Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Химико-фармацевтическое исследование гуминовых веществ сапропеля озера Горчаково

На правах рукописи

Савченко Ирина Александровна

ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ САПРОПЕЛЯ ОЗЕРА ГОРЧАКОВО

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

15 АПР 2015

Улан-Удэ-2015

005567462

005567462

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Лукша Елена Александровна кандидат фармацевтических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Раднаева Лариса Доржиевна - доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Байкальский институт природопользования» Сибирского отделения Российской академии наук / лаборатория химии природных соединений, заведующий

Чирикова Надежда Константиновна - кандидат фармацевтических наук, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Амосова», Институт естественных наук / кафедра биохимии и биотехнологии, доцент

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «22» мая 2015 г. в 10.00 час. на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки "Институт общей и экспериментальной биологии" СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН и на сайте ИОЭБ СО РАН: http://igeb.ru

Автореферат разослан «_££_» апреля 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент

— В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Одной из приоритетных задач фармации в современном мире является создание отечественных лекарственных средств на основе сырья природного происхождения. Сапропель, как возобновляемый природный ресурс, является перспективным сырьем для выделения и получения гуминовых веществ. Гуминовые вещества (ГВ) представляют собой сложные высокомолекулярные полидисперсные соединения стохастического характера, обладающие биологической активностью. Исследования последних десятилетий свидетельствуют о том, что строение и свойства гуминовых веществ зависят не только от вида исходного сырья, но и от месторождения конкретного сырьевого источника (Соколова, 2008; Лиштван, 2012; Уразова, 2013; Gondal, 2008).

Воздействие различных факторов (ультразвук, УФ-свет, температура и др.), применяемых в процессе выделения ГВ для повышения их биодоступности и увеличения выхода из природных объектов, изменяет их структуру и свойства, что в итоге влияет на биологическую активность конечного продукта (Лебедева, 2005; Москаленко, 2011; Тюнина, 2012).

Данные по исследованию биологической активности гуминовых веществ, достаточные сырьевые ресурсы экологически чистого и доступного для переработки источника ГВ - сапропеля на территории Омской области, определяют перспективность изучения гуминовых соединений для внедрения в медицинскую практику. В связи с этим проведение комплексного сравнительного химико-фармацевтического исследования гуминовых веществ из сапропеля озера Горчаково, является актуальным.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось химико-фармацевтическое изучение гуминовых веществ сапропеля озера Горчаково Ткжалинского района Омской области.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить химический состав сапропеля озера Горчаково и определить содержание в нем экотоксикантов;

- изучить влияние различных физических и химических факторов на процесс извлечения гуминовых веществ из сапропеля;

- определить химический состав и установить спектральные характеристики выделенных гуминовых веществ;

- выявить оптимальные критерии качественной и количественной стандартизации сапропеля и гуминовых веществ;

- разработать нормативную документацию на сапропель и PCO «Гуминовые вещества».

Научная новизна. В результате исследования химического состава сапропеля озера Горчаково Тюкалинского района Омской области установлено, что органическая часть сапропеля включает липофильные компоненты, гуминовые вещества, в т.ч. гуминовые и гиматомелановые

кислоты, фульвокислоты, водорастворимые и легкогидролизуемые вещества и негидролизуемый остаток. Исследуемый сапропель не содержит в составе хлорорганические пестициды, удельная эффективная активность природных радионуклидов в образцах сапропеля не превышает предельно допустимые значения для лечебных грязей, содержание тяжелых металлов в объектах анализа не превышает гигиенические нормативы. Установлено, что доминирующей группой БАВ сапропеля являются гуминовые вещества. Определены числовые показатели (влажность, зольность, содержание гуминовых веществ).

Исследована зависимость выхода гуминовых веществ из сапропеля от различных физических факторов (УЗ-кавитация, УФ-облучение, температура). При выделении гуминовых веществ из сапропеля использовано УФ-облучение щелочного гидролизата с целью получения модифицированных гуминовых соединений. Изучены свойства выделенных гуминовых веществ. Адаптированы методики качественного и количественного определения гуминовых веществ. Впервые показана возможность применения метода Боэма с кондуктометрической фиксацией точки эквивалентности для количественного определения гуминовых веществ.

Практическая значимость. На основании данных химического и фармакогностического анализа разработаны: проект ФСП «Сапропель озера Горчакове»; проект ФСП «Гуминовые вещества активированные»; проект ТУ «Гуминовые вещества активированные озера Горчакове - стандартный образец»; методические рекомендации «Количественное определение функциональных групп кислотного характера в гуминовых веществах методом Боэма с кондуктометрической фиксацией конечной точки титрования».

Методы исследования. Применительно к проблематике диссертации использован комплекс спектральных (УФ, ИК, ЯМР), экстракционных, химических, микроскопических, биохимических и статистических методов исследований, а также современные методики сбора и обработки исходной научной информации.

Степень внедрения. Разработанные методические рекомендации внедрены в рабочий процесс ООО «Биолит», г. Томск, используются при проведении научно-исследовательских работ в лаборатории резистентности животных института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина, а также в учебном процессе кафедры фармацевтической, аналитической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия», кафедры фармацевтической химии ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия».

На защиту выносятся:

- данные изучения химического состава сапропеля озера Горчаково Тюкалинского района Омской области;

- результаты изучения влияния различных факторов на процесс выделения гуминовых веществ из сапропеля;

- результаты исследования физико-химических свойств выделенных из сапропеля гуминовых веществ;

- методики качественного и количественного определения гуминовых веществ.

Апробация полученных результатов. Основные положения работы доложены и обобщены на научно-практических конференциях: 66-ой региональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2011); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (Владикавказ, 2013), Всероссийской научно-методической конференции с международным участием «Инновационные технологии в фармации», посвященной 95-летию Иркутского государственного медицинского университета (Иркутск, 2014); Всероссийском съезде фармацевтических работников (Москва, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Теоретические и прикладные исследования в области естественных и гуманитарных наук» (Прокопьевск, 2014).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России, тематикой проблемной комиссии «Актуальные проблемы лекарствоведения в Сибирском регионе №7».

Личный вклад автора. Автор принимал участие в определении цели исследования и путей ее реализации, планировании и выполнении экспериментов. Автором проводились химические, фармакологические виды исследований, анализ, статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Согласно сформулированным задачам подготовлены доклады, тезисы и статьи, оформлена диссертация, автореферат, представленные к защите.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия, конкретно пунктам 2, 3 и 6.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 8 статей в изданиях Перечня ВАК МОиН РФ.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 209 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, состоящего из 282 источников, в том числе 75 на иностранных языках, и включает 32 рисунка, 31 таблицу и 8 приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во введении обозначены актуальность темы, цель и задачи исследований, научная новизна, практическая значимость исследований, сведения об апробации работы и основные положения, выносимые на защиту.

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРОЕНИИ, МЕТОДАХ

ВЫДЕЛЕНИЯ И СВОЙСТВАХ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

В главе представлен наукометрический анализ данных по степени изученности сапропеля, как источника гуминовых веществ, обобщены сведения по методам выделения, модификации и исследования гуминовых веществ, представлены данные о фармакологической активности биологически активных добавок на основе гуминовых соединений, систематизирована информация по методам анализа гуминовых веществ, отражены основные проблемы их стандартизации.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил сапропель озера Горчаково Тюкалинского района Омской области, предоставленный ЗАО НПО «Вега-2000-Сибирская органика» в период с 2010 по 2013 годы, гуминовые вещества, выделенные из сапропеля и гуминовые вещества, подвергнутые УФ-облучению на стадии выделения из сапропеля («гуминовые вещества активированные» - ГВА). Образцы предварительно высушивали до воздушно-сухого состояния.

Определение экотоксикантов в сапропеле проводили с помощью гамма-спектрометрического анализа на приборе гамма-спектрометр сцинтилляционный «Гамма - 1С» (ЗАО НПЦ Аспект, Россия), атомно-эмиссионной спектрометрии на приборе iCap 6300 Duo (Thermo Electron Corporation, США), газохроматографического метода с электронозахватным детектором на хроматографе «Хроматэк-Кристалл 5000» (ЗАО СКБ Хромата к, Россия) с колонкой НР-5 (60 м х 0,32 мм, толщина пленки 1,00 мкм). Обработка результатов измерений проводилась с помощью компьютерной программы «LSRM 16», DUO (v8) и методом абсолютной калибровки.

Гуминовые вещества из сапропеля выделяли по модифицированному методу Н. Н. Бамбалова (Бамбалов Н. Н., 1998), при получении гуминовых веществ активированных щелочную суспензию сапропеля подвергали УФ-облучению в термостатируемых кюветах (20-22°С) с помощью ртутной разрядной лампы (Osram, Германия) при длине волны 254 нм.

Элементный анализ гуминовых веществ определяли методом пиролизной хроматографии на автоматическом CHNS/O элементном анализаторе «Vario Micro cube» (Elementar GmbH, Германия).

Спектроскопическое исследование гуминовых веществ проводили на приборах: спектрофотометр UNICO-2802S (United Products & Instruments, США) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см в диапазоне от 190 до 1100 нм, ИК-Фурье спектрометр «Infralum FT - 801» (ООО НПФ «СИМЕКС», Россия) в таблетках КВг в соотношении 1:100, в интервале значений частот от 500 до 4000 см"1, флуориметр AvaSpec-2048 (Avantes, Голландия), спектрометр AVANCE III™ 400 (Bruker Analytic GmbH, Germany) с рабочей частотой на ядрах 13С 100,63 МГц.

Изучение морфологии поверхности ГВ и ГВА проводили с использованием сканирующего электронного микроскопа JEOL JSM-6610LV («JEOL», Япония), оснащённого энергодисперсионным анализатором INCAx-Act («Oxford Instruments», Япония).

Количественное определение гуминовых веществ проводили методом Боэма (Boehm Н. Р., 2002) с кондуктометрической фиксацией конечной точки титрования на лабораторном анализаторе «Мультитест KCJI» (НПП «Семико», Россия) при температуре 20±2°С. Массовую концентрацию гуминовых веществ определяли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала удельной электропроводности (мСм/м), рассчитанного при титровании карбоксильных функциональных групп методом Боэма, от массы навески гуминовых веществ.

Стандартизацию сапропеля и гуминовых веществ по показателям растворимость, потеря в массе при высушивании, зола, тяжелые металлы, микробиологическая чистота проводили согласно методикам ГФ XI и ГФ XII. При разработке проектов ФСП на сапропель и гуминовые вещества активированные руководствовались ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества JIC. Основные положения» и Руководством по стандартизации лекарственных средств (Хабриев Р. У., 2006).

Статистическую обработку полученных результатов проводили путем расчета средней (А',,) и средней квадратичной ошибки (т), граничных значений доверительного интервала (Хср±Ах). О достоверности различий судили, используя параметрический (/-критерий Стьюдента) и непараметрические (Г-критерий Манна-Уитни, Даннета) методы (Вершинин В. И., 2005; Смагунова А. Н., 2012). Расчеты проводили с использованием программ Statistica 6.0 и SPSS 12.0.

Глава 3. ОПТИМИЗАЦИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ

САПРОПЕЛЯ

В результате исследований было установлено, что исследуемый сапропель не содержит в составе хлорорганические пестициды, удельная эффективная активность природных радионуклидов в образцах сапропеля не

превышает предельно допустимые значения для лечебных грязей, содержание тяжелых металлов в объектах анализа не превышает гигиенические нормативы.

В составе органической части сапропеля определены следующие группы соединений: липофильные фракции (3,1±0,07%), гуминовые вещества (25,8±0,57%), фульвокислоты (2,0±0,04%), водорастворимые и легкогидролизуемые вещества (15,1±0,34%) и негидролизуемый остаток (27,8±0,62%). В состав минеральной части сапропеля входят макро- и микроэлементы: кальций, магний, алюминий, железо, медь, цинк, марганец, кобальт и др.

При разработке способа выделения гуминовых веществ из сапропеля было установлено, что воздействие УФ-света с длиной волны 254 нм при температуре 25°С в течение 120 мин приводит к максимальному изменению свойств гуминовых веществ, о чем свидетельствует увеличение количества карбоксильных ФГ и повышение антиоксидантной активности.

Глава 4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ САПРОПЕЛЯ ОЗЕРА ГОРЧАКОВО

Химическими и физико-химическими методами было проведено сравнительное исследование свойств гуминовых веществ, выделенных из сапропеля и гуминовых веществ, подвергнутых активирующему влиянию ультрафиолетового света на стадии выделения. При изучении элементного состава установлено, что для исследуемых ГВА отмечены более высокие значения (38,28 масс. %) содержания кислорода по сравнению с ГВ (34,63 масс. %), что может быть связано с увеличением в их структуре карбоксильных, лактонных и гидроксильных групп (таблица 1).

Таблица 1 - Элементный состав и атомные отношения для ГВ и ГВА (средние значения за 2010-2013 г.)

Образец

ГВ

ГВА

Элементный состав*, масс. %

53,96

51,77

Н

5,78

5,53

N

4,89

4,43

О

34,63

38,28

*В пересчете на бемольную сухую навеску (влажность 7%)

Атомные отношения

Н/С

1,28

1,27

С/И

12,88

13,65

О/С

0,48

0,56

Степень окисленности, рассчитываемая как атомное соотношение О/С, характеризует изменения в строении ГВА, происходящие в процессе воздействия УФ-света. Среднее соотношение О/С для ГВА составляет 0,56, для ГВ - 0,48, что косвенно указывает на увеличение количества кислородсодержащих групп под воздействием УФ-облучения. ГВ и ГВА имеют близкие значения показателя Н/С, характеризующего степень

ароматичности или ненасыщенности, и составляют: 1,28 и 1,27 соответственно, что указывает на преобладание в их составе алифатических фрагментов (Н/С>1). Об относительно высоком количестве амидных и аминогрупп могут свидетельствовать данные атомного отношения C/N (Кирейчева JI. В., 2000; Белоусов М. В., 2009). Незначительное увеличение атомного отношения C/N в ГВА объясняется уменьшением количества углерода.

Оценка морфологии поверхности гуминовых веществ, проведенная методом сканирующей электронной микроскопии, показала, что гуминовые вещества имеют глобулярную структуру (рисунок 1 а), а гуминовые вещества активированные - слоистую структуру (рисунок 1 б).

Рисунок 1 - Микрофотографии поверхности гуминовых веществ (а *1000) и гуминовых веществ активированных (б *5000)

Электронные спектры поглощения гуминовых веществ и спектроскопические коэффициенты позволили оценить изменения в структуре гуминовых соединений, происходящие при облучении их УФ светом.

Представленный на рисунке 2 спектр ГВА отличается от спектра ГВ максимумом при 265 им - область вторичных В-полос, обусловленная переходами Alg B2u, а также более сильным поглощением в диапазоне от 220 до 300 нм, что может свидетельствовать о присутствии большего количества полисопряженных фрагментов и/или об уменьшении доли периферической части в структуре ГВА.

0,4

-ГВА

0,35 А —гв

0,3

0,25 и \

< 0,2 ]\ \

0,15 В Ч\

од

0,05

0

190 240 290 340 390 440 490 540 590 640 690

Л, нм

Рисунок 2 — Электронные спектры поглощения растворов 0,001% ГВ и ГВА в УФ и видимой областях

Наблюдаемое снижение коэффициента цветности для ГВА может свидетельствовать об увеличении содержания полисопряженных фрагментов и увеличении степени их окисленности по сравнению с ГВ, что согласуется с полученными ранее данными элементного анализа. Сравнение коэффициентов экстинкции также подтверждает данное заключение (таблица 2).

Таблица 2 - Спектроскопические коэффициенты для гуминовых веществ и гуминовых веществ активированных

Образец Е465/Е650 р0.001% 465 р0.001% 650

ГВ 4,92 0,01625 0,0033

ГВА 4,18 0,02519 0,00603

Данные ИК-спектроскопии свидетельствуют о влиянии УФ-излучения на состав и количество функциональных групп в молекулах гуминовых соединений. На рисунке 3 представлены фрагменты ИК-спектров гуминовых веществ и гуминовых веществ активированных. Наибольшие изменения в ИК-спектре ГВА наблюдаются в области 1100-900 см"1, где происходит уменьшение поглощения, соответствующего валентным колебаниям С-О-связей первичных и вторичных спиртовых групп и С-О-С-связей, в том числе в полисахаридных фрагментах.

•- Волновое число •- Волновое число

3000 1500 10ОО

ИК-спектроскопия исследуемых образцов показала, что ГВ и ГВА имеют близкое химическое строение, но в активированных гуминовых веществах снижено количество алифатических фрагментов и увеличилось содержание карбонильных (хиноидных) и карбоксильных групп. Снижение количества алифатических фрагментов возможно за счет разрушения низкомолекулярных фракций гуминовых соединений и периферийной части макромолекул под воздействием облучения УФ-светом.

Вероятно, увеличение содержания карбонильных и карбоксильных групп в молекулах ГВА связано с окислением и фотодеструкцией макромолекул гуминовых соединений в процессе их выделения под действием УФ-света.

СРМАБ 13С ЯМР спектры ГВ и ГВА представлены на рисунке 4. В целом, ЯМР спектры имеют схожий вид. Основные различия проявляются в алифатическом регионе (48-5 м.д.): в процессе активации увеличилось относительное содержание метильных (СН3-С(0)-0-, СНз-СН=СН-) и метиленовых групп в а- и р-положении к амино- или карбоксигруппе (42.1 м.д.). Также снизилась интенсивность сигналов углерода полисахаридных фрагментов в области 60, 70 и 100 м.д.

Рисунок 4 - СРМАБ 13С ЯМР спектры гуминовых веществ и гуминовых веществ активированных

Количественное определение гуминовых веществ проводили по разработанной методики, основанной на зависимости удельной электропроводности растворов гуминовых веществ в конечной точке титрования методом Боэма от их концентрации.

При разработке методики в качестве стандартного образца использовали высокоочищенные гуминовые вещества активированные, отвечающие требованиям технических условий.

При определении карбоксильных функциональных групп методом Боэма (таблица 3) были последовательно зарегистрированы сигналы удельной электропроводности растворов гуминовых веществ активированных - стандартного образца в порядке возрастания их концентрации в конечной точке титрования.

Таблица 3 - Показатели удельной электропроводности гуминовых веществ в конечной точке титрования при определении карбоксильных групп (средние значения)

№ п/п Удельная электропроводность, мСм/м Концентрация раствора гуминовых веществ, %

1 58,0 0,01

2 58,6 0,02

3 59,2 0,03

4 59,8 0,04

5 60,4 0,05

Количественное содержание ГВА в процентах рассчитывали, используя построенный градуировочный график зависимости выходного сигнала удельной электропроводности (мСм/м) от массовой концентрации гуминовых веществ активированных — стандартного образца.

Результаты исследования in vitro показали наличие мягких сорбционных свойств гуминовых веществ.

Согласно полученным данным, ГВ и ГВА обладают большей адсорбцией по метиленовому голубому (270 ± 10 мг/г и 240 ± 8 мг/г), что характеризует макропористость объектов (рисунок 5).

Сорбционные свойства гуминовых веществ

800

700 670 б?° 600 500 400

300 XI 1| 270 240

200 Н Я 'х5 ■ 162 ■■ 147 140

II II ■! ■■

Активированный ГВА ГВ сапропель

уголь

■ сорбционная емкость по йоду, мг/г

■ сорбционная емкость по метнленовому голубому, мг/г

Рисунок 5 - Результаты оценки сорбционных свойств гуминовых веществ

Гуминовые вещества, подвергнутые УФ-воздействию на стадии выделения, обладают несколько большей сорбционной емкостью, что объясняется увеличением количества пор под воздействием ультрафиолетового облучения. Сорбционная емкость по метиленовому голубому и по йоду у сапропеля значительно ниже, чем у гуминовых веществ, что свидетельствует о небольшом количестве микро-, макро- и мезопор и невозможности химического взаимодействия между функциональными группами сапропеля и указанными реагентами.

Результаты исследования антиоксидантной активности сапропеля, ГВ и ГВА приведены на рисунке 6.

Все исследуемые вещества проявляют антиоксидантную активность, поскольку величина АО А превышает 10% (Хасанова С. Р., 2007).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

73 74

Стандартный

образец (аскорбиновая кислота)

29,68

21.12

15,21

ГВА

ГВ

Сапропель

Рисунок 6 — Результаты исследования антиоксидантной активности

Проведенные исследования показали, что наибольшее значение АОА выявлено у гуминовых веществ (ГВА), подвергнутых щелочному фотолизу, что может быть связано с увеличением содержания кислородсодержащих функциональных групп (фенольных, карбонильных и хиноидных) и степени ненасыщенности связей в молекуле.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили, что наиболее перспективной для внедрения в медицинскую практику является субстанция гуминовых веществ, выделенных из сапропеля под воздействием УФ-света.

Глава 5. ПОКАЗАТЕЛИ КАЧЕСТВА САПРОПЕЛЯ И ГУМИНОВЫХ

ВЕЩЕСТВ

Для качественного обнаружения гуминовых веществ в сапропеле был использован метод ИК-спектроскопии, как наиболее информативный. Для увеличения достоверности результатов испытания проводили, используя каждый раз не менее 5 проб образцов.

В соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00 к структуре и перечню разделов фармакопейной статьи, установлены основные числовые показатели для стандартизации сапропеля: влажность не более 15%, зола общая не более 28,0%, зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной не более 1,0%, сапропель выдерживает требования микробиологической чистоты согласно ОФС 42-0016-04 (категория 4А) и ГФ XII, стр. 160, в сапропеле отсутствуют возбудители сальмонеллеза, сибирской язвы, анаэробной и синегнойной микрофлоры, патогенного протея, кишечной палочки, содержание тяжелых металлов не более 0,001%, отсутствуют остаточные количества хлорорганических пестицидов.

Количественное содержание гуминовых веществ в исходном сырье -сапропеле устанавливали гравиметрическим методом. Статистическая обработка результатов количественного определения гуминовых веществ представлена в таблице 4.

Таблица 4 - Метрологическая характеристика методики количественного определения гуминовых веществ в сапропеле

п ср s-' 5 Sr / (0,95) Хср ± Ах

20 25,80 16,8х 10"^ 41,0x10"2 1,59x10"' 2,09 25,8 ±0,18

Разработанная методика количественного определения гуминовых веществ гравиметрическим методом в сапропеле провалидирована по показателям: линейность (}'= 0,255 ■ Х- 0,0273, г = 0,993), прецизионность (А' = 25,91%, ИБО = 1,55%, Ж = 0,40) и точность (Я = 99,47%, = 0,37%, 50 = 0,36). Установлено, что предлагаемая методика количественного определения гуминовых веществ в сапропеле является специфичной, воспроизводимой и точной, что дает возможность рекомендовать данную методику для контроля качества сапропеля, как источника для получения гуминовых веществ.

В соответствии с проектом ФСП «Сапропель озера Горчаково», содержание гуминовых веществ должно быть не менее 25,0%. Соответствующие нормы качества для сапропеля представлены в таблице 5.

Таблица 5 — Спецификация на сапропель озера Горчаково

Показатели качества Методы испытания Нормы

1 2 3

Описание Органолептнческий, ГФ XII, ч. 1 Порошок темно-коричневого цвета с вкраплениями, без запаха

Растворимость ГФХН, ч. 1, стр. 92 Практически нерастворим в воде, умеренно растворим в растворах щелочей, мало растворим в хлороформе, спирте и эфире. При растворении образуются мутные растворы

Подлинность ИК-спектроскопия Должен соответствовать рисунку

Потеря в массе при высушивании ГФХ1, вып. 1, стр. 176 Не более 15%

Тяжелые металлы ГФХН, ч. 1, стр. 121 Не более 0,001%

Зола общая ГФХН, ч. 1, стр. 115 Не более 28,0%

Зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной ГФ XI, вып. 2, стр. 24 Не более 1,0%

Микробиологическая чистота ОФС 42-0016-04 Категория 4А

Количественное определение Гравиметрический Не менее 25,0% гуминовых веществ

Упаковка По 0,5 кг в пакеты полиэтиленовые

Маркировка Соответствие ФС

Условия хранения В сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25 "С

Срок годности 4 года

При разработке проекта ФСП на гуминовые вещества, выделенные из сапропеля, были учтены результаты собственных сравнительных исследований по изучению структуры и свойств гуминовых веществ и гуминовых веществ активированных. Проект ФСП был создан на более перспективную для внедрения в медицинскую практику субстанцию гуминовых веществ активированных.

Для идентификации ГВА использовали методы ИК-спектроскопии, спектрофотометр ии в ультрафиолетовой и видимой областях. Для объективной оценки спектральных характеристик гуминовых веществ было проведено сравнительное исследование спектров стандартных образцов гуминовых веществ активированных и испытуемых гуминовых веществ активированных, полученных в одинаковых условиях.

Разработку норм качества ГВА проводили в соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения».

Количественное определение гуминовых веществ активированных проводили методом Боэма с коцдукгометрической фиксацией конечной точки титрования. Статистическая обработка результатов количественного определения гуминовых веществ активированных представлена в таблице 6.

Таблица 6 - Метрологическая характеристика методики количественного определения гуминовых веществ активированных

п Хср 5 1(0,95) Хср ± Ах

10 97,78 2,37 0,648 1,57х КГ4 2,26 97,78 ± 1,1

Разработанная методика количественного определения гуминовых веществ провалидирована по показателям: линейность (7 = 240 ■ X + 57,4; г = 0,999), прецизионность (X = 97,6%, Бй = 5,143x10"', ШБ = 5,ЗОхЮ-3 %) и точность {К = 99,63%, 50 = 0,279, ЛЖ> = 2,80* Ю"3%). Установлено, что предлагаемая методика количественного определения гуминовых веществ активированных является специфичной, воспроизводимой, точной и линейной в диапазоне концентраций 0,01-0,05%, что предполагает

рекомендовать данную методику для контроля качества гуминовых веществ активированных, как источника для получения лекарственных средств.

В соответствии с проектом ФСП «Гуминовые вещества активированные», содержание гуминовых веществ активированных должно быть не менее 95%. Соответствующие нормы качества для гуминовых веществ активированных представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Спецификация на гуминовые вещества активированные

Показатели качества Методы испытания Нормы

1 2 3

Описание Органолептический Аморфный порошок темно-коричневого цвета, без запаха

Растворимость ГФXII,ч. 1, стр.92 Практически нерастворим в воде, умеренно растворим в горячей воде, растворим в растворах щелочей, мало растворим в хлороформе и спирте. При растворении в указанных растворителях образует мутные растворы

Подлинность: ИК-спектр ИК-спектроскопия Должен соответствовать рисунку

Спектр в УФ- и видимой областях Спектрофотометрия Спектр поглощения раствора в диапазоне длин волн 190-900 пм должен обладать максимумом при длипе волны 265±2 им

Коэффициент цветности (Е4/Е6) Спектрофотометрия Коэффициент цветности должен быть не менее 4,16 и не более 4,20

Потеря в массе при высушивании ГФ XI, вып. 1, стр. 176 Не более 5%

Хлориды ГФ XI, вып. 1, стр. 165 Не более 0,02%

Сульфаты ГФ XI, вып. 1, стр. 165 Не более 0,02%

Сульфатная зола ГФ XII, ч. 1, стр. 115 Не более 0,1%

Тяжелые металлы ГФ XII, ч. 1, стр. 121 Не более 0,001%

Микробиологическая чистота ГФ XII, ч. 1, стр. 160 Категория 3.2.

Количественное определение: Содержание гуминовых веществ активированных Кондукгометрическое титрование Не менее 95%

Упаковка По 1 кг в мешки бумажные многослойные

Маркировка Соответствие ФС

Условия хранения В сухом, защищенном от света месте при температуре пе выше 25°С

Срок годности 3 года

Для обоснования сроков хранения образцы гуминовых веществ активированных закладывали на хранение в соответствии с действующей нормативной документацией ОФС 42-0075-07 «Сроки годности лекарственных средств».

В образцах гуминовых веществ активированных в течение 3 лет проводили количественное определение функциональных групп кислотного характера с периодичностью 6 месяцев. Полученные результаты (рисунок 7) позволяют установить срок годности 3 года для «Гуминовых веществ активированных» и использованы для разработки проекта ФСП.

Количественное определение ФГ кислотного характера

2,86

2,4

ы 1,61

£

2,86

£ 1 й^

т

I

1,6

-2,84 2,83 2,37 1

1,59

■Л

1,58

—|

А 2,82

в 1,56

6 12 18 24 30 36

Продолжительность контроля, месяцы

- Карбоксильные группы, ммоль/г

| Лактонные группы, ммоль/г

Гидрокскпьные группы, ммоль/г

Рисунок 7 - Результаты изучения сроков годности гуминовых веществ активированных

выводы

1. На основании данных научной литературы по содержанию гуминовых веществ в сырье природного происхождения, а также территориальных запасов, экологической безопасности, доступности переработки сапропеля в озерах Западной Сибири устаповлено, что одним из перспективных источников гуминовых веществ может являться сапропель озера Горчакове Тюкалинского района Омской области.

2. В результате определения экотоксикантов было установлено, что исследуемый сапропель не содержит в составе хлорорганические пестициды, удельная эффективная активность природных радионуклидов в образцах сапропеля не превышает предельно допустимые значения для лечебных грязей, содержание тяжелых металлов в объектах анализа не превышает гигиенические нормативы. Бактериологические исследования сапропеля показали отсутствие в нем возбудителей сальмонеллеза, сибирской язвы, анаэробной и синегнойной микрофлоры, патогенного протея, кишечной палочки.

3. Установлено, что состав органической части сапропеля представлен следующими группами соединений: липофильные фракции (3,1±0,07%), гуминовые вещества: гуминовые и гиматомелановые кислоты (25,8±0,57%), фульвокислоты (2,0±0,04%), водорастворимые и легкогидролизуемые вещества (15,1±0,34%) и негидролизуемый остаток (27,8±0,62%).

4. На основании сравнительного анализа гуминовых веществ, выделенных из сапропеля и гуминовых веществ, подвергнутых фотохимической активации в процессе выделения, установлено, что под воздействием УФ-облучения происходят изменения физико-химических свойств гуминовых соединений. Результаты исследований показали, что более выраженными сорбционными свойствами и антиоксидантной активностью обладают гуминовые вещества активированные.

5. На основании выявленных особенностей структуры сапропеля и гуминовых веществ активированных разработаны критерии стандартизации исходного сырья — сапропеля и выделенных из него гуминовых веществ. Предложены методики определения подлинности сапропеля и количественного определения основной группы БАВ в сапропеле -гуминовых веществ. Разработаны методики определения подлинности гуминовых веществ активированных методом ИК-спектроскопии и их количественного определения методом Боэма с кондуктометрической фиксацией точки эквивалентности. Валидационный анализ показал соответствие методик критериям правильности, прецизионности, специфичности и линейности.

6. Создан проект фармакопейной статьи предприятия «Сапропель озера Горчакове» и проект фармакопейной статьи предприятия «Гуминовые вещества активированные».

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Савченко, И. А. Исследование продуктов термической переработки сапропелем Омской области / И. А. Савченко, Г. В. Плаксин, О. И. Кривонос [и др.] // Омский научный вестник. Серия «Ресурсы земли. Человек». - 2006. - №3 (37). - С. 168-174.

2. Савченко, И. А. ИК-спектры гуминовых веществ, выделенных из сапропеля Омского Прииртышья / И. А. Савченко, И. Н. Корнеева, Е.А. Лукша [и др.] // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг фармацевтической продукции» / Тез. докл. науч. конф. -Пятигорск, 2011. -Вып. 66. -С. 398-400.

3. Савченко, И. А. Спектроскопическое исследование гуминовых веществ сапропеля Омского Прииртышья / И. А. Савченко, И. Н. Корнеева, Е. А. Лукша // Омский научный вестник. Серия «Ресурсы земли. Человек». - 2012. — №2 (114). — С. 56-60.

4. Савченко, И. А. Сапропель как перспективный источник получения БАВ / И. А. Савченко, И. Н. Корнеева, Е.А. Лукша [и др.] // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики». - Владикавказ: Изд-во СОГУ, 2013. — С.171-175.

5. Савченко, И. А. Изменение свойств гуминовых веществ под воздействием УФ-света / И. А. Савченко, И. Н. Корнеева, Г. В. Плаксин, Е. А. Лукша, Д. С. Гончаров // Фундаментальные исследования. - 2013. -№10. Ч. 12. - С. 2705-2709.

6. Савченко, И. А. Новый подход к решению проблемы стандартизации гуминовых кислот / И. А. Савченко, И. Н. Корнеева, Г. В. Плаксин, Е. А. Лукша, Д. С. Гончаров // Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 3.

7. Савченко, И. А. Исследование динамики поведения гуминовых веществ в водных растворах методом кондуктометрии / И. А. Савченко, Е. А. Лукша, И. Н. Корнеева // Сб. науч. трудов Всероссийской научно -практической конференции «Теоретические и прикладные исследования в области естественных и гуманитарных наук». -- Прокопьевск, 2014. — С. 6669.

8. Савченко, И. А- Изучение общетоксического действия гуминовых веществ озерного сапропеля / И. А. Савченко, И. Н. Корнеева, Е. А. Лукша // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). -

2014,- №2. -С. 75-78.

9. Савченко, И. А. Исследование сорбционной емкости гуминовых веществ сапропеля / И. А. Савченко, Е. А. Лукша, И. Н. Корнеева // Сборник материалов Всероссийского II съезда фармацевтических работников. -Москва, 28 апреля 2014. - С. 242-243.

10. Савченко, И. А. Изучение структурных особенностей гуминовых веществ / И. А. Савченко, И. Н. Корнеева, Д. С. Гончаров, Е. А. Лукша // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 2.

11. Савченко И. А. К вопросу об использовании гуминовых веществ в медицине / И. А. Савченко, Е. А. Лукша, И. Н. Корнеева II Сборник научно-методических трудов Всероссийской научно — методической конференции «Инновационные технологии в фармации». - Иркутск, 9-10 июня 2014 г. - С. 86-87.

12. Савченко, И. А. Сравнительная оценка фармакодинамических свойств гуминовых веществ, выделенных из сапропеля разными методами, в тесте ДНК-комет / И. А. Савченко, И. И. Корнеева, С. В. Скальский, Е. А. Лукша и др. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2014. - № 9. — С. 9-13.

13. Савченко, И. А. Оценка специфической фармакологической активности гуминовых веществ сапропеля Омской области / И. А. Савченко, И. Н. Корнеева, И. С. Погодин, Е. А. Лукша и др. // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2014. - № 4. - С. 48-51.

Автор выражает глубочайшую благодарность и признательность главному научному сотруднику Института проблем переработки углеводородов СО РАН, доктору химических наук, профессору |Георгию Валентиновичу Плаксину); заведующему кафедрой фармакологии с курсом клинической фармакологии, кандидату медицинских наук Сергею Викторовичу Скальскому; директору ЗАО НПО «Вега-2000-Сибирская органика» Александру Георгиевичу Третьякову, доценту кафедры фармацевтической, аналитической и токсикологической химии ОмГМА, кандидату химических наук Ирине Николаевне Корнеевой.

Список сокращений: АОА — антиоксидантная активность; БАВ - биологически активные вещества; ГВ — гуминовые вещества; ГВА - гуминовые вещества активированные; ГОСТ — государственный отраслевой стандарт; ГФ - Государственная фармакопея; ИК — инфракрасная спектроскопия; ДЦ50 - среднелетальная доза; ОСТ - отраслевой стандарт; ПДК - предельно допустимая концентрация; PCO — рабочий стандартный образец; РФ - Российская Федерация; СФ - спектрофотометрия, спектрофотометр; УФ - ультрафиолетовый; ХОП - хлорорганические пестициды; ФС - фармакопейная статья; ЯМР - ядерно-магнитный резонанс;

Савченко Ирина Александровна

ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ САПРОПЕЛЯ ОЗЕРА ГОРЧАКОВО

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать 24.03.2015 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Пл. -1,0 Способ печати - оперативный Тираж 100

Издагельско-полиграфический центр ОмГМА 644050, г. Омск, пр. Мира, 30, тел. 60-59-08