Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-фармацевтическая характеристика биологически активных веществ гуминового ряда

На правах рукописи

РОМАНТЕЕВА ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА

ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ГУМИНОВОГО РЯДА

15 00 02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Самара-2007

Д/

003160954

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Агапов Альберт Иванович

Официальные оппонен- доктор биологических наук,

ты: профессор Подковкин Владимир Георгиевич

кандидат фармацевтических наук, доцент Браславский Валерий Борисович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится ^ЗъОиШЩиьр 2007 г в часов на заседании диссертационного совета К 208 085 03 при ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (443079 г Самара, пр К Маркса, 165 Б)

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (г Самара, Ул Арцыбушевская, 171)

Автореферат разослан « о?£ »Bktfjjp2007г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

ЕВ Авдеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из трудных проблем на пути создания и применения пелоидопрепаратов гуминового ряда является недостаточная изученность гумусовых кислот, обусловливающих терапевтическую эффективность пелоидов (Самутин Н М , Кривобоков Н Г , 1997) Одним из ведущих направлений развития исследовании является изучение физико-химических, биохимических основ действия гумусовых кислот в целях получения новых высокоэффективных пелоидопрепаратов, что имеет как общебиологическое значение в изучении закономерностей биотрансформации органических веществ, так и способствует увеличению доступности и эффективности пелоидотерапии, экономии истощающихся грязевых ресурсов и сохранению экологического равновесия биогеоценозов природных курортных зон

Установлено, что пеяоидопрепараты низкоминерализованных иловых сульфидных грязей относятся к IV классу токсичности, обладают противовоспалительной, антиоксидантной, иммуноферментной активностями (Агапов А И , 1999, Аввакумова Н П , 2003)

Известно, что пелоидопрепараты, не уступающие по эффективности синтетическим аналогам, являются более безопасными (Аввакумова Н П , 2003)

Цель исследования - выявление закономерностей в изменении физико-химических и химико-фармацевтических свойств в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей Задачи исследования

1 Получить препараты гуминовых, гиматомелановых, фульвокислот и суммарного препарата низкоминерализованных иловых сульфидных грязей курорта федерального значения «Сергиевские минеральные воды»

2 Исследовать состав и структурные фрагменты пелоидопрепаратов гуминового ряда с применением как классических, так и современных методов исследования (ЭПР-, ЯМР-спектроскопия)

3 Изучить кислотно-основные свойства, осадительную и комплексообразо-вательную способности и определить коэффициенты распределения гуминовых веществ

4 Охарактеризовать потенциальную кардиотоническую активность и влияние на вязкость крови препаратов гуминового ряда в модельных опытах Научная новизна. Впервые с использованием современных методов исследования проведено сравнительное изучение совокупности свойств гуминовых, гиматомелановых, фульвокислот и суммарный препарата, то есть ряда, на

основе которого можно получить большое количество биологически активных веществ с разнообразными функциями

Зафиксировано активирование кислотно-основных, комплексообразова-тельных свойств в результате разработанной технологии получения пелоидо-препаратов по сравнению с исходным суммарным органическим веществом

Впервые установлены потенциальное кардиотоническое действие и влияние на вязкость крови в опытах т vitro

Практическая значимость работы Комплекс сведений о пелоидопре-паратах гуминового ряда, полученных в ходе исследования, создает основу для дальнейшего получения новых пелоидопрепаратов и разработки методов стандартизации субстанций гуминовых веществ и оценки их потенциальной эффективности

Получен патент № 2241471 Суппозитории для лечения хронического простатита от 10 12 2004 г

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе

" кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии

ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (акт внедрения от 12 09 2007 г), ■ кафедры фармацевтической технологии ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (акт внедрения от 12 09 2007 г)

Положения, выносимые на защиту:

1 Пелоидопрепараты, полученные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей озера Молочка, относятся к классу гуминовых веществ по идентификационным критериям элементный состав, ИК-спектры, коэффициенты цветности

2 В ряду гуминовые, птматомелановые, фульвокислоты и суммарное органическое вещество низкоминерализованных пелоидов наблюдается периодически непрерывное, закономерное изменение состава и характеристических структурно-функциональных свойств

3 Гумусовые кислоты обладают хелатирующей способностью и являются своеобразными матрицами-носителями для введения в организм биологически активных компонентов, например, ионов биогенных элементов

4 Вещества гуминового ряда пелоидов потенциально могут являться высокоэффективными препаратами с разнообразным терапевтическим действием

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на III Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (г Санкт-Петербург, 2005 г ), X Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (г Самара, 2005г ), VI Всероссийском съезде физиотерапевтов (г Санкт-Петербург, 2006 г )

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (Государственная регистрация № 01200405620)

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы, приложения Библиографический указатель включает 188 источников, в том числе 32 на иностранном языке Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 44 рисунка

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований гуминовых веществ различных биообъектов, в котором обобщены и систематизированы сведения о структурной организации, физико-химических свойствах гуминовых веществ, о применении лечебных грязей и препаратов на их основе в медицинской практике

В главе 2 представлены характеристики объектов и методов исследования

В главах 3-4 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по идентификации, изучению физико-химических свойств, биологической активности гуминовых веществ, полученных из низкоминерализованных пелоидов курорта федерального значения «Сергиевские минеральные воды»

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования были образцы гуминовых, гиматомелановых, фулъвокислот и суммарного препарата, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей санатория «Сергиевские минеральные воды» Изучение биологической активности проводили на образцах крови доноров и больных с диагнозом ХОБЛ (хроническая обструктивная болезнь легких)

Получение гуминовых веществ проводили согласно авторской методике (Агапов А И , Аввакумова Н П патенты РФ № 2028149 от 09 02 95, № 2043107 от 10 09 1995, № 2122414 от 27 11 98)

Определение углерода, водорода, азота в гуминовых веществах проводили на анализаторе фирмы «Карло Эрба» модели 1106 По результатам элементного анализа рассчитывали атомные соотношения, степень окисленности и бен-зодности Количество кислорода в образцах рассчитывали по разности

Определение зольных элементов проводили на атомно-абсорбционном анализаторе «Спектр -5-3»

Спектры поглощения растворов натриевых солей гуминовых веществ в видимой области получены на спектрофотометре СФ-26

ИК-спектры гуминовых веществ были получены на спектрофотометре Бресогс!—Ш Подготовку образцов к съемке осуществляли методом КВг-техники Спектр регистрировали в диапазоне 4200-400 см"1, используя дифракционную решетку

Спектры ПМР регистрировали в ДМСО-ё6 на спектрометре Вгикег АС-400 на рабочей частоте 400 МГц В качестве внутреннего стандарта использовали сигнал остаточных протонов гексаметилдисилоксан

Спектры ЭТТР образцов получены на спектрометре ВИГТ 421400 012 с рабочей частотой 9,3 - 9,5ГГц при мощности СВЧ сигнала 100мВт и амплитуде ВЧ модуляции магнитного поля — 0,5 Гс

Содержание функциональных групп кислотного характера гуминовых веществ определяли потенциометрически

Динамику процесса осаждения изучали фотоэлектроколориметрическим методом Расчет пороговой концентрации проводили общепринятым способом

Процесс комплексообразования исследовали электрофоретическим методом

Коэффициент распределения определяли в системе н-октанол - вода методом встряхивания

Кардиотоническую активность определяли путем установления наличия комплексообразования с катионами кальция методом УФ-спектрофотометрии согласно авторскому свидетельству 1668921 от 07 08 1991 г

Определяли вязкость 15 образцов крови доноров и больных с диагнозом хроническая обструктивная болезнь легких классическим методом с использованием капиллярного вискозиметра

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием персонального компьютера и программ МВ Ехе1 ХР, 5 5

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Элементный состав гуминовых веществ пелоидов

Одним из основных идентификационных признаков гумусовых кислот является элементный состав углерод, водород, кислород, азот

Таблица 1 - Средний элементный состав препаратов гумусовых кислот пелоидов курорта "Сергиевские минеральные воды"

1репа-рат Содержание элементов

углерод водород кислород азот

масс % моль % масс % моль % масс % моль % масс % моль %

ГК 54,27±1,10 М,10±0,90 3,80±0,03 »,50±0,73 38,28±1Д0 21,75±1,00 3,23±0,03 2,12*0,03

ГМК 59,56*1,25 36,31±0,92 >,50±0,33 7,90±1,10 31,52±1,10 14,36±0,75 2,20±0,04 1,15±0,02

ФК 24 96±0 70 14 95±0,38 7,56±0 20 4 30±110 >3,95±1 05 28 61±0 50 2 93±0 05 1,52±0,02

СП 36 96±0 75 25 08±0 71 5 38±0 30 )56±1 10 >4 66±1 00 27,58±0,52 г зз±о оз 1,32±0 02

Основную информацию о составе и структурных компонентах гуминовых веществ дает содержание углерода, которое у фульвокислот составляет 24,96 масс %, что свидетельствует о невысокой ароматичности данной группы гумусовых кислот

Выражение элементного состава в массовых процентах не дает полного правильного представления ни о роли отдельных элементов в построении вещества, ни о тех изменениях, которые происходят с гуминовыми веществами в ходе различных преобразований Более информативное представление можно получить, используя мольные проценты (Орлов Д С , 1990)

Анализируя данные по элементному составу, мы видим значительное изменение долей участия элементов в построении вещества Наиболее обуглеро-женными по величине массовых процентов из выбранного нами ряда веществ

являются гиматомелановые кислоты (59,56%), и, наоборот, по результатам мольных выражений, последние уступают по содержанию углерода (36,31 моль %) гуминовым кислотам, у которых оно составляет 41,10 моль % Менее обуглероженными среди представленных препаратов являются фульвокислоты с содержанием углерода 14,95 моль %

Обращает на себя внимание тот факт, что возрастает содержание водорода с 3,8 массовых процента до 34,5 мольных процента у гуминовых кислот, у гиматомелановых кислот с 6,5 массовых % до 47,9 мольных %, а у фульвокис-лот с 7,56 масс % до 54,3 моль %

Таблица 2 - Атомные соотношения и степень окисленности гуминовых веществ различных мест происхождения

Источник Препарат Н/С О/С Степень окисленности Формула

Озеро Молочка Гуминовые кислоты 0,84 0,53 +0,22 С19Н161ЧО,о

Гиматомелановые кислоты 1,32 0,40 -0,53 С3,Н41Ж)12

Фульвокислоты 3,63 1,91 +0,20 С,оНз5Ж)18

Суммарный препарат 2,02 1,10 +0,18 С,9НззМ02,

Озеро Б Тамбукан Гуминовые кислоты 1,42 0,52 -0,39 СпН^Ой

Гиматомелановые кислоты 1,27 0,37 -0,53 СгоН^О,

Фульвокислоты 1,75 0,99 +0,23 С,9Нз4Ж),9

Из таблицы 2 видно, что соотношение водород /углерод возрастает в следующей последовательности гуминовые — гиматомелановые — суммарный препарат - фульвокислоты У последних данный показатель достигает наибольшего значения 3,64, что свидетельствует о преобладании в структуре фульвокис-лот алифатических фрагментов

Одной из важнейших характеристик гумусовых кислот является степень окисленности - величина, показывающая соотношение окислительных и восстановительных структур в молекуле

На основании результатов анализа специфических органических веществ можно сказать, что имеет место окисленный характер фульвокислот и суммарного препарата, о чем свидетельствует величина окисленности +0,20 и +0,18 соответственно Группа гиматомелановых кислот характеризуется превалированием восстановительных свойств, так как степень окисленности имеет зна-

ченне -0,5?. Для гуминовых кислот величина степени окисленности близка к нулю, что говорит о высокой буфер пост и и химической стабильности данной группы гуминовых веществ.

Количественная характеристика степени бёнзбидности, являющейся объективным групповым диагностическим признаком, показывает, что фульвокис-лоты представлены менее конденсированными структурами со степенью бен-зоидности около 7%.

ГуЫ.!ЦЛВ:.е ГИМЯиМвЛансеие Фул>№ЖИСЛ01Ъ) ^уУ^НЫИ хгелэты кислоты препарат

Рисунок 1 - Степень бенюицности гумусовых кислот н зависимости

от месторождения фязм В гиматомелаковых кислотах данный показатель доставляет 17%. Наиболее развиты ароматические структуры в молекулах гуминовых кислот и составляют 34,6%, что на четверть превышает таковые у ¡умиковых кислот оз. Там-букан (курорт «Кавказские минеральные воды»).

2. Идентификация гумусовых кислоI пелоидов

Одним из диагностических критериев при обнаружений гумусовых кислот является шачение коэффициента цветности Ё4 Ёь- Эта величина не зависит от концентрации веществ И определяется структурой.

Таблица 3 - Значении козффицаентов цветности Е4:К,, гумусовых кислот

Препарат

Гу ми но вые кислоты 2,42±0,0]

Гнматомслаиовыс кислоты 3,47±0,02

Фулыю кислоты 6,81-0,02

Суммарный препарат 2,48*0,01

Увеличение коэффициента цветности для растворов гуминовых веществ происходит в следующей последовательности гуминовые кислоты - суммарный препарат - гиматомелановые кислоты - фульвокислоты Гуминовые кислоты наиболее конденсированы из данного ряда и значение коэффициента цветности составляет 2,42, фульвокислоты, напротив, являются менее ароматичными со значением Е4 Еб равным 6,81

Рисунок 2 - ИК-спектры веществ гуминового ряда ГК-гуминовые кислоты, ГМК-гиматомелановые кислоты, ФК-фульвокислоты, СП-суммарный препарат, ГК-Мегск-гуминовая кислота фирмы Merck

Гуминовые, гиматомелановые, фульвокислоты и суммарный препарат имеют однотипные спектры, свидетельствующие о родстве этих веществ друг с другом и с другими биосферными объектами, к примеру с гуминовыми кислотами торфа фирмы «Мегск» Несмотря на сходства ИК- спектров, наблюдаются и различия Фульвокислоты имеют максимальную интенсивность полос в области поглощения спиртовых гидроксилов и простых эфиров Для гиматомела-новых кислот характерно набольшая насыщенность метальных групп Интенсивность полосы поглощения 1620-1600 см"1, характеризующая ароматическую структуру гумусовых кислот, возрастает в следующей последовательности фульвокислоты, суммарный препарат, гиматомелановые, гуминовые кислоты

Вышеизложенные результаты доказывают принадлежность исследуемых объектов к классу гуминовых веществ

3 Результаты исследования структурно-функциональных свойств гумусовых кислот

Характерной особенностью 'Н-ЯМР-спектров гуминовых веществ является наличие суперпозиции большого числа сигналов, поэтому общепринятым подходом к обработке 'Н-ЯМР -спектров гуминовых веществ является разделение химических сдвигов на интервалы

Как видно из рисунков 3 - 6, в спектрах гуминовых веществ можно выделить сигналы

- протонов углеродного скелета ароматических (САг-Н), протонов карбо-гидратных, спиртовых и метоксильных фрагментов (СН„-0), алифатических в а-положении к карбоксильной группе или ароматическому кольцу (а-СН„) и алифатических, находящихся к указанным группам не ближе, чем в р-положении (СН„)

Рисунок 3 - 'Н-ЯМР суммарного препарата

Рисунок 4 - 'Н-ЯМР спектры гуминовых кислот

Рисунок 5 - 'Н-_ЯМР гиматомелановых кислот

Т

и

I

Рисунок 6 - 'Н-ЯМР спектры фульвокислот

Как видно из рисунка 4 в протонном спектре гуминовых кислот в ДМСО-с!6 наблюдаются сигналы протонов алифатических групп в области 8=1 2-3 О ррт Резонансный сигнал при 8=1 23 ррт относится к метальным группам ал-кильных цепочек гуминовых кислот Сигнал при 5=1 80 ррт может быть отнесен к протонам групп СНз - СО а при 5=2 15 ррт соответствует, вероятно, протонам групп - СН2 - СО - резонансный сигнал при 5=3 24 ррт обусловлен протонами А1к-ОН, АЮ- Сигналы при 5=4 68 и 4 78 ррт соответствуют протонам групп - СН=СН - Кроме того, в области 5=7 00-8 52 наблюдается мощный сигнал протонов ароматических фрагментов (САг-Н+ С^,- - ОН) Причем, сигналы ароматических Сдг-Н протонов перекрываются с сигналами протонов фенольных гидроксилов САг- ОН

В 'Н-ЯМР спектре гиматомелановых кислот в ДМСО-с16 также имеется область, соответствующая алифатическим протонам (5=2 57-2 90 ррт), которые относятся к группам, находящихся в а-положении к электроноакцепторной группе Пик остаточных протонов ДМСО-с16 частично закрывает область а-СНп Область при 5=3 60-4 85 ррт можно отнести перекрывающихся сигналы подвижных протонов спиртовых групп СА|к-ОН и СНп-0 - протонов карбогидрат-ных фрагментов Аналогично 'Н-ЯМР спектру гуминовых кислот, в протонном спектре ГМК имеется ярко выраженная область при 5=6 22-8 20, соответствующая ароматическим протонам Здесь также происходит перекрывание сиг-

налов ароматических САг-Н протонов с сигналами протонов фенольных гидро-ксилов Сд, - ОН Серия сигналов 5=9 53, 10 02 и 11 08 ррт, вероятно, соответствует кпротонам ассоциированных гидроксильных групп (САг- ОН)

В протонном спектре фульвокислот в ДМСО-de наблюдаются сигналы протонов алифатических фрагментов в области 5=2 08-2 89 ррт, находящихся в a-положении к электроноакцепторной группе Область 5=3 30-3 80 ррт соответствует перекрывающимся сигналам подвижных протонов спиртовых групп CAit-OH и скелетных СН„-0 - протонов карбогядратных фрагментов Наблюдается сильный сигнал в области 5=6 39-8 52 ррт ароматических CAJ-H протонов, перекрывающихся с сигналами протонов фенольных гидроксилов Саг — ОН Пик остаточных протонов ДМСО-с16 частично закрывает область a-CHn

В спектре суммарного препарата в ДМСО-dr, резонансный сигнал при 5=2 09 соответствует, вероятно, a-CHn по отношению к электроноакцепторной группе Область 5=3 35-3 94 ррт соответствует сигналам подвижных протонов спиртовых групп СдигОН и скелетных СНп-0 - протонов карбогидратных фрагментов Сигналы ароматических СА,-Н протонов перекрываются с сигналами протонов фенольных гидроксилов Сд,. - ОН располагаются в области 5=6 749 94 ррт

Протонные спектры индивидуальных компонентов являются более выраженными по сравнению с таковым у суммарного органического вещества В области, соответствующей сигналам протонов групп CA)k-OH и СН„-0, резонансный сигнал при 5=3 60 встречается в спектрах гиматомелановых и фульвокислот

При рассмотрении совокупности 'Н-ЯМР спектров гуминовых веществ можно выявить общие характерные сигналы В области протонов а-СН„ сигнал при 5=2,09 наблюдается у суммарного препарата и фульвокислот, но отсутствует в спектре гуминовых и гиматомелановых кислот, для которых характерны линии при 5=2,74 и 2,90 ррт

В интервале 4 50-5 50 ррт сигналы при 5=4 68 и 4 77 ррт встречаются у гуминовых и гиматомелановых кислот, а при 5=5 10 ррт у фульвокислот и суммарного препарата

В области 6 20-8 90 ррт наблюдается мощный сигнал ароматических протонов и протонов фенольных гидроксилов, среди которых выделяют при 5=6 20-7 30 ррт моноциклические ароматические фрагменты, при 5=7 30-

8.90 поли циклические, что подтверждает ранее известные данные о наличии хорошо развитой поли сопряженной системы в структуре данных веществ.

Совокупность сигналов при одинаковых значениях химического сдвига свидетельствует о ехидности структурных компонентов в молекулах веществ гуминового ряда. Перекрывание аналитических областей обусловлено смин-еппновым взаимодействием протонов.

Метод 'Н-ЯМР спектроскопии может быть использован для идентификации при стандартизации гуминовых веществ, как фармацевтических субстанций.

Некоторые авторы (A.C. Алиев. 1989, Н,П. Аввакумова, 2002 ) объясняют, чго биологическая активность ГВ определяется за счет свободных радикалов. Нами были получены спектры ЭПР.

Рисунок 7 - Спектры ЭПР гуминовых веществ: а) гумнновых; б) гимктомелановых; в) суммарного препарата; г) фулыш кислот

Исследования! показали, что для вссх препаратов гумикойого ряда исследованной нязкоминерализованной иловой сульфидной грязи выявлены отчет-

ливые спектры поглощения ЭПР с характерными довольно узкими синглетны-ми симметричными линиями

«Узкие» сигналы ЭПР всегда возникают в веществах с сопряженными связями и никогда не наблюдаются без сплошной цепи сопряжения

По результатам расчета §-фактора было выявлено, что значения этой величины в выбранном нами ряду биологически активных веществ близки к таковому для свободного электрона Это может служить доказательством присутствия в гуминовых веществах органических свободных радикалов

Таблица 3 - Характеристика соектров ЭПР гуминовых веществ

Образец ДН,Э А, мВ 8, ВЭ2 КПЧ* 10"15 на 1г образца

ГК 5,0 1640 35,2 600,0

ГМК 5,0 875 21 414,3

Суммарный препарат 4,5 448 8,6 147,5

Фульвокислоты (при 1М=0,75А) 12,5 22 2,7 46,3

Где АН - ширина спектральной линии спектра ЭПР, А — амплитуда линий в спектре ЭПР,

8 - интеграл спектра ЭПР (площадь под кривой поглощения), КПЧ - количество парамагнитных частиц

Из таблицы 3 видно, что интенсивность сигнала, то есть амплитуда сигнала возрастает в следующей последовательности фульвокислоты - суммарный препарат — гиматомелановые кислоты - гуминовые кислоты, что объясняется повышением молекулярного веса (точнее, увеличением размеров системы с сопряженными связями или с ростом системы конденсированных колец)

Минимальное количество парамагнитных частиц содержится в фульво-кислотах, являющихся менее конденсированными и обладающих минимальной молекулярной массой среди представителей данного ряда веществ, в то время как концентрация их в гиматомелановых кислотах превышает в 9 раз и достигает максимального значения у гуминовых кислот, где их концентрация по сравнению с фульвокислотами возрастает в 13 раз

Присутствие металлов, безусловно, влияет на количество парамагнитных частиц, но в данных соединениях не является определяющим Так, например, фульвокислоты, минерализация которых близка к 30 %, содержит минимальное значение парамагнитных частиц

С целью характеристики КОС в ряду гуминовых веществ нами было проведено прямое потенциометрическое титрование.

рн

V смЗ 0,02 N8 ОН

Рисунок 8 - Кривые потенциометрического титрования препаратов гуминового ряда

УсмЗООЖ№ОН

Рисунок 9 - Дифференциальные кривые потенциометрического титрования гуминовых веществ

Кривые титрования (рис 8) гуминовых и гиматомелановых кислот схожи и отличаются от фульвокислот и суммарного препарата меньшей крутизной, отсутствием выраженных перегибов

Различия кривых гуминовых и гиматомелановых кислот появляются после рН=6,5 Но возможно выделить одинаковые для гуминовых и гиматомелановых кислот кислотные функциональные группы с рК!=4,0, рК2=5,4, рК3=7,25 отличающиеся с рК4=8,5 для гиматомелановых и с рК4=8,8 и рК5=9,3 для гуминовых кислот

Как и следовало ожидать, наиболее выражены кислотные свойства у фульвокислот, преобладающей группой является — СООН с рК=6,0, с содержанием 63,6%

Суммарный препарат титруется как трехосновная кислот,, наименьшее количество кислотных групп и более равномерное распределение по количественному содержанию в соответствии с рК Преобладающей является группа с рК=7,0 (42,8%) Гуминовые кислоты титруются как пятиосновные, а ги-матомелановые, как четырехосновные Ведущими у них являются группы с рК=7,25 с содержанием 44,4 % и 52,9% соответственно Что примечательно, гуминовые и гиматомелановые кислоты содержат небольшое количество более сильных кислотных групп, чем у фульвокислот (с рК!=4,0 и рК2=5,4) У гуминовых кислот представлены и наиболее слабая кислотная группа с рК=9,3, вероятно, из числа фенольных

В результате исследований по изучению динамики осаждения образцов было выявлено, что данный процесс в ряду гуминовых веществ носит сходный характер Быстрее осаждаются такие токсичные ионы металлов, как свинец, хром, медь Динамика осаждения таких ионов металлов, как кальций, цинк, марганец, никель, кобальт носит сходный характер Наибольшей коагулирующей способностью обладают ионы хрома и свинца, наименьшей ионы серебра и магния

На основании электрофоретических исследований получены денсито-граммы

Рисунок 10 - Денситограммы ГК (1), смеси ГК с Ме2+ 3 1 (2), ГК с 1 1 Ме2+ (3)

при рН 8,68

50 »

30

го-{0; } 4 >> 6 тем

Рисунок 11 - Денситограммы ГК (1), смеси ГК с Ме2+ 3 1 (2), ГК с 1 1 Ме2+ (3)

при рН 7,0

Рисунок 12 - Денситограммы СП (1), смеси СП с Со 3 1 (2), СП с Со 1 1 (3)

при рН 8,68

/

0 12 3 4 5 6 СМ

Рисунок 13 - Деиснтограммы СП (1), смеси СП с Со 3:1 (2). СП с Со 1:1 (3).

Из сенситограмм видно, что подвижность комплексов п слои до препарат-металл меньше, чем самих гумусовых веществ. Чем ниже содержание и смеси иона металла, тем меньше пройдет от старта компонент. При увеличении значения рН, т.е. сдвигу в щелочную среду, происходит активизирование кислотных. групп, участвующих в комплексообразовании, в результате чего повышается доля связанного в комплекс иона металла.

Для выяснения характера распределения металлов на форс граммах и количественной оценки компдексообразовательной способности в ряду гум и новых веществ было определено количественное содержание металлов в анодной, стартовой и катодной частях электрофоре грамм.

при рН 7,0

Буфер фосфатный ) ► Н 7,1)

Буфер ффефлп НЫВ

41 .д

Ш Анодная чона н Зона старта □ Катодная

Рисунок 14 - Распределение Со * на электрофореграммах в смеси с препаратами ¡уминового ряда в соотношений 1:1,%

Как показывают данные рисунка 14, при повышении рН комплексообра-зовательная способность гуминовых веществ возрастает, что приводит к увеличению количества иона металла, связываемого в анионный комплекс

4 Изучение биологической активности гумусовых кислот

Количественной мерой липофильности или гидрофобности веществ является коэффициент распределения На основании полученных данных можно сделать вывод, что гидрофобность гуминовых веществ возрастает в следующей последовательности фулъвокислотьксуммарный препарат<гиматомелановые <гуминовые кислоты

Потенциальную кардиотоническую активность выявляли по величине константы устойчивости комплексов с ионами кальция При значении Куст более 100 делали вывод о наличии кардиотонической активности Видно, что все препараты гуминового ряда потенциально могут проявлять кардиотоническую активность Данное свойство возрастает в ряду фульвокислоты - суммарный препарат - гиматомелановые кислоты — гуминовые кислоты

Таблица 7 - Константы устойчивости гуминовых веществ

Препарат Куст комплекса с ионами кальция

Гуминовые кислоты 239,56±4,70

Гиматомелановые кислоты 198,35±3,10

Фульвокислоты 141,25±2,26

Суммарный препарат 172,15±2,65

Нами была определена влияние на вязкость крови в гумусовых кислот В результате исследования было выявлено, что по отношению к контролю (р<0,05) гуминовые кислоты снижают вязкость крови на 22,2%, гиматомелано-вые - 17,5%, фульвокислоты - 15,2%, а суммарный препарат - на 19,6%

Таким образом, результаты проведенных исследований позволили разработать подходы, которые можно использовать при стандартизации препаратов на основе гуминовых веществ пелоидов и показали целесообразность их дальнейшего изучения с целью уточнения спектра фармакологической активности

выводы

1 Результаты изучения элементного состава, соотношения Е4 Еб, характера ИК-спектров и электронных спектров подтверждает принадлежность пелои-допрепаратов, выделенных из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей курорта «Сергиевские минеральные воды» к классу гуминовых веществ

2 На основании данных элементного анализа было выявлено, что по атомному соотношению С/Н, степени бензоидности пелоидопрепаратов имеет место последовательность фульвокислоты < суммарный препарат < гиматомела-новые < гуминовые кислоты

3 По результатам спектроскопии ЭПР установлено, что возрастание количества парамагнитных частиц гуминовых веществ соответствует последовательности фульвокислоты < суммарный препарат < гиматомелановые < гуминовые кислоты

4 Установлено возрастание полифункциональности и основности гумусовых кислот в ряду фульвокислоты < суммарный препарат < гиматомелановые < гуминовые кислоты

5 Комплексообразовательная способность - фундаментальное свойство гуминовых веществ По способности к образованию хелатных анионных комплексов гуминовые вещества образуют ряд гуминовые > гиматомелановые кислоты > суммарный препарат > фульвокислоты Перспективным является получение пелоидопрепаратов с ионами металлов-биогенов (серебра, магния, цинка)

6 В результате исследований определены коэффициенты распределения в системе н-октанол - вода для изученных компонентов пелоидов установлено повышение гидрофобности в ряду фульвокислоты < суммарный препарат < гиматомелановые < гуминовые кислоты

7 Для пелоидпрепаратов выявлены потенциально возможные кардиотониче-ская активность и способность влиять на вязкость крови, что позволяет их рекомендовать для дальнейшего фармакологического исследования с целью их практического применения

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Аввакумова, Н П Перспективы применения препаратов гуминовых кислот в медицинской практике/ Н П Аввакумова, М А Семионова, Ю В Роман-теева и др // Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем Материалы междунар науч -практ конф , посвящ 85-летию академии - Санкт-Петербург, 2004 - С 157-159

2 Аввакумова, Н П , Романтеева, Ю В , Аввакумова, А А Гуминовые препараты и их применение / Н П Аввакумова, Ю В Романтеева, А А Аввакумова // Тезисы докладов III Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» - Санкт-Петербург, 2005 -С 91-92

3 Романтеева, Ю В Химико-фармацевтическапя оценка гуминовых веществ лечебных грязей / Ю В Романтеева, Е Е Катунина, М Н Глубокова// Материалы II Всероссийского съезда фармацевтических работников Дагомыс, 2005 -С 130-131

4 Аввакумова, Н П Роль гуматов в сохранении экологического равновесия / Н П Аввакумова, Ю В Романтеева, Е А Захарова, Е Е Катунина // Экология и здоровье человека Тр ХВсерос Конгр -Самара, 2005 - С 7-10

5 Романтеева, Ю В Исследование характера взаимодействия соединений гуминового ряда с ионами металлов-биогенов / Ю В Романтеева // Аспирантский вестник Поволжья - 2005 - № 2 - С 74-76

6 Воробьев, Д В ДЭНС-форез обоснованность, эндоэкологичность и эффективность нового метода электрогрязелечения пелоидопрепаратами/ Д В Воробьев, А И Агапов, Е Е Катунина, Ю В Романтеева// Гигиенические проблемы оптимизации окружающей среды и охраны здоровья населения Науч тр Федерального научного центра гигиены им Ф Ф Эрисмана - Самара, 2006 -вып 17 - С 139-142

7 Агапов, А И Парамагнитность в ряду гуминовых веществ пелоидов/ А И Агапов, О К Сизиков, Ю В Романтеева, Е Е Катунина// Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования Сб науч трудов юбилейной конф , посвящ 25-летию фармацевтического факультета БГМУ Медицинский вестник Башкортостана — Уфа Изд-во БГМУ, 2006 - С 212-214

8 Аввакумова, Н П Обоснование эффективности пелоидопрепаратов гуминового ряда / Н П Аввакумова, А И Агапов и др // Тезисы докладов VI Всероссийского съезда физиотерапевтов - Санкт-Петербург, 2006 - С 74-75

9 Суппозитории для лечения хронического простатита пат Рос Федерация /А И Агапов, Н П Аввакумова (РФ) - № 2241471, заявл 03 02 04 , опубл 10 12 04, Бюлл №34 - б с

Подписано в печать 24 09 2007 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать оперативная Уел печ я 1 Л Тираж 100 чкч Чакач 1001 Отпечатано в типографии ООО «ОФОРТ» 443080, г Самара ул Революционная, 70, литера П Тел 372-00-56 372 00-57

Актуальность темы

Одной из трудных проблем на пути создания и применения пелои-допрепаратов гуминового ряда является недостаточная изученность гумусовых кислот, обусловливающих терапевтическую эффективность пелои-дов [122]. Одним из ведущих направлений развития исследований является изучение физико-химических, биохимических основ действия гумусовых кислот на живые организмы в целях получения новых высокоэффективных пелоидопрепаратов, способствующих увеличению доступности и эффективности пелоидотерапии, экономии истощающихся кондиционных грязевых ресурсов и сохранению экологического равновесия биогеоценозов природных курортных зон.

Установлено, что пелоидопрепараты низкоминерализованных иловых сульфидных грязей относятся к IV классу токсичности, обладают противовоспалительной, антиоксидантной, иммуноферментной активностью, проявляют терапевтическую эффективность при заболеваниях опорно-двигательного аппарата и неврологических заболеваниях [3,2].

Известно, что пелоидопрепараты, не уступающие по эффективности синтетическим аналогам, являются более безопасными [2].

Цель исследования — выявление закономерностей в изменении физико-химических и химико-фармацевтических свойств в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, как потенциально высокоэффективных биологически активных субстанций.

Задачи исследования: 1. Получить препараты гуминовых, гиматомелановых, фульвокислот и суммарного препарата низкоминерализованных иловых сульфидных грязей курорта федерального значения «Сергиевские минеральные воды».

2. Исследовать состав и структурные фрагменты пелоидопрепаратов гу-минового ряда с применением как классических, так и современных методов исследования (ЭПР-, ЯМР-спектроскопия).

3. Изучить кислотно-основные свойства, осадительную и комплексообра-зовательную способности.

4. Определить коэффициенты распределения гуминовых веществ системе октанол-вода.

5. Охарактеризовать потенциальную кардиотоническую активность и влияние на вязкость крови препаратов гуминового ряда в модельных опытах.

Научная новизна

Впервые с использованием современных методов исследования проводится изучение совокупности свойств гуминовых, гиматомелановых, фульвокислот и суммарного препарата, то есть ряда, на основе которого можно получить большое количество биологически активных веществ комплексной природы с ионами металлов-биогенов с разнообразными функциями.

Зафиксировано активирование кислотно-основных, комплексообра-зовательных свойств в результате разработанной технологии получения пелоидопрепаратов по сравнению с исходным суммарным органическим веществом.

Впервые установлены потенциальное кардиотоническое действие и влияние на вязкость крови в опытах in vitro.

Практическая значимость работы

Комплекс сведений о пелоидопрепаратах гуминового ряда, полученных в ходе исследования, создает основу для дальнейшего получения новых пелоидопрепаратов и разработки методов стандартизации субстанций гуминовых веществ и оценки их потенциальной эффективности.

Получен патент № 2241471 Суппозитории для лечения хронического простатита от 10.12.2004 г.

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе: кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (акт внедрения от 12.09.2007 г); кафедры фармацевтической технологии ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (акт внедрения от 12.09.2007 г).

Положения, выносимые на защиту:

1. Пелоидопрепараты, полученные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей озера Молочка, относятся к классу гуминовых веществ по идентификационным критериям: элементный состав, ИК-спектры, коэффициенты цветности.

2. В ряду гуминовые, гиматомелановые, фульвокислоты и суммарное органическое вещество низкоминерализованных пелоидов наблюдается периодически непрерывное, закономерное изменение состава и характеристических структурно-функциональных свойств.

3. Гумусовые кислоты обладают хелатирующей способностью и являются своеобразными матрицами-носителями для введения в организм биологически активных компонентов, например, ионов биогенных элементов.

4. Вещества гуминового ряда пелоидов потенциально могут являться эффективными препаратами, так как обладают кардиотоническим действием и оказывают влияние на вязкость крови.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на III Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (г. Санкт-Петербург, 2005 г.), X Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2005г.), VI Всероссийском съезде физиотерапевтов (г. Санкт-Петербург, 2006 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «СамГМУ Рос-здрава» (№ государственной регистрации 01200405620).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы, приложений. Библиографический указатель включает 188 источников, в том числе 32 на иностранном языке. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 44 рисунка.

выводы

1. Результаты изучения элементного состава, соотношения Е.^Еб, характера ИК-спектров и электронных спектров подтверждает принадлежность пелои-допрепаратов, выделенных из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей курорта «Сергиевские минеральные воды» к классу гуминовых веществ.

2. На основании данных элементного анализа было выявлено, что по атомному соотношению С/Н, степени бензоидности пелоидопрепаратов имеет место последовательность: фульвокислоты < суммарный препарат < гиматомела-новые < гуминовые кислоты.

3. По результатам спектроскопии ЭПР установлено, что возрастание количества парамагнитных частиц гуминовых веществ соответствует последовательности: фульвокислоты < суммарный препарат < гиматомелановые < гуминовые кислоты.

4. Установлено возрастание полифункциональности и основности гумусовых кислот в ряду: фульвокислоты < суммарный препарат < гиматомелановые < гуминовые кислоты.

5. Комплексообразовательная способность - фундаментальное свойство гуминовых веществ. По способности к образованию хелатных анионных комплексов гуминовые вещества образуют ряд: гуминовые > гиматомелановые кислоты > суммарный препарат > фульвокислоты. Перспективным является получение пелоидопрепаратов с ионами металлов-биогенов (серебра, магния, цинка).

6. В результате исследований определены коэффициенты распределения в системе н-октанол - вода для изученных компонентов пелоидов установлено повышение гидрофобности в ряду: фульвокислоты < суммарный препарат < гиматомелановые < гуминовые кислоты.

7. Для пелоидопрепаратов выявлены потенциально возможные кардиотониче-ская активность и способность влиять на вязкость крови, что позволяет их рекомендовать для дальнейшего фармакологического исследования с целью практического применения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Элементный состав, выраженный в массовых процентах, определяет принадлежность полученных препаратов к классу гуминовых веществ, но не дает представления о роли отдельных элементов в макромолекулах вещества, которое можно получить с помощью мольных процентов. В этом случае наблюдается изменение содержания водорода с 3,80% (масс.) до 34,5% (мольн.) у гуминовых кислот; с 7,56% (масс.) у фульвокислот до 54,3% (мольн.); у гиматомелано-вых кислот с 6,50% (масс.) до 47,9% (мольн.). Эти данные показывают вклад водорода в структуру вещества и указывают на значительную развитость цепей, представленных алкильными радикалами. При переходе к мольным процентам изменяется и относительное содержание углерода. Наиболее обуглероженные по массовым процентам гиматомелановые кислоты (59,56) теперь уступают гу-миновым кислотам, в которых содержание становится более значительным (41,10 мольн.%). Из результатов анализа видно, что по степени увеличения обуглероженности гуминовые вещества располагаются в следующем ряду: фульвокислоты, гиматомелановые, гуминовые кислоты.

Соотношение Н/С для гуминовых кислот низкоминерализованных пелои-дов составляет 0,84, характеризуя их более высокую обуглероженность. Гуминовые кислоты оз. Б. Тамбукан, как оказалось, более обогащены периферическими алифатическими объектами; соотношение Н/С составляет 1,42. Соотношение водород/углерод для фульвокислот высокоминерализованных пелоидов достигает 1,75, что значительно ниже, чем в низкоминерализованных, где оно составляет 3,63. Соотношение водород/углерод для гиматомелановых кислот составляет 1,32, что свидетельствует о превалировании в их составе алифатических цепочек. По результатам элементного анализа органических веществ выделяется ярко выраженный окисленный характер фульвокислот со значением степени окисленности +0,20. Напротив, группа гиматомелановых кислот характеризуется явным преобладанием восстановительной природы, о чем свидетельствует значение степени окисленности -0,53.

Объективной характеристикой гуминовых веществ является степень их бензоидности. Фульвокислоты представлены наименее полисопряженными, поликондесированными структурами, в которых степень бензоидности не превышает 7,0%. В гиматомелановых кислотах бензоидные структуры составляют 17 %. Наиболее развита полисопряженность в макромолукулах гуминовых кислот, у которых данный показатель составляет 36,3%.

Электронные спектры поглощении являются одним из диагностических принципов в изучении гуминовых веществ. Эти спектры мало специфичны из-за схожести: поглощение света растворами гуминовых веществ с увеличением длины волны убывает. Несмотря на это сходство, спектры различаются крутизной, что делает отношение Е4/Еб идентификационным критерием, который не зависит от концентрации веществ и косвенно характеризует состав и структуру, а именно, степень ароматичности. Среднее значение коэффициента цветности фульвокислот составляет 6,81±0,02, что характеризует их слабо ароматические соединения в ряду гуминовых веществ. По сравнению с ними, большей ароматичностью обладают гиматомелановые кислоты со значением Е4/Е6 3,47±0,02. Минимальное значение данного показателя имеют гуминовые кислоты 2,42±0,01.

С целью изучения природы представителей гуминового ряда нами были поулучены ИК-спектры, анализ которых позволяет выявить как общие стороны специфических органических веществ пелоидов, так и отличительные, в том числе в сравнении с другими биосферными объектами. Гуминовые, гиматомелановые, фульвокислоты и суммарный препарат имеют однотипные спектры, свидетельствующие о родстве этих веществ друг с другом и с другими биосферными объектами, к примеру с гуминовыми кислотами торфа фирмы «Мегск». Несмотря на сходства ИК- спектров, наблюдаются и различия. Фуль-воксислоты имеют максимальную интенсивность полос в области поглощения спиртовых гидроксилов и простых эфиров. Для гиматомелановых кислот характерно набольшая насыщенность метальных групп. Интенсивность полосы поглощения 1620-1600 см"1, характеризующая ароматическую структуру гумусовых кислот, возрастает в следующей последовательности: фульвокислоты, суммарный препарат, гиматомелановые, гуминовые кислоты.

Сравнение ИК-спектров гуминовых кислот серноводских пелоидов и фирмы «Мегск» позволяет выявить существенные различия при лишь самом общем сходстве.

На основании результатов экспериментального исследования элементного анализа, оптических свойств гуминовых веществ можно сказать, что группы специфических органических веществ характеризуются общностью строения и составляют по мере увеличения бензоидности ряд: фульвокислоты, гиматомелановые, гуминовые кислоты. В данном ряду закономерно изменяются обугле-роженность, ароматичность, электроно-донорные и электроно-акцепторные свойства. Поэтому идентификацию можно проводить по РЖ-спектрам, по значению коэффициента цветности.

По литературным данным многие авторы связывают лечебный эффект гуминовых веществ с наличием в них свободных радикалов, поэтому нами были проанализированы их ЭПР-спектры. Возрастание количества свободных pa- 4 дикалов происходит с увеличением сопряженных структур в макромолекулах.

Кислотно-основные свойства изучаемых препаратов гуминового ряда пелоидов есть следствие их полифункциональности. Согласно литературным данным макромолекулы гуминовых веществ содержат до 15 функциональных групп разной природы, в том числе кислотных. В процессе потенциометриче- , ского титрования фульвокислоты титруются как двухосновные, суммарный препарат — как трехосновная, почти на порядок слабее фульвокислот; гиматомелановые - как четырехосновные, а гуминовые - как пятиосновные. Причем, гуминовые и гиматомелановые кислоты содержат более сильные - СООН группы, хотя и в меньшем количестве, нежели фульвокислоты.

Изучение осадительной способности гуминовых веществ ионами металлов показало, что данный процесс носит сходный характер для представителей выбранного нами ряда веществ. Равновесие в системе гуминовые кислоты — металл устанавливается через 1 час, в то время, как гиматомелановых кислот наступает через сутки, вследствие чего измерения проводили по прошествии суток. Нами было выявлено, что наибольшей осадительной способностью обладают ионы меди хрома и свинца. В меньшей степени она проявляется у серебра и магния. В связи, с чем, представляется возможность расширения фармакологического спектра действия пелоидопрепаратов на основе гумусовых кислот путем введения в них ионов металлов-биогенов (например, серебра и магния).

Комплексобразовательная способность гуминовых веществ, как ранее нами было отмечено, является фундаментальным свойством, обеспечивающим большинство функций этих веществ в биосфере. С помощью электрофореза на бумаге были получены данные о комплексообразовательной способности препаратов. Установлено, что гуминовые вещества образуют с ионами кобальта, меди, цинка комплексно-гетерополярные соли. При увеличении щелочности происходит активизация кислотных функциональных групп, принимающих участие в комплексообразовании, поэтому количество ионов металлов, связанных в составе анионного комплекса, увеличивается, что было количественно подтверждено.

На основании как классических, так и современных методов исследования, в нашей работе дана разносторонняя количественная характеристика гуминовых веществ.

На субмолекулярном уровне установлен элементный состав макромолекул представителей гуминовых веществ пелоидов, а также свойства, характеризующие структуру.

Количественно охарактеризовано содержание функциональных групп, которые ответственны за кислотно-основные и комплексообразовательные свойства; отмечены как общие, так и частные признаки этих соединений. В целом, это более или менее окрашенные высокомололекулярные полисопряженные, поликонденсированные, полидисперсные органические соединения, преимущественно кислотной природы, обладающие электроно-донорными и элек-троно-акцепторными свойствами, содержащие разнообразные функциональные группы. Данный ряд гуминовых веществ с близким типом строения и несколько отличающихся по степени выраженности выше перечисленных свойств, по химическому составу, молекулярной массе, что приводит к проявлению ими различной биологической активности.

Нами было выявлено модельных опытах, что гуминовые вещества могут проявлять за счет комплексообразования с ионами кальция кардиотоническую активность, а также понижать вязкость крови.

На основании комплекса полученных экспериментальных данных можно утверждать следующее:

Специфические органические вещества низкоминерализованных иловых сульфидных грязей в виде гуминовых, гиматомелановых, фульвокислот и суммарного препарата представляют собой генетический ряд веществ, сходных по структуре и свойствам, но отличные по степени проявления последних.