Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение структурных компонентов и физико-химических свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей как источника антиоксидантных лекарственных средств

Жданова Алина Валитовна

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ КОМПОНЕНТОВ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ НИЗКОМИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ИЛОВЫХ СУЛЬФИДНЫХ ГРЯЗЕЙ КАК ИСТОЧНИКА АНТИОКСИДАНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

1 9 МАЙ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Самара-2011

4846945

Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Аввакумова Надежда Петровна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Первушкин Сергей Васильевич

доктор химических наук,

профессор Халилов Леонард Мухибович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессибнального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерств здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится « 2 » июня 2011 г. в 10°° часов на заседании диссерта ционного совета Д 208.085.06 при ГОУ ВПО «Самарский государственный меди цинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Рос сийской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ» Мин здравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «М » (ЩиЬЛлЯ 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

И.К. Петрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Живой организм, как открытая термодинамическая система, активно реагирует на негативные изменения биосферы, и вместе с тем, характеризуется высоким постоянством состава внутренней среды. Поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза, как неотъемлемого свойства живых организмов, обеспечивается комплексом взаимосвязанных биохимических процессов. Нарушение функций редокс-систем тканей и органов является важным звеном патогенеза ряда заболеваний, к которым относятся сахарный диабет, гепатиты различной этиологии [Мехтиев С.Н., 2008], патологии сердечно-сосудистой системы [Барсель В.А., 1998; Решетова Г.Г., 2004; Tang M., 1996], множество онкологических [Бурла-кова Е.Б., 1979, Fukushima M, 2001] и аутоиммунных заболеваний, в том числе, ревматоидный полиартрит, склеродермия и другие [Маянский Д.Н., 1991; Меныцикова Е.Б., 2008]. Сказанное обуславливает активный поиск средств лечения окислительно-восстановительных нарушений и коррекции свободнорадикального статуса организма. С этой целью широко используются синтетические антиоксидантные препараты, такие как ионол [Репин В.С, 1998], пробукол (фенбутол) [Оковитый C.B., 2005; Burkitt M.J., 1996], диметилсульфоксид, мексидол [Воронина, 2000] и другие, применение которых ограничено рядом противопоказаний. Причинно-следственные отношения между терапевтическим эффектом и побочными действиями синтетических препаратов остаются недостаточно изученными. Иногда токсическое действие лекарственных средств на организм становится источником серьезных патологий. Вместе с тем, далеко не полностью исчерпаны возможности по разработке и внедрению в фармацевтическую практику терапевтических препаратов на основе природных соединений. Приоритетной задачей фармации в настоящее время является создание инновационных лекарственных субстанций на основе отечественного природного сырья для производства современных конкурентоспособных фармацевтических препаратов.

Перспективными с этой точки зрения являются гуминовые вещества, которые предполагают реализацию терапевтического эффекта на субклеточном и молекулярном уровне. Актуально фармацевтическое использование гуминовых веществ пелоидов, формирующихся в восстановительных условиях при участии сульфатре-дуцирующих микроорганизмов, что отражается на их структуре и химических свойствах, которые определяют биологическую активность соединений. Гуминовые вещества обладают широким спектром терапевтического действия, что подтверждается экспериментальными исследованиями последних лет. Специфические органические вещества обладают адаптогенным [Бузлама А. В., 2010], антитоксическим [Агапов А. И., Аввакумова Н.П., 1999], противомикробным [Жернов Ю.В., 2010],

диуретическим [Дубищев A.B., 2010], противовоспалительным [Агапов А.И. 1999; Аввакумова Н.П., 2002; Катунина Е.Е., 2007] действием, а также являются универсальной матрицей, позволяющей ввести в организм человека необходимые микроэлементы в активной форме [Аввакумова Н.П., 2002; Кривопалова М.А., 2010].

Отсутствие в информационных источниках сведений о влиянии гуминовых веществ пелоидов на окислительно-восстановительные процессы обуславливает актуальность и новизну проведенного исследования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование зависимости антиоксидантных свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей от их структурной организации.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать по общепринятым критериям гуминовые вещества низкоминерализованных иловых сульфидных грязей: фульвовые, ги-матомелановые, гуминовые и гумусовые кислоты.

2. Исследовать структурные компоненты гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей физико-химическими методами: инфракрасной спектроскопии (ИКС), ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

3. Разработать методы количественного анализа гумусовых кислот и их компонентов: фульвовых, гиматомелановых и гуминовых кислот.

4. Охарактеризовать в сравнительном аспекте про- и антиоксидантные свойства отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в условиях «in vitro».

5. Оценить биодоступность отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей на модельных опытах.

6. Изучить антиоксидантную активность фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов по основным гематологическим характеристикам в условиях «in vivo».

Научная новизна. Получены новые сведения о структурных компонентах фульвовых, гиматомелановых, гуминовых кислот с использованием ИК, ЯМР, ЭПР-спектроскопии. Установлены особенности молекулярной структуры гуминовых веществ пелоидов.

Впервые уточнена и детализирована природа парамагнитных центров в молекулах гуминовых веществ пелоидов, свидетельствующая об их высокой реакционной способности. Установлены соотношения электронодонорных и электроноакцеп-торных свойств гуминовых веществ пелоидов.

Получены новые данные о влиянии гуминовых веществ пелоидов на динамику окислительного стресса в эксперименте. Выявлена антиоксидантная активность фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов, раскрывающая перспективность их использования в фармацевтической практике.

Впервые предложен способ количественного определения гуминовых веществ пелоидов методом амперометрии, который может быть использован для стандартизации лекарственных субстанций.

Практическая значимость. Данные об антиоксидантной активности гуминовых субстанций являются основой при выработке алгоритма по рациональной пелоидотерапии с позиций доказательной медицины.

Совокупность сведений о составе, структурной организации, а также количественные характеристики антиоксидантной активности и биодоступности гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей являются необходимой базой для создания стандартизированных субстанций и лекарственных препаратов с целью дальнейшего использования в медицинской и фармацевтической практике.

Внедрение результатов работы позволит создать новый для России класс лекарственных средств сочетанного действия на основе экологически чистых природных веществ с доступной сырьевой базой.

Преимуществами применения пелоидопрепаратов, по сравнению с нативным грязелечением, является уменьшение противопоказаний и возможность использования лечебного фактора вне курортных зон.

По результатам исследований оформлено рационализаторское предложение:

- удостоверение на рационализаторское предложение № 122 от 1 февраля 2011г. «Средство природного происхождения для лечения инфицированных ран на основе хелатокомплекса гуминовых кислот пелоидов с ионами серебра».

Результаты диссертационного исследования внедрены:

• В учебный процесс на кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 1.03.2011);

• В учебный процесс на кафедре химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 1.03.2011).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Принадлежность субстанций выделенных из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей к классу гуминовых веществ, а именно: фульвовым, гематоме-

ладовым и гуминовым кислотам, по общепринятым идентификационным признакам: элементному составу, ИК-спектроскопии, коэффициенту цветности.

2. Генетическое сходство представителей веществ гуминового ряда по совокупности результатов, полученных физико-химическими методами анализа: инфракрасной спектроскопии, ядерно-магнитного резонанса, электронного парамагнитного резонанса.

3. Антиоксидантная активность в ряду гуминовых веществ пелоидов в условиях in vitro по результатам амперометрического, манометрического и хемилюминес-центного методов.

4. Результаты определения биологической доступности отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей на модельных опытах.

5. Методика количественного анализа фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов как основа для стандартизации лекарственных субстанций.

6. Сравнительный анализ антиоксидантной активности в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в условиях in vivo.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на «XII конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2007), межрегиональной научно-практической конференции по вопросам восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии, посвященной 175-летию ФГУ «Санаторий «Сергиевские минеральные воды» (г. Самара, 2008), XVI и XVIII Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (г. Пенза 2009, 2010), IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (г. Москва, 2008), VII Всероссийской конференции с Молодежной научной школой «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009» (г. Уфа, 2009), региональной конференции «Молодые ученые - медицине», «Аспирантские чтения, 2009» (г. Самара, 2009), V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (г. Санкт-Петербург, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, из них 6 работ - в ведущих рецензируемых журналах ВАК.

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (государственная регистрация № 01200809998).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 33 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), трех глав (глава'3,4,5), отражающих результаты собственных исследований, заключения, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 209 источников, из которых 65 - на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований в области гуминовых веществ, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению состава, свойств и применения специфических органических соединений.

В главе 2 представлена характеристика объектов и методов исследования. Приведены методики элементного, фотоколориметрического, спектроскопического, хе-милюминесцентного, мано- и амперометрического, биохимического и гистологического изучения гуминовых веществ пелоидов.

В главах 3-5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований элементного состава, компонентов молекулярной структуры, антиокси-дантной активности в условиях «in vivo» и «in vitro» фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов. Полученные результаты обработаны статистически и представлены в виде таблиц, формул и рисунков, приведенных в тексте диссертации.

В заключении проведен сравнительный анализ полученных данных, установлены особенности молекулярной структуры и закономерности изменения антиокси-дантных свойств в генетическом ряду гуминовых веществ пелоидов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом нашего исследования явились гуминовые вещества, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей ФГУ «Санаторий «Сергиевские минеральные воды» ФМБА России, Самарская область.

Фракции фульвовых (ФК), гиматомелановых (ГМК), гуминовых (ГК) и гумусовых кислот (ГсК) были получены из пелоидов по авторским методикам, разработанным на кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России» (патенты РФ № 2043107 от 20.07.1992; № 2122414 от 27.11.98).

Идентификация и изучение структурных компонентов гуминовых веществ пелоидов. Идентификацию гуминовых веществ осуществляли по общепринятым критериям: элементному составу, коэффициентам цветности: Е4/Е6, характеристическим полосам поглощения ИК- спектров. Полученные результаты сравнивали с литературными данными.

Определение элементного состава гуминовых веществ, а именно, содержание углерода, водорода, азота, серы и кислорода проводили на анализаторе фирмы «Carlo Erba ЕА-1108» при температуре 1010° С в постоянном потоке гелия. Согласно результатам элементного анализа содержание углерода находится в интервале 28,659,5% (масс.), водорода 3,7-6,2 % (масс.), кислорода 31,3-58,9% (масс.).

Таблица 1

Элементный состав (в пересчете на беззольное вещество), степень окисленно-сти, бензоидности и коэффициенты цветности гуминовых веществ пелоидов

Определяемый показатель ФК ГМК гк ГсК

Углерод Масс. 28,58±0,17 59,49±0,19 55,18±1,70 55,78±0,01

Мольн 19,01±0,15 40,21 ±0,17 42,89+0,20 41,60+0,74

Водород Масс. 6,18±0,19 5,22+0,12 3,56+0,36 4,01±1,30

Мольн 49,34±1,60 42,33±0,05 33,21±0,24 35,88+1,42

Азот Масс. 2,10±1,84 1,83±1,69 5,16±0,79 4,16±0,91

Мольн 1,21+0,67 1,06±0,54 3,44±0,14 2,66±0,58

Кислород Масс. 58,90±0,61 31,26±0,14 34,10±0,16 34,97+0,14

Мольн 29,38±0,14 15,84+0,05 19,88+0,05 19,56+0,07

Сера Масс. 4,24±1,47 2,2±0,17 2,00±0,01 1,08+0,32

Мольн 1,06±0,16 0,56±0,05 0,58±0,25 0,30+0,46

Н/С 2,59 1,05 0,77 0,86

О/С 1,55 0,39 0,46 0,47

Степень окисленности +0,50 -0,26 +0,15 +0,08

Степень бензоидности 6,87 20,01 32,69 26,97

Коэффициент цветности 7,50 5,30 2,70 2,60

Содержание азота колеблется в диапазоне 1,8-5,6% (масс.), серы 1,08 -4,2% (масс.). Полученные результаты соответствуют критериям элементного состава гуминовых веществ, принятым международным гуминовым обществом (ШББ).

На основании результатов элементного анализа были рассчитаны величины степени бензоидности и окисленности, а также атомные соотношения Н/С и О/С (табл.1). Максимальная степень бензоидности характерна для гуминовых и мини-

мальна для фульвовых кислот. Это коррелирует со значениями коэффициентов цветности (табл.1), значения которых обратно пропорциональны степени ароматизации фракций. Величина Н/С, указывающая на соотношение ароматических и алифатических компонентов, свидетельствует о том, что в фульвовых кислотах превалируют алифатические, а в гуминовых кислотах - ароматические составляющие.

Степень окисленности, показывающая относительное соотношение кислорода, водорода и углерода, указывает (табл.1) на ярко выраженный окисленный характер фульвокислот и достигает значения +0,50. Группа гиматомелановых кислот характеризуется явным преобладанием восстановительных свойств (степень окисленности равна -0,26). Для гуминовых кислот характерно значение степени окисленности близкое к нулю, что свидетельствует об их высокой окислительно-восстановительной буферности.

Качественное сравнение относительной интенсивности полос ИК - спектров, снятых спектрометре Spectrum 100 (Perkin Elmer) в диапазоне 400-4200 см"1, позволяет утверждать, что в фульвовых кислотах преобладают алифатические цепочки с большим количеством спиртовых групп, а гуминовые кислоты содержат сопряженные ароматические структуры со значительным содержанием карбоксильных групп (рис.1).

Рис. 1. ИК-спектры а) фульвовых, б) гиматомелановых, в) гуминовых г) гумусовых кислот пелоидов

Гиматомелановые кислоты, по сравнению с гуминовыми и фульвовыми, по результатам ИК-спектроскопического исследования можно отнести к наиболее ненасыщенной фракции, содержащей значительное количество непредельных фрагментов алифатического и ароматического характера. Анализ относительной интенсивности полос позволяет предположить превалирование кислотных свойств в фульво-

вых и гиматомелановых кислотах по сравнению с гуминовыми и гумусовыми кислотами. Гуминовые вещества пелоидов характеризуются присутствием в молекулярной структуре ароматического углеродного скелета с различными функциональными группами, среди которых преобладают карбоксильные, гидроксильные, ме-токсильные и алкильные. Помимо ароматической части, в гуминовых веществах присутствуют алифатические фрагменты различной степени выраженности, обогащенные полисахаридными группам.

Спектры ЯМР ]Н и ЯМР 13С регистрировали на спектрометре Вгикег Ауапсе-400 (400,13 мГц и 100,62 мГц ) в растворе Б20 с числом накоплений N=128 и 30000 соответственно, цифровое разрешение 0,2 Гц/т.

Таблица 2

ЗГ

18,27 24,26

56,02 68,47 79,71 87,95

108, 115, 118, 119, 122, 125,

147, 168, 174,

202, 204. 209. 218,

Отнесения в Н и 13С ЯМР-спектрах гуминовых веществ пелоидов (ОД М раствор N800 в Р2Р)

Функциональные группы

ФК

ГМК

ГК

ГсВ

гн

1Г

Значения химических сдвигов, м.д.

'Н

'Н

СН3)СН2

0,81,0,83; 1,44;1,91

35,27 38,08

0,74; 1,12 1,24;1,35 1,68;1,84

18,42; 28,51; 29,91

0,81; 0,83 1,10;1,11; 1,20;1,23; 1,34;1,44

21,42; 28,78; 32,24

0,89;1,68; 1,82;1,86

а-СН

1,96;2,01; 2,29;2,64;

2,20;2,32 2,50;2,55 2,60;2,94

1,96;2,01; 2,29;2,64;

2,17;2,18

СНз-0 СН2-0, N

3,38;3,54; 3,67;3,74; 3,80;4,09;

57,77

59,78

СН-О, N

67,72 69,23 85,68

3,08;3,30: 3,58;

3,68;3,80; 4,04;4,74;

55,62

61,64;63,04; 66,66;72,49 77,50;82,52; 87,74

3,32;3,58; 3,66;3,74; 3,80

64,69;б5,99

67,72

82,43

3,30;3,56; 3,84;4,02; 4,08; 4,12

о-сн-од

98,88 100,82

96,72

5,90

Аг-Н,С

7,29;7,35; 7,72;8,08; 8,15;

136,31 137,61

7,38;7,80; 8,40;

110,8;

120,2

124,7

128,91

130,51

7,36;7,66; 7,72;8,09; 8,15;

115,32; 136,7

6,97;7,10;

7,14;7,31;

7,50;7,54;

7,57;7,62;

7,64;8,01

8,36;9,01;

Аг-ОД

154,49

соо-н,с

168,33

168,46 170,26 176,09 177,89

167,69

с=о

192,56

209,62 211,03 214,24 220,27

Регистрация спектра ЯМР 'Н в растворителе NaOD в D20 позволяет провести дифференцированную оценку трех типов атомов водорода: карбоксильных групп (в области от 2,5 м.д. до 4,0 м.д.), ароматических (в области от 6,5 до 8,0 м.д.) и алифатических фрагментов (в области от 0,5 до 2,5м.д.).

Анализ спектров ЯМР ]Н и ЯМР 13С (табл.2) показал, что в фульвовых кислотах преобладают разветвленные алифатические цепочки с большим количеством спиртовых групп. Молекулярная структура гуминовых кислот представляет собой ароматический каркас, в котором боковые алифатические заместители включают карбоксильные и спиртовые группы. Установлено, что гиматомелановые кислоты по своей молекулярной структуре имеют существенные отличия от структур других фракций, прежде всего, присутствием не менее четырех типов карбонильных атомов углерода различной природы: хиноидной, сложноэфирной, еноловой, кетонной. Указанная особенность молекулярного строения гиматомелановых кислот определяет наиболее выраженную степень сопряжения структурных фрагментов, и их можно, по-видимому, условно отнести к наиболее ненасыщенной фракции пелои-дов.

Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) в виде первой производной сигнала поглощения получали на спектрометре "Bruker ЕМХ plus X" (-9.75 ГГц). Спектры ЭПР исследуемых фракций имеют приблизительно одинаковый вид (рис.2). В спектрах идентифицируется одна интенсивная широкая линия с g=2,003 (табл.3), свидетельствующая о явном присутствии свободных радикалов в структуре гуминовых веществ. Концентрация парамагнитных центров рассчитывалась по известной концентрации спинов угольного пека, которая составляет 3,66-1015 спин/г.

Рис. 2. ЭПР спектры а) фульвовых б) гиматомелановых в) гуминовых кислот пелоидов

Анализ концентраций парамагнитных центров (табл.3) показывает, что минимальное число свободных радикалов содержат молекулы фульвовых кислот пелои-дов. Концентрация парамагнитных центров в гиматомелановых кислотах повышается в 6 раз и достигает максимального значения в гуминовых кислотах, возрастая в 34 раза. Концентрация свободных радикалов в гумусовых кислотах принимает промежуточное значение равное 15-Ю16 спин/г.

Таблица 3

Значения g-фактора и концентрации парамагнитных центров в гуминовых веществах пелоидов

Фракция g-фактор Полуширина синглетной линии, (ДН,Гс) Концентрация ПМЦ, (в спинах/г)* 10'6

Фульвовые кислоты 2.00345 3,6 0,8

Гиматомелановые кислоты 2.00330 3,6 4,8

Гуминовые кислоты 2.00310 3,1 27

Гумусовые кислоты 2.00320 3,1 15

Концентрация парамагнитных центров возрастает в ряду фульвовых - гиматомелановых - гуминовых кислот и изменяется симбатно степени ароматичности фракций, рассчитанной на основании результатов элементного анализа.

Антиоксидантную активность гуминовых веществ в условиях in vitro определяли с использованием манометрического, амперометрического и хемилюми-несцентного методов.

Манометрическое определение антиоксидантной активности проводили на модельной реакции радикально-цепного инициированного окисления 1,4-диокеана в стандартных условиях при температуре 348 К и скорости инициирования Vj= 1-Ю'7 моль/л'с в кинетическом режиме окисления [Денисов Е.Т, 1997]; в качестве инициатора окислительных процессов выбран азодиизобутиронитрил (АИБН) с использованием модифицированной установки типа Варбурга. Скорость окисления Vo определяли по тангенсу угла наклона кинетической кривой поглощения кислорода (рис.3). Ингибированное окисление 1,4-диоксана проводили в присутствии ионола и фракций гуминовых веществ пелоидов. В этом случае скорость ингибирования V0 определяли по начальному участку кинетической кривой.

[ГМК], г/л 1,0 1,5

[ГЦ, г/л

10С 150 200

[ГсК], г/л

Рис. 3. Зависимость начальной скорости окисления 1,4-диоксана (1) и параметра ингибирования Б (2) от концентрации гуминовых веществ

Из полученных данных следует, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают гиматомелановые кислоты: при концентрации 0,2 г/л степень торможения составляет 54% , а при концентрации 2 г/л степень торможения достигает максимального значения - 97% (рис.3).

Гуминовые кислоты обладают как антиоксидантными, так и прооксидантными свойствами в интервале концентраций от 1 до 30 г/л и от 30 до 70 г/л соответственно. Максимальная степень торможения окислительного процесса составляет 80,8%.

Гумусовые кислоты характеризуются схожими с гуминовыми кислотами антиоксидантными свойствами, но в меньшей степени замедляют процессы ингибиро-ванного окисления. Это связано, по-видимому, с более сложной, стохастической структурой, в которой функциональные группы находятся внутри глобулярной макромолекулы, что затрудняет их участие в общей цепи сопряжения.

Фульвовые кислоты обладают менее выраженными антиоксидантными свойствами, так как в их структуре преобладают карбоксильные и спиртовые группы, которые, по-видимому, менее активно взаимодействуют с радикалами и обрывая цепь окисления.

Зависимость параметра ингибирования Б от концентрации фракций гуминовых веществ определяли в координатах уравнения:

'о 'о

где К0° - начальная скорость поглощения кислорода при окислении 1,4-диоксана в отсутствии ингибитора;

У0- начальная скорость поглощения кислорода при окислении 1,4-диоксана в присутствии ингибитора;

[АО] - концентрация добавки АО;

к,п - константа скорости обрыва цепи окисления на АО;

2к6 - константа скорости квадратичного обрыва цепи на пероксильных радикалах субстрата 2£6 =6,67*107 л/моль*с; УрЫО"7 моль/л»с [Денисов Е.Т., 1997; БешБОУ Е.Т., 2005].

Между параметром ингибирования и концентрацией исследуемых кислот в интервале 0,25-30 г/л наблюдается линейная зависимость и, следовательно, предложенное уравнение удовлетворительно выполняется для всех изученных веществ (коэффициент корреляции > 0,95). Величина ^'^/щ^у. ®ьша определена по тангенсу

угла наклона зависимости параметра ингибирования Б от концентрации гуминовых веществ для каждого образца (рис.3). На основании полученных данных была рассчитана эфффективная константа скорости ингибирования, которая имеет наибольшее значение для гиматомелановых кислот и составляет 8,5 л/г-с. Гуминовые кислоты по эффективной константе скорости ингибирования окислительного процесса уступают гиматомелановым в 2,8, гумусовые кислоты - в 5,0 и фульвовые кислоты - в 6,5 раза, и составляют 3,0 л/г-с, 1,7 л/г-с, 1,3 л/г-с соответственно.

Таким образом, гиматомелановые кислоты характеризуются наибольшими значениями манометрических показателей, что указывает на их высокую антиокси-дантную активность.

Для прямого количественного измерения содержания антиоксидантов в биологических объектах использовали амперометрическое определение, которое проводили на приборе «Цвет Яуза АА-01». Условную массовую концентрацию антиоксидантов измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала силы тока (нА) от концентрации кверцетина, который использовался в качестве стандарта. Максимальное количество антиоксидантов содержится в гиматомелановых кислотах и изменяется от 0,2*10"3 мг/мл при концентрации 0,001% до 73,5*10° мг/мл при концентрации 1,0%. В гуминовых кислотах содержание антиоксидантов

меньше, чем в гиматомелановых кислотах 2 раза, в гумусовых кислотах - в 3,3 раза, в фульвовых кислотах - в 10 раз (табл.4).

Таблица 4

Значения величии суммарного содержания антиоксидантов (ССА) амперометрическим методом

Концентрация раствора (масс. %) ГМК ГК ГсК ФК

ССА * КГ* мг/мл 0,001 0,20±0,05 0,10±0,01 0,06±0,02 0,02±0,01

0,010 2,10±0,02 0,58±0,01 0,52±0,01 0,32±0,01

0,100 9,98±0,02 3,87±0,03 2,18±0,04 1,02±0,02

1,000 73,50±0,01 25,6±0,04 10,6±0,01 5,46±0,03

Проведенные исследования показали, что суммарное содержание антиоксидантов прямолинейно зависит от концентрации гуминовых веществ, что позволяет использовать амперометрию для количественного определения гуминовых веществ пелоидов (табл. 5). Нами разработана методика, которая может служить одним из способов стандартизации гуминовых веществ пелоидов. Массовую концентрацию антиоксидантов в гуминовых веществах измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала силы тока (нА) от концентрации гуминовых веществ.

Таблица 5

Результаты амперометрического определения

суммарного содержания антиоксидантов в гуминовых веществах пелоидов

Фракции Линейность, мг/мл Метрологические характеристики п=15

Фульвовых кислот от 0,001 до 0,5 (R2 = 0,996) Х±ДХ=0,00507±0,00017 е, % =3,4

Гиматомелановых кислот от 0,001 до 0,5 (R2 = 0,997) Х±ДХ=0,00994±0,00026 £, % =2,7

Гуминовых кислот от 0,001 до 0,5 (R2 = 0,999) X ±ДХ=0,0042±0,0003 е, % =4,5

Гумусовых кислот от 0,001 до 0,5 (R2 = 0,996) X ±ДХ=0,0042±0,0003 £, % =4,5

Для построения градуировочного графика гуминовых веществ последовательно регистрировали сигналы стандартных растворов в порядке возрастания их концентрации. Для исключения случайных результатов и усреднения данных выполняли пять последовательных измерений для каждого из пяти градуировочных растворов.

Предлагаемая методика валидирована по основным критериям, она линейна и воспроизводима. В ходе проведенных исследований показана возможность применения жидкостного хроматографа «Цвет Яуза АА-01» для определения суммарного содержания антиоксидантов в субстанциях гуминовых веществ.

Исследование антиоксидантной активности методом Ре2+-индуцированной хемилюминесценции проводили по методике Ю.А. Владимирова. Свечение индуцировали добавлением 1 мл 0,05М раствора железа (И) сульфата, ускоряющего процессы окисления. Определяли спонтанное свечение, амплитуды быстрой и медленной вспышки, светосумму свечения (табл.6). Величины показателей выражали в условных единицах.

Таблица 6

Показатели Ке2+-индуцированной хемилюмипесции фракций гуминовых веществ пелоидов

Концентрация ФК ГМК ГК ГсК

светосумма 0,01% 69,59±0,01 17,56±0,06 19,54±0,01 27,32±0,14

0,1% 48,36±0,05 15,46±0,01 18,82±0,24 24,60±0,31

1% 34,36±0,14 10,41 ±0,01 18,65±0,14 24,47±0,02

спонтанная светимость 0,01% 6,92±0,01 1,30±0,01 1,42±0,01 2,06±0,01

0,1% 2,69±0,04 1,21±0,01 1,41 ±0,01 1,98±0,02

1% 2,56±0,04 1,09±0,01 1,38±0,02 1,46±0,01

вспышка 0,01% 19,68±0,17 3,05±0,01 3,40±0,03 4,56±0,03

0,1% 6,56±0,01 3,04±0,02 3,30±0,01 3,59±0,03

1% 5,80±0,01 2,45±0,01 3,10±0,02 3,42±0,01

ОАА, % 0,01% 17,62±0,21 57,28±0,14 53,99±0,16 27,79±0,21

0,1% 29,74±0,29 60,51±0,79 59,46±0,13 30,54±0,01

1% 35,85±0,31 69,08±0,17 61,02±0,17 42,34±0,02

Наиболее выраженной способностью гасить свободнорадикальные процессы обладают гиматомелановые кислоты, значения светосуммы которых в 3-4 раза меньше, чем в фульвовых кислотах и приблизительно в 1,5 раза меньше, чем в гумусовых кислотах. В фульвовых кислотах амплитуда быстрой вспышки возросла при концентрации 0,01% в 6,5 раз, а при концентрации 1% - в 2,5 раза по сравнению с гиматомелановыми. Следовательно, общая антиоксидантная активность, определенная по способности соединений тормозить реакции свободнорадикального окисления ионов железа, повышается в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые, гиматомелановые кислоты.

Биологическую доступность гуминовых веществ пелоидов определяли фото-электроколориметрическим методом диализа через биологические мембраны животного происхождения. По результатам эксперимента рассчитана степень диализа, кото-

рая имеет при физиологической кислотности (рН 7,4) максимальное значение у фульвокислот (0,5), а минимальное - у гуминовых кислот (0,2). Гиматомелановые кислоты характеризуются промежуточным значением степени диализа равным 0,35. Введение диметилсульфоксида и ионов металлов повышает биодоступность всех фракций гуминовых веществ, что, по-видимому, обусловлено изменением макромо-лекулярных конформационных форм.

Проведенные исследования доказывают высокую биологическую доступность гуминовых веществ, несмотря на высокое значение их молекулярных масс.

Про- и антиоксидантные свойства гуминовых веществ пелоидов условиях in vivo. Эксперимент выполнен на беспородных крысах самцах половозрелого возраста. При проведении опытов неуклонно соблюдали положения Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным [Касаткина Т.Б., 2000]. Животные содержались на стандартном лабораторном рационе в условиях свободного доступа к пище и воде. Экспериментальные исследования проведены в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г «Об утверждении правил лабораторной практики», Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005 г).

Оценка антиоксидантной активности исследуемых соединений проведена в модели острой интоксикации при парентеральном и пероральном введении отдельных фракций гуминовых веществ в дозе 1 мг/кг массы, хемилюминесцентным методом на приборе «Хемшпоминометр - XJI-003». Контролем служила группа интактных животных. Острую интоксикацию вызывали однократным внутрижелудочным введением отечественной смеси полихлорированных бифенилов (ПХБ) «Совол» в оливковом масле в дозе 600 мг/кг (0,1 LD50).

Данная группа животных составила группу сравнения. Полихлорированные бифенилы значительно активизируют процессы свободнорадикального окисления (СРО). Все показатели СРО достоверно изменялись по сравнению с контрольной группой (рис.4): светосумма, отражающая скорость расходования свободных радикалов за счет их взаимодействия с антиоксидантами, увеличилась на 60%; амплитуда быстрой вспышки, характеризующая содержание гидроперекисей, увеличилась на 11%; латентный период времени, определяющий скорость окисление липидов понизился на 33%.

Введение растворов компонентов гуминовых веществ сопровождалось статистически значимыми изменениями изучаемых параметров. В сравнении с животными, подвергшимися интоксикации «Соволом», у них наблюдалось снижение спонтанной светимости на 30,31% под действием гиматомелановых и на 52,38% -фульвовых кислот.

14 12 10 в 6 4 2 О

контроль группа ФК сравнения

контроль группа ФК сравнения

ГКэм.

3 амплитуде быстрой вспышки Оамппитуда медленной вспышки ■ спонтанная светамость а латентный период

Рис 4. Значения параметров хемилюминесценции плазмы крови на а) 3 сутки и б) 10 сутки исследования

Латентный период увеличился при введении крысам гиматомелановых и гу-миновых кислот на 74% и 83% соответственно. Спонтанная светимость снизилась в 2-3 раза под действием гиматомелановых и гуминовых кислот пелоидов. Значения светосуммы также имели тенденцию к понижению.

Таким образом, наибольшей способностью угнетать свободнорадикальное окисление модельной системы, а значит, более высокой антиоксидантной активностью обладают гуминовые и гиматомелановые кислоты.

Данные Бе2+- индуцированной хемилюминесценции подтверждали результатами определения ТБК-реагирующих продуктов.

Рис. 5. Содержание ТБК-РП в плазме крови крыс при интоксикации со-волом и коррекции гуминовыми веществами на 3 и 10 сутки исследования

Максимальная концентрация продуктов тиобарбитуровой кислоты на третьи сутки в группе сравнения указывает на интенсификацию процессов свободноради-кального окисления липидов, которое несколько снижается (на 10 сутки) вследствии включения антиоксидантных защитных систем организма (рис. 5). Применение

компонентов гуминовых веществ вызывает понижение уровня ТБК-реагирующих продуктов по отношению к группе сравнения на 24% при использовании фульво-вых, на 63,7% - гиматомелановых, на 43,0% - гуминовых и 46,8% - 1умусовых кислот пелоидов.

Влияние гуминовых веществ пелоидов на ферментативное звено антиокси-дантных систем исследовали по активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и глутатионперокидазы (ГПО) до и после интоксикации бифенилами (табл.7).

Таблица 7

Активность ферментов плазмы крови крыс на 3 сутки исследования

Группа животных СОД, Ед/мл Каталаза, Ед/мл ГПО, Ед/мл

Контроль 57,01±0,2 2,13±0,02 787±18,9

Сравнение 38,4±0,28 1,38±0,02 466±21,6

ГМК 58,61±0,20 2,13±0,09 709±24,92

ГК 55,73±1,61 2,00±0,02 630±23,83

ГсК 58,87±0,75 2,30±0,02 818 ±30,83

ФК 58,72±0,77 2,13±0,05 709±24,92

Введение «Совола» достоверно снижает активность всех антиоксидантных ферментов. При лечении экспериментальных животных растворами гуминовых веществ пелоидов уже к 3-им суткам наблюдалось повышение активности глутати-онпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы, которая достигало нормативных значений.

Таким образом, определение количественных характеристик хемилюминес-ценции, ТБК-реагирующих продуктов и показателей основных антиоксидантных ферментов плазмы крови подтвердило, что свободнорадикальное окисление поддается коррекции при введении гуминовых веществ пелоидов.

Объективным критерием оценки антиоксидантной активности являются гистологические исследования. Гистологическая картина свидетельствует о том, что при моделировании окислительного стресса у крыс в печени развиваются выраженные патологические изменения, такие как гибель эпителиоцитов, нарушение радиального расположения печеночных балок и разрыв анастомозов между ними, изменение формы и размеров гепатоцитов. Часть гепатоцитов лишена ядер или находится в состоянии гидропической и баллонной дистрофии и характеризуется отсутствием гликогена в гепатоцитах печеночных долек. На десятые сутки в центральных зонах печеночных долек формируются очаги некроза с усилением венозного застоя (рис.6).

Рис. 6. Микрофото ткани печени крысы при интоксикации «Соволом». 10 сутки наблюдения. ШИК-реакция но Мак-Манусу. Ув. 400

Рис. 7. Микрофото го-могената печени крыс на фоне интоксикации «Соволом» и лечении ГМК, 3 сутки наблюдения. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.

Рис. 8. Действие ГМК на фоне интоксикации, 10 сутки наблюдения. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.

Под влиянием фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот на 3 сутки происходит уменьшение патологических изменений: синусоиды гемока-гшлляров умеренно расширены, причем степень расширения уменьшается от центра к периферии, в стенках сосудов и желчных протоков дистрофические изменения носят очаговый характер, большинство гепатоцитов имеют нормальную форму, размеры и структуру (рис.7). На 10 сутки в клетках обнаруживается гликоген, очаги некроза отсутствуют, структура стенки междольковых артерий и желчных протоков в триадах практически не отличается от структуры ткани печени крыс контрольной группы (рис. 8). Таким образом, для коррекции метаболических нарушений при острой интоксикации использованы антиоксидантные препараты группы гуминовых веществ.

Экспериментальные данные, полученные различными физико-химическими и химическими методами подтверждают антиоксидантную активность гуминовых веществ пелоидов, которая возрастает в ряду фульвовых, гумусовых, гуминовых, гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей.

ВЫВОДЫ:

1. Установлена и экспериментально подтверждена зависимость антиоксидант-ных свойств в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей от характера сопряжения и особенностей структурной организации макромолекул.

2. Специфические органические вещества, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, на основании совокупности результатов элемент-

ного, фотометрического и спектрального анализа относятся к группе гуминовых веществ и образуют генетический ряд: фульвовых, гиматомелановых и гуминовых кислот, характеризующихся как общими и специфическими свойствами.

3. Установлен структурно-групповой состав фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов методами ИК-, ЯМР- , ЭПР- спектроскопии. Гиматомелановые кислоты отличаются от других фракций присутствием карбонильных атомов углерода хиноидной, сложноэфирной, еноловой и кетонной природы. Детализирована природа парамагнитных центров, свидетельствующая о высокой реакционной способности гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей.

4. Получены количественные характеристики окислительно-восстановительной активности в ряду гуминовых веществ пелоидов в условиях in vitro манометрическим, амперометрическим и хемилюминесцентным методами. Все фракции гуминовых веществ обладают антиоксидантной активностью, которая возрастает в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые, гиматомелановые кислоты и зависит от особенностей структурной организации соединений, определяющим фактором которой является характер сопряжения. Высокая антиоксидантная активность (in vitro) гиматомелановых кислот обусловлена сопряжением хиноидно - енолового типа с включением сложноэфирных фрагментов. Обнаружено, что гуминовые и гумусовые кислоты проявляют прооксидантные свойства, при увеличении концентрации их антиоксидантная активность уменьшается.

5. Разработаны методики амперометрического количественного определения отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей. Относительная ошибка методик определения не превышает для фульвовых кислот - 3,4 %, гиматомелановых кислот - 2,7%, гуминовых - 4,5% и гумусовых кислот -3,6 % . Валидационная оценка количественного амперометрического определения гуминовых веществ показала, что методики линейны, воспроизводимы и правильны.

6. Впервые доказана способность отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов диализировать через биологическую мембрану, возрастающая в ряду: фуль-вовые-гиматомелановые - гуминовые - гумусовые кислоты. Биодоступность возрастает в присутствии трансагентов и ионов металлов и с понижением кислотности раствора.

7. По результатам гематологических и гистологических исследований выявлена способность гуминовых веществ пелоидов нивелировать воздействие свободно-радикального окисления при моделировании окислительного стресса in vivo, приводя показатели антиоксидантной защиты организма к норме. Установлено возраста-

ние антиоксидантной активности в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые, гима-томелановые кислоты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Аввакумова Н.П. Роль гумусовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в ликвидации антропогенного загрязнения / Н.П. Авакумова, М.А. Кривопалова, A.B. Жданова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Специальный выпуск «ХПконгресс «Экология и здоровье человека», т1,2007.

2. Катунина Е.Е. Динамика морфологических изменений в иммунокомпетентных органах крыс с адьювантным артритом в присутствии ГМК / Е.Е. Катунина, Н.П. Аввакумова, В.В. Российская, A.B. Жданова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Специальный выпуск «XIII конгресс «Экология и здоровье человека», т2,2008 С

3. Аввакумова Н.П. Амфифильность гумусовых кислот как фактор гомеостаза лечебных грязей / Н.П. Аввакумова, Е.Е Катунина, М.А. Кривопалова, М.Н. Глубокова, A.B. Жданова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Тематический выпуск. Том 11 (27) №1 (6), 2009

4. Аввакумова Н.П. Оптимизация диализа гуминовых кислот (статья) / Н.П. Аввакумова, М.Н. Глубокова, Е.Е. Катунина, М.А. Кривопалова, A.B. Жданова, В.Я. Кириллова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. Тематический выпуск. Том 11 (27) №1 (6), 2009

5. Аввакумова Н.П. Некоторые особенности функционально-группового состава гумусовых кислот пелоидов/ Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, И.В. Фомин, A.B. Жданова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. № 11,2010 С.24-27

6. Аввакумова Н.П. Антиоксидантные свойства гуминовых веществ пелоидов / Н.П. Аввакумова, А.Я. Герчиков, В.Р.Хайруллина, A.B. Жданова// Химико-фармацевтический журнал, т.45, №3,2011 С. 50-51

7. Кривопалова М.А. Проницаемость в ряду гумусовых кислот пелоидов / Н.П. Аввакумова, М.Н. Глубокова, A.B. Жданова // Труды IV Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» - Санкт-Петербург, 2007

8. Глубокова М.Н. Стандартизация биологически активной субстанции «гуминовые кислоты пелоидов» методом спектрофотометрии / М.Н.Глубокова, А.В.Жданова, Е.Е. Катунина // Сборник трудов II международной научной конференции молодых ученых-медиков. В 3-х томах,- Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2008.-T.III-c.328

9. Аввакумова Н.П. Анализ термодинамических характеристик и биоэнергетических потенциалов в ряду гумусовых кислот иловых сульфидных грязей / Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, М.Н. Глубокова, A.B. Жданова // Биология: теория, практика, эксперимент: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 100 летию со дня рождения Е.В. Сапожниковой -Саранск, 2008.-Кн. 1.-С. 137-140.

10. Awakumova N.P. Structural components and biological activity among humic substances of low-mineralized silt sulphide muds.// N.P. Awakumova, A.V. Zhdanova // International humic substances society "From molecular understanding to innovative applications of humic substances"-Moscow- St.Peterburg, 2008

11. Аввакумова Н.П. Биодоступность компонентов лечебных грязей курорта «Сергиевские минеральные воды» / Н.П. Аввакумова, М.Н. Глубокова, A.B. Жданова // Научно-практическая конференция по восстановительной медицине, курортологии физиотерапии, посвященной 175-летию санатория «Сергиевские минеральные воды» - Серноводск, 2008. -С. 17-16.

12. Аввакумова Н.П. Биологическая активность гумусовых кислот в сверхмалых дозах / Н.П. Аввакумова, М.А.Кривопалова, М.Н. Глубокова, A.B. Жданова //Механизмы действия сверхмалых доз: тез. докл. 4 Междунар. симпоз.-М., 2008.-С. 3-4.

13. Аввакумова Н.П., Про- и антиоксидантные свойства гуминовых кислот пелоидов / Н.П. Аввакумова, М.Н. Глубокова, A.B. Жданова // XVI Международная научно-практическая конференция «Экология и жизнь» апрель 2009, Пенза - стр. 6

14. Аввакумова Н.П. Исследование адсорбционных свойств гиматомелановых кислот пелоидов // Н.П. Аввакумова, М.А Кривопалова, A.B. Жданова // VII Всероссийская конференция с Молодежной научной школой «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009», 1-5 июля 2009г, Уфа, стр 97.

15. Аввакумова Н.П. Манометрическое определение антиоксидантных свойств гиматомелановых кислот пелоидов / Н.П. Аввакумова, А.Я. Герчиков, В.Р. Хайруллина, A.B. Жданова, М.А. Кривопалова, М.Н. Глубокова // VII Всероссийская конференция с Молодежной научной школой «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009», 1-5 июля 2009г, Уфа, стр.101

16. Жданова A.B. Инновационные подходы к использованию лечебных грязей Самарской области // Всероссийская конференция «Аспирантские чтения, 2009», Умник, коммерциализация результатов научно-технической деятельности» Самара, 2009

17. Жданова A.B. Степень окисленности и антиоксидантные свойства в ряду гумусовых кислот //«Аспирантские чтения, 2009», труды региональной конференции «Молодые ученые - медицине», Самара, 2009 С.

18. Аввакумова Н.П. Антиоксидантные свойства гумусовых кислот в условиях in vitro и in vivo // Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А, Глубокова М.Н., Жданова A.B. // Труды V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» - Санкт-Петербург, 2010г, стр 13219. Кривопалова М.А. Адсорбционные равновесия в системе гуминовые кислоты -Ag+ / М.А.

Кривопалова, Н.П. Аввакумова, С.Х. Шарипова, A.B. Жданова // Труды V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» - Санкт-Петербург, 1-4 марта 2010г, -256 стр

20. Аввакумова Н.П. «Оценка металлосвязывающей способности гумусовых кислот» / Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, A.B. Жданова // «Экология и жизнь»: сборник статей XVIII Международной научно-практической конференции. - Пенза: Приволжский Дом знаний, 2010, стр 5-7

21. Аввакумова Н.П. Исследование антиоксидантной активности гуминовых кислот пелоидов амперометрическим и хемилюминесцентным методом / Н.П. Аввакумова, A.B. Жданова, М.А. Кривопалова // Материалы международной конференции по аналитической химии и экологии, Казахстан, 2010 С. 215-216

22. Жданова A.B. Характеристика антиоксидантной активности гиматомелановых кислот пе-лоидов / A.B. Жданова, Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, М.Н. Глубокова// VII Международной конференции «Биоантиоксидант», тезисы докладов, г. Москва, 2010 - С. 155-157.

23. Удостоверение на рационализаторское предложение № 122 ГОУ ВПО «СамГМУ Росздра-ва» от 1 февраля 2011г. «Средство природного происхождения для лечения инфицированных ран на основе хелатокомплекса гуминовых кислот пелоидов с ионами серебра» / A.B. Жданова, Н.П. Аввакумова, Ю.В. Жернов.

Автор выражает глубокую признательность д.х.н., член-корреспонденту РАН, профессору Джемилеву У.М., д.ф-м.н., с.н.с., профессору Лебедеву Ю.А, д.х.н., профессору Герчикову А.Я., д.х.н., профессору Яшину Я.И., д.м.н., профессору Камилову Ф.Х., к.м.н., доценту Российской В.В. за консультации при проведении экспериментов.

Формат 60x84. Печ. л. 1,0. Тираж 120 экз. Бумага офсетная. Печать оперативная. Заказ 482. Отпечатано в Центре Оперативной Полиграфии ООО «Стройкомплект». г. Самара, 443010, ул. Молодогвардейская, 104, тел.: (846) 333-33-32

Актуальность темы. Живой организм, как открытая термодинамическая система, активно реагирует на негативные изменения биосферы, и вместе с тем, характеризуется высоким постоянством состава внутренней среды. Поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза, как неотъемлемого свойства живых организмов, обеспечивается комплексом взаимосвязанных биохимических процессов. Нарушение функций редокс-систем тканей и органов является важным звеном патогенеза ряда заболеваний, к которым относятся сахарный диабет, гепатиты различной этиологии [97], патологии сердечно-сосудистой системы [12; 110; 204], множество онкологических [15, 160] и аутоиммунных заболеваний, в том числе, ревматоидный полиартрит, склеродермия и другие [86; 92]. Сказанное обуславливает активный поиск средств лечения окислительно-восстановительных нарушений и коррекции свободнорадикального статуса организма. С этой целью широко используются синтетические антиоксидантные препараты, такие как ионол [110], пробу-кол (фенбутол) [91; 152], диметилсульфоксид, мексидол [20, 79] и другие, применение которых ограничено рядом противопоказаний. Причинно-следственные отношения между терапевтическим эффектом и побочными действиями синтетических препаратов остаются недостаточно изученными. Иногда токсическое действие лекарственных средств на организм становится источником серьезных патологий. Вместе с тем, далеко не полностью исчерпаны возможности по разработке и внедрению в фармацевтическую практику терапевтических препаратов на основе природных соединений. Приоритетной задачей фармации в настоящее время является создание инновационных лекарственных субстанций на основе отечественного природного сырья для производства современных конкурентоспособных фармацевтических препаратов.

Перспективными с этой точки зрения являются гуминовые вещества, которые предполагают реализацию терапевтического эффекта на субклеточном и молекулярном уровне. Актуально фармацевтическое использование гуминовых веществ пелоидов, формирующихся в восстановительных условиях при участии сульфатредуцирующих микроорганизмов, что отражается на их структуре и химических свойствах, которые определяют биологическую активность соединений. Гуминовые вещества обладают широким спектром терапевтического действия, что подтверждается экспериментальными исследованиями последних лет. Специфические органические вещества обладают адаптогенным [141], антитоксическим [5, 65], противомикробным [43], диуретическим [38], противовоспалительным [3, 6, 58] действием, а также являются универсальной матрицей, позволяющей ввести в организм человека необходимые микроэлементы в активной форме [3,7].

Отсутствие в информационных источниках сведений о влиянии гуминовых веществ пелоидов на окислительно-восстановительные процессы обуславливает актуальность и новизну проведенного исследования.

Цель работы. Исследование зависимости антиоксидантных свойств гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей от их структурной организации.

Задачи исследования:

1. Выделить и идентифицировать по общепринятым критериям гуминовые вещества низкоминерализованных иловых сульфидных грязей: фульвовые, гиматомелановые, гуминовые и гумусовые кислоты.

2. Исследовать структурные компоненты гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей физико-химическими методами: инфракрасной спектроскопии (ИКС), ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).

3. Разработать методы количественного анализа гумусовых кислот и их компонентов: фульвовых, гиматомелановых и гуминовых кислот.

4. Охарактеризовать в сравнительном аспекте про- и антиоксидантные свойства отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в условиях «in vitro».

5. Оценить биодоступность отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей на модельных опытах.

6. Изучить антиоксидантную активность фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов по основным гематологическим характеристикам в условиях «in vivo».

Научная новизна исследования

Получены новые сведения о структурных компонентах фульвовых, гиматомелановых, гуминовых кислот с использованием ИК, ЯМР, ЭПР-спектроскопии. Установлены особенности молекулярной структуры гуминовых веществ пелоидов.

Впервые уточнена и детализирована природа парамагнитных центров в молекулах гуминовых веществ пелоидов, свидетельствующая об их высокой реакционной способности. Установлены соотношения электронодонорных и электроноакцепторных свойств гуминовых веществ пелоидов.

Получены новые данные о влиянии гуминовых веществ пелоидов на динамику окислительного стресса в эксперименте. Выявлена антиоксидант-ная активность фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов, раскрывающая перспективность их использования в фармацевтической практике.

Впервые предложен способ количественного определения гуминовых веществ пелоидов методом амперометрии, который может быть использован для стандартизации лекарственных субстанций.

Практическая значимость. Данные об антиоксидантной активности гуминовых субстанций являются основой при выработке алгоритма по рациональной пелоидотерапии с позиций доказательной медицины.

Совокупность сведений о составе, структурной организации, а также количественные характеристики антиоксидантной активности и биодоступности гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей являются необходимой базой для создания стандартизированных субстанций и лекарственных препаратов с целью дальнейшего использования в медицинской и фармацевтической практике.

Внедрение результатов работы позволит создать новый для России класс лекарственных средств сочетанного действия на основе экологически чистых природных веществ с доступной сырьевой базой.

Преимуществами применения пелоидопрепаратов, по сравнению с на-тивным грязелечением, является уменьшение противопоказаний и возможность использования лечебного фактора вне курортных зон.

По результатам исследований оформлено рационализаторское предложение:

- удостоверение на рационализаторское предложение № 122 от 1 февраля 2011г. «Средство природного происхождения для лечения инфицированных ран на основе хелатокомплекса гуминовых кислот пелоидов с ионами серебра».

Результаты диссертационного исследования внедрены:

• В учебный процесс на кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 1.03.2011);

• В учебный процесс на кафедре химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (акт внедрения от 1.03.2011).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Принадлежность субстанций выделенных из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей к классу гуминовых веществ, а именно: фульво-вым, гиматомелановым и гуминовым кислотам, по общепринятым идентификационным признакам: элементному составу, ИК-спектроскопии, коэффициенту цветности.

2. Генетическое сходство представителей веществ гуминового ряда по совокупности результатов, полученных физико-химическими методами анализа: инфракрасной спектроскопии, ядерно-магнитного резонанса, электронного парамагнитного резонанса.

3. Антиоксидантная активность в ряду гуминовых веществ пелоидов в условиях in vitro по результатам амперометрического, манометрического и хемилюминесцентного методов.

4. Результаты определения биологической доступности отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей на модельных опытах.

5. Методика количественного анализа фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов как основа для стандартизации лекарственных субстанций.

6. Сравнительный анализ антиоксидантной активности в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в условиях in vivo.

Апробация работы

Результаты , диссертационной работы доложены и обсуждены на «XII конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2007), межрегиональной научно-практической конференции по вопросам восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии, посвященной 175-летию ФГУ «Санаторий «Сергиевские минеральные воды» (г. Самара, 2008), XVI и XVIII Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (г. Пенза 2009, 2010), IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (г. Москва, 2008), VII Всероссийской конференции с Молодежной научной школой «Химия и медицина, ОРХИМЕД-2009» (г. Уфа, 2009), региональной конференции «Молодые ученые - медицине», «Аспирантские чтения, 2009» (г. Самара, 2009), V Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (г. Санкт-Петербург, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 22 работы, из них 6 работ — в ведущих рецензируемых журналах ВАК.

Связь задач исследования с планами научных работ

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (государственная регистрация № 01200809998).

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 33 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), трех глав (глава 3,4,5), отражающих результаты собственных исследований, заключения, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 209 источников, из которых 65 - на иностранных языках.

ВЫВОДЫ:

1. Установлена и экспериментально подтверждена зависимость антиокси-дантных свойств в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей от характера сопряжения и особенностей структурной организации макромолекул.

2. Специфические органические вещества, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, на основании совокупности результатов элементного, фотометрического и спектрального анализа относятся к группе гуминовых веществ и образуют генетический ряд: фульвовых, гиматомелановых и гуминовых кислот, характеризующихся общими и специфическими свойствами.

3. Установлен структурно-групповой состав фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов методами ИК-, ЯМР- , ЭПР- спектроскопии. Гиматомелановые кислоты отличаются от других фракций присутствием карбонильных атомов углерода хиноидной, сложноэфирной, еноловой и кетон-ной природы. Детализирована природа парамагнитных центров, свидетельствующая о высокой реакционной способности гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей.

4. Получены количественные характеристики окислительно-восстановительной активности в ряду гуминовых веществ пелоидов в условиях in vitro манометрическим, амперометрическим и хемилюминесцентным методами. Все фракции гуминовых веществ обладают антиоксидантной активностью, которая возрастает в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые, гиматомелановые кислоты и зависит от особенностей структурной организации соединений, определяющим фактором которой является характер сопряжения. Высокая антиокси-дантная активность (in vitro) гиматомелановых кислот обусловлена сопряжением хиноидно - енолового типа с включением сложноэфирных фрагментов. Обнаружена полимодальная зависимость антиоксидантной активности гуминовых и гумусовых кислот.

5. Разработаны методики амперометрического количественного определения отдельных фракций гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей. Относительная ошибка методик определения не превышает для фульвовых кислот - 3,4 %, гиматомелановых кислот — 2,7%, гуминовых — 4,5% и гумусовых кислот -3,6 % . Валидационная оценка количественного амперомет-рического определения гуминовых веществ показала, что методики линейны, воспроизводимы и правильны.

6. Доказана способность отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов диализировать через биологическую мембрану, возрастающая в ряду: гумино-вые-гумусовые-гиматомелановые-фульвовые кислоты. Биодоступность возрастает в присутствии трансагентов и ионов металлов и с повышением рН раствора.

7. По результатам гематологических и гистологических исследований выявлена способность гуминовых веществ пелоидов нивелировать воздействие свободно-радикального окисления при моделировании окислительного стресса in vivo, приводя показатели антиоксидантной защиты организма к норме. Установлено возрастание антиоксидантной активности в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые, гиматомелановые кислоты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Главным патогенетическим фактором любого заболевания являются свободные радикалы. Их образование стимулируют различные неблагоприятные экологические условия и электромагнитное воздействие (ежедневное пользование сотовыми телефонами, компьютерами).

Любая клетка организма способна к генерации активных форм кислорода, что приводит к окислительному стрессу, который способствует возникновению различных заболеваний и патологий. Применение антигипоксантов и антиокси-дантов позволит увеличить биологический возраст человека и способность организма противостоять вредным воздействиям окружающей среды, а так же различным патологическим процессам. В случае заболевания, необходимо вначале предотвратить окислительный стресс, который инициирует дальнейшие патологические процессы (например, воспаление) путем назначения антиоксидантов. Препараты природного происхождения, по сравнению с синтетическими, наряду с биологической активностью, обладают, как правило, минимумом побочных эффектов. Поэтому актуальным является поиск новых препаратов, природного происхождения, причем приоритетным направлением является разработка действующих веществ комплексного характера, обладающих разнонаправленным действием на животные организмы.

Гуминовые вещества низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, представляющие собой биотермодинамически устойчивые соединения, которые образуются в результате разложении и биотрансформации растительных и животных остатков, относятся к группе биологически активных веществ сочетанно-го действия. Они состоят из нескольких фракций, основными из которых являются фульвовые, гиматомелановые и гуминовые кислот. Каждая из фракций представляет собой не индивидуальное соединение, а группу соединений близких по молекулярной структуре, массе, способу выделения и ряду физико-химических свойств. Гумусовые кислоты имеют более сложный состав, включающий все фракции гуминовых веществ, с преобладающим содержанием гуминовых и фульвовых кислот. При получении гумусовые кислоты выделяют в первую очередь. Вещества, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, по ряду количественных характеристик и качественных показателей (элементному составу, коэффициентам экстинкции и характеристическим полосам в спектрах) относятся к группе гуминовых.

Рассчитанные по результатам элементного анализа общепринятые соотношения показывают, что максимальная степень обуглероженности характерна для гуминовых кислот и убывает через гиматомелановые к фульвовым. Значение соотношения водорода и углерода используется для оценки доли ароматической и алифатической составляющей в составе соединений. Значения Н/С < 1 характеризуют преобладание ароматических фрагментов, а при значении соотношения > 1 — алифатических фрагментов в составе соединений. Анализ указанного соотношения позволяет предположить в составе гуминовых кислот значительной доли ароматической составляющей, представленной в остальных фракциях в меньшей степени. Отношение О/С имеет наибольшее значение (1,55) в фульвовых кислотах и наименьшее (0,39) в гиматомелановых кислотах.

Расчет степени окисленности с учетом количества углерода, кислорода и водорода является косвенной характеристикой окислительно-восстановительных свойства исследуемых фракций. Фульвовые кислоты, имеющие наибольшее значение степени окисленности, обладают, по—видимому, менее выраженными восстановительными свойствами по сравнению с гиматомелановыми, которые характеризуется явным преобладанием восстановительных свойств. Для гуминовых кислот характерно значение степени окисленности, близкое к нулю, что свидетельствует о высокой окислительно-восстановительной буферности и химической стабильности соединений данной фракции. Рассчитанная на основании результатов элементного анализа степень бензоидности подтверждает выявленный характер изменения ароматичности, который согласуется с коэффициентами экс-тинкций фракций гуминовых веществ. Степень бензоидности увеличивается в ряду фульвовые, гиматомелановые, гуминовые кислоты.

Анализ ИК- и ЯМР-спектров позволил с достаточной определенностью выявить как сходство молекулярной структуры всех фракций гуминовых веществ пелоидов, так и особенности их строения. Все гуминовые вещества характеризуются присутствием алифатических фрагментов метильного и метиленового типа, а также сигналов связей О-Н, причем форма полос свидетельствует о структурированном характере спиртовых фрагментов, по-видимому, за счет водородных связей. Для всех фракций характерно наличие карбоксильных групп, достоверно установленных как ИК-, так и ЯМР-спектрами, а также сигналов, которые можно отнести как к сигналам ароматических структур, так и ненасыщенных фрагментов типа олефиновых. Скорее всего указанные сигналы являются проявлением совокупности всех ненасыщенных фрагментов, включая колебания С=С в хиноидных молекулах. Таким образом, в фульвовых кислотах преобладают разветвленные алифатические цепочки с большим количеством спиртовых групп типа углеводов. Молекулярная структура гуминовых кислот представляет собой ароматический каркас, в котором боковые алифатические радикалы включают карбоксильные и спиртовые группы. Установлено, что гиматомелано-вые кислоты по своей молекулярной структуре имеют существенные отличия от структур других фракций, прежде всего, присутствием множества карбонильных атомов углерода различной природы: хиноидной, сложноэфирной, еноловой, ке-тонной. Указанная особенность молекулярного строения гиматомелановых кислот определяет наиболее выраженную степень сопряжение структурных фрагментов, и ее можно условно отнести к наиболее ненасыщенной фракции пелоидов. Наличие в молекулах гуминовых веществ широкого спектра функциональных групп (карбоксильных, гидроксильных, карбонильных, азот и серусодержа-щих) в сочетании с присутствием ароматических и алифатических фрагментов обеспечивает способность гуминовых веществ вступать в ионные и донорно-акцепторные взаимодействия, образовывать водородные связи. Это обуславливает их высокую реакционную способность и представляет возможность получения новых высокоэффективных пелоидопрепаратов широкого спектра действия и дальнейшего изучения их механизмов действия. Таким образом, анализ положения и относительной интенсивности характеристических полос спектров показал, что молекулярная структура гуминовых кислот представлена ароматическими и алифатическими фрагментами, в фульвовых кислотах преобладают группы хиноидного и спиртового характера. В структуре гиматомелановых кислот содержится, кроме алифатической и ароматической части, максимальное по сравнению с другими фракциями количество карбонильных групп хиноидного, спиртового, сложноэфирного характера. Концентрация парамагнитных центров, определенная с помощью электронного парамагнитного резонанса, свидетельствует о том, что минимальное число свободных радикалов содержат молекулы фульвовых кислот. Концентрация свободных радикалов в гуминовых кислотах имеет промежуточное значение и находится в интервале между фульвовыми и гиматомелановыми кислотами. Таким образом, данные ЭПР согласуются с особенностями молекулярной структуры соединений гуминовой природы.

Антиоксидантная активность всех фракций гуминовых веществ пелоидов была доказана химическими методами. Исследуемые фракции обладают антиок-сидантной активностью и тормозят окисление 1,4-диоксана в модельной системе. Наибольшим ингибирующим действием обладают гиматомелановые кислоты, незначительное количество которых вызывает практически полное торможение окислительного процесса. Выяснено, что гуминовые кислоты обладают как антиоксидантными, так и прооксидантными свойствами при возрастании их концентрации, что возможно, связано с усилением межмолекулярных взаимодействий. Количественные кинетические характеристики скорости ингибирования и эффективная константа скорости ингибирования увеличиваются в ряду: фульво-вые, гумусовые, гуминовые, гиматомелановые кислоты.

Результаты хемилюминесцентного определения антиоксидантной активности подтверждают закономерности манометрического исследования.

Применение амперометрического метода для определения суммарного содержания антиоксидантов по кверцетину позволило выявить, что эффективность проявления субстанциями антиоксидантная активность зависит от их концентрации обратно пропорционально: чем меньше содержание препарата, тем выше антиоксидантная активность фракций. Следует отметить, что наибольшее содержание антиоксидантов при малых концентрациях характерно для гиматомелановых кислот. Полученные результаты позволят в будущем при создании лекарственных средств на основе субстанций регулировать соотношение «доза — эффект».

Полученные в работе результаты амперометрического анализа позволяют использовать его как один из способов стандартизации гуминовых веществ, так как установлено, что суммарное содержание антиоксидантов прямолинейно зависимость от концентрации гуминового вещества.

Важным фармакокинетическим свойством любого потенциального лекарственного средства является его биологическая доступность. В работе доказана биодоступность гуминовых веществ методом диализа через мембрану животного происхождения. Степень диализа зависит от кислотности раствора: чем больше значение водородного показателя, тем больше степень диализа. При уменьшении значений рН до 4,0 происходит резкое уменьшение степени диализа в 5, 7 и 8 раз в фульвовых, гиматомелановых и гуминовых кислотах соответственно. Наибольшая степень диализа при физиологической кислотности (7,4) характерна для фульвокислот (0,5), а наименьшая для гуминовых кислот (0,2). Гиматомелановые кислоты характеризуются промежуточным значением е равным 0,35. Введение диметилсульфоксида и ионов металлов улучшает способность гуминовых веществ к диализу. Отмеченные особенности диализа определяются, по-видимому, непостоянством конформационных форм гуминовых веществ.

Изучение антиоксидантных свойств гуминовых веществ пелоидов в условиях in vivo, на модели окислительного стресса, вызванного добавлением поли-хлорированных бифенилов, показало, что они обладают эффективными антиок-сидантными свойствами, поскольку угнетают свободнорадикальное окисление модельной системы, причем наибольшей способностью угнетать свободно-радикальное окисление модельной системы обладают гуминовые и гиматомелановые кислоты, у которых светосумма снижается на 79% и 45% соответственно. Под действием фульвовых и гумусовых кислот пелоидов показатель светосуммы снижался, но незначительно. Введение гуминовых кислот перорально и парентерально показало, что их антиоксидантное действие не зависит от пути введения.

Таким образом, установлено, что при острой затравке крыс соволом инициируются процессы свободнорадикального окисления, развивается недостаточность антиокислительной защиты, токсическое поражение печени.

Коррекция нарушений метаболических процессов у животных препаратами гуминового ряда снимала тяжесть поражения гепатоцитов, активировала антирадикальные резервы организма, причем на третьи сутки гуминовые вещества оказывают существенное антиоксидантное действие, активируя ферментные системы организма.

Объективным критерием оценки антиоксидантной активности являются гистологические исследования. Воздействие дифенилов значительно вызывают нарушения структуры печени. Наблюдается массивная гибель эпителиоцитов, нарушение радиального расположения печеночных балок и разрыв анастомозов между ними, изменена форма и размеры гепатоцитов, часть гепатоцитов лишена ядер, или находится в состоянии гидропической и баллонной дистрофии, отсутствует гликоген в гепатоцитах печеночных долек. При лечении крыс гуминовы-ми веществами пелоидов восстанавливается структура стенок желчных протоков, выявляются зерна гликогена, застой в венозных сосудах уменьшается, восстанавливается структура стенки междольковых желчных протоков, выявляются зерна гликогена отсутствуют микроочаги некрозов.Таким образом, экспериментальные данные, полученные различными физико-химическими и химическими методами подтверждают антиоксидантную активность гуминовых веществ пелоидов, которая возрастает в ряду фульвовых, гумусовых, гуминовых, гиматоме-лановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей.

117