Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение структурно-функциональных характеристик фермента Taq ДНК-полимеразы с помощью моноклональных антител
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.36
Оглавление диссертации Шершакова, Надежда Николаевна :: 2006 :: Москва
Список принятых сокращений.
Введение.
1. Обзор литературы.
1.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
1.2. Структурно-функциональные характеристики ДНК-полимераз.
1.3. Функциональные особенности и применение ДНК-полимераз.
1.4. Компоненты ПЦР. Их свойства и влияние на условия и ход реакции.
1.5. ПЦР в реальном времени.
1.6. Иммунохимическое изучение Taq ДНК-полимеразы.
1.7. Плазмонный резонанс.
1.8. Метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.
2. Материалы и методы исследования.
2.1. Получение и очистка рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы.
2.2. Получение и выращивание клеток, продуцирующих моноклональные антитела к Taq полимеразе.
2.3. Биохимическая очистка антител.
2.4. Биотинилирование антител.
2.5. Биотинилирование TaqPol.
2.6.Постановка иммуноферментного анализа для определения полимеразы, конъюгированной с биотином.
2.7.Выявление специфических антител к Taq ДНК-полимеразе методом твердофазного ИФА.
2.8.Взаимные блокировки антител.
2.9.Электрофорез в ПААГе.
2.10.Иммуноблот.
2.11 .Постановка ПЦР.
2.12.0пределение аффинности мкАТ методом конкурентного ИФА.
2.13.Определение аффинности на приборе «IASys», основанном на принципе плазмонного резонанса.
2.14. Изучение термостабильности моноклональных антител.
3. Результаты.
3.1. Антитела, специфичные к Taq полимеразе.
3.2. Взаимные блокировки мкАТ.
3.3. Определение аффинности мкАТ с помощью конкурентного ИФА.
3.4. Определение аффинности мкАТ на оптическом биосенсоре «IASys».
3.5. Исследование доменной специфичности моноклональных антител с помощью ИФА.
3.6. Исследование доменной специфичности мкАТ с помощью иммуноблота.
3.7. Изучение взаимодействия полученных антител с другими видами ДНК-полимераз методом ИФА и иммуноблота.
3.8. Исследование влияния моноклональных антител на полимеразную активность Taq ДНК-полимеразы.
3.9. Исследование характера влияния специфических антител на ход полимеразной цепной реакции.
3.10. Исследование термостабильности мкАТ методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.
3.11. Исследование термостабильности комплекса Taq ДНК-полимеразы с мкАТ в ИФА.
4. Обсуждение.
4.1. Антитела, специфичные к Taq ДНК-полимеразе.
4.2. Эпитопное картирование Taq ДНК-полимеразы.
4.3. Аффинность моноклональных антител к Taq ДНК-полимеразе.
4.4. Определение доменной специфичности мкАт и сравнение их взаимодействия с ДНК-полимеразами и фрагментом TaqPol
KlenTaq).
4.5. Регуляция полимеразной активности фермента TaqPol.
4.6. Термостабильность антител и комплекса антител с TaqPol.
Выводы.
Список используемой литературы.
Список принятых сокращений
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дизоксинуклеозид трифосфат
ИФА - иммуноферментный анализ
Ка - константа аффинности
Касс - константа ассоциации
Кдасс - константа диссоциации
МкАТ - моноклональное антитело
ПААГ — полиакриламидный гель
ПЦР — полимеразная цепная реакция
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ТМБ - тетраметилбензидин
Ig — иммуноглобулин
PBS - фосфатно-солевой буфер
PBS/T - фосфатно-солевой буфер с 0,1 % Твин
PfuPol - ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Pyrococcus furiosus
TaqPol - ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus aquaticus
Tm - температура плавления
TthPol - ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus thermophilus
CMV — цитомегаловирус dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфат дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфат
Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Шершакова, Надежда Николаевна, автореферат
Актуальность темы диссертации
Taq ДНК-полимераза (TaqPol) - фермент, который в настоящее время широко используется при ПЦР-диагностике различный заболеваний, генотипировании и во многих молекулярно-биологических приложениях [25]. Данный фермент проявляет одновременно два вида активности - полимеразную и экзонуклеазную, является термостабильным и высокопроцессивным. Несмотря на все положительные свойства TaqPol, ведется поиск и создание новых форм этого белка, обладающих улучшенными потребительскими качествами. Для целенаправленной модификации фермента необходимо глубокое изучение структуры данного белка. Одним из инструментов исследования структуры белка являются моноклональные антитела. С помощью антител возможно не только изучение строения фермента, но и направленная регуляция его активности [5].
ДНК-полимераза проявляет заметную активность уже при комнатной температуре и начинает работать сразу после приготовления ПЦР-смеси, еще до нагревания. Это может приводить к образованию неспецифических продуктов реакции, что существенно снижает чувствительность реакции. Для того, чтобы исключить этот нежелательный эффект, применяют несколько способов, одним из которых является использование специфических антител, блокирующих активность фермента до температуры денатурации антител, что позволяет инициировать начало реакции только после нагревания смеси. Применение антител в ПЦР дает ряд преимуществ, например, по сравнению с широко используемым физическим разделением смеси парафиновой прослойкой. Во-первых, применение антител уменьшает количество операций при приготовлении ПЦР-смеси, сокращая время подготовки к анализу. Во-вторых, поскольку температура плавления парафиновой прослойки ниже, чем температура распада комплекса антител с TaqPol, то использование моноклональных антител 6 обеспечивает уменьшение количества неспецифических продуктов реакции, увеличивая специфичность анализа.
В связи с этим представляется актуальным изучение структуры и свойств фермента, а также регуляции его активности, с помощью моноклональных антител.
Цель работы
Целью данной работы являлось получение моноклональных антител, реагирующих с Taq ДНК-полимеразой, способных регулировать активность фермента и перспективных для использования в диагностических ПЦР тест-системах для создания условий «горячего старта».
Задачи исследования
1. Создать гибридомные линии, продуцирующие моноклональные антитела к Taq ДНК-полимеразе.
2. Определить эпитопную структуру Taq ДНК-полимеразы и доменную специфичность антител.
3. Изучить перекрестную реактивность полученных антител с другими термостабильными ДНК-полимеразами.
4. Определить константы аффинности антител.
5. Изучить влияние моноклональных антител на функциональную активность Taq ДНК-полимеразы.
Научная новизна
Впервые проведено систематическое исследование эпитопной и доменной структуры Taq ДНК-полимеразы.
Впервые проведено исследование влияния антител на ферментативную активность ДНК-полимеразы при помощи ПЦР в режиме «реального времени» с использованием праймеров с заменами нуклеотидов.
Впервые найдено антитело, увеличивающее сродство Taq ДНК-полимеразы к дуплексам неспецифических праймеров с ДНК-матрицей.
Теоретическая и практическая значимость работы
Настоящая работа выполнена в рамках программы фундаментальных исследований. Научная значимость настоящего исследования заключается в получении новых сведений об эпитопной и доменной структуре Taq ДНК-полимеразы. Полученные данные позволяют более целенаправленно вести поиск новых модификаций Taq ДНК-полимеразы, обладающих повышенными реакционными свойствами. Созданные антитела могут найти практическое применение в качестве компонента новых более совершенных ПЦР тест-систем.
Публикации
1. Семенихина Н.Н., Храмцов А.В., Филатов А.В. Изучение антигенной структуры белка р24 ВИЧ-1. Аллергология и иммунология, 2004, т. 5, № 1, с. 110.
2. Семенихина Н.Н., Храмцов А.В., Абрамов Д.Д., Павлова О.Г., Трофимов Д.Ю. и Филатов А.В. Получение антител к Taq ДНК-полимеразе. Материалы третьего съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва, 2005, с. 20.
3. Семенихина Н.Н., Абрамов Д.Д. Изучение структурно-функциональных характеристик Taq ДНК-полимеразы. Материалы 10-ой пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2006, с. 47.
4. Семенихина Н.Н., Павлова О.Г., Храмцов А.В., Савилова A.M. и Филатов А.В. Получение гибридом, секретирующих специфические антитела к Taq ДНК-полимеразе, и изучение структурной характеристики фермента. Физиология и патология иммунной системы, 2006, т. 10, № 5, с. 3-10.
1. Обзор литературы
Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение структурно-функциональных характеристик фермента Taq ДНК-полимеразы с помощью моноклональных антител"
Выводы
1. Получена панель из 15 гибридом, секретирующих моноклональные антитела к ферменту Taq ДНК-полимеразе.
2. Определена эпитопная и доменная специфичность полученных антител. Построена антигенная карта белка TaqPol, включающая в себя, по крайней мере, три группы взаимно не перекрывающихся эпитопов. Три антитела реагировали с нуклеазным доменом Taq ДНК-полимеразы, 11 антител-с полимеразным, а одно антитело распознавало эпитоп, находящийся на границе доменов.
3. Для трех антител обнаружена перекрестная реактивность с Tth ДНК-полимеразой, выделенной из термофильной бактерии Thermus thermophilus.
4. Методом плазмонного резонанса, а также методом конкурентного ингибирования определены константы аффинности антител, которые
7 9 1 соответствовали друг другу и находились в области от 10 до 3,1*10 М" . Измерены также константы ассоциации и диссоциации комплексов антиген-антитело.
5. Показано, что антитело Pol5 взаимодействует с TaqPol, но не блокирует полимеразную активность фермента и никак не влияет на ход ПЦР. При взаимодействии полимеразы с антителом Pol4 наблюдалось увеличение ферментативной активности TaqPol, что приводило к образованию большего количества неспецифических продуктов реакции.
6. Антитела Ро2 и РоЗ блокировали полимеразную активность Taq ДНК-полимеразы. Блокировка активности фермента снималась после полной денатурации антител при нагревании реакционной смеси до 70 °С.
7. Получены гибридомы, продуцирующие антитела Ро2 и РоЗ, которые обеспечивают условия «горячего старта» и являются перспективными для использования в качестве компонентов ПЦР-диагностикумов.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Шершакова, Надежда Николаевна
1. Адамов А.К., Агафонов В.И. Суспензионные антигены, антитела и имуносорбенты. // М. Медицина. 1995. - с. 69-81.
2. Иванов Ю.Д., Гнеденко О.В., Николаева Л.И., Конев В.А., Ковалев О.Б., Учайкин В.Ф., Говорун В.М., Покровский В.И., Арчаков А.И. Определение поверхностного антигена вируса гепатита В с помощью оптического биосенсора.// Микробиол. 2003.- №2.-С.58-62.
3. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии. // С-П. Интермедика. 1999. - т. 2. - с. 438-480.
4. Кеннет Р.Г., Мак-керн Т.Д., Бехтол К.Б. Моноклональные антитела. // М. Медицина. 1983.
5. Кохен Ф., Амир Зальцман Ю. Новые методы иммуноанализа. // Подред. Коллинз У.П. М. Медицина. 1991. - С. 65 - 77.
6. Лефковитс И., Пернис Б. Иммунология. Методы исследований. // М. Мир.- 1983.-с. 313.
7. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. Методы иммунохимического анализа в биологии развития. // М. Наука. 1998. - с. 147-152.
8. Никитин П.И. Усовершенствованные методы поверхностно-плазмонного резонанса и биологические и химические сенсорные системы на их основе. // Сенсорные системы. 1998. — Т. 12. — №1. — С. 69-78.
9. Петров Р.В. Иммунология: издание 2. // М. Медицина. 1987.
10. Потехин С.А., Тиктопуло Е.И., Лосева О.И., Огасахара К., Ютани К., Хечинашвили Н.Н., Сараи А., Добрица А.П. Изучение активационного барьера тепловой денатурации белков методомсканирующей микрокалориметрии. // II съезд биофизиков. Тезисы.-1999.
11. Стьюард М. Структура и функции антител. // Под ред. Глинна А. М. Мир. 1983.-с. 56.
12. Хаитов P.M. Физиология иммунной системы. // М. ВИНИТИ РАН. -2005.
13. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. // М. Медицина. 2000.
14. Ярилин А.А. Основы иммунологии. // М. Медицина. 1999.
15. Adams M.W. Enzymes and proteins from organisms that grow near and above 100 °C. // Annu. Rev. Microbiol. 1993. - V. 47. - P. 627-658.
16. Agros P., Rossmann M.G., Grau U.M., Zuber H., Frank G., Tratschin J.D. Thermal stability and protein structure. // Biochemistry. — 1979. V. 18. — P. 5698-5703.
17. Andreotti G., Cubellis M.V., Nitti G., Sannia G., Mai X., Adams M.W., Marino G. An extremely thermostable aromatic aminotransferase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus fiiriosis. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 1247. - P. 90-96.
18. Arnheim N. and Ehrlich H. Polymerase chain reaction strategy. // Annu. Rev. Biochem. 1992. - V. 61. - P. 131.
19. Avilov S.V., Aleksaridrov N.A., Demchenko A.P. Quaternary structure of alpha-crystallin is necessary for the binding of unfolded proteins: a surface plasmon resonance study. // Protein Pept. Lett. 2004. - V. 11. № 1. -P. 41-48.
20. Ayyadevara S, Thaden J.J, Shmookler R.J. Discrimination of primer 3-nucleotide mismatch by taq DNA polymerase during polymerase chain reaction. // Anal. Biochem. 2000. - V. 284. - № 1. - P. 11-8.
21. Barnes W.M. The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion. // Gene. 1992. - V. 112. - P. 29-35.
22. Bell J. The polymerase chain reaction. // Immunol. Today. 1989. - V. 10. - № 10.-P. 351-355.
23. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexinghybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. // Analytycal Biochemistry. 1999. - № 273.- P. 221-228.
24. Berzowsky I.A., Berkower I.J. Antigen-antibody interaction. // Clin. Immunopathol. 1987. - № 1. - P. 96.
25. Blanco L., Bernard A., Blasco M.A., Salas M. A general structure for DNA-dependent DNA polymerases. // Gene. 1991. - V. 100. - P. 27.
26. Bohm G., Jaenicke R. Relevance of sequence statistic for the properties of extremophilic proteins. // Int. J. Pept. Protein Res. 1994. - V. 43. -P. 97-106.
27. Brock T.D. Life at high temperatures. // Science. 1967. - V. 158. - P. 1012-1019.
28. Daiss J.L., Scalice E.R. Epitope mapping on BIAcore: Theoretical and practical considerations. // Methods Compan. Methods Enzymol. 1994. -V. 6.-P.143.
29. Datta K. and LiCata VJ. Salt Dependence of DNA binding by Thermus aquaticus and Escherichia coli DNA Polymerases. // J. Biol. Chem. -2003. V. 278. - № 8. - P. 5694-5701.
30. Davies D.R., Padlan E.A., Sheriff S. Antigen-antibody complexes. // Annu. Rev. Biochem. 1990. - V. 59. - P. 439.
31. Delarue M., Poch O., Tordo N., Moras D., Argos P. An attempt to unify the structure of polymerases. // Prot. Eng. 1990. - V. 3. - P. 461.
32. Elcock A.H. The stability of salt bridges at high temperatures: implications for hyperthermophilic proteins. // J. Mol. Biol. 1998. - V. 284. - P. 489502.
33. Engelke D.R., Krikos A., Bruck M.E. and Ginsburg D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. // Analytical biochemistry. 1990. - P. 396-400.
34. Eom S.H., Wang J., Steitz T.A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site. // Nature (London). 1996. - V. 382. - P. 278281.
35. Erlich H.A., Gelfand D.H., Saiki R.K. The polymerase chain reaction can synthesize millions of copies of specific DNA sequence in a brief in vitro reaction.//Nature. 1988,-V. 35. -№5.-P. 1017-1019.
36. Fagerstam L.G., Frostell A., Karlsson R., Kullman M., Larsson A.,
37. Malmqvist M., Butt H. Detection of antigen-antibody interactions by surface plasmon resonance: application to epitope mapping. // J. Mol. Recogn. 1990. - V. 3. - P. 208.
38. Frutos S.C., Weibel R.M. Corn Near-Infrared Surface Plasmon Resonance Measurements of Ultrathin Films. 2. Fourier SPR Spectroscopy A.G. // Anal. Chem. 1999. - V. 71. - P. 3935-3940.
39. Galfre G., Milstein, C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. // Methods Enzymol. 1981. - V. 73. - P. 3.
40. Ghirlando R, Lund J, Goodall M, Jefferis R. Glycosylation of human IgG-Fc: influences on structure revealed by differential scanning micro-calorimetry. // Immunol Lett. 1999. - V. 68. - № 1. - P. 47-52.
41. Gibson U.E., Heid C.A., Williams P.M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. // Genome Res. 1996. - V. 6. - P. 995-1001.
42. Hall D., Winzor D .J. Use of Resonant Mirrow Biosensor to Caracterize the Interaction of Carboxypeptidase A with an Elicted Monoclonal Antibody. // Anal. Biochem. -1997. V. 244. - P. 152-160. БСС (60)
43. Harlow E., Lane D. Using antibodies. // Cold spring Harbor Laboratory Press. 1999.-P. 23-59.
44. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR. // Genome Res. 1996. - V.6. - P. 986-994.
45. Higuchi R. Kinetic PCR analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. // Biotechnology. 1993. -V. 11. - P. 1026-1030.
46. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P., Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. // Biotechnology. 1992. - V. 10.-P. 413-417.
47. Higuchi R., Fockler C., Watson R. Kinetic PCR: real time monitoring of DNA amplification reactions. // Biotechnology. 1993. - V. 11. - P. 1026-1030.
48. Hiller R., Zhou Z.H., Adams M.W., Englander S.W. Stability and dynamics in a hyperthermophilic protein with melting temperature close to 200 °C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. - V. 94. - P. 11329-11332.
49. Hirs C.H., Timasheff S.N. Enzyme structure. // Methods in enzymology. -1986.-V. 131.
50. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. - V. 88. - P.7276-7280.
51. Huang M., Arnheim N., Goodman F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implication for single nucleotide discrimination in PCR. // Nucleic Acids Research. 1992. -V. 20 (17). - P. 4567-4573.
52. Ignatov KB, Kramarov VM, Uznadze OL, Miroshnikov AL
53. DNA polymerase mediated amplification of DNA fragments using primers with mismatches in the 3'-region. // Bioorg Khim. 1997. - V. 10. -P. 817-822.
54. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of E.coli with plasmids. // Gene. 1990. - V. 96. - P. 23-28.
55. Jaenicke R. Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions. // Eur. J. Biochem. 1991. -V. 202. - P. 715-728.
56. Jaenicke R., Bohm G. The stability of proteins in extreme environments. // . Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. - V. 8. - P. 738-748.
57. Johnsson В., Lofas S., Lindquist G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. // Anal. Biochem. 1991. -V. 198.-P. 268.
58. Karantzeni I, Ruiz C., Liu C.-C. and Licata V J. Comparative thermal denaturation of Thermus aquaticus and Escherichia coli type 1 DNA polymerases. // Biochem. J. 2003. - V. 374. - P. 785-792.
59. Karlsson R., Michaelsson A. and Mattsson L. Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system. // J. Immunol. Methods. 1991. - V. 145. - P. 229.
60. Kaur H., Richardson E., Murty L. Preparation of Monoclonal Antibodies Against Human Telomerase. // Hybridoma. 2001. - V. 20. - № 3. -P. 183-188.
61. Kim Y., Eom S.H., Wang J., Lee D.-S., Suh S.W. and Steitz T.A. Crystal structure of Thermus aquaticus DNA polymerase. // Nature (London). -2002.-V. 376.-P. 612-616.
62. Kitabayashi M., Nishiya Y., Esaka M. A simple and efficient method for high fidelity PCR cloning using antibody-neutralizing technology. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. - V. 67. - № 9. - p. 2034-2037.
63. Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG. Studeis on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. // J Mol Biol. 1971. - V. 56. - № 2. -P. 341-61.
64. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature. 1975. - V. 256. - P. 495.
65. Korolev S., Nayal M., Barnes W.M., Cera E., Waksman G. Crystal structures of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I at 2.5-A resolution: structural basis for thermostability. // Biochemistry — 1995. V. 92. - P. 9264-9268.
66. Kotelnikov G.V., Moiseyeva S.P., Mezhburd E.V., Krayev V.P. New isothermal titration calorimeter for investigations on very small samples. // Journal of thermal analysis and calorimetry. 2002. - V. 68. - P. 803-818.
67. Kunkel T.A. Biological asymmetries and the fidelity of eukaryotic DNA replication. // BioEssays. 1992. - V. 14. - P. 303-308.
68. Labadia M.E., Jeanfavre D.D., Caviness G.O., Morelock M.M. Molecularregulation of the interaction between leukocyte function-associated antigen-1 and soluble ICAM-1 by divalent metal cations. // The Journal of Immunology.- 1998.-V. 161-P. 836-842.
69. Lane R.D. A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. // J. Immunol. Methods. 1985. -V. 81. - P. 223.
70. Larrick J.W. The PCR technique: quantitative PCR. Eaton Publishing, Natick, Mass. 1997.
71. Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.C. Myambo K., Drummond R., and Gelfand D.H. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. // J.Biol.Chem. 1989. - 264. - P. 6427-6437.
72. Li Y., Kong Y., Korolev S., Waksman G. Crystal structures of Klenow fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I complexed with deoxyribonucleoside triphosphstes. // Protein Science. 1998. - V.7. -P. 1116-1123.
73. Lohff C.J. and Cease K.B. PCR using a thermostable polymerase with 3' to 5' exonuclease activity generates blunt products suitable for direct cloning. // Nucleic Acids Res. 1992. - V. 20. - №1. - P. 144.
74. Malakauskas S.M., Mayo S.L. Design, structure and stability of a hyperthermophilic protein variant. // Nat. Struct. Biol. 1998. — V. 5. -P. 470-475.
75. Malmborg A.C., Michaelsson A., Ohlin M., Jansson B. and Borrebaeck C.A. Real time analysis of antibody-antigen reaction kinetics. // Scand. J. Immunol. 1992. - V. 35. - P. 643.
76. Mergener K., Enzensberger W., Rubsamen-Waigmann H. Immunoglobulin class- and subclass-specific HIV antibody detection in serum and CSF specimens by ELISA and Western blot. // Infection. -1987. V. 15. - № 5. - P. 317-322.
77. Mizuguchi H., Nakatsuji M. Fujiwara S., Takagi M., Imanaka T. Characterization and application for hot start PCR of neutralizing- monoclonal antibodies against KOD DNA polymerase. // J. Biochem. -1999.-V. 126.-P. 762-768.
78. Mozhaev V.V. Mechanism-based strategy for protein thermostabilization. // Trends Biotechnol. 1993. - V. 11. - P. 88-95.
79. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986. - V. 51. - P. 263-73.
80. Mullis K.B. and Fallona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. // Methods Enzymol. 1987. -V. 155.-P. 335.
81. Mullis K.B. The polymerase chain reaction in an anemic mode: How to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion. // PCR Methods Applic. 1991. -V. l.-P. 1.
82. Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. // Sci Am. 1990. - V. 262. - № 4. p. 56-61, 64-5.
83. Murali R., Helmer-Citterich M., Sharkey D.J. et al. Structural studies on an inhibitory antibody against Thermus aquaticus DNA polimerase suggest mode of inhibition. // Protein Engineering. 1998. - V.l 1. - №2. - P. 7986.
84. Myszka D.G., Rich R.L. Implementing surface plasmon biosensors in drug discovery. // Pharm. Sci. Technol. Today. 2000. - V. 3. - №9. - P. 310317.
85. Natsume Т., Nakayama H., Jansson O., Isobe Т., Takio K., Mikoshiba K. Combination of biomolecular interaction analysis and mass spectrometric amino acid sequencing. // Anal.Chem. 2000. - V. 72. - №17. - P. 41934198.
86. Nelson R.W., Nedelkov D., Tubbs K.A. Biosensor chip mass spectrometry: a chip-based proteomics approach. // Electrophoresis. -2000. -V. 21.- №6.- P. 1155-1163.
87. Novotny L.A., Jurcisek J.A., Pichichero M.E., Bakaletz L.O. Epitop mapping of the outer membrane protein P5-homologous fimbrin adhesin of nontypeable Haemophilus influenzae. // Infect Immun. 2000. - V. 68. -№4.-P. 2119-2128.
88. Ollis D.L., Brick R., Xuong N.G., Steitz T.A. Structure of the large fragment of E. coli DNA polymerase I complexed with dTMP. // Nature. -1985.-V. 313.-P. 762.
89. Perler F.B., Kumar S., Kong H. Thermostable DNA polymerases. // Adv. Protein Chem. 1996. - V. 48. - P. 377-435.
90. Privalov P.L. Stability of proteins. // Advances in protein chemistry. -1982.-V. 35.
91. Privalov P.L. Stability of proteins. // Advances in protein chemistry. -1979.-V. 33.
92. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffe S. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. // Science. — 1988.-V. 31.-№ l.-P. 487-491.
93. Scalice E.R., Sharkey D.J., Daiss J.L. Monoclonal antibodies preparedagainst the DNA polimerase from Thermus aquaticus are potent inhibitors of enzyme activity. // J. Immunol. Methods. 1994. -V. 172. -P. 147-163.
94. Selivanova O.M., Shiryaev V.M., Tiktopulo E.I., Potekhin S.A. and Spirin A.S. Compact Globular Structure of Thermus thermophilus Ribosomal Protein SI in Solution. // J Biol. Chem. 2003.- V. 278. -P. 36311-36314.
95. Sharkey D.G., Scalice E.R., Christy K.G., Atwood S.M., Daiss J.L. Antibodies as thermolabile switches: high temperature triggering for the polimerase chain reaction. // Bio/Technology. 1994. - V.12. - P. 506.
96. Shulman M., Wilde C.D., Kohler G. A better cell line for making secreting specific antibodies. // Nature. 1978. - V. 276. - P. 269.
97. Silbert P. The PCR technique: RT-PCR. Eaton Publishing, Natick, Mass. 1998.
98. Skerra A., Pfitzinger I. and Pluckthun A. The functional expression of antibody Fv fragments in Escherichia coli: improved vectors and a generally applicable purification technique. // Bio Technology. 1991. -V. 9.-P. 273.
99. Spiegelberg H.L. Biological activities of immunoglobulins of different classes and subclasses. // Adv. Immunol. 1974. - V. 19. - P. 259-294.
100. Stenberg E., Persson В., Roos H., Urbaniczky C. Quantitative determination of surface concentration of protein with surface plasmon resonance by using radiolabeled proteins. // J. Colloid Interface Sci. -1991.-V. 143.-P. 513.
101. Sterner R. and Liebl W. Thermophilic Adaptation of Proteins. // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2001. - V. 36 - № 1. - P. 39-106.
102. Takagi M., Nishioka M., Kakihara H., Kitabayashi M., Inoue H., Kawakami В., Oka M., Imanaka T. Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. Stain KOD I and its application to PCR. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 4504-4510.
103. Tanaka S., Hu S.-Z., Wang T.S.-F., Korn D. Preparation and preliminary characterization of monoclonal antibodies against human DNA polymerase a. // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - P. 8386.
104. Tischenko VM, Zav'yalov VP, Medgyesi GA, Potekhin SA, Privalov PL. A thermodynamic study of cooperative structures in rabbit immunoglobulin G. // Eur. J. Biochem. 1982. - V. 126. - № 3. - P. 517521.
105. Tishchenko VM. Interaction between CH2 and СНЗ-domains of human immunoglobulin G1 in glycosylated and aglycosylated Fc-fragments. // Biofizika. 1999. - V. 44. - № 5. - P. 811-2.
106. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350.
107. Uemori Т., Ishino Y., Toh H., Asada K., Kato I. Organization and nucleotide sequence of the DNA polymerase gene from the archaeon Pyrococcus furiosis. // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 259-265.
108. Vieille C. and Zeikus G.J. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. // Microbiol. Mol. Biol. Rev.-2001.-V.65.-№ l.-P. 1-43.
109. Villbrandt B. Investigations on the Thermostability and Function of the Subunits of Thermus aquaticus DNA Polymerase. // TU Braunschweig Ph.D. Thesis. 1995.
110. Villbrandt В., Sanger, G. and Schomburg, D. Investigations on the thermostability and function of truncated Thermus aquaticus DNA polymerase fragments. // Protein Eng. 1997. — V.10. - P. 1281.
111. Weir D.M. Immunochrmistry. V.l. - 1986.
112. Wilson I.A., Niman, H.L., Houghten, R.A., Cherenson, A.R., Conolly, M.L. and Lerner, R.A., 1984. The structure of an antigenic determinant in a protein. // Cell. 1984. - V.37. - P. 767.
113. Yeung D., Gill A., Maule C.H., Davies R.J. Detection and quantification of biomolecular interactions with optical biosensors. // Trends in analytical chemistry. 1995. - V. 14. - P. 49-56.
114. Zav'yalov VP, Troitsky GV, Demchenko AP, Generalov IV. Temperature and pH dependent changes of immunoglobulin G structure. // Biochim Biophys Acta. 1975. - V. 386. - № 1. - P. 155-67.