Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-фармацевтические свойства гуминовых кислот пелоидов как биологически активной субстанции для суппозиториев

На правах рукописи

ГЛУБОКОВА МАРИЯ НИКОЛАЕВНА

ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ПЕЛОИДОВ КАК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ ДЛЯ СУППОЗИТОРИЕВ

15.00.02 - фармацевтическая химии и фармакогнозия

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Ге

ПЯТИГОРСК 2009

1 О ДЕК 2009

003488677

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Аввакумова Надежда Петровна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Оганесян Эдуард Тоникович кандидат фармацевтических наук Санакоев Юрий Амиранович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится 23 декабря 2009 года в 900 часов на заседании диссертационного совета Д.208.069.01. при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава.

Автореферат разослан «23» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ж/' Е.В. Компанцева

Актуальность темы. Одним из интересных и перспективных источников биологически активных веществ, с точки зрения экономической и терапевтической эффективности, являются низкоминерализованные иловые сульфидные грязи - пелоиды, представляющие собой сложный комплекс как неорганических, так и органических веществ.

Иловые сульфидные грязи наиболее распространены в Российской Федерации. Преобладающим компонентом низкоминерализовшшых иловых сульфидных грязей являются гуминовые кислоты, которые в настоящее время получили широкое применение в ветеринарии, растениеводстве как эффективные биостимуляторы и протекторы.

Пелоиды применяются как в народной, так и официальной медицине в качестве противовоспалительных средств, а также при патологиях опорно-двигательного аппарата, центральной и периферической нервной системы, желудочно-кишечного тракта, JIOP-органов, в гинекологии, андрологии. Однако нативная пелоидотерапия, являясь нагрузочной процедурой, имеет определенные ограничения в применении и даже противопоказания, обусловленные наличием у пациентов сопутствующих заболеваний. Кроме того, пелоидотерапия связана с пребыванием больных в районе месторождения лечебных грязей, что делает такую терапию малодоступной для многих категорий больных.

В то же время существует возможность решения этих вопросов путем преформирования, то есть выделения из лечебных грязей биологически активных компонентов и создания на их основе лекарственных средств с целью их самостоятельного использования. Предпосылками для такого решения являются многочисленные исследования по составу лечебных грязей и их биологической активности, раскрывающие роль гуминовых кислот как ключевого фактора терапевтического действия низкоминерализованных иловых лечебных грязей (Агапов А.И., 1999; Перминова И.В., 2000; Аввакумова Н.П., 2002). При этом целенаправленного изучения возможности получения стандартизированных лекарственных средств на основе гуминовых веществ в нашей стране в достаточной мере не проводилось. Основной трудностью на пути создания

официнальных гуминовых препаратов является отсутствие методов контроля производства и контроля качества получаемого продукта.

Поэтому исследования по разработке методов стандартизации гуминовых кислот и лекарственных средств на их основе являются актуальными. Применение пелоидопрепаратов сделает лечение дозированным, облегчит их транспортировку и хранение, позволит использовать их в сочетании с другими лекарственными веществами.

Цель исследования - установить физико-химические параметры и биологическую активность гуминовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей и на их основе разработать технологию и способы оценки качества суппозиториев, содержащих исследуемую субстанцию.

Задачи исследования:

1. Выделить из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей сумму гуминовых кислот, провести их идентификацию.

2. Установить физико-химические характеристики полученной субстанции гуминовых кислот Пелоидов.

3. На основе изучения физико-химических свойств разработать методы качественного и количественного анализа субстанции гуминовых кислот.

4. Разработать технологию суппозиториев на основе гуминовых кислот пелоидов и методы стандартизации данного лекарственного средства.

5. Исследовать биологическую активность гуминовых кислот пелоидов в модели иммунного воспаления.

6. Разработать проекты ФСП на биологически активную субстанцию гуминовых кислот пелоидов, суппозитории с гуминовыми кислотами.

Научная новизна. Впервые выделена из отработанных низкоминерализованных иловых сульфидных грязей сумма гуминовых кислот.

Установлены физико-химические параметры гуминовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей: элементный состав, электронные спектры поглощения, молекулярно-массовое распределение, окислительно-восстановительные свойства. Получены новые сведения о

структурной организации гуминовых кислот пелоидов методами ПК-спектроскопии, 'Н-ЯМР, установлено соотношение гидрофильных и гидрофобных структурных компонентов. Все это позволяет дать комплексную характеристику полученной субстанции.

Определена антиоксидантная активность гуминовых кислот пелоидов в условиях in vitro.

Получены новые данные о позитивном влиянии гуминовых кислот пелоидов на динамику воспалительного процесса в условиях in vivo.

Проведенные химико-фармацевтические исследования научно

обосновывают целесообразность использования в медицинской практике лекарственных препаратов, полученных на основе 1уминовых кислот, обладающих антиоксидантными и противовоспалительными свойствами, что позволит расширить ассортимент отечественных лекарственных средств с вышеуказанным спектром терапевтического действия.

Практическая значимость. Совокупность полученных сведений о составе, строении, физико-химических и биологических свойствах гуминовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей является обоснованием дальнейших исследований по созданию новых пелоидопрепаратов в виде различных лекарственных форм и выработке рекомендаций по рациональной пелоидотерапии.

Разработаны методы качественного и количественного анализа биологически активной субстанции гуминовых кислот пелоидов.

Разработана технология суппозиториев на основе гуминовых кислот пелоидов, исследовано высвобождение гуминовых кислот из суппозиториев, разработаны методики качественного и количественного определения действующего вещества - гуминовых кислот в этой лекарственной форме.

По результатам проведенных исследований разработаны проекты ФСП на субстанцию гуминовых кислот, на лекарственное средство - суппозитории с гуминовыми кислотами. Получен патент «Способ анализа гуминовых кислот пелоидов» № 2312343 от 28.11.2005.

Применение пелоидопрепарата позволит снизить стоимость лечения и осуществлять его не только в санаторно-курортных условиях, но и в лечебно-профилактических учреждениях по месту жительства пациентов.

Результаты диссертационного исследования внедрены:

• в учебный процесс на кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (акт внедрения от 15.03.2008 г.);

• в производственный процесс ООО «ПРАНАФАРМ» г. Самары (акт внедрения от 15.03.2008 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Принадлежность субстанции, выделенной из обработанных низкоминерализованных иловых сульфидных грязей Самарского региона, к классу гуминовых кислот по общепринятым идентификационным критериям: элементному составу, ИК-спектрам, коэффициентам цветности.

2. Результаты изучения гуминовых кислот пелоидов совокупностью физико-химических методов анализа: атомно-адсорбционного, ИК-, УФ-, *Н-ЯМР спектроскопии, амперометрического, хроматографического и других.

3. Методы качественного и количественного анализа гуминовых кислот пелоидов.

4. Технология суппозиториев на основе гуминовых кислот и методики качественного и количественного анализа этого лекарственного средства.

5. Данные по биологической активности гуминовых кислот пелоидов в условиях in vivo с позиций доказательной медицины как теоретическая основа для получения отечественного пелоидопрепарата.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на X Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2005), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи,

2005), V научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза,

2006), IX Международной научно-практической конференции (Пенза, 2006.), VI

Всероссийском съезде физиотерапевтов (Санкт-Петербург, 2006 ), ХП, Х1П конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2007, 2008), VI Всероссийской конференции' «Гуминовые вещества в биосфере» (Санкт-Петербург, 2007), II Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2008), межрегиональной научно-практической конференции по вопросам восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии, посвященной 175-летию ФГУ «Санаторий «Сергиевские минеральные воды» (Самара, 2008), Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Сапожниковой Е.В. (Саранск, 2008), III Всероссийской научно-практической конференции «Процессы, технологии, оборудование и опыт переработки отходов и вторичного сырья» (Самара, 2008), IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ, 5 работ -в рекомендуемых ВАК изданиях, получены 2 патента.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (№ государственной регистрации 01200405620).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 140 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы и 3 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 198 источников, в том числе 44 иностранных; содержит 31 рисунок, 27 таблиц и приложение.

Основное содержание работы.

Объектом исследования были отработанные пелоиды озера Серное, находящегося на территории Самарской области и являющимся местом сбора и регенерации отработанной грязи санатория «Сергиевские минеральные воды».

Субстанция гуминовых кислот (ГК) была выделена из пелоидов озера Серное по авторской методике, разработанной на кафедре общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский

университет Росздрава» (патент РФ № 2043107 от 20.07.1992). Изучение физико-химических свойств гуминовых кислот пелоидов

Изучение физико-химических свойств гуминовых кислот проводилось в сравнении со стандартным образцом - гуминовыми кислотами фирмы Merck.

ИК-спектры образцов ГК регистрировали с помощью спектрометра Бресогс!-75 в диапазоне частот 400-4000 см-1.

Таблица 1 - Отнесение полос поглощения (см"1) в ИК спектрах гуминовых кислот

и, см"1 3430 2920 2851 1712 1618 1401 1235 1041

отнесение ОН СНвал. С=0 С=С С-О ОН С-О

вал. вал. вал. i ОН деф. вал.

. Полученные спектральные характеристики (табл. 1) свидетельствуют о наличии в молекулах гуминовых кислот фрагментов ароматической природы, содержащих как спиртовые, так и карбоксильные группы.

В ИК-сгтектрах поглощения гуминовых кислот пелоидоз присутствуют все полосы поглощения, характерные для этой группы гуминовых веществ в сравнении со стандартным образцом.

'Н-ЯМР-спекггры регистрировали с помощью спектрометра ОКХ-500 фирмы Вгикег, с рабочей частотой 400 МГц для ядра 'Н. Ширина развертки спектра составляла около 10 000 Гц (от 0 до 12 м.д.). В качестве внутреннего стандарта использовали сигнал остаточных протонов гексаметилдисилоксана.

Как следует из рис. 1, в спектрах гуминовых кислот можно выделить сигналы:

- протонов углеродного скелета: ароматических (Сдг-Н), протонов карбогидратных, спиртовых и метоксильных фрагментов (СН„-Н), алифатических в а-положении к карбоксильной группе или ароматическому кольцу (а- СН„) и алифатических, находящихся к указанным группам не ближе, чем в (3-положении (СН„);

? ?

Рисунок 1 - 'Н-ЯМР спектр гуминовых кислот

- подвижных протонов функциональных групп: СООН, Сдг-ОН, Саш-ОН). Как видно из рисунка 1, в протонном спектре гуминовых кислот в ДМСО-с]4 наблюдаются сигналы протонов алифатических групп в области 5=1.2-3.0 ррш. Резонансный сигнал при 5=1.23 ррш относится к метальным группам апкильных цепочек гуминовых кислот. Сигнал при 5=1.80 ррш может быть отнесен к протонам групп СН3 - СО-, а при 5=2.15 ррш соответствует, вероятно, протонам групп -СН2 - СО-. Резонансный сигнал при 5=3.24 ррт обусловлен протонами А1к-ОН, А1-0-. Сигналы при 5=4.68 и 4.78 ррш соответствуют протонам групп -СН=СН-. Кроме того, в области 5=7.00-8.52 ррт наблюдается мощный сигнал протонов ароматических фрагментов (САг-Н+ С^-ОН). Причем сигналы ароматических Сдг-Н протонов перекрываются сигналами протонов фенольных гидроксилов Сдг-ОН.

'Н-ЯМР-метод позволяет определить не только частоту и интенсивность линий поглощения фрагментов макромолекул, но и количественные параметры их взаимодействия с окружающими атомами.

Относительное содержание гидрофобных и гидрофильных фракций было найдено методом амфифильной хроматографии (на кафедре физики почв МГУ).

По экспериментальным данным (табл. 2) можно выявить в гуминовых кислотах шесть фракций по выраженности гидрофильно-гидрофобных компонентов.

Таблица 2 - Относительное содержание гидрофобных и гидрофильных фракций в гуминовых кислотах

Образец Гидрофильная часть Гидрофобная часть

1 2 I 3 4 5 6 I

ГК 9,30 17,04 26,34 35,78 33,59 2,43 1,85 73,65

ГК (Merck) 18,24 22,12 40,36 29,22 25,59 2,97 1,86 59,64

Гидрофильные компоненты могут обусловливать миграцию органических и минеральных веществ в биосубстратах, в то время как малоподвижные гидрофобные компоненты гуминовых кислот пелоидов способны существенно влиять на разнообразные процессы в целом, в частности могут быть носителями фармакофоров. Таким образом, можно предположить механизмы всасывания гуминовых кислот, что может являться основанием для выбора лекарственной формы.

Гель-хроматография как способ фракционирования специфических органических веществ пелоидов позволяет разделить ГК по значениям молекулярных масс.

Таблица 3 - Молекулярно-массовое распределение гуминовых кислот пелоидов

Наименование Номер Молекулярная Содержание фракции, %

группы фракции масса, а.е.м.

ГК I 74 480 73,80

И 33 000 26,20

Результаты изучения молекулярно-массового распределения позволяют сделать вывод, что группа гуминовых кислот представляет собой комплекс полидисяерсных сложных природных высокомолекулярных соединений, а не является индивидуальным веществом. Таким образом, гуминовые кислоты - это

совокупность близких по строению и свойствам органических веществ с различными значениями молекулярной массы.

Результаты изучения физико-химических свойств гуминовых кислот, полученных из отработанных лечебных грязей озера Серное санатория «Сергиевские минеральные воды» позволяют отнести выделенную субстанцию к классу гуминовых кислот.

Разработка методов стандартизации гуминовых кислот пелоидов

Выделенные ГК представляют собой темно-коричневое, почти черное чешуйчатое твердое вещество, без запаха и вкуса, не растворимо в воде и этаноле, мало растворимо в водных растворах щелочей через стадию набухания.

В виду того, что гуминовые кислоты являются сложным биогеохимическим объектом, определение их возможно по данным соввокупности определенных критериев, среди которых элементный состав, степень окисленности, электронные спектры поглощения, ИК спектры.

Определение углерода, водорода, азота, серы проводили на анализаторе фирмы «Карло Эрба» модели 1106, в основу работы которого положено сочетание пиролиза пробы в кислороде в вертикальном реакторе проточного типа с последующим газохроматографическим разделением продуктов (табл. 4).

По результатам элементного анализа определяли степень окисленности гуминовых кислот пелоидов, которую можно рекомендовать как показатель качества для данной субстанции ГК.

Как следует из табл. 4, сезонные колебания элементного состава гуминовых кислот невелики и не выходят за рамки значений, характерных для данной группы специфических органических веществ пелоидов. Это позволило нам не проводить сезонных наблюдений физико-химических свойств гуминовых кислот и ограничиться исследованиями летних образцов.

Таблица 4 - Средний элементный состав гуминовых кислот пелоидов грязи озера Серное в зависимости от сезона года (%)

Определяемый показатель Весна Лето Осень

Углерод (С) Масс. 51,95±1,40 52,97±1,35 54,27±1,48

Мольн. 35,88 37,61 36,49

Водород(Н) Масс. 5,01 ±0,04 4,63+0,03 5,31±0,05

Мольн. 41,53 36,49 42,84

Азот (Ы) Масс. 4,01±0,05 4,13±0,04 4,0310,07

Мольн. 2,37 2,52 2,32

Кислород (О) Масс. 39,03±1,08 38,2711,10 36,39+1,10

Мольн. 20,22 20,38 18,35

Соотношение Н/С 1,03 0,92 1,06

Соотношение О/С 0,57 0,55 0,50

Окисленность 0,09 0,10 0,07

Формула С,5Н|7Н09 С15Н16Ш8 С16Н18Ж)8

Соотношение водород/углерод для гуминовых кислот колеблется в среднем составляет 1,0, что характеризует высокую обуглероженность гуминовых кислот, обусловленную высокой активностью биомасс.

Для идентификации субстанции гуминовых кислот рекомендуются сравнивать ее ИК-спектр поглощения с ИК-спектром стандартного образца. Кроме того, нами был использован спекгрофотометрический метод, применить который позволяет высокая интенсивность поглощения света растворами гуминовых кислот в качестве чувствительного индикаторного и диагностического метода при их изучении (Орлов Д.С., 1997). Как известно, соотношение оптических плотностей Е4:Е6 не зависит от концентрации гуминовых кислот и определяется структурой (табл. 5).

Таблица 5 - Оптическая плотность 0,001% растворов гуминовых кислот

пелоидов

Источник ГК А465 (п=5) А665 (в=5) Е4:Е6

Озеро Серное Весна 0,113+0,008 0,048+0,002 2,35

Лето Л 1М+ППОЯ 0,048Ю,002 2,38

Осень 0,11810,008 0,048+0,001 2,46

В связи с тем, что структура гуминовых кислот позволяет предположить наличие антиоксидантных свойств, нами использовался амперометрический метод определения суммарного содержания антиоксидантов, как показатель качества полученной субстанции.

В работе использовали прибор «Цвет Яуза АА-01», который предназначен для прямого количественного измерения содержания антиоксидантов в биологических объектах. Условную массовую концентрацию антиоксидантов измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала силы тока (нА) от концентрации кверцетина, который использовался в качестве стандарта.

Для построения градуировочного графика кверцетина последовательно регистрировали сигналы стандартных растворов кверцетина в порядке возрастания их концентрации.

Анализ проводили в условиях: постоянно-токовый режим - АД п.т.; потенциал рабочего электрода (Ир) - (+)1,3 В; элюэнт: раствор ортофосфорной кислоты (0,0022 моль/л); скорость потока элюента: 1,2 мл/мин; объем вводимой пробы: 1 мл.

Регистрацию и математическую обработку результатов анализа осуществляли с помощью универсальной компьютерной системы сбора и обработки информации «г-1аЬ» либо «Системы обработки данных АД&КД»

Таблица 6 - Результаты анализа субстанции ГК амперометрическим методом

Метод определения Амаерометрическос определение суммарного содержания антиоксидантов

Линейность, мг/мл от 0,001 до 0,5 (Я2 = 0,993)

Метрологические характеристики п=15 X ±ДХ = 0,0046±0,0003 (мг/г субстанции) Б ср =0,0001; 8,% =6,5

Таким образом, в ходе проведенных исследований показана возможность применения жидкостного хроматографа «Цвет Яуза АА-01» для определения суммарного содержания антиоксидантов в субстанции гуминовых кислот.

Разработка методики количественного определения субстанциии Тумановых кислот

С целью разработки методики количественного определения субстанции ГК нами изучены возможности использования физико-химических методов анализа.

А

Рисунок 2- Спектр поглощения 0,001 % раствора гуминовых кислот (рН= 10,0)

Как следует из рис. 2, спектр поглощения ГК характеризуется наличием характерных максимумов - при длинах волн 350 и 390 нм. В связи с этим представляло интерес изучение возможного применения спектрофотомерии для количественного определения содержания гуминовых кислот в субстанции.

Нами была предложена методика количественного определения гуминовых кислот спектрофотометрическим методом (табл. 7). В качестве стандартного образца был использован препарат гуминовых кислот фирмы Merck.

Таблица 7 - Результаты количественного анализа субстанции ГК методом спектрофотометрии

Метод определения Спектрофотометрическое определение гуминовых кислот

Линейность, мг/мл от 0,01до 0,3 (R2 = 0,994)

Метрологические характеристики П=15 traft, = 2,14 X ±ДХ = 100,6±4,7 (%) Sep =1,81; е,% =4,6, W=0,14

Как следует из представленной таблицы, предлагаемая методика линейна, воспроизводима и правильна, так как t^ > tBbM

Таким образом, в ходе проведенных исследований показана возможность применения прямого спектрофотометрического анализа при длине волны 350 нм для количественного определения ГК.

Разработка технологии суппозяториев, содержащих гуминовые кислоты

Выбор оптимальной основы для суппозиториев с гуминовыми кислотами осуществлялся в опытах in vitro методом диализа через изолированную кишечную стенку быка.

Так как предлагаемое лекарственное средство является ректальными суппозиториями, то в качестве диализной среды использовали буферный раствор с рН = 9,18, что соответствует физиологическому показателю рН слизистой оболочки прямой кишки.

Количественное определение гуминовых кислот в водных растворах определяли спектрофотометрическим методом. Результаты определения высвобождения гуминовых кислот из основ, представленных на рис. 3.

Рисунок 3 - Зависимость высвобождения гуминовых кислот от времени: А-гидрофобная основа (масло какао); Б - гидрофильная основа (желатино-глицериновой основе)

На основании полученных данных рис. 3 можно сделать вывод о том, что наиболее быстрое высвобождение гуминовых кислот наблюдается из гидрофобной основы.

При исследовании технологических показателей предлагаемых суппозиториев использовали показатели: описание, средняя масса, температура плавления и время полной деформации.

На основании проведенных исследований, нами выбран следующий состав одного суппозитория:

. гуминовых кислот - 0,002 г,

суппозиторной основы - достаточное количество

для получения суппозитория массой 1,9-2,1 г.

Было установлено, что извлечение гуминовых кислот можно проводить экстракцией из расплавленной суппозиторной массы. Для определения подлинности использовали идентичность спектра 0,002% извлечения из суппозиторной массы спектру 0,002% раствору СО гуминовых кислот.

Для количественного определения гуминовых кислот в суппозиториях предложен также спектрофотометрический анализ.

Таблица 8 - Результаты количественного определения ГК в суппозиториях спектрофотометрическим методом

(Act = 0,448, аст = 0,1013)

Взято, г (масса суппозитория) Оптическая плотность, А Найдено ГК, г Метрологические характеристики

1,9198 0,455 0,00196 Х±ДХ = 0,0020±0,00007 Sep =0,000029 е, % =3,5

2,0602 0,453 0,00190

1,9789 0,419 0,00192

1,9932 0,442 0,00203

2,0789 0,487 0,00209

2,0103 0,403 0,00200

Как следует из представленных результатов (табл. 8), относительная погрешность (е%) определения гуминовых кислот не превышает 3,5%.

Предлагаемая методика валидирована по основным критериям: правильность, линейность, сходимость.

Кроме спектрофотометрического метода нами исследовалась возможность использования амперометрического определения содержания гуминовых кислот в суппозиториях, используя для расчетов площадь пика стандартного образца гуминовых кислот (Merck).

Таблица 9 - Результаты количественного определения гуминовых кислот пелоидов в суппозиториях (жидкостной хроматограф «Цвет Яуза АА-01») (Б^нАс = 14520,2, а„ = 0,1013)

Взято, г (масса суппозитория) Sx, нАс Найдено ГК, г Метрологические характеристики

1,9198 15467,48 0,00198 Х±ДХ=0,0020±0,00012 Sep =0,000049 £, % = 6,0

2,0602 14522,42 0,00184

1,9789 13553,74 0,00183

1,9932 16003,02 0,00210

2,0789 16428,29 0,00209

2,0103 14152,27 0,00189

Как следует из представлешгых результатов, относительная погрешность (е%) амперометрического определения гуминовых кислот в суппозиториях

17

составляет 6,0%. Предлагаемая методика валидирована по основным критериям: правильность, линейность, сходимость.

Таким образом, в ходе проведенных исследований показана возможность применения жидкостного хроматографа «Цвет Яуза АА-01» для количественного определения ГК в суппозиториях.

Содержание ГК в суппозиториях должно быть от 0,0018 до 0,0022 г.

Для определения сроков годности, суппозитории с гуминовыми кислотами были заложены на хранение.

Результаты визуального контроля показали, что внешний вид суппозиториев в течение одного года хранения не менялся, однако при оценке внешнего вида суппозиториев, хранившихся 1,5 года, было отмечено наличие белого налета, неоднородности окраски. Количество действующего вещества в процессе хранения суппозиториев изменялось незначительно и не превышало допустимых норм содержания. Значение температуры плавления не превышало 36°С, также не наблюдалось ее снижения. Время полной деформации суппозиториев не превышало 15 минут и составляло в процессе хранения 5-6 минут.

Средняя масса суппозиториев в процессе хранения оставалась стабильной. На основании проведенных исследований можно сделать заключение: предлагаемые суппозитории стабильны в течение 12 месяцев, что позволяет ' установить предварительный срок хранения суппозиториев - 1 год. Фармакологические исследования субстанции гуминовых кислот

Выделенная субстанция гуминовых кислот является очищенным концентратом из лечебных грязей.

На первоначальном этапе исследовалась токсичность субстанции ГК.

Об отсутствии токсичности свидетельствовало внутрибрюшинное введение субстанции ГК (250 мг/кг массы). Изучаемый объект относится к IV классу токсичности.

Так как адыовантный артрит представляет собой аутоиммунное воспаление, были изучены изменения в иммунокомпетентных органах.

Хроническое иммунное воспаление моделировали у крыс субплантарным введением в правую заднюю лапу 0,1 мл адъюванта Фрейнда (взвесь БЦЖ в вазелиновом масле).

Введение гуминовых кислот в виде 0,1% водного раствора (рН=7,4) начинали с 14-го дня после инъекции адъюванта и проводили ежедневно в течение 10 дней. Воспалительная реакция оценивалась на 3, 7, 12 сутки после начала введения гуминовых кислот, соответственно на 17, 21 и 26 сутки после индукции воспаления.

Наблюдали за гистологическими изменениями, протекающими в периферических органах иммуногенеза (лимфатических узлах, печени, селезенке).

Гистологическое изучение периферических органов иммуногенеза (лимфатических узлов и селезенки) и печени подтвердило данные об отсутствии признаков токсического действия гуминовых кислот пелоидов на организм крыс при парентеральном введении ЛС.

Применение гуминовых кислот пелоидов в значительной степени купировало воспалительный процесс, вызванный парентеральным введением адъюванта Фрейнда.

Гистологическая картина свидетельствует о том, что при моделировании ревматоидного артрита у крыс в периферических органах иммуногенеза (регионарных лимфатических узлах, селезенке, печени) развиваются выраженные патологические изменения, такие как отек паренхимы и стромы, склероз, утолщение стенок сосудов и другие.

Характерно, что под влиянием гуминовых кислот в динамике происходило уменьшение как количества лимфоидных узелков с герминативными центрами, так и размеров этих центров.

У животных, которым вводили гуминовые кислоты, в печени сохраняется структура большинства долек, отсутствуют некрозы, а явления кариопикноза и кариорексиса единичны.

По морфометрическим исследованиям и морфологической картаке гуминовые кислоты проявляли наглядный протекторный эффект, снижали

выраженность воспалительного процесса, при этом терапевтический эффект нарастал с увеличением курсовой дозы.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С помощью физико-химических методов (ИК-, УФ-, 'Н-ЯМР спектроскопии и хроматографии) подтверждена принадлежность субстанции, выделенной из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей Самарского региона, к классу гуминовых кислот.

2. Для идентификации гуминовых кислот пелоидов обоснованы такие показатели качества, как элементный состав, соотношение оптических плотностей Е4:Е6, ИК-спектры, зольность, суммарное содержание антиоксвдантов.

3. Для количественного определения гуминовых кислот предложен метод спектрофотометрии по стандартному образцу, при этом относительная ошибка определения не превышает 4,6%. Валидационная оценка показала, что методика линейны, воспроизводимы и правильны.

4. Разработана технология суппозиториев на основе гуминовых кислот пелоидов и методы стандартизации предлагаемого лекарственного средства.

5. Показано, что по токсичности ГК относятся к IV классу токсичности. На модели адьювантного артрита по морфометрическим исследованиям и морфологической картине гуминовые кислоты проявляют наглядный протекторный эффект, снижают выраженность воспалительного процесса.

6. Разработаны проекты ФСП на субстанцию гуминовых кислот и суппозитории на основе гуминовых кислот.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Химико-фармацевтическая оценка гуминовых веществ лечебных грязей// Материалы 2 Всерос. съезда фармацевтических работников. - Сочи, 2005. -С. 130 - 131. (Соавт. Романтеева Ю.В., Катунина Е.Е.)

2. Роль гуматов в сохранении экологического равновесия // Экология и здоровье человека: сб. тр. 10 Всерос. конгр. - Самара, 2005. - С. 7-10. (Соавт. Аввакумова Н.П., Романтеева Ю.В., Захарова Е.А., Катунина Е.Е.)

3. Экопротекторная функция гиматомелановых кислот пелоидов: биотестирование // Медицинская экология: сб. статей 5 Международной науч.-практ. конф. - Пенза, 2006. - С. 63-65. (Соавт. Катунина Е.Е., Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А.)

4. Спектрофотометрия как метод стандартизации гуминовых кислот пелоидов // Экология и жизнь: сб. ст. 9 Междунар. науч.-практ. конф. — Пенза, 20Q6. — С. 71 -73. (Соавт. Аввакумова Н.П., Кривопалова М.Л., Захарова Е. А.)

5. Обоснование эффективности пелоидопрепаратов гуминового ряда // Тез. докл. 4 Всерос. съезда физиотерапевтов. - СПб., 2006. - С. 74-75. (Соавт. Агапов А.И., Аввакумова Н.П., Катунина Е.Е., Романтеева Ю.В.)

6. Адсорбционная способность в ряду гумусовых кислот пелоидов // Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж, 2006. - Т. 6. - Вып. 6. - Ч. 2. - С. 1060-1065. (Соавт. Аввакумова Н.П., Егоров В.А., Семионова М.А.)

7. К вопросу о детоксикационных свойствах гуминовых компонентов пелоидов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. «12 конгресс «Экология и здоровье человека». — Самара, 2007. - Т. 1. — С. 134137. (Соавт. Аввакумова Н.П, Катунина Е.Е.)

8. Изучение репаративной активности пелоидопрепаратов гуминового ряда // Гуминовые вещества в биосфере: труды 4 Всерос. конф. - М., 2007. — С. 1722. (Соавт. Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А., Катунина Е.Е.)

9. Объективная оценка эффективности лечения гуминовыми кислотами экологически обусловленных заболеваний // Экология и здоровье человека: материалы 13 конгр. - Самара, 2007. - С. 180-185. (Соавт. Аввакумова Н.П., Лимарева JI.B., Катунина Е.Е.)

Ю.Разработка способа идентификации биологически активной субстанции «гиматомелановые кислоты пелоидов» // Медицинская экология: сб. ст. 6 Межцунар. науч.-практ. конф. - Пенза, 2007. - С 5-10. (Соавт. Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А., Катунина Е.Е.)

11. Определение биодоступности гуминовых кислот из суппозиториев // Медицинская экология: сб. ст. 7 Междунар. науч.-практ. конф. - Пенза, 2007. -С. 43-44.

12.Проницаемость в ряду гумусовых кислот пелоидов // Гуминовые вещества в биосфере: тр. 4 Всерос. конф. - М., 2007. - С. 51-54. (Соавт. Кривопалова М.А., Аввакумова Н.П., Жданова A.B.)

13.Биодоступность компонентов лечебных грязей курорта «Сергиевские минеральные воды» // Материалы Межрегион, науч.-практ. конф. по вопросам восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии, посвященной 175-летию ФГУ «Санаторий «Сергиевские минеральные воды». - Серноводск, 2008. - С. 17-16. (Соавт. Аввакумова Н.П., Жданова A.B.)

14.Стандартизация биологически активной субстанции «Гуминовые кислоты , пелоидов» методом спектрофотометрии // Материалы 2 Междунар. науч. конф. молодых ученых-медиков. - Курск, 2008. - Т. 3. - С. 275-277. (Соавт. Жданова A.B., Катунина Е.Е.)

15. Методология изучения проницаемости пелоидопрепаратов на основе гуминовых кислот под воздействием биполярных импульсных токов / Материалы 2 Междунар. науч. конф. молодых ученых-медиков. - Курск , 2008. - Т. 3. - С. 296-298. (Соавт. Катунина Е.Е., Воробьев Д.В.)

16.Рациональное использование отработанной лечебной грязи // Процессы, технологии, оборудование и опыт переработки отходов и вторичного сырья:

материалы 3 Всерос. науч.-практ. конф. - Самара, 2008. - С. 84-87. (Соавт. Аввакумова Н.П., Катунина Е.Е.)

17.Биологическая активность гумусовых кислот в сверхмалых дозах // Механизмы действия сверхмалых доз: тез. докл. 4 Междунар. симпоз. — М., 2008. - С. 3-4. (Соавт. Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А., Жданова A.B.)

18.Анализ термодинамических характеристик и биоэнергетических потенциалов в ряду гумусовых кислот иловых сульфидных грязей // Биология: теория, практика, эксперимент: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 100 летию со дня рождения Е.В. Сапожниковой - Саранск, 2008. - Кн. 1. - С. 137-140. (Соавт. Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А., Жданова A.B.)

19.Влияние диметилсульфоксида на биодоступность препаратов // Экология и жизнь: сб. ст. 16 Междунар. науч.-практ. конф. - Пенза, 2009. - С. 3-5. (Соавт. Аввакумова Н.П., Жданова A.B.)

20.Про- и антиоксидантные свойства гуминовых кислот пелоидов // Экология и жизнь: сб. ст. 16 Междунар. науч.-практ. конф. - Пенза, 2009. - С. 6-9. (Соавт. Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А., Жданова A.B.)

21.Способ анализа гуминовых кислот пелоидов: пат. 2312343 Рос. Федерация: МПК А61 КЗ5/00 G 01N 33/00 / № 2005136935; заявл. 28.11.05; опубл.

10.12.07, Бюл. №25. -8с. (Соавт. Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А., Ткаченко М.Л., Захарова Е.А., Аввакумова A.A., Бонцевич А.И.).

22.Способ анализа гиматомелановых кислот пелоидов: пат. 2338188 Рос. Федерация: МПК G 01N 33/15 / № 2006133697/15; заявл. 20.09.06; опубл.

27.03.08, Бюл. №31.-5с. (Соавт. Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А., Катунина Е.Е., Аввакумова A.A.).

ГЛУБОКОВА МАРИЯ НИКОЛАЕВНА

ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ПЕЛОИДОВ КАК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ ДЛЯ СУППОЗИТОРИЕВ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ

пиггйптяпии на гпиг^яннр уи^нпн СТСН6НИ

' 1 г* 1 ■

кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати « » КХиК^Хг009 г., формат 60 х 84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0

Тираж 100 экз. Заказ № 4258

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИТЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУРАЗВИТИЮ» (357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11)