи шстонов с процессом дифференвдровки. Вмло установлено, что для больных XII было характерно перераспределение фракций шстонов: Н1 18%, Н2А 17%, Н2В+НЗ - 33%, Н4 - 11%, димер НЗ - 7%. Кроме того, была сделана попытка с помощью определения содержания шстонов провести дифференциальную диагностику миело- от лимфолейкоза, при этом максимальный уровень фракций шстонов отмечен при XII, минимальный - при ХМ /П7/. Автор указывает на снижение процентное го содержания Н2*-шстона и отличия шетоновых фракций у больных ХМ по сравнению с нормой по таким параметрам, как содержание, электрофоретическая подвижность, седиментавдонные характеристики.

Механизмы нарушения нормального содержания шстонов в лейкозных клетках еще недостаточно изучены. Высказано мнение, что относительное содержание шетоновых фракций определяется скоростью цикла;| а не синтезом шстонов /369/* Следует обратить внимание и на недостаточную и порой противоречивую информацию о нормальных уровнях жетонов и ЦК в лимфоцитах здоровых жц, В частности, о генерогенности клеток периферической крови здорового человека по указанным параметрам свидетельствуют опубликованные данные /43/* Авторы определяли содержание ДНК по интенсивности окраски фуксином в ядрах, окрашенных по Фёльгену, а жетоны фотометрически после окраски красителем прочным зеленым» о. о.

4,4. Са , М| -зависшая эндонуклеаза хроматина

Са2+, -»зависимую ендонукиеазу («) оМооОТ к до» эндо-ДНКаз, ферментам метаболизма ДНЖ, которые известны как поли меризущие, деиолимеризущае ж модифицирующие. молекулу ДНК,

Эндо-ДНКазы - это деполимери зующие энзимы, участвующие в ме ханизме запуска репарации, репликации ж транскрипции ДНК. Деполи меризация рассматривается в качестве начальной стадии "деструктивно-восстановительной" реакции при рекомбинации ДНК, известна ее роль в деструкции чужеродной ДНК и Д1К погибших клеток^ Повре: дение системы ДНК*ферментов может оказаться решающим фактором в развитии таких патологических процессов, как канцерогенез, вирус ные инфекции, иммунодефицита /34, 153, 154, 156, 208, 259 , 354/.

Группа эндо-ДНКаз представляет собой значительную группу ферментов, способных гидролизовать фосфодиэфирные мостики ДНК. Эндо-ДНКазной активностью обладает некоторые другие ферменты метаболизма нуклеиновых кислот, называемые неспецифическими нук-леазами, субстратом которых служит не только ДНК, но и ШК, Так, фосфодиэфирные связи могут быть гидролизованы модифицирущиш ферментами, в частности, ДйК-топоизомеразами. В отличие от эндо-нуклеаз, молекула ДНК-топоизомеразы после фрагментации Д11 на первом этапе реакции сохраняет ковалентную евязь с 3* или 5* -концом фрагмента ДНК, который служит скорее чаетью фермент-субстратного комплекса, чем конечным продуктом реакции.

По механизму действия, т.е* способа разрезания молекулы ДНК» эндо^ДНКазы разделяют на "двуударные" (сочетание двух одноцепо-чечных разрывов в одном и том же локусеДНК) и "одноударные". Для образования комплекса с ДНК и эффективного катализа эндо-ДНКазе необходимы кофакторы (ионы металлов, ^ -аденозилметионин, да и др.) и особые условия реакции (время, рН). Этим вопросам посвящены обзоры литературы /208, 354/.

Эндо-ДНКазы выявлены в© многих объектах, включая лимфоидные органы (селезенка, тимус)* клетки крови (эритроциты* лшфобласты) и печещ, культуру клеток Лиши НеЪа, Общим незнаком считают на» личие эндонуклеаз в клеточных ядрах, что указывает на их участие в функционировании генетического аппарата? Локализация эндо-ДНКаз внутри ядра окончательно не определена* Имеются указания на прочную ассоциацию е хроматином, не исключают их присутствие в нук-леопйазме и в виде резервного пула в различных участках хроматина? Данные свидетельствуют о том, что эндонуклеазы могут принимать участие в реаранжировке ж ТсЗ|*ген©в/94/?

ЯЕ^активность была впервые продемонстрирована в 1973 году. К настоящему времени сложилось представление о неслучайном (сш> обзор, 208) распределении Са, М^-зависимой эндонуклеазы на хроматине* Исследования показали, что в хроматине имеются сайты преимущественно атакуемые эндонуклеазами. Узнавание специфических структур хроматина и взаимодействие с этими структурами эндонуклеаз, вероятно, представляет ©дин из факторов рефляции активности генома исследуемых эукариотических клеток, о. о.

Са , М^ -зависимая эндонуклеаза как компонент нуклеазного комплекса, мол. масса 27 К, широко распространена и обнаружена во многих филогенетически отдаленных таксонах. Особый интерес вызывают исследования, в которых объектом служат лимфоидные клетки, Жак показали результаты исследований научной группы во главе с й*ШВ©тринш /27 , 34, 153, 155, 354/, активность и снижается но отличается в зависимости от локализации в следующем ряду; селезенка 4 лимфатические узлы - тшаус - периферическая кровью Выделив и® периферической крови здоровых лиц обогащенные фракции Т- и В-клеток, авторы обнаружили, что актива ность СИ в Е+-лимфоцитах снижена* а в Е^-лимфовдтах достаточно высока. Кроме того, отмечены реципрокные изменения активности фермента в тимусе и селезенке при первичном ответе у экспериментальных -Животных, мышей линии СВА, иммунизированных эритроцитами барана: усиление активности в ядрах тимоцитах и относительное снижение активности фермента в ядрах спленоцитов в первые сутки после иммунизации* Последнее обстоятельство авторы связывают с нар коплением в селезенке Т^лимфоцитов со сниженной активность® СИЕ, а наблюдаемый подъем активности в спленоцитах на 5 сутки - в основном активацией ~ активности при опухолях М|систеш о показателях активности СМЕ при лейкозах и мах довольно фрагментарны и немногочислен!!»

При обследовании группы больных с сердечно-сосудистой патологией, заболеваниями органов Дыхания, пищеварения, урологических больных, а также больных с злокачественными новообразованиями, группа авторов /155/ установила, что снижение интенсивности ауто-лиза хроматина характерно только для онкологических больных и, в частности,для больных хроническим лимфолейкозом.

Жолучешше данные касались лишь ограниченного числа клинических случаев.

Жри исследовании экспериментального лимфолейкоза крупного рогатого скота (КРС) было показано, что для данного заболевания также характерно резкое снижение активности эндонуклеолиза ДНК лимфоцитов. Результаты позволили сделать вывод о тт, что снижение СМЕг-активности служит характерным признаком развития лимфолейкоза IPC, который классифицируют как пролиферация В~кле точного тисвидетельствуют о том, что энзимы клеточного ядра иогут служить маркерами лимфопролиферативных процессов /214 , 228,

Таким образом, обращает на еебя внимание малочисленность сведений о клиническом значении определения уровня жетонов, ДНЕ и активности ДйЩзерментов. С другой стороны, имеются важные указания на изменение этих параметров при заболеваниях опухолево! природы.

На сегодняшний день практически отсутствуют данные о максимальных и минимальных значениях показателей распределения фракций жетонов, соотношения лизинг и артанин«богатых белков, ео-т и СМЕ-активности в лимфоидных клетках здоровых лиц, детей и взрослых; больных гематологическими заболеваниями неопухолевой клинических феративных процессов у нелеченинх при гематологических ремиссиях у Особый интерес привлекает сопоставление иммунологических показателей с внутриядерными характеристиками лимфоидных клеток {уровень жетонов, ДНК, активность систем ферментов, участвуадих в метаболизме нуклеиновых кислот). Это свидетельствует о необходиф 69 ^ мости детального анализа этих параметров в одной пробе крови больного, а также обследование групп больных с широким спектром

РАЗВИТИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ трашяюр1 развития злокачественных лимфопролифера-тивных заболеваний рассматривают, как правило, # позиции теорий канцерогенеза» На сегодняшний день еще не предложена универсальная концепция онкогенеза, тем не менее очевидно, что в основе опухолевого роста ж индивидуального развития организма лежат единые биологические закономерности пролиферации и дифференцировки.

Большинство исследователей полагают, что ЛИВ # это поли этиологические цроцессы: механизм запуека злокачественной пролифера^* ции может быть обусловлен ионизирующей радиацией, инфекцией, интоксикацией; в исследованиях последних лет многократно была дока!» зана центральная этиологическая роль онкогенных вирусов.

Предлагаемые теории, как правило, базируются на точке зрения автора относительно природы, этиологии;, патогенеза лейкозов и лимфом, включая дефект иммунорегуляции.

Среда известных гипотез особое внимание привлекают такие, как

- биохимическая, мутационная или "клоповая теория", теория вирогена и связанная с ней, теория вируеного онкогена в ее современной интерпретации , теория аутокринной регуляции, роста опухоли.

Следует отметить» что эти гипотезы основаны на разном уров* не развития научной мысли, научных методов, однако в их обоснован нии усматривается преемственность и взаимосвязь, ------------------------ ---------------

1. Теория конвергенции , предложенная в начале 50-х годов .Огееш^еол в качестве биохимической концепции, провозглашала, что перестройка систем ферментов один из механизмов опухолевого роста /12В/*

Ее основной тезие был связан с представлением о дедифферен-цировке клеток и утрате функции специфических ферментов» Указв* валось на биохимическое и частично морфологическое подобие опухолевых клеток, была сделана попытка доказать недостаточность ферментов функционального метаболизма и одновременно усиление систем ферментов; связанных с пролиферацией* Однако тезис об унификации обмена веществ опухолей разного гистогенеза оказался несостоятельным.

Экспериментальный и клинический материал, накопленный к началу 70-х годов, позволил В.СЛПаяоту заявить, что отдельно взятая опухоль может быть фенотишчески уникальна, а спектр биохимических характеристик неповторим /170/,

О биохимической гетерогенности неоплазм свидетельствует» в частности, многообразие форм шеломы, развитие которых , как полагают, зависит от стабильности матриц иШК и их связи с внутриклеточной мембраной,

2, Основы вирусо-генетической теории канцерогенеза были разработаны представителями научной школы академика Л,А.Зильбера. Жзвестны многочисленные экзо- и эндогенные вирусы, которые рассматривают в качестве этиологических факторов развития лейкоза /5, 7 , 58 , 79 , 80 , 83, 365/, Так, лимфоматоз, особая форма лейкоза птиц, вызывается герпесподобным вирусом, обладающим трошзмом к Т**клеточным зонам лимфоидных органов»: Спонтанный Тйклеточный лейкоз у мышей линии AKR ассоциирует с эндогенным ретровирусом, лейкозы и жмфомыу кошек с ретровируеом1еЪК

Лейкоз крупного рогатого скота (IPC) вызывается вирусом eblv, поражаадим В-лжмфоциты# Вирус относится к экзогенным фор« мам и при заражении животных вызывает клиническую картину , напоминающую хронический лимфолейкоз человека B-клеточного типа» При спонтанных лейкозах у приматов (гиббоны) из слюны выделен вирус, ответственный за развитие заболевания; описаны также вирусы группы герпес, с помощью которых можно индуцировать развитие лимфомы и лейкоза у подопытных обезьян*

I человека интенсивно изучается вирус Т-клеточного лейкоза (НТЬУ) в связи с возможной причастностью к развитию синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Кроме того, доказана этиологическая роль вируса Эпштейна-Барр в развитии жмфомы Беркитта.

Логическим продолжением вирусной теории канцерогенеза и лей-козогенеза следует считать теорию яlиp©гeнa,,.

1» Теория вирогена основана на фундаментальных разработках в области вирусологии, генетики, молекулярной биологии. Ще к началу 70-х годов были опубликованы принципиально новые данные, свидетельствующие о присутствии в структуре генома нормальной клетки полного генома онковируса, подобного по своим структурным, иммунологическим ж биологическим характеристикам экзогенному вирусу. Правильность этой концепции применительно к лейкозам и опухолям человека была доказана открытием у РНК-содержапщх онкогенных вирусов РНК-зависимой ДНК-полимеразы, иж обратной транскриптазы, что позволило объяснить внедрение этих вирусов в клеточный геном ж дальнейшую опухолевую трансформацию /118/.

Согласно гипотезе /266/f геном нормальной клетки, включая герминальную, содержит в интернированной форме геном (вироген) онковируса С-типа. При этом вироген можетбыть встроенв геном------клетки в виде "генного блока" или локализован отдельными генами (группами генов) на разных хромосомах. Геном вирогена может быть полностью репрессирован в нормальной клетке, однако воздействие целого ряда факторов способно вызвать его экспрессию. Дальнейшим развитием этих представлений следует считать данные о присутствии в геноме лейкозных клеток человека последовательности нуклеотидов ДНК, комплементарных структурам известных онкогенных вирусов,

4» Гипотеза активации щеточных онкогенов была разработана на основе открытия феномена интеграции вируеног© и клеточного геномов, предсказанного Л*А,Зильбером, а также открытия вирушых и клеточных онкогенов. Подробный обзор представлен в Публикациях /3-6, 128/, Обнаружено уже более 20 фуншщонирущих онкогенов, активация которых »вероятно, обусловливает разные этапы опухолевой клеток* Методы соматической и блот-гибриди зации по позволили определить локализацию онкогенов на хромосомах человека: src -20, аЪ1 -9, sis ¿22* туе ишуЬ -6, ез?ЪВ^7, вть А -17, mos -8, fes -15, fms -5, mil «3, Предполагают, что в клеточной трансформации участвует каскад генов /5/*

Среди механизмов активации клеточных онкогенов называют елеточковые мутации, - присоединение "сильного" промотора в связи с хромосомной перестройкой? транслокавди генов, в частности, в локус Icj-генов» амплификация (умножение) протоонкогенов, разная выражен-» ность их экспрессии в зависимости от локализации, фаз клеточного щшк ж тщ#

При изучении иммунных аспектов лейкозогенеза привлекают внимание 2 механиша^опосредавдх ощ^олевй! рост i

- ферментативная активность продуктов онкогенов,

- дерегуляция продукции факторов роста»

Эти механизмы взаимосвязаны* Выделены несколько групп онкогенов , кодирущих продукцию белков с эффектом факторов роета, кодирующих рецептор к фактору роста или часть рецептора к эпидер-мальному фактору роста (I®), обладащую тирозинкиназной актива ностью /19/.

Итак, нормальные клетки животных и человека содержит семейство консервативных генов, потенциально способных трансформировать клетка» Это с-оззс или протоонкогены. ДНК протоонкогенов по нуклеотидной последовательности подобна ДНК вирусных онкогенов (Т«овс)* Полагают, что функция онкогенов причастна к регуляции клеточной пролиферации. Об этом свидетельствуют прямые и косвен

Онкоген sis , продукт которого практически идентичен одной из субъединиц молекулы фактора роста из тромбоцитов (PdGïO. Клетки обладают свойством секретировать этот онкобелок и стимулировать пролиферацию клеток, несущих рецептор для К этой же группе относятся онкогены erb В, то в , fms и kit , которых объединяет свойство ихгродуктов, представлящих протеинкиназы, специфичные к тирозину (тирозинкиназы) . IT тому же они гомологичны локализованным в плазматической мембране факторам роета. Тирозинкиназной активностью обладает онкобелок гена ros t что было доказано в опытах in vitr© и in vivo *

Другая группа онкогенов кодирует синтез тирозинкиназ, не имеющих гомологов относительно рецепторов факторов роста. Субстратн фосфорилирования тирозинкиназ данной группы представляют со** бой белки, связанные с клеточной пролиферацией, однако прямых указаний на участиесубстратов фосфорилирования в передаче мито-генных сигналов или в других процессах контроля за клеточной пока не получены. с- аЪ1с последующей амплификацией в клетках больных хроническим шелолейкозом сопровождается усилением про*-теинкиназной активности.

Продукты онкогенов mos,raî/mii, pim -1 представляют собой растворимые цитоплазматические протеинкиназы, потенциально способные фосфорилировать белки по сериновым и треошшовым остаткам. Доказана также частичная гомология между продуктами гена mos и предшественником эпидермального фактора ростам

Структура гена туе и свойства его продуктов имеют практик ческое значение при лимфоме Беркитта и 01Л. Эти белки способны связываться с ДНЕ и ядерным матриком /338/. Обычно онкоген туе транслоцируется с нормальной позиции на хромосоме 8 у человека на позицию в непосредственной близости с генами, кодирующими О^участок Н-^цепей

Ври фолликулярной лимфоме был ©писан онкоген bel «2; его локализация 18<у 21.3, при транслокации « 14<|/32.В, локус близкий к гену Н-цепей I

Активация онкогенов, кодирущих структуру факторов роста, активация рецепторов для факторов роста или активация тирозин-киназы А все эти процессы ответствены за инициацию и поддержание аутостимуляции опухолевого роста при лейкозах и лимфомах.

5. Теория аутокринной регуляции. Согласно этой концепции, собственный рост клетки стищулируют, освобождая факторы роста, которые связываются на рецепторах. Этот механизм аутостимуляции, когда рецепторы к секретируемому регулятору (гормоноподобному веществу) находятся на самих секретирувдих этот регулятор клетках полагают, что этот способ рефляции характерен для раннего эмбриогенеза, на более поздних этапах развития происходит переход на паракринную (секретируемый регулятор достигает рецепторов кле-ток^-мишеней б ев выхода в специализированную транспортную систему, путем диффузии) и эндокринную, когда регулятор секретируется в кровь» По мнению (Гоааго ал. (1982), гены, контролирующие синтез аутокринных регуляторов и их рецепторы, репрессируются. В трансформированных клетках происходит ихдерепреесия.

Нарушение регуляции продукции и функциональной активности цитокинов можно назвать в качестве одного из возможных иммунных механизмов развития пролиферативного процесса. Так^ продукцию лейкозными клетками фактора некроза опухоли, 'М и 13»-6 расценивают как аутокринный механизм с обратной связью, который поддерживает пролиферацию у больных волосатоклеточным лейкозом и тем самым опосредует ©пухолевШ рост /215/.

6. Гипотеза иммуностимуляции роста опухоли. Согласно предложенной концепции /3^6/, на поверхности опухолевых клеток экспрессируются эмбриональные антигены, эволюционн© консервативные, которые могут оказаться мишенью иммуностимулирующего действия со стороны ишунокошетентных клеток в аутосистеме. Возможно, в роли таких таких антигенов могут также выступать вирус-индувд-рованные полипептиды в сочетании с эмбриональными и стадаоспевд-фичеекими белками. При этом предполагается присутствие не поверхности опухолевых клеток антигенов как для ишуновдтолиза, так и иммуностимуляции. Выетрое размножение трансформированных клеток происходит в случае появления на их поверхности эмбриональных секреция) был назван антигеноввызывающих стимуляцию их роста. Авторы полагают, что это новая концепция канцерогенеза объеданяет в единый процесс аутоиммунитет, экспрессию эмбриональных стадиоспецифическх антигенов ж ускорение темпов роста пролиферации клеток в качестве механизма опухолевого перерождения.

7» "Клоновая" теория происхождения лейкозов предполагает, что в результате первичной мутации в одной из клеток кроветворной системы утрачивается способность к нормальному созреванию и диффережвдровке, что приводит к появлению клона патологических клеток, предрасположенных к трансформации в бласты и живущих по законам опухолевой прогрессии. Недостаточность лейкопоэза сопровождается гипоплазией нормального кроветворения /29-33/.

8. 1 последние годы предложена концепция канцерогенеза, рассматривающая опухолевый процесс как явление регрессивной морфо-энергетической эволюции тканей и прогрессивного отбора клопогонных клеток /50/. По мнению автора, развитие опухолей включает такие процессы, как I) незавершенность дифференцировки стволовых клеток; 2) дедифференцировка ткани, в результате чего нарушается межклеточная кооперация и осуществляется переход клетки на одноклеточную форму существования; 3) появление очаговых пролифера-тов; 4) прогрессивный отбор клоногенннх клеток, способных к длительной пролиферации. Морфоэнергетическую эволюцию тканей автор рассматривает как приспособительную реакцию при переживании вредных влияний внешней среды (предопухолевая стадия). Без этой реакции не проявляется действие канцерогенов. На основании опытов е мицельннш грибами высказано предположение, что примитивные формы неоплазм могли формироваться уже у первых многоклеточных организмов и выполняли функцию сохранения жизни (регенерация организма из одной предопухолевой или опухолевой клетки). У высших организмов предопухолевая стадия ж развитие опухоли, по-видимому, есть проявление атавизма, например, через экспрессию протоонкогенов.

Рассмотренные теории, безусловно, не объясняют всех особенностей лейкозогене за, однако они вносят определенный вклад в раскрытие и понимание механизмов развития злокачественной трансформации клеток иммунной системы*

6. ШТИ К0РР1ШЩ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЖМФОПРОЖ§ЕШИВНЫХ

ПРОЦЕССОВ

Современный этаж развития иммунологии характеризуется поиском путей иммунокоррекции при заболеваниях иммунной системы, жзуш ченжем молекулярных механизмов ищунорегулвдиж, Высказано предлог ложенже , что имщунокоррекщя относится к области молекулярной инженерии*'

Основная цель разработки иммунокорржгирущих препаратов связана с изысканием средств направленного воздействия на главные регуляторные клетки, с нахождением путей их избирательной актива* оди или подавления /101, 107, 112/.

К настоящему времени уже накоплен опыт получения и клинической апробациж препаратов, воздействущих на иммунную систему. К ним относят с л едущие:

•А» препараты, полученные из тимуса (сыворошяй тимичеекий и гуморальный тимический факторы ,,тимозин) /9, 39 , 41, 42 , 88 , 95 126, 147, 171, 178 , 244 , 264 , 278 , 327 , 330/; мйелопежтйды костномозгового происхождения /55, 92, 93, ПО, XII, 112/;

-факторы некроза onyxojü /2&, 61, 88/; цитокйны /35, 96, 165/; ~ препараты группы интерферона /45 , 49, 51, 54, 61, 67 , 75, 90 , 91, 98, 119, 132, 158, 163 , 215 , 240, 288, 304, 316, 318,

Сообщения о возможности коррекции иммунодефицитов, включая ЛПЗ, с помощью гормонов тимуса, костномозгового активного фактора (СМ) и препаратов группы интерферона /9, 87, 88, 9G, 112, 134, 215, 318, 321/ поставили перед исследователям целый ряд задач практической направленности. Остановимся на 2-х из них: критерии оценки индивидуальной чувствительности больного к действию препарата in vitro ;

- критерии контроля за эффективностью проводимого лечения.

Общепринятые иммунологические тесты были взяты за основу при определении индивидуальной чувствительности больного к действию препаратов, полученных из етмуса. Эффект in vitro тимозина (фракция 7 ), тактивина (фракция in ), тималииа был продемонстрирован по вбсстановлению числа Е-розеткообразувдих клеток, усилен нию ответа на митогены, экспрессии Ш^йшаркера у больных с первичными и вторичными иммунодефицитамиОценка иммунной системы: больных в процессе лечения показала, что с помощью использованных тест-систем можно прогнозировать лечебный эффект химических факторов.

Опыт терапии тактивнном был описан Л.А.Махоновой на материале обследования 150 детей, больных острым лимфолейкозом и лимфо-саркомой. Обоснованием для использования иммунокорржшрущих средств послужил факт нежелательного воздействия интенсивной химиотерапии на важные количественные ж функциональные иммунологические параметры. Введение тактивина подкожно короткими курсами в дозе от 40 до 100 мкг/I м^ поверхности тела приводило не только к частичному восстановлению иммунологической компетенции организма, но и к изменению гистологической картины заболевания. Так, уже на 2-е сутки после введения тактивина детда с лимфогранулематозом отмечались очаги размягчения в лимфатических узлах и выделеше их из конгломератов. Цитологический анализ позволил обнаг-ружить лизис клеток Березовского-Штернберга. Клинико-^ммунологи-ческое исследование установило, что у детей с ЛГМ на фоне такти-винотерапии отменяются симптомы интоксикации, уменьшаются показа« тели биологической активности, восстанавливаются показатели Т-клеточного иммунитета.

Начиная с середины 70-х годов открыт и интенсивно изучается низкомолекулярнжй костномозговой растворимый фактор, получивший название стимулятор антителопродукции (САП^или В-активин), приоритет в разработке которого принадлежит научной группе академика Р.В.Петрова /55, 92, 93, Ш» III, 112/. Препарат в 2-8 раза усиливает антителопродукцию в эффекторную фазу иммунного ответа как в культуре in vi-tro * так и in -vivo » что может служить критерием эффективности препарата. Оценка продукции 1-активина в культуре клеток костного мозга больных злокачеетвенными формами лимфопролеферативных заболеваний позволила установить , что при ОМ (10 случаев), лимфосаркоме (II случаев) активность препарата практически не отличалась от нормы; при множественной миеломе фйктор костного мозга стимулировал антителообразование в 2,8 раз по сравнению с контролем (здоровые лица) - в 2,0 раза, Однако при использовании сунернатанта культуры костного мозга больших острым шелолейкозом (8 случаев) стимуляция антителообразования была снижена по сравнению с нормой в 1,3 раза. Результаты опытов in vitro нашли подтверждение при лечении данным «елопептидом больных шелолейкозощ /134/, больных с другши формами иммунологической недостаточности /112/.

В настоящее время имеются убедительные доказательства эффективности препаратов группы интерферона в противолейкозной терапии. Опыт йнтерферонотерапии у детей с гемобластозами показал, что у больных лейкозами и лимфомаш уменьшаются симптомы интоксика*

4*. 80 Ф щж$ анемического и геморрагического синдромов, сокращаются размеры увеличенных до лечения лимфатических узлов, уменьшаются размеры печени и селезенки. Наиболее выраженный эффект наблюдали у больных острым лимфобластным лейкозом /87/.

Значительный интерес представляет положительный эффект лечения больных волосатоклеточным лейкозом рекомбинантнш ^-интерфероном /318, 321/. Среди предлагаемых тест-систем для оценки тераши ЛПЗ привлекает внимание определение активности ДНК-ферI ментов. Было установлено, что разные варианты активности ДНКаз могут служить критериями для терапевтического мониторинга не-ходаинских лимфом /2X4 , 216 , 227/.

Наиболее известна тест-система для определения индивидуальной чувствительности больного к действию интерферона, основанная на определении активности н К-клеток /98, 132, 158 , 328/.

Усиление активности естественных киллеров при действии «•интерферона in vitro и in vivo было обнаружено как у больных волосатоклеточным лейкозом, так и при состояниях, обусловленных иммунологической недостаточностью /215, 321/.

Регуляция пролиферативной и супрессорной активности лимфоА цитов - это еще одно из проявлений действия рекомбинантного оС¿интерферона /163/.

Наряду с этим описаны /35/ такие эффекты интерферона, как влияние на систему выработки фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов: обработка §Г1-етимулжровашшх лимфоцитов здорового человека интерфероном (250, 1550 вдкг/мл) вызывала отмену торможения миграции нежтрофилов здорового донора. Предварительная обработка препаратом нейтрофилов отменяла их взаимодействие с медиаторами. Было высказано предположение# что интерферон, по-видамо-му, блокирует рецепторы нейтрофилов да ф 81 ф

Таким образом, наряду с шо! и лучевой терапией, транс«* плантацией костного мозга возможные пути коррекции лимфопрожфе** ративных процессов связаны с иммунотерапией, включая заместитель«* ную терапию биологически активными факторами* В этом плане привлекают внимание отечественные иммунокорришрующие средства. Перспективно нам представляются наиболее актуальными следующие вопросы: возможность коррекции малигнизированной иммунокомпетент-ной клетки как на клеточном, так и не внутриядерном уровне; ** поиск новых критериев контроля за иммунокоррекцией; - возможность прогнозирования лечебного эффекта с помощью тестов тИгэ?©, штжшш и иода

I. Характеристика групп обследуемых

Исследовали лимфоидные клетки периферической крови здоровых лиц (119 здоровых детей, 35 доноров крови) и 249 больных лимфо-нролиферативныш заболеваниям (90 детей и 159 взрослых) с клиническим диагнозом у детей: острый лимфолейкоз (ОМ), злокачественная неходжкинская лжмфома (1X1) или лимфосаркома; лимфогранулематоз (ЛМ)^у взрослых}

- хронический лимфолейкоз (ХМ), злокачественная неходжкинская лимфома (1X1), множественная шелома (И), грибовидный микоз (Ш), синдром ©езари /6/.

Группы сравнения составили больные с клиническим диагнозом: у д © т е й

- хронический гранулематозний кандидоз (ХГК) /21/; гематологические заболевания неопухолевой природы /35/; у взрослых

- бактериальная инфекция /47/;

- гематологические заболевания неопухолевой природы /18/, Всего обследовано 524 больных и здоровых лиц» Характеристика групп ©беледуемых представлена в таблице 3, В работе использовали пробы крови:

- здоровых детей, взятые в большинстве случаев из пальца ребенка (разработанный наш шкрометод, рацпредложение 1 0-2534), в дни профилактического обследования в поликлинике или у детей, посещающих базовый детсад, при содействии ст.научн.сотр. кафедры физиологии и воспитания детей ЦОЛИУВ Макаровой З.С., ассистента кафедры дет.бол. ЗЩН к.м.н. Цушко Л,В,; детей с ОМ, находящихся под наблюдением в гематологическом отделении кафедры дет.бол Л I РЗЖ (доц., к.м.н. Финогенова Н.А.,

Табжда 3

Характеристика групп обследованных

1 ! ———— цело оо- Общее

I. Дети с лимфопролиферативныш заболеваниями #Й4 90

ОМ 28

НИ- 15

ЖШ 47

2, Дети е гематологическими заболеваниями неопухолевой природы 1-12 35 56

ХГК 1-10 21

3. Здоровые дети до 3-х мес, 17

4-6 мес. 25

7-12 мес» 19 119

1-3 лет 22

4-6 лет 18

7-14 лет 18

4. Больные лимфопролиферативными заболевание 159 ями

ХМ 48-58 50

ШЖ 46-52 45

Ш 52-66 34

Л 48-64 24 синдром Сезари 52-54 6

5. Больные гематологичеА скими заболеваниями неопухолевой природы 36-56 18

Больные с бактериаль^ ^ ной инфекцией 34-70 47

6. Здоровые лица» доноры крови 18-45 35 35

Общее количество обследованных 524 зав.лаб. д.б.н. Р.В.Ленская); детей с НХЛ ж ЛИ (детская клиника ВОНЦ МН Российской Федерации, зав.отд. канд.мед.наук Ильяшенко В.В.)4

Пробы крови здоровых доноров были получены при содействии ст.научн.сотр. 1ДЩ АМН Российской Федерации Вавиловой Л.М,, пробы крови больных лимфопролиферативных заболеваний до лечения и в процессе терапии исследовали совместно с сотрудниками ВГНЦ АМН (проф. Полянская А.М., зав.отд. проф. Савченко ВЛ?., с.н.с. к.м.н. Григорьева М.А.^ЮШШ им.М.Ф.Владимирского (зав.отд. докт.мед.наук Голенков А.К.). Исследование периферической крови больных груш сравнения проводили совместно с сотрудниками ЦКВИ им.Короленко (докт.мед.наук Степанова Ж.В.), кафедры инфекционных болезней РШГ (проф. Погорельская Л.В.).

2. Методы

Фенотинжческие и функциональные характеристики иммунокомпе-^ тентных клеток определяли с помощью тестов X и П уровней /103, 153, 162/, внутриядерные характеристики с помощью тестов, обозная ченных как тесты Ш уровня (табл,4-6). Схема опытов представлена на рис.3.

Тес£ы I уровня включали определение числа лейкоцитов и лимфоцитов периферической крови , относительного и абсолютного числа Т- и В-клеток, их соотношения, концентрация в сыворотке крови (табл.4).

Т аблица 4

Тесты I уровня г

Исследуемые параметры :

Число лей*« Число тм~ Т^кдетки В^клетщ Соотно- Уровень ковдтов, фоцитов, ——ЙЕе 1о/в еш»

Ю9/л По9/л '% Ю9/Л % ю-д

А И &

Выделение чистой суспензии мононуклеашых клеток осуществляв ли по известному методу Воуша /200/, принцип седиментации в одноступенчатом градиенте фиколЬгипак был использован ж в разработанном нами (рацпредложение 1 0-2534) микрометоде выделения чистой суспензии лимфоцитов из микроколичеств крови, взятой из пальца ребенка.

Уровень циркулирующих Т- и B-лимфоцитов определяли с помощью общепринятых методов E-, IAC-, ЕА-, Ш-розеткообразовашя и имму-нофлюоресценвди (

Тесты И уровня (табл.5).

Таблица 5

Тесты П уровня

Исследуемые параметры

Тх, % Тс, % Соот Тх ношение РБТ1 СТФ » Д^Т'""

Ас яф©1 i" ответ на мито«* ген индекс Ioq стиму- Ü ЛЯЦИЙ г> клет- й ки, %

Тесты 1 уровня включали определение числа Т-Уимфоцитов с фе-* нотипом Т~хелперов/индукторов(^СД4+), Т-супрессоров/цитотоксиче-ских клеток^Д 8+), их соотношения, ответа на митоген с учетом спонтанной бласттрансформации лимфоцитов, или "фона*1, ответа ФГА-стимулированных клеток и индекса стимуляции, концентрации сывороточного тимического фактора (0Т#, ¿0^)» числа Д-клеток с двойными маркерами (Е+ЕАС или Е+1А) .

Определение количества иммунотэегулятошых клеток проводили в большинстве случаев в соответствии с методом /302/ при использовании обогащенной суспензии Т-клеток, полученных с помшцью селективного розеткообразования. Идентификацию ШЦуЦ и ТСКу - несущих лимфоцитов осуществляли с помощыэ 1<р- и Icp ¿фракций кроличьей антисыворотки к эритроцитам быкав тесте розеткообразовашя. У больных ОШ, XII, 1X1, Mi, ГМ, ЛГИ фенотишрование проводили соА трудники ВОЩ и ВШЦ АМН Российской Федерации с помощью монокло-нальнжх антител, что позволил© определить соотношение СД4+/СД8+ клеток и выявить детерминанты, ассоциированные е лейкозом или лимфомой (сАХЪ, ОД5, ОД? и др.).

Определение щщщщ^щщ^ тгвтмхштт Штт К t ствию имдашомодулятора (тактивияа) осуществляли 2 способами:

1 ~ при исследовании поверхностных маркеров лимфоцитов;

2 4 при изучении ответа ФГА-стимужроваяных лимфоцитов после добавления тактивинав культуру in vitro.

Уровень сывороточного тимического Фактора (СТФ) определяли

Для выявления Д-клеток использовали 2-эташшй способ розетко-образования (с ЕАСниаркером, а затем с Е-Маркером), при этом комплекс ЕАС готовили с окрашенными красителем бенгальским розовым эритроцитами быка и антисывороткой к этим окрашенным эритроцитам.

Тесты И уровня, связанные с определением внутриядерных характеристик иммунокомпетентншх клеток (см. табл.6).

Таблица 6

Тесты оценки имщунокомпетентных клеток на внутри*« ядерном уровне

Исследуемые параметры/ фракции гистон :ов. % Соотношение Содержание Активность

II I2B ГРАНИН1 лизин/аргинин -богатых белков ДНК/лимфоцит, пг ДНК- эндонуклео-лиза, ед.

- 87

I, Одежка уровня фрашшй шстонов

Метод выделения гистоновых бежев

Использовали суспензию выделенных лимфоидыых клеток с заведомо известной концентрацией (2i5 х 109/л), Предварительно удаляли глобулиновне белки; С этой целью к 0,5 мл суспензии клеток добавляли 3 мл и 0,14 I i/aCI, перемешивала ж после отстаивания в течение Х0 минут при 0-4° центрифугировали (I 500 cj/b течение 10 мин*.)» Полученный супернатант, содержащий глобулиновую фракцию белков, удаляли^

Для получения фракций шстонов использовали метод, основанный на разной степени растворимости основных фракций /310/ и ана^ лизе выделенных фракций с помощью электрофореза в 15$ полиакрил» ададном геле. Последовательность проводимых операций представлена на рис. 3 и 4.

Тут экстракции HI-шстона к осадку, ©ставшемуся после удаления глобулиновой фракции, добавляли при перемешивании 2 мл 5$ НС104 и отстаивали в течение 15-20 минут при температуре 0-4° С. Затем центрифушровали в течение 10 минут при I 100 cji Надосадок содержал фракцию HI, 0,5 мл которой использовали для количественного определения белка /16/. Для осаждения фракции HI к раствору, содержащему эту фракцию, приливали трихлоруксусную кислоту (TU) до конечной концентрации 18$. При соблюдении этих условий фракция выпадала в осадок с оптимальным выходом около 80$ и затем ее ©тде-ляж Центрифугированием.

Экствакшя Н2А+НЗ+Н4 возможна после удаления ÏÏI. С этой целью к осадку добавляли 3 мл 96° этанола, подкисленного ICI, перемешивали и оставляли на 18 час. при 0-4° С, после чего центрифушровали в течение 10 минут при I 100 <р Супернатант содержал смесь Н2АНЗН4 ¿фракций шстонов. Из этой фракции также отбирали пробу

Удаление, глобулино-вых белков о:, 14 ж йог

Удаление, ДНК^цред« шественников о;г5 Ж нсю4

ФРАКЦИЯ МЕТОЧНЫХ

Инкубация яр^^

I. 50' мМ трис-ЙСЕ рИ=8Д-8,3

10 мМ М^С12 0,25 Е" сахароза Время::!,5 ч сывороточ«» ноги тимическог фактора активности — ответ- на

ФРАКЦИИ Н1 Количественное, 2» Нротеинкиназа К экстракция, определение, ЮО мкг/мл

5$ НС104 спектрофото» КаС£ I М 0,5

Осаждение метрически Время:30 мин г л Спирину

ТХУ по митогены ФГА и лаконоса

ФРШЩ. Н2А экстракция этанолом осаждение ацетоном 1:,8 з;«

Смесь хлороформа и изоамилового; спирта 24й1 мин в 0,7 геле экстракция 0,25 I НСХ осаждение ацетоном гетерогенности; фракций гистонов электрофорез, в 15 % полиакриламидном геле 3. Схема, опытов*.

•*» Q9 для количественного определения белка! Для осаждения данного комплекса гистонов к осадку добавляли ацетон в соотношении 1:8, а затем центрифугировали в течение 30 минут при I 100 <у

Экстракцию Н2В*фракции проводили из осадка, оставшегося после выделения Н1»'и-Н2ДНШ4г С этой целью к осадку приливали 2 мл 0,25 Н НСС, перемешивали и отстаивали при температуре 0-4 С в течение 15-20 мин,, а затем центрифугировали в течение 10 мин, при I 100 су Супернатант, содержащий Н2В-фракцию, исследовали для количественного определения белка. Для осаждения Н2В%ракции к оставшемуся надосадку приливали раствор ацетона в соотношении 1:5, Фракция Н2В выпадала в осадок и ее отделяли центрифугировав нием в течение 30 мин, при I 100 с^

Электрофорез гистонов в ЪЬ% полиакриламидном геле в присутствии мочевины по методу /310/* прибор фирмы Реанал, проводили дня идентификации и анализа гетерогенности получаемых гистонов, Поли«« меризацию геля проводили при температуре 20°С в течение 1-1,5 час* Префорез » в течение 5-7 часов в холодной комнате при силе тока 2 А на пробу, буфер - 0,9 Н уксусная кислота,

Фракции отдельных гистонов для разделения указанным методом предварительно растворяли в 0,9 I уксусной кислоте. Пробу готовили из расчета 30 мкг белка с добавлением 1Ъ% сахарозы и индикаторной краски, после чего наслаивали на гель! Первые 30 минут электрофорез проводили при силе тока I А на пробу, затем при 2 А, разделение проводили в холодной комнате в течение 3$4 часов. После прекращения форе за пробы окрашивали в 1% растворе амидо-черного 10В, приготовленного на 7% уксусной кислоте. Отмывание производили в 7% уксусной кислоте. Электрофореграммы представлены на рже,4.

2» Метод выделения ДНК

ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови с помощью известного метода /104/* Принцип метода состоит в том, что при добавлении к щелочному гидролизату суспензии клеток насыщенного раствораУаС1 в уксусной кислоте белки выпадают в осадок, а ДНК и другие фосфосодержащие соединения остаются в растворе* ДНК от других фосфосодержащих соединений отделяют путем ее осаждения этанолом?

Для предварительного удаления предшественников ДНК к суспензии лимфоцитов приливали 0,5 Н НС/О^ в соотношении 1:3, тщательно пвремешвали , цен^шрава» в тачеше 10 щж I 500у

В полученном супернатанте содержались предшественники ДНК,

Оставшийся осадок переносили в центрифужные пробирки, содержащие I мл I Н /аОН, и помещали в кипящую баню при температуре примерно 100° С, Гзщюлизат представлял собой слегка опалесвдру-щий раствор'* Пробу охлаждали после бани при комнатной температур ре, а затем ставили на лед* К охлажденной пробе добавляли 0,5 мл насыщенного раствораУаС1 в 10% уксусной кислоте* При этом белки выпадали в осадок, через 3-5 минут после добавления реактива пробу центрифугировали 5 минут при I 100 щ» Надосадок сливали в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл этанола, находящуюся на льду. Для полноты экстравдии ДНК к осадку приливали 0,5 мл I Н УаОН и 0,5 мл насыщенного раствора УаС1 в 20$ уксусной кислоте. Полученную пробу центрифугировали 5 минут при I 100 у Надоеадок едивали в ту же пробирку, что и первый, содержимое пробирки перемешивали и оставляли ее на холоду на 2-3 часа при ©¿4® С. В этих условиях ДНК выпадала в осадок, который отделяли цеитрнфугирова- • нием в течение 5 минут при I 100 ер

Количественное определение ШК проводили спектрофотометрически /133/. Пробу готовили следующим образом: к осадку ДНК добавляли 0,5 Н до 5 мл, затем пробирку забывали и помещали в кипящую водяную баню на 20 минут. Полученный гидролизат ДЙК охлаждали , а затем проводили измерение на спектрофотометре 124-Хитачи при 270 и 290 нм. Количество ДНК рассчитывали по формуле : ■ (%0 & В290) х 10*1х5 О Д9 х где: 10.1 и 0.19 коэффициенты, предложенные Спириным для ©предел ления мкг ДНК в мл исследуемого раствора;

0 й е290 * Бычины экстинкции при соответствующих длинах волн;

5 количество исследуемого раствора в мл;

X ** количеств© ДНК в мкг/млн клеток; количество клеток (млн), из которых проводят выделение ДНК.

Опенка активности эндонуклеолиза ДНК лимфоцитов

I. Выделение суспензии клеточных ядер

Осадок предварительно выделенных мононуклеарных клеток суспендировали в 2 мл среды TIC (ЗОмй трис-НС^, pH 8,0, Змй Мср£2 0,9 М сахароза, 0,02$ тритон Х-100) ж гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера. Полученный гомогенат наслаивали на I мл буфера TKKU2/30 мМ трисЖЕ, pH 8,0, ЗмЯ M^ß^* J*2 ш сахароза) и центрифугировали при I 500-2 ООО у в течение 10 минут при 4° С. По данным световой микроскопии осадок был представлен интактныш клеточными ядрами. Выход ядер * 0,3 мг J®K/I0g клет©к^

Для ©©хранения ядер в течение нескольких дней (недель) при -20° С ядра суспендировали в минимальном объеме буфера TIC -0,25 (6© мй трисЖЛ, pH 8,5, 6 мЯ ijCIgi 0.25 I еахар©за) с добавлений ем глицерина до 50$ с целью стабилизации ядер.

2. Определение концентрации ДНК

При определении концентрации ДНК в препаратах ядер использовали их лизис в эбэ (додецилсульфата натрия раствор), конечная концентрация которой составила 0,5%. Измеряли оптическую плотность проб при длине волны 260 нм. Концентрацию ДНК определяли иеходя из соотношения: I, ^60 ^ шт ДНК/мл

Ш/ШШ&/4

В пробирки на льду вносили аликвоту суспензии ядер, содержащую 5 мкг ДНК, и добавляж 5 мкг буфера ТМС х 10* Объем доводиж деионизированной водой до 50 мкл, а затем пробы инкубировали в термостате при 37® в течение 1,5 час*

Для экстракции ДНС в каждую пробу вноеиж 5 M раствор жаС1 (до конечной концентрации I М) и 10% раствор sds (до конечной концентрации 0,5-1,0%). Пробы инкубировали при 37° 6 в течение 5 минут для растворения SM f после чего добавляли протеиназу К до конечной концентрации 50 мкг/мя и инкубировали еше 30 минут для протеожза и освобождения ДНК из ДНК-белковых комплексов,

Для освобождения от белков к пробам добавляли равный объем смеси хлороформа с изоашловым спиртом (в соотношении 24:1) с последующим встряхиванием в течение 20 минут и центрифугировали при 3 ООО cj/в течение 15 минут. Верхнюю водную фазу, содержащую ДНК, исследовали с помощью электрофореза. зш Размер блоков - 17x20-24 см. Использовали стандартный трис-ацетатный электродный буфер (10 Ш трис-ацетат, pH 8,3, 0f002 M

К пробам добавляж 1/5 объема 50$ раствора гжцерина, содержащего 2,5$ бромфеноловог© синего. электтэоФошза готовили горизонтальные блоки 0,7$ агаро

Проба содержада 5 мкг ДНК ядер лимфоцитов; напряжение при электрофорезе * 180 t время. # I час. Гель окрашивали раствором бромистого этидая (1мкг/мл) в течение 10 минут с последующим фотографированием через оранжевый фильтр е освещением двумя ультра-хемископами (длина волны 254 нм), расположенными с обеих сторон геля параллельно направлению каналов с углами наклона к поверхности геля 45°.

Негативы сканировали на денситометре "Хромоскан-200п.

Полученные денситограммы представляли распределение ДНК в гелях агарозы после электрофореза (рис.5,6), пики соответствовали субстратной (хромосомной) ДНК неинкубированных (А) и инкубированных (1) ядер. На высоте 2/3 амплитуды от базовой линии измеряли ширину пика ("в") и относили ее к 1/3 амплитуда (Maw)¿ Определяли величину в/а для каждого образца и обозначали ее индексом А "А". Величину в/а соответствующих контрольных (не инкубированных) проб обозначали индексом ЙА0И* Активность СЖ считали вели* чину "А" * определяемую по формуле.:

А * Ал A e i - 0 # Ю0

Ао

За единицу активности реакции принимали такую активность, которая обеспечивает за данное время инкубации изменение величины "А" по сравнению с контрольной на ОДЦ

Жри статистической обработке полученных данных использовали критерий Стыодента-Фишера и критерий значимости различий "Хи-квад-рат". Для сопоставляемых параметров были определены коэффициенты корреляции*

БОЛЬНОГО ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФ0ЛЕЙК030М

Результаты исследования проб периферической крови с помощью тестов I уровня показали, что примерно в 1/3 случаев ЛГМ отмечается лейкой и в 2/3 случаев лимфопешя. По уровню Т-лимфовдтов больных детей можно разделить на 2 подгруппы: I- с нормальным числом Т-клеток, 2- с- количественный Т-клеточным дефицитом, 1/4 обследованных. В последнем случае, как было выше указано, лимфоциты были чувствительны к обработке тактижином 1п тЗ/Ьго.