Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Эпоксимодифицированные полисахаридные гели в химии гуминовых, гуминоподобных веществ и препаратов на их основе

На правах рукописи

СУХИХ АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

ЭПОКСИМОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИСАХАРИДНЫЕ ГЕЛИ В ХИМИИ ГУМИНОВЫХ, ГУМИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПРЕПАРАТОВ НА ИХ ОСНОВЕ

Специальность 15 00 02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание степени кандидата фармацевтических наук

ООЗО ^¿ио

Тюмень - 2007

003070203

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровская государственная

медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель

доктор фармацевтических наук, профессор Кузнецов Петр Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Нохрин Дмитрий Фокеевич

кандидат фармацевтических наук, доцент Фомин Анатолий Николаевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «25» мая 2007г в 13 00ч на заседании диссертационного совета К208 101 03 при ГОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу г. Тюмень, ул Одесская, 54

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г Тюмень, ул Одесская, 61)

Автореферат разослан «<§3» апреля 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 208 101 03,

кандидат фармацевтических наук,

доцент в в Тихонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Гуминовые кислоты являются составной частью объектов природного происхождения (лечебные грязи, торфяные и угольные ископаемые) и находят самостоятельное применение в медицинской практике и фармации Препараты гуминовых кислот являются альтернативными для лиц с противопоказаниями к нативному грязелечению Поэтому создание оригинальных фармакотерапевтических препаратов с биостимулирующими и репаративными свойствами, средств для косметологии на основе гуминовых и гуминоподобных веществ, остается актуальным и приоритетным направлением исследований

Использование современных физико-химических методов исследования (спектроскопические, хроматографические), позволяет получать сравнимые характеристические данные с нативных образцов гуминовых кислот Поэтому их часто практически не подвергают очистке и фракционированию, что оставляет нерешенной проблему наличия в них примесных органических и неорганических компонентов Разногласия в данных о структурных особенностях гуминовых кислот связаны с большой разновидностью, и в значительной степени, со сложностью их фракционирования Остается малоизученным использование тандемных вариантов хроматографии с последующим инструментальным анализом выделенных фракций Практически не исследованы сравнительные характеристические показатели гуминовых кислот и гуминоподобных веществ, содержащихся в некоторых лекарственных препаратах (полифепан, чага, и др) Следовательно, исследование структурных особенностей гуминовых и гуминоподобных веществ, разработка способов их очистки и фракционирования безусловно актуальны и перспективны

Цель и задачи исследования. Целью работы является определение основных компонентов и поиск возможных структурных фрагментов гуминовых веществ в препарате ФиБС, а так же сравнительная характеристика нативных и хроматографически очищенных фракций гуминовых кислот и гуминоподобных веществ, выделенных из различных объектов природного происхождения (лечебных грязей) и лекарственных препаратов (полифепан, чага) Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Определить хроматографическими методами наличие структурных компонентов гуминовых веществ в лекарственном препарате ФиБС, изучив их качественные характеристики

2 Изучить возможность использования хроматографической очистки щелочных экстрактов гуминовых кислот, выделенных из лечебных грязей, и гуминоподобных веществ, выделенных из лекарственных препаратов (полифепан, чага) с использованием перешитых декстрановых сорбентов при мягких режимах элюции.

3 Определить возможность использования тандемного варианта хроматографирования при фракционировании гуминовых кислот и

гуминоподобных веществ в объектах исследования (полифепан, чага, лечебные грязи)

4 Исследовать возможность хроматографирования гуминовых кислот, выделенных из лечебной грязи, на адсорбентах аффинного типа

5 Определить с помощью современных методов ЯМР-, ИК-, ЭПР-спектроскопии, СЫН - элементного анализа структурные компоненты гуминовых кислот и гуминоподобных веществ в лечебных грязях и лекарственных препаратах

Научная новизна исследования. Впервые разработан метод определения ключевых компонентов препарата ФиБС (кумарин и коричная кислота) методом неклассической аффинной хроматографии и проанализированы качественные характеристики минорных примесей в нем

Впервые рассмотрена сравнительная характеристика гуминовых кислот и гуминоподобных веществ, выделенных в стандартных условиях из различных природных объектов, находящих применение в медицинской практике

Для очистки и фракционирования щелочных экстрактов гуминовых кислот и гуминоподобных веществ, полученных в одинаковых условиях из различающихся лечебных грязей и лекарственных препаратов (чага и полифепан), впервые применили тандемный вариант с использованием перешитых полисахаридных сорбентов Затем их хроматографические фракции были инструментально исследованы с применением методов спектрального анализа

Научно-практическая значимость работы. Совокупность полученных физико-химических характеристик гуминовых и гуминоподобных веществ, выделенных из различающихся природных объектов и лекарственных препаратов, являются основой дальнейших исследований по созданию новых лекарственных средств на их основе Особенности качественного состава препарата ФиБС (с учетом минорных компонентов) должны быть учтены при разработке и стандартизации пелоидопрепаратов и биостимуляторов На основании данных, полученных при выполнении работы, разработаны методические рекомендации по оптимизации способов выделения и хроматографической очистки гуминовых кислот и гуминоподобных веществ

С использованием современных физико-химических методов определены структурные особенности изученных нативных гуминовых и гуминоподобных веществ и их хроматографических фракций

Внедрение результатов работы. По результатам исследования разработаны методические рекомендации «Способы выделения, концентрирования и очистки гуминовых и гуминоподобных веществ из объектов природного происхождения», которое внедрено в научно-исследовательскую работу Института экологии человека СО РАН (Акт внедрения от 25 10 2006г), ГОУ ВПО Кемеровской государственной медицинской академии Росздрава (Акт внедрения от 16 01 2007г), ГОУ

ВПО Кемеровского технологического института пищевой промышленности (Акт внедрения от 10 11 2006)

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО КемГМА Росздрава (№ госрегистрации 0120 0506552)

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на областных и региональных научных конференциях Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2004) Международных конференциях XI конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии, и экологии 1Т +МЕ' 2003» (Украина, Крым, Ялта - Гурзуф, 2003), на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), VI международной научно - практической конференции «Безопасность жизнедеятельности предприятий в угольных регионах» (Кемерово, 2005), IX международной научно- практической конференции «Химия - XXI век новые технологии, новые продукты» (Кемерово, 2006), Международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006)

Публикации. Основные материалы исследований опубликованы в 14 печатных работах и методическом пособии Положения, выносимые на защиту:

- Результаты по изучению качественных характеристик состава препарата ФиБС хроматографическими методами,

- Идентификация микро примесей в препарате ФиБС,

- Результаты хроматографирования гуминовых кислот на азоадсорбентах аффинного типа,

- Данные хроматографического способа очистки и фракционирования гуминовых кислот и гуминоподобных веществ с использованием полисахаридных гелей в тандемном варианте,

- Сравнительная оценка физико-химических и хроматографических особенностей гуминовых кислот и гуминоподобных веществ

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава1), экспериментальной части (главы 2,3,4,5) выводов, списка литературы и приложения Работа изложена на страницах, содержит Т7 таблиц, рисунка Библиографический список включает 242 источника, из них 119 на иностранных языках

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, изложены положения, выносимые на защиту

В главе I диссертации собраны и обобщены основные литературные данные современных аспектов структурной организации гуминовых кислот Впервые в обзор включены работы по фантомной хроматографии

(Кузнецов,2002, Лисичкин и соавт, 2006), а так же отражены основные концепции о супромолекулярной структуре гуминовых кислот (Piccolo, 2002) Глава II посвящена описанию объектов и методов исследования В главах III -V приводятся результаты собственных исследований Изучены качественные характеристики состава препарата ФиБС хроматографическими методами Изучены хроматографические и структурно-функциональные свойства гуминовых кислот и гуминоподобных веществ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования были использованы образцы гуминовых кислот выделенные из- низкоминерализованной иловой сульфидной грязи оз Утичье (курорт Шира, республика Хакасия), и донных отложений сапропелевого типа оз Большой Берчикуль (Кемеровская область) Гуминоподобные кислоты выделены из препаратов полифепан, представляющего собой гидролизованный лигнин лиственничных и хвойных пород деревьев (Россия), гриб чага Inonotus obliquus (FI ) (Россия) Исследуемый препарат ФиБС, представлял собой паровой отгон грязи Куяльницкого лимана с добавлением кумарина и коричной кислоты (Украина) В качестве образца стандарта использована гуминовая кислота в виде натриевой соли (гумат натрия) фирмы (Aldnch, Германия)

Процедуру извлечения ГВ из навески ЛГ при помощи раствора NaOH повторяли три раза Объединенные щелочные извлечения закисляли (0,5М HCI до рН=1-2, и оставляли на 15-20 минут в прохладном месте)

Стандартные препараты (чаги и полифепана) в количестве 300 г заливали 0,1 M раствором NaOH, и настаивали в течение 6 часов, после этого центрифугировали, остаток сырья заливали 0,1 M раствором NaOH, надосадочный раствор объединяли с последующими извлечениями, процедуру обработки повторяли три раза Объединенные щелочные извлечения закисляли до рН 1-2, 0,5М раствором хлороводородной кислоты, образовавшийся осадок при помощи центрифугирования отделяли от раствора повторяя процедуру переосаждения три раза

Выделенные гуминовые кислоты и гуминоподобные вещества обозначены следующими условными сокращениями из оз Утичье - ГКУ, из оз большой Берчикуль - ГКБ, из чаги - ГКЧ, из полифепана - ГКП Гумат натрия фирмы Aldnch обозначен - ГМН

Для исследуемых образцов, в режиме щелочной экстракции выход ГК был следующий ГКУ 33,5%, ГКБ 16%, ГКЧ 166,5%, ГКП 108%

Определение углерода, водорода и азота проводили на автоматическом элементном CNH-анализаторе Hewlett Packard mod 185 Количество кислорода в образцах рассчитывали по разности

Ультрафиолетовые спектры получали с использованием спектрофотометра СФ-26 (Россия) в диапазоне 225-335нм При

хроматографировании препарата ФиБС детекция - 280 нм, при хроматографировании образцов гуминовых кислот и гуминоподобных веществ - 260нм

ИК- спектры изучаемых образцов регистрировались на спектрометре Tensor 27 фирмы Bruker в диапазоне от 4000-400см"', с программным обеспечением OPUS 3 0 Для регистрации спектров прессовались таблетки с КВг

Ядерный магнитный резонанс на ядрах С13 Для получения спектров ЯМР С13 50мг образца ГК растворяли в 0,5 мл 0,5М Na0H/D20 и помещали в ампулу с внешним диаметром 5мм Спектры были получены на спектрометре DRX-500 фирмы Bruker Обработку спектров проводили с использованием программного обеспечения WINNMR фирмы Bruker

Электронный паромагнитный резонанс (ЭПР) Для получения спектров ЭПР использовали прибор фирмы «Карло Эрба» Интегрирование двойное (DI), без фильтрации шума в одинаковом диапазоне по полю

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) исследуемых образцов проводилась на приборе "Миллихром А-02" (Россия) Хроматограммы регистрировали в режиме многоволнового детектирования с опорной длинной волны 210 нм

Газо-жидкостная хроматографии (ГЖХ-МС) Газожидкостная хроматография осуществлялась на хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890/5973N , состоящей из масс-селективного детектора Agilent 5973N, в сочетании с газовым хроматографом Agilent 6890 plus

Для хроматографического скрининга были использованы готовые эпоксиазоадсорбенты из фонда кафедры фармацевтической и токсикологической химии КемГМА Дополнительно в данной работе, были синтезированы два эпоксиазоадсорбента с новокаиновым лигандом на основе матрицы сефадекс LH-20 (СФ-20), и сефадекс G-100 (СФ-100)

Синтез азоадсорбентов проводился по схеме представленной на рис 1 Подготовку хроматографической колонки с 30-35 мл геля азо-ААФТ проводили (после промывки водой очищенной (15-20 мл), промывая ее последовательно 0,05М раствором натрия гидроксида (5 мл), водой очищенной до pH около 7,0 (по универсальному индикатору) 0,05 М раствором кислоты хлороводородной (5 мл) После дополнительной промывки колонки до pH 7,0 на ней хроматографировали 1 мл препарата ФиБС со скоростью 0,15-0,20 мл/мин Элюцию приводили водой очищенной, объем фракций - 2,5 мл, детектирование осуществляли на длине волны 280 и 320 нм (СФ-26, Россия) В аналогичных условиях осуществляли хроматографирование 1 мл ФиБС на немодифицированных носителях

Скорость элюции при хроматографировании на сефадексах LH-20, G-25, 30-35мл/ч, для сефадексов G-50, G-75, СФ-100 составляла 20-25мл/ч

Гуминовые и гуминоподобные образцы, исследованные в работе, получены и хроматографированы по схеме, представленной на рис 1 Синтез эпоксиазоадсорбента аффинного типа показан на рис 2

Экстрагирование из природного объекта 0,1М раствором ИаОН

Рис 1 Схема экстракции и тандемного варианта хроматографирования гуминовых кислот и гуминоподобных веществ

¿-он _ ДГЭЭД \~0"СН 2 не -сн 2-о -{сн 2\о -СН 2-^7-

< (ДМСО, ОН" Ч он О

ггк рН=9 2

он

)-СН 2НС -сн 2"0(СН 2-^О-СН 2-С-СН 2-1ЧН —ын ■

ОН он

С1®

V он

уэ-сн 2НС -сн 2-0(СН СН 2-С-СН 2-ин-МН

I х ' '2 ' |

ОН он

Рис 2 Схема синтеза эпоксиазоадсорбента аффинного типа, где ДГЭЭД-диглицидиловый эфир 1,2-этандиола, ДМСО - диметилсульфоксид, ГСК-гидразидсалициловой кислоты, Я- фрагмент новокаиновой структуры

Структура и химическое название полученных азоадсорбентов представлены на рисунке 3

0-О'

,сн.

сн2

4 / \ НС Ъ'

он

:сн,]

\

. / сн

¿н

,сн3

оД _ о

*—' --^ '2 С9Н5

Рис 3 Структурная формула (М- матрица) сефадекс Ш-20 (или в-100) -бис (оксипропил)-этилендиокси-гидразинокарбонил-фенилазо-новокаина (СФ-20-ДГЭЭД-ГСК-НОВ) или (СФ-ЮО-ДГЭЭД-ГСК-НОВ)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Особенности хроматографирования препарата ФиБС на эпоксимодифицированиых азоадсорбеитах аффинного типа

Для изучения ключевых компонентов препарата методом НАФХ был проведен хроматографический скрининг нескольких типов эпоксиактивированных азо-ААФТ с различными лигандами, вставками (гидразиды л-нитробензойной и салициловой кислот, а-нафтилэтилендиамин) В качестве полимерных матриц использовались сефадексы С-10, С-25, СФ-20 Обобщенные данные хроматографической особенности гелей представлен в таблице 1

Согласно табличным данным наилучшая хроматографическая эффективность отмечена у сорбента на основе СФ-20 с новокаиновым лигандом Тенденция к хроматографическому разделению нативного раствора ФиБС отмечено и на полученном азо-ААФТ на основе сефадекса в-25 с лигандом, производным фенантренизохинолина

Таблица 1

Особенности хроматографического разделения основных компонентов

Носитель Активация Вставка Лиганд Результат разделения

Сефадекс в-Ю неактивированный стандартный гель частичное

ДГЭЭД | ГСК | НОВ отсутствует

Сефадекс в-25 неактивированный стандартный гель отсутствует

ДГЭЭД ГСК НОВ частичное

ДГЭЭД пНБГ ФИХ частичное

ДГЭЭД ГСК АБГЛУ отсутствует

Сефадекс ЬН-20 неактивированный стандартный гель частичное

ДГЭЭД ГСК НОВ Четкое полное

ДГЭЭД пНБГ ТРОКС частичное

Таким образом, для полумикропрепаративного накопления компонентов нативного препарата ФиБС в режиме НАФХ нами использовался только сефадекс ЬН-20-БЭП-ГСК-НОВ в объеме 30 мл,

контрольным гелем служил немодифицированный носитель (СФ-20) в равных объемах

Хроматографический профиль препарата ФиБС на сефадексе СФ-20-ДГЭЭД-ГСК-НОВ, СФ-20, представлен на рис 4

Рис 4 Хроматографическое профиль препарата ФиБС (1 мл) в режиме водной элюции на гелях СФ-20(-А-), СФ-20-БЭП-ГСК-Нов(—) Детекция на длине волны 280нм

Методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии, было показано, что с использованием эпоксимодифицированного азоадсорбента СФ-20-ДГЭЭД-ГСК-НОВ, в режиме водной элюции были элюированы I-хроматографическая фракция является коричной кислотой (рис 5 (А)), II-хроматографическая фракция является кумарином (рис 5 (Б))

А

Рис 5 Анализ хроматографических пиков препарата ФиБС, выделенных на геле СФ-20-ДГЭЭД-ГСК-НОВ методом ГЖХ-хромато-масс-спектрометрии Хроматографический пик (А) - коричная кислота (время выхода 15,266 мин), Хроматографический пик (Б) - кумарин (время выхода 15,318 мин)

Исследование нативного водного раствора препарата ФиБС и его хлороформного экстракта методом газожидкостной хроматографией с масс-спектрометрической детекцией, позволило определить наличие, помимо основных компонентов (кумарин, коричная кислота), минорных компонентов

По химической структуре идентифицированные минорные примеси являются кремнийорганическими соединениями типа циклокарбосилксанов Используя в процессе исследования элюции препарата ФиБС с геля сефадекс СФ-20 ДГЭЭД-ГСК-НОВ, спиртовый градиент 20-50-70% этанола была элюирована третья (липофильная) фракция

Рис 6 Минорные компоненты III пиковой фракции элюируемой этанолом (по данным ГЖХ-МС)

Анализ полученных пиковых фракций методом ГЖХ-МС и ВЭЖХ, позволил установить, что во фракциях, выходящих в режиме водной элюции и идентифицированных как коричная кислота (I хроматографический пик (рис 4), и кумарин (И хроматографический пик (рис 4), практически отсутствуют кремнийорганические вещества Высокое содержание этих соединений, было найдено в третьей хроматографической фракции (рис 6), элюируемой 70% этанолом Как показали исследования, проведенные со стандартным образцом кумарина и коричной кислоты, данные вещества (или их смесь) практически полностью сорбируется на колонке, а выход в режиме водной элюции их из препарата ФиБС может быть связан с конкурентным взаимодействием минорных кремнийорганических соединений с поверхностью адсорбента аффинного типа

Спектр ЯМР С13 воздушно - высушенного препарата представлен на рис 7 и хорошо согласуется с литературными данными для ЯМР-С13 спектров коричной кислоты и кумарина

I I

V I -¡/V

I 1|,

Рис 7 Спектр ЯМР С13 воздушно-высушенного препарата ФиБС

Таким образом, нами впервые доказан сложный качественный состав нативных образцов препарата ФиБС

Исследование влияния структурных параметров адсорбентов на хроматографическое разделение гуминовых и гуминоподобных веществ

Известно, что СФ-20 гель универсального назначения, представляет собой декстрановый эпоксимодифицированный адсорбент, который обладает как липофильными, так и гидрофильными свойствами Он также характеризуется высокой стабильностью в кислых и щелочных средах, что в совокупности и обуславливает его широкое применение в химии природных соединений

Образцы щелочных экстрактов ГК и ГПВ, при хроматографировании на СФ-20, характеризуются типичным выходом массивной пиковой фракции (зона 7-13 фракции рис 8), свободной от низкомолекулярных компонентов и обладающей значением рН в пределах 7,0-7,7

Рис 8 Типичный хроматографический профиль ГК и ГПВ на примере образцов ГМН (—), ГКУ (-А-), ГКЧ(-и-) Таким образом, использование на первом этапе сефадекса ЬН-20, видимо способствует очистке ГК от компонентов, присутствующих в щелочных экстрактах и необратимо связывающихся с сорбентом СФ-100

Дальнейший хроматографический скрининг заключался в возможности фракционного разделения ГК и ГПВ на сорбентах с различным размером пор Оказалось, что использование сефадексов С-50 и С-75 в режиме гель-фильтрации не приводит к фракционному разделению ГК Однако, использование СФ-100, в тандеме с СФ-20 привело к фракционированию исследуемых образцов на две ключевые (I и II) хроматографические фракции Этот феномен характерен для всех исследуемых образцов Не исключено, что на первом этапе хроматографирования с использованием СФ-20, исследуемые образцы ГК и ГПВ изменяют свою супрамолекулярную структуру, элюируясь одним мощным пиком (в концентрированном виде) Далее на этапе гель-фильтрации на СФ-100 происходит достаточно четкое, разделение (отличающихся по супрамолекулярным структурам - фракций) (рис 9 (А) и (Б))

№ фракции № фракции

Рис 9 Хроматография на сефадексе в-100 образцов (А)ГКУ(—)иГКБ(-■-), (Б) ГМН (—), ГКП (-■-), ГКЧ (-А-) 1-первая фракция, Н-вторая фракция.

Спектральная активность в УФ области I и II пиковой фракции исследуемых образцов имеет вид нисходящей кривой без выраженных максимумов поглощения и является типичной для ГК в целом

Таким образом, предложенный нами впервые вариант тандемного хроматографирования, позволил в едином режиме фракционировать как ГК, так и ГПВ на две ключевые фракции

Сравнительный комплексный физико-химический анализ нативных образцов и полученных хроматографических фракций гуминовых кислот и гуминоподобных веществ

В главе V диссертации физико-химическими методами были исследованы некоторые основные структурные параметры нативных ГК и ГПВ, и их хроматографических фракций (I и Нем рис 10)

Так, методом СЫН - элементного анализа установлено, что процентное содержание углерода (С%), (как и азота (№/<>)), повышается у всех изученных

образцов фракций ГК и ГПВ после СФ-100 Это особенно выражено у I хроматографических фракций, являющихся более высокомолекулярными (табл 2), и достигает максимума (65,14% углерода) в образце ГКП (пик I) Интересно, что пик II ГКП содержит уже 44,8% углерода и около 1,0% азота В процессе фракционирования ГКЧ, в первой хроматографической фракции (пик I), после СФ-100, относительно исходного образца существенно увеличивается содержание азота, и заметно снижено содержание кислорода Таким образом, эту фракцию можно считать наименее окисленной Из данных табл 2 видно, что у первых хроматографических фракций (после СФ-100) с возрастанием размера молекулы наблюдается увеличение содержания азота, находящегося в аминофрагментах у исследуемых фракций По видимому, менее окисленными следует считать и фракции пика I (после СФ-100), для ГКУ и ГКБ (табл 2) Напротив, фракции этих образцов (пик II) наиболее окислены (табл 2), но относительное содержание кислорода меньше, чем у исходного образца Самым окисленным является нативный образец (ГКБ) оз Берчикуль (72,23% О)

Таблица 2

Элементный состав ГК и ГПВ из объектов различного типа, и их

Образец %С %Н %N о% Н/С N/0 О/С

ГМН натив 42,625 3,63 0,57 53,175 1,015 0,011 0,936

ГМН после СФ-20 36,095 2,415 0,75 60,785 0,797 0,017 1,26

ГМН СФ-100 Пик1 54,785 5,123 2,77 37,322 1,115 0,043 0,51

ГМН СФ-100 Пик II 50,246 3,125 1,72 44,909 0,742 0,029 0,670

ГКУ натив 37,46 4,685 3,705 54,15 1,490 0,084 1,085

ГКУ после Ш-20 33,455 4,76 3,05 58,736 1,695 0,078 1,318

ГКУ СФ-100 Пик1 41,885 5,725 3,64 48,75 1,520 0,074 0,873

ГКУ СФ-100 Пик II 30,456 2,993 2,865 63,686 1,171 0,08 1,569

ГКБ натив 22,785 2,925 2,06 72,23 1,529 0,077 2,379

ГКБ СФ-20 37,75 4,12 3,23 59,9 1,3 0,073 1,191

ГКБ СФ-100 Пик1 39,325 5,842 4,652 50,181 1,77 0,101 0,957

ГКБ СФ-100 Пик II 26,681 3,07 2,171 68,071 1,371 0,069 1,915

ГКЧ натив 34,765 3,075 0,2 61,96 1,054 0,004 1,337

ГКЧ СФ-20 47,285 3,915 0,36 48,44 0,986 0,006 0,769

ГКЧ СФ-100 Пик I 53,345 4,83 1,8 40,025 1,078 0,028 0,563

ГКЧ СФ-100 Пик II 45,37 3,775 0,565 50,29 0,991 0,0106 0,832

ГКП нратив 39,525 3,685 0,13 56,66 1,110 0,002 1,076

ГКП после СФ-20 51,84 4,57 0,44 43,15 1,105 0,007 0,624

ГКП СФ-100 Пик1 65,14 6,17 0,57 28,12 1,128 0,007 0,324

ГКП СФ-100 Пик II 44,48 4,07 0,985 50,465 1,09 0,018 0,851

Для повышения информативности результатов СЫН-элементного анализа, нами были рассчитаны и отношения Н/С, N/0 и О/С (табл 2), которые хорошо подтверждают сделанные выше выводы

В ИК-спектрах всех исследуемых образцов обнаружены интенсивные полосы поглощения при 3500-3400см"', отнесенные по литературным

данным (Орлов, 1993) к гидроксильным группам, 1460, 740-720см"' - к метиленовым фрагментам, 1670-1510 см"1 - карбонильные, карбоксильные группы, полосы слабой интенсивности 1500-1470см'', 1000-760см"' свидетельствуют о наличии ароматических (бензоидных) структур, полосы 1270 -1100см"1 (-С-О-эфирных связей), около 1150см"1 (-ОН-углеводов), 1090-1030см"' (-С-О-) углеводных компонентов

Рис 10 ИК-спектры ГМН (А), ГКУ (Б), ГКБ (В), ГКЧ (Г), ГКП (Д), где (1) - нативный образец, (2)- фракция после СФ-20, (3)- после СФ-100 (I) - хроматографическая фракция, (4) после СФ-100 (II) -хроматографическая фракция

Общей особенностью ИК-спектров всех исследуемых образцов после сефадекса ЬН-20 является усиление интенсивности характерных полос поглощения, связанного, по нашему мнению, с увеличением концентрации исследуемого образца

Характеристики ИК-спектров I и II фракций после СФ-100 (рис 10) очень близки по своей структуре, обладая характерными полосами поглощения Так, пик I (ГКУ) может быть охарактеризован (по типу ИК-спектров) как более гидрофильный, чем пик II Для ГМН пик I более гидрофобен, чем пик И, так как имеет в зоне 2950-2800см"' сильно выраженные колебания алифатического фрагмента Однако, повышенной

гидрофобностью (колебания в зоне 2950-2800см"') видимо характеризуется и пик IГКУ, в отличие от пика IIГКУ, хотя в целом оценить их гидрофильно — гидрофобный баланс только по данным ИК-спектров затруднительно С другой стороны, по данным ИК-спектров, для образцов ГКУ(рис 10 БЗ) и ГКБ (рис 10 ВЗ) четко регистрируется так называемая полисахаридная зона (1065-1030см"'), но которая обладает слабой интенсивностью у Н-х хроматографических фракций (рис 10 Б4 и В4) этих же образцов В целом, ИК-спектры, изученных образцов регистрируют наиболее значимые изменения блоков А, Б, В и наименьшее у блоков Г,Д

Характерной особенностью ЯМР спектров С13 у ГК и ГПВ является отсутствие индивидуальных пиков и наличие суперпозиции большого числа сигналов Поэтому общепринятым подходом к обработке ЯМР-спектров ГК является разделение химических сдвигов на диапазоны, которые в общем виде рассматриваются как наиболее общие фрагменто-группы в следующих диапазонах 200-160м д карбоксильно-карбонильный углерод, 160-1 Юм д ароматический углерод, 110-65м д «полисахаридный» углерод, 65-0м д углерод алифатических структур (Тихова, 2002) Данный подход был использован нами при анализе исследуемых образцов ГК, ГПВ и их хроматографических фракций

Так, все исследуемые образцы содержат сигналы, соответствующие одинаковому набору структурных компонентов ГК и ГПВ Различие заключается лишь в относительном содержании данных структурных компонентов При этом профиль спектров ЯМР С13 у ГКЧ и ГКП в наибольшей степени содержит довольно стабильные наборы сигналов Аналогичное сходство присутствует и у ГК выделенной из лечебной грязи (образцы ГКУ и ГКБ) Такое подобие спектров можно объяснить условиями образования данных веществ

Типичные спектры ЯМР С13 ГК, на примере образца ГКБ, представлены на рис 11

Рис 11 Спектры ЯМР С13 на примере образцов ГКБ* нативного экстракта

(А), и после хроматографирования на сефадексе ЬН-20 (Б)

*- ЯМР С13 спектр образцов ГКБ снят с нативного образца и фржции после СФ-20

В целом, по общему виду ЯМР С спектров (рис.11. А и Б), у образца после СФ-20 можно четко зафиксировать усиление практически всех групповых сигналов, что может свидетельствовать об увеличении при хроматографировании концентрации ГК,

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

А

ш

гмн

ГКУ

гкч

гкп

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

ГМН ГКУ

гкч гкп

ГМН ГКУ гкч гкп

гмн

ГКУ

гкч

Рис. 12.

Графические спектры ЯМР С13: А -иативиых образцов, Б -после хроматографирования на СФ-20; и образцов после СФ-100: АН - I хромато Графической фракции, БИ - !1 хромато графической фракции, где;

- алифатический углерод (АЛУ) (65-0м.д.)

- «полисахарид! 1ый» углерод (ПСУ) (110-65м,д.)

- ароматический углерод (АРУ) (160-1 Юм.д.)

- карбокййшьно-карбонильный углерод(КАУ) (200-160м.д.)

По данным спектра ЯМР С нагивных образцов (рис.12А), видно, что основное отличие характеризуется разным количественным содержанием полисахаридпых и карбокс ил ьно-карбон ильных структур. После хроматографирования па СФ-20 для образцов ГМН и ГКЧ характерно незначительное увеличение ароматического углерода и снижение относительного содержания алифатического углерода. При увеличении

ароматического углерода снижается процентное содержание окисленных структур, что согласуется с данными СИН-анализа Для образцов ГКУ, ГКБ, ГКП прослеживается иная закономерность, связанная с некоторым увеличением содержания алифатического углерода и уменьшением ароматического углерода После фракционирования на СФ-100 I-хроматографическая фракция характеризуется более высоким содержанием алифатического углерода, тогда как во II пиковой фракции превалирует содержание ароматического углерода

В целом, наибольшие изменения параметров ЯМР С13, показали образцы I и II хроматографической фракций особенно для образца ГКП

Фундаментальное свойство ГК - их электронный парамагнетизм Парамагнитная активность, под которой понимается концентрация свободных радикалов, в наибольшей степени может характеризовать общей уровень биохимической активности и биотермодинамической устойчивости ГК и ГПВ Для получения информации о ЭПР активности ГК и ГПВ, ЭПР-спектры снимали у фракций выделенных на СФ-100

те м»

Рис 13 Типичный ЭПР- спектр для ГК и ГПВ на примере образца ГКУ фракция II после СФ-100

ТаблицаЗ

Содержания парамагнитных центров в образцах хроматографических

Образец Поле образца, Гс 2г фактор образца Б1 Навеска, мг БУнав, Инт ед /мг

ГКУ Пик I 348539 2,00170 3,84800 3,10000 1,24129

ГКУ Пик И 3485,02 2,00194 9,09800 2,70000 3,36963

ГКБ Пик I 3485,21 2,00183 8,39477 2,90000 2,89475

ГКБ Пик II 348536 2,00153 5,07276 3,30000 1,53720

ГКЧ Пик I 3484,02 2,00264 3,09800 2,90000 1,06828

ГКЧ Пик II 3484,51 2,00235 5,28200 6,00000 0,88033

ГМНПик 3484,865 2,00224 6,8835 3,90000 1,7650

ГМН Пик II 3484,847 2,00205 5,64000 4,70000 1,20000

ГКП Пик I 3484,115 2,00219 4,00900 4,80000 0,83521

ГКП Пик II 3483333 2,00264 2,34200 5,80000 0,40379

Обращает на себя внимание g-фaктop образцов так у образцов с относительно высоким содержанием ароматических фрагментов (ГМН, ГКЧ, ГКП), сигналы свободных радикалов регистрируются в области £>=2,002, тогда как у образцов с преобладанием алифатических структур (ГКУ, ГКБ) сигналы свободного радикала регистрируются при g=2,001 Наивысшую ЭПР активность проявил образец ГКУ фракция II Таким образом, все изученные фракции всех исследуемых образцов показали четкую ЭПР - активность

ВЫВОДЫ

1 Показана возможность идентификации и микропрепаративного накопления ключевых компонентов препарата ФиБС в образце с использованием метода неклассической аффинной хроматографии

2 С помощью адсорбента аффинного типа были впервые накоплены и подвергнуты анализу минорные компоненты препарата ФиБС, что позволило идентифицировать их как кремнийорганические соединения и производные фталевой кислоты

3 С помощью хроматографического тандемного варианта на перешитых полисахаридных гелях показана возможность выделения и очистки двух ключевых водорастворимых фракций как из лечебной грязи, так и гуминоподобных веществ из некоторых лекарственных препаратов (чага, полифепан) Предложенный хроматографический тандемный метод выделения и очистки гуминовых и гуминоподобных веществ является альтернативным вариантом для их углубленного изучения

4 Нативные образцы и фракции, полученные в тандемном варианте хроматографирования из всех изученных объектов (чага, полифепан, два вида лечебной грязи, гумат натрия фирмы АЫпсЬ), были исследованы с использованием методов ЯМР С13, ИК, ЭПР - спектроскопии, СЫН-элементного анализа Некоторые физико-химические характеристики гуминоподобных веществ из лекарственных препаратов получены нами впервые

5 Комплексом физико-химических методов проведена сравнительная характеристика гуминовых, гуминоподобных веществ в изучаемых объектах, а также их хроматографических фракций

6 Выделенные при щелочной экстракции из лекарственных препаратов чага и полифепан образцы гуминоподобных веществ по своим физико-химическим характеристикам соответствуют параметрам стандарта гуминовой кислоты фирмы АМпсЬ

7 Определены характерные физико-химические параметры гуминовых кислот выделенных из лечебных грязей различного типа

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1 Хроматографический скрининг эпоксиазоадсорбентов для исследования лекарственного средства ФиБС // Сб статей по материалам XI международной конференции и дискуссионного

научного клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии 1Т+МЕ 2003» -Крым, Ялта-Гурзуф, 2003 -С 223-225 (Соавт. ПВ Кузнецов)

2 Эпоксиактивированные адсорбенты в исследовании физиологически активных веществ // Тезисы докладов XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии -Казань, 2003 -Т 3 -С 231 (Соавт П В Кузнецов, Л С Теслов, Е Г Поленок)

3 Эпоксиактивированные адсорбенты аффинного типа в исследовании трудно стандартизируемых лекарственных препаратов // Сб статей по материалам межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы медицины и биологии» - Кемерово, 2004 Спецвыпуск №5 -С 102-103 (Соавт ЕА Гуров, Е М Кравчук)

4 О проблеме современных подходов к изучению методов выделения, очистки и анализа нативных БАВ из лечебных грязей // Вестник Российской академии естественных наук (ЗСО) -Вып 6 , 2004 -С 5964 (Соавт П В Кузнцов)

5 Изучение биостимулирующих лекарственных средств методом неклассической аффинной хроматографии // Сб тезисных докладов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» -Москва, 2005 -С 255 (Соавт ЕА Гуров, П В Кузнецов)

6 Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ Изучение качества лекарственного средства ФиБС на эпоксиазоадсорбентах нового поколения //Медицина в Кузбассе -2005 №4 -С 97-98 (Соват. П В Кузнецов, Е А Гуров, Н Б Барсегян)

7 Гуминовые комплексы лечебных грязей и перспективы создания препаратов на их основе // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Безопасность жизнедеятельности предприятий в угольных регионах» -Кемерово -2005 -С 427-428

8 Особенности хроматографирования некоторых типов гуминовых веществ на полисахаридных гелях //Сб материалов региональной научно-практической конференции с международным участием «Проблемы медицины и биологии» -Кемерово -2006 Спецвыпуск №3 -С 140

9 Полимерные адсорбенты аффинного типа в исследовании физиологически активных веществ (XXII Эпоксиазоадсорбенты в очистке гуминовых веществ лечебных грязей) // Вестник Российской академии естественных наук (ЗСО)-Вып 8 ,-2006 -С 113-117 (Соавт П В Кузнецов)

10 О феномене взаимодействия гуминовых кислот лечебных грязей с гепарином и его производными // Вестник Кузбасского научного центра (РАМН СО) «Инновационные технологии медицинской науки и практики здравоохранения -Вып №2 -Кемерово -2006 -С 144-146 (Соавт П В Кузнецов)

11 Разделение полифенольного комплекса чаги на полисахаридных гелях перешитого типа //Сб научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» -Вып61 -Пятигорск, 2006 -С 233-234 (Соавт П В Кузнецов, Е А Гуров)

12 Эпоксиактивированные адсорбенты нового поколения на основе перешитых полимерных матриц //Сб статей по материалам международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» -Томск, -2006 -С 253 (Соавт П В Кузнецов, Е А Гуров, В В Халахин)

13 Выделение и очистка гуминоподобного комплекса фармацевтического препарата полифепан //Сб научных трудов XI международной научно-практической конференции «Химия -XXI век новые технологии, новые продукты» -Кемерово, -2006 -С 392-394 (Соавт П В Кузнецов)

14 К проблеме хроматографического исследования гумата натрия (АИпсЬ, Германия) на перешитых полисахаридных гелях //Вестник КузГТУ -2006 -№6 -С 115-117 (Соавт ПВ Кузнецов)

Список используемых сокращений

АБГЛУ - пара -Аминобензоил-глугаминовая кислота

азо-ААфТ - азо-Адсорбент аффинного типа

А Л У - Алифатический углерод по данным ЯМР С13

АРУ - Ароматический углерод по данным ЯМР С13

ГВ - Гуминовое вещество

ГК - Гуминовая кислота

ГКБ - Гуминовая кислота из грязи озера Берчикуль

ГКП - Гуминовая кислота из препарата Полифепан

ГКУ - Гуминовая кислота из грязи озера Утичье

ГКЧ - Гуминовая кислота из Чаги (ЬюпоШв оЫцшв)

ГМН - Гумат натрия фирмы АЫпсЬ

ГПВ - Гуминоподобное вещество

ГСК - Гидразид салициловой кислоты

ГФ-Х, XI - Государственная фармакопея X или XI изданий

ДГЭЭД - Диглицедиловый эфир 1,2 этандиала

ДМСО - Диметилсульфоксид

КАУ - Карбоксильный углерод по данным ЯМР С13

ЛГ - Лечебная грязь

НАФХ - Неклассическая аффинная хроматография

НОВ - Новокаин

пНБГ - пара -Нитробензгидразид

ПСУ - Полисахаридный углерод по данным ЯМР С13

СФ-100 - Сефадекс в-100

СФ-20 - Сефадекс ЬН-20

ТРОКС - Троксеругин

ФИХ - Производное фенантренизохинолина

СУХИХ АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

ЭПОКСИМОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИСАХАРИДНЫЕ ГЕЛИ В ХИМИИ ГУМИНОВЫХ, ГУМИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПРЕПАРАТОВ НА ИХ ОСНОВЕ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание степени кандидата фармацевтических наук

Отпечатано в типографии издательского центра «Академия» Лицензия на издательскую деятельность №05351 от 10 07 2006 Печать ризограф Тираж 100 экземпляров Заказ 117

На правах рукописи

АБДУЛВАХЕД ЛУАЙ МУХАМЕД

ХАРАКТЕРИСТИКА КАМНЕОБРАЗУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ МОЧИ В РАЗЛИЧНЫЕ ТРИМЕСТРЫ БЕРЕМЕННОСТИ

14.0040 -Урология

14 00 01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург . 2007

003070201

Работа выполнена в ГОУ ВПО Федерального аген гства по здравоохранению и социальному развитию «Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени ИМ Мечникова»

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Панин Александр Григорьевич, доктор медицинских наук профессор Татарова Нина Александровна

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук профессор Михайличенко Владимир Васильевич, доктор медицинских наук профессор Абрамченко Валерий Васильевич

Ведущее учреждение

Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия

Защита диссертации состоится « 24 » мая 2007 года в 13 30 часов на заседании диссертационного совета Д 215 002 05 в Военно-медицинской академии им СМ Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул Академика Лебедева, 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им С М Кирова

Автореферат разослан « 23 » апреля 20071 ода

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор Цвелев ЮЛ

Актуальность работы. Гуминовые кислоты являются составной частью объектов природного происхождения (лечебные грязи, торфяные и угольные ископаемые) и находят самостоятельное применение в медицинской практике и фармации. Препараты гуминовых кислот являются альтернативными для лиц с противопоказаниями к нативному грязелечению [2]. Поэтому создание оригинальных фармакотерапевтических препаратов с биостимулирующими и репаративными свойствами, средств для косметологии на основе гуминовых и гуминоподобных веществ, остаётся актуальным и приоритетным направлением исследований [92,106].

В последние годы наблюдается также активизация исследований в области очистки и стандартизации биологически активных веществ гуминоподобно-го типа, что в первую очередь связано с антропогенным загрязнением пелоидов [1,5]. Одной из главных проблем на пути разработки теории и практики применения пелоидопрепаратов является недостаточная изученность гуминовых кислот (как компонентов пелоидов), которые обуславливают их терапевтическую эффективность [5, 121], а так же наличие их антропогенных загрязнителей [1]. С другой стороны, нет четких представлений об особенностях структурны гуминовых кислот, выделенных из различных типов лечебных грязей. Отсутствие методологических подходов к анализу органических объектов стохастического характера и численному описанию их строения привело к тому, что определение класса гуминовых веществ до сих пор базируется на способе извлечения из природных объектов, а их классификация на процедуре фракционирования [78]. Использование современных физико-химических методов исследования (спектроскопические, хроматографические) преследует цель получения сравнимых характеристических данных с нативного образца гуминовых кислот. Поэтому образцы ГК часто практически не подвергают фракционированию и очистке, что оставляет нерешенной проблему наличия примесных органических и неорганических компонентов [178, 215]. Разногласия, имеющиеся в литературных источниках, связаны с большой разновидностью гуминовых веществ, и в значительной степени со сложностью их фракционирования [208]. С другой стороны, методы фракционирования: хроматография, мембранное разделение, ультрацентрифугирование ограничиваются только определением молекулярных масс у отдельных фракций [71, 178]. Нереализованным на сегодняшнее время остается использование тандемных хроматографических методов с последующим их инструментальным анализом. Практически не исследованными остаются сравнительные характеристические показатели гуминовых кислот и гуминопо-добных веществ, содержащихся в некоторых лекарственных препаратах (поли-фепан, чага и др.).

В этой связи разработка новых способов фракционирования гуминовых и гуминоподобных веществ, безусловно актуальна и перспективна.

Цель исследования. Целью работы является определение ключевых компонентов и поиск возможных структурных фрагментов гуминовых веществ в препарате ФиБС, а так же сравнительная характеристика нативных и хрома-тографически очищенных фракций гуминовых кислот и гуминоподобных веществ, выделенных из различных объектов природного происхождения и лекарственных препаратов (полифепан, чага).

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить хроматографическими методами наличие структурных компонентов гуминовых веществ в лекарственном препарате ФиБС и изучить их качественные характеристики.

2. Изучить возможность использования хроматографической очистки на перешитых декстрановых сорбентах при мягких режимах элюции щелочных экстрактов гуминовых кислот и гуминоподобных веществ, выделенных из лечебных грязей и лекарственных препаратов (полифепан, чага).

3. Определить эффективность тандемного варианта хроматографирова-ния при фракционировании гуминовых кислот и гуминоподобных веществ исследуемых объектов (полифепан, чага, лечебные грязи).

4. Исследовать возможность хроматографирования на адсорбентах аффинного типа гуминовых кислот, выделенных из лечебной грязи.

5. Определить с помощью методов ЯМР-, ИК-, ЭПР-спектроскопии, СМН-элементного анализа структурные компоненты гуминовых кислот и гуминоподобных веществ в лечебных грязях и лекарственных препаратах.

Научная новизна исследования. Впервые разработан метод определения ключевых компонентов препарата ФиБС (кумарин и коричная кислота) методом неклассической аффинной хроматографии и проанализированы качественные характеристики минорных примесей в нем.

Впервые рассмотрена сравнительная характеристика гуминовых кислот и гуминоподобных веществ, выделенных в стандартных условиях из различных природных объектов, находящих применение в медицинской практике.

Для очистки и фракционирования щелочных экстрактов гуминовых кислот и гуминоподобных веществ, полученных в одинаковых условиях из различающихся лечебных грязей и лекарственных препаратов (чага и полифепан), впервые применили тандемный вариант с использованием перешитых полиса-харидных сорбентов. Затем их хроматографические фракции были инструментально исследованы с применением методов спектрального анализа.

Впервые осуществлен синтез нового адсорбента аффинного типа на основе сефадекса в-100.

Научно-практическая значимость работы. Совокупность полученных физико-химических характеристик гуминовых и гуминоподобных веществ, выделенных из различающихся природных объектов и лекарственных препаратов, являются основой дальнейших исследований по созданию новых лекарственных средств на их основе. Особенности качественного состава препарата ФиБС (с учётом минорных компонентов) должны быть учтены при разработке и стандартизации пелоидопрепаратов и биостимуляторов. На основании данных, полученных при выполнении работы, разработаны методические рекомендации по оптимизации способов выделения и хроматографической очистки гумино-вых кислот и гуминоподобных веществ.

С использованием современных физико-химических методов определены структурные особенности изученных нативных гуминовых и гуминоподобных веществ и их хроматографических фракций.

Положения, выносимые на защиту:

- Результаты по изучению качественных характеристик состава препарата ФиБС хроматографическими методами;

- Идентификация микропримесей в препарате ФиБС;

- Результаты хроматографирования гуминовых кислот на азоадсорбен-тах аффинного типа;

- Данные хроматографического способа очистки и фракционирования гуминовых кислот и гуминоподобных веществ с использованием по-лисахаридных гелей в тандемном варианте;

- Сравнительная оценка физико-химических и хроматографических особенностей гуминовых кислот и гуминоподобных веществ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на областных и региональных научных конференциях: Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы медицины и биологии» (Кемерово, 2004). Международных конференциях: XI конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии, и экологии. 1Т +МЕ' 2003» (Украина, Крым, Ялта - Гурзуф, 2003); на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); VI международной научно - практической конференции «Безопасность жизнедеятельности предприятий в угольных регионах» (Кемерово, 2005); IX международной научно- практической конференции «Химия - XXI век: новые технологии, новые продукты» (Кемерово, 2006); Международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006).

Публикации. Основные материалы исследований опубликованы в 14 печатных работах и методическом пособии.

Внедрение результатов работы. По результатам исследования разработаны методические рекомендации «Способы выделения, концентрирования и очистки гуминовых и гуминоподобных веществ из объектов природного происхождения», которое внедрено в научно-исследовательскую работу Института экологии человека СО РАН (Акт внедрения от 25.10.2006г.), ГОУ ВПО Кемеровской государственной медицинской академии Росздрава (Акт внедрения от 16.01.2007г.), ГОУ ВПО Кемеровского технологического института пищевой промышленности (Акт внедрения от 10.11.2006).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава в соответствии с планом НИР ГОУ ВПО КемГМА Росздрава (№ госрегистрации 0120.0506552).

Личный вклад автора состоит в планировании, организации и проведении исследований по всем разделам диссертации, включая разработку направлений исследований, сбор и анализ информации, выбор методов, интерпретации результатов, написании диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2, 3, 4, 5), выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 148 страницах, содержит 11 таблиц, 44 рисунка. Библиографический список включает 242 источника, из них 119 на иностранных языках.

122 ВЫВОДЫ

1. Показана возможность идентификации и микропрепаративного накопления ключевых компонентов препарата ФиБС в образце с использованием метода неклассической аффинной хроматографии.

2. С помощью адсорбента аффинного типа были впервые накоплены и подвергнуты анализу минорные компоненты препарата ФиБС, что позволило идентифицировать их как кремнийорганические соединения и производные фталевой кислоты.

3. С помощью хроматографического тандемного варианта на перешитых поли-сахаридных гелях показана возможность выделения и очистки двух основных водо-растворимых фракций как из лечебной грязи, так и из некоторых лекарственных препаратов (чага, полифепан). Предложенный хроматогра-фический тандемный метод выделения и очистки гуминовых кислот и гуми-ноподобных веществ является альтернативным вариантом для их углубленного изучения.

4. Нативные образцы и фракции, полученные в тандемном варианте хроматографирования из всех изученных объектов (чага, полифепан, два вида лечебной грязи, гумат натрия фирмы А1с1пс11), были исследованы с использованием методов ЯМР С13, ИК, ЭПР - спектроскопии, СМН-элементного анализа, при этом некоторые физико-химические характеристики гуминоподобных веществ из лекарственных препаратов были получены нами впервые.

5. С помощью комплекса физико-химических методов осуществлена сравнительная характеристика гуминовых кислот и гуминоподобных веществ в изучаемых объектах, а также в их хроматографических фракциях.

6. Выделенные при щелочной экстракции из лекарственных препаратов чага и полифепан образцы гуминоподобных веществ по своим физико-химическим характеристикам соответствуют параметрам стандарта гуминовой кислоты фирмы А1с1псЬ.

7. Определены характерные физико-химические параметры гуминовых кислот выделенных из лечебных грязей различного типа.