Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние экспрессии изоформ ядерного рецептора HNF4α на свойства клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека

На правах рукописи -

ЧЕСНОКОВ МИХАИЛ СЕРГЕЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ИЗОФОРМ ЯДЕРНОГО РЕЦЕПТОРА Н№4а НА СВОЙСТВА КЛЕТОК ПРОТОКОВОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА

Специальность 14.01.12 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2014

005550556

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук (директор - академик РАН и РАМН, проф., д.м.н. Давыдов Михаил Иванович)

Научный руководитель:

профессор, доктор биологических наук Лазаревич Наталия Леонидовна

Официальные оппоненты:

Гуревич Лариса Евсеевна — профессор, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник патологоанатомического отделения Государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Московский областной научно-исследовательский клинический институт (МОНИКИ) им. М. Ф. Владимирского», Москва.

Сергеева Наталья Сергеевна — профессор, доктор биологических наук, руководитель отделения прогноза эффективности консервативного лечения Федерального государственного бюджетного учреждения «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П. А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта» Российской академии наук, Москва.

Защита диссертации состоится « 2 t^io i-u^î_2014 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. H. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте www.ronc.ru.

Автореферат разослан « Ь » ^^^J?_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

профессор, доктор медицинских наук ¡//Ьсь piM^? '""Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Опухоли поджелудочной железы (ПЖ) относятся к наиболее злокачественным онкологическим заболеваниям. Самая распространенная форма опухолей ПЖ -протоковая аденокарцинома (ПАКПЖ), доля которой достигает 90% среди всех опухолей ПЖ. ПАКПЖ развивается из протоковых клеток и характеризуется крайне агрессивным фенотипом и высокой скоростью прогрессии, ей свойственны раннее метастазирование и устойчивость к современным методам терапии. Дополнительной проблемой является отсутствие четко выраженных симптомов и эффективных методов ранней диагностики таких опухолей. Пятилетняя выживаемость среди пациентов с ПАКПЖ не превышает 5-6%. Поэтому поиск ключевых механизмов развития, способов ранней диагностики и прогнозирования ПАКПЖ остается актуальной областью исследований. Одним из наиболее перспективных направлений на сегодняшний день представляется исследование молекулярных механизмов, вовлеченных в процессы трансформации протоковых клеток.

Возникновение и прогрессия ПАКПЖ связаны с нарушениями дифференцировки ткани ПЖ. Дифференцировочный статус ткани регулируется «ключевыми» тканеспецифическими транскрипционными факторами (ТФ), контролирующими процессы дифференцировки и функционирования клеток. В случае ПЖ наибольшее значение имеет активность факторов РОХ1 (регулирует развитие эндокринных клеток) и РТР 1а (отвечает за дифференцировку ациноцитов). В последнее время появляется все больше сведений о том, что важную роль в регуляции дифференцировки клеток ПЖ играют гепатоцитарные ядерные факторы (ГЯФ).

ГЯФ - одна из наиболее полно охарактеризованных на сегодняшний день систем тканеспецифической регуляции активности генов. Эта группа включает в себя 5 неродственных семейств ТФ: Н№1, РОХА, 1ЮТ4, ОЫЕСиТ и С/ЕВР. Экспрессия различных ГЯФ необходима для правильного развития и функционирования печени, ПЖ, желудка, кишечника, почек и ряда других органов. При этом для каждой ткани на определенных этапах развития характерен специфический спектр активности представителей ГЯФ. Центральное место в регуляторной сети ГЯФ в гепатоцитах занимает ядерный рецептор НЫР4а, его значение в других типах тканей также велико.

Для гена Н№4а описано два независимо регулируемых промотора, Р1 и Р2. С этих промоторов в результате альтернативного сплайсинга экспрессируется 12 изоформ фактора НОТ4а, которые делятся на 2 группы: РШР4аР1 (изоформы а1-аб) и КЮТ4аР2 (изоформы а7-а12). Эти группы изоформ отличаются по своим транс-активирующим свойствам и могут по-разному экспрессироваться в различных тканях и на разных стадиях их развития. Так, для ПЖ в нормальном состоянии характерна активная экспрессия изоформ группы НЫР4аР2 и очень слабая - НЫР4аР1, в то время как во время эмбриогенеза в панкреатических клетках экспрессируются обе группы изоформ.

Фактор РГЫР4а играет критическую роль в развитии гепатоцеллюлярной карциномы (ГК) - наиболее распространенной формы опухолей печени. Ранние стадии развития ГК характеризуются активацией экспрессии НЫР4аР2, а более поздние -подавлением всех изоформ Н>1Р4а. Реэкспрессия Н№4а в культурах клеток ГК сопровождается их частичной редифференцировкой и ослаблением злокачественного потенциала. Ряд работ описывает опухоле-супрессорную функцию НОТ4а в клетках почки, толстой и тонкой кишки, однако роль Н№4а в прогрессии ПАКПЖ на

сегодняшний день остается мало исследованной.

В данной работе исследуется влияние изменений экспрессии изоформ НМ-Ча на уровень дифференцировки и биологические свойства клеток ПАКПЖ, отвечающие за развитие их злокачественного фенотипа. В качестве модельной системы использована панель из четырех клеточных линий ПАКПЖ человека, отличающихся уровнями дифференцировки и спектрами экспрессии изоформ НОТ4а. В исследуемых культурах клеток, в зависимости от первоначального уровня экспрессии Н№4а, либо экзогенно экспрессировали изоформы Н№4а1 или Н№4а7, либо подавляли эндогенную экспрессию НЫР4а с помощью малых шпилечных РНК (мшРНК). Анализ изменений экспрессии панкреа-специфических генов и биологических параметров этих клеток позволил установить основные закономерности влияния НЫЯ4а на дифференцировочный статус и злокачественный потенциал клеток ПАКПЖ. Обнаруженные изменения активности генов были верифицированы на панели клинических образцов ткани ПАКПЖ человека.

Цель исследования

Анализ роли изменений экспрессии изоформ фактора Н№4а в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и исследование влияния этого фактора на экспрессию генов и основные биологические характеристики опухолевых клеток, определяющие выраженность их злокачественного фенотипа.

Задачи исследования

1. С помощью лентивирусных конструкций получить культуры низкодифференцированных клеток ПАКПЖ человека, экзогенно экспрессирующие изоформы Н№4а1 и РП\[Р4а7.

2. Исследовать влияние экзогенного повышения уровней экспрессии изоформ Н№4а в низкодифференцированных клетках ПАКПЖ на уровни экспрессии регуляторов дифференцировки и функциональных генов ПЖ, а также на биологические свойства этих клеток.

3. С помощью мшРНК, комплементарных к последовательности мРНК НЫР4а, получить культуры высоко- и умереннодифференцированных клеток ПАКПЖ с подавленной экспрессией НЫР4а.

4. Исследовать влияние подавления синтеза Н№4а в высоко- и умереннодифференцированных клетках ПАКПЖ на уровни экспрессии регуляторов дифференцировки и функциональных генов ПЖ, а также на биологические свойства этих клеток.

5. Провести верификацию обнаруженных закономерностей экспрессии панкреа-специфических генов на панели клинических образцов ткани ПАКПЖ и неопухолевой панкреатической ткани тех же пациентов.

Научная новизна исследования

Научная новизна исследования определяется тем, что в представленной работе впервые произведен анализ роли изменения экспрессии изоформ ЮЛЧа в клетках ПАКПЖ человека. Ранее роль нарушения экспрессии НОТ4а в канцерогенезе была исследована в опухолях печени, кишечника и клетках инсулиномы. Антипролиферативное действие НЫР4а описано также в клетках почки и эмбриональной карциномы. Однако на сегодняшний день ни одной работы,

направленной на исследование нарушений экспрессии Н№4а в клетках ПАКПЖ, в научной литературе не опубликовано.

В работе исследованы изменения экспрессии важнейших регуляторов дифференцировки панкреатических клеток (РБХ1, РТР 1 а, факторов семейств НИР 1, РОХА, Н№4, (ЖЕСиТ), которые наблюдаются при повышении или понижении уровней экспрессии изоформ РЮТ4а в клеточных линиях ПАКПЖ человека. Параллельно исследованы изменения экспрессии секретируемых белков ПЖ (а-амилаза-2а, эластаза-2а), регулятора клеточного цикла р21сп'|/,л'лп и белков межклеточных контактов Е- и М-кадхерина. Показано, что изменения экспрессии РЮТ4а могут оказывать значительное влияние на уровень дифференцировки клеток ПАКПЖ.

Кроме того, в работе исследовано влияния изменения экспрессии Н№4а на биологические характеристики клеток ПАКПЖ, определяющие их злокачественный фенотип: пролиферативную активность, способность к колониеобразованию и миграционный потенциал. В результате исследований обнаружено, что в клетках ПАКПЖ фактор РЮТ4а может выполнять функции опухолевого супрессора и оказывать ингибирующий эффект на их пролиферативную и колониеобразующую активность, а также регулировать способность этих клеток к миграции. Более того, впервые описано ослабление пролиферативного и клоногенного потенциала при подавлении гиперэкспрессированного 11ЫР4а в умереннодифференцированных клетках ПАКПЖ.

Обнаруженные при исследовании клеточных культур закономерности экспрессии НЫР4а и других тканеспецифических генов верифицированы на панели клинических образцов ПАКПЖ человека. Впервые произведен анализ нарушений экспрессии изоформ Н№4а в ткани ПАКПЖ и корреляций этих нарушений с экспрессией маркеров дифференцировки клеток ПЖ.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическое значение работы заключается в описании новых взаимосвязей между экспрессией тканеспецифических ТФ и опухолевой профессией ПАКПЖ. Исследование зависимости между изменениями экспрессии Н№4а и регуляторов дифференцировки клеток ПЖ является важным шагом в направлении установления механизмов, опосредующих прогрессию ПАКПЖ. Анализ корреляций между экспрессией тканеспецифических генов и биологическими свойствами клеток позволит лучше понять причины высокой агрессивности ПАКПЖ.

Практическое значение работы определяется описанием нового важного регулятора прогрессии ПАКПЖ - НОТ4а. Исследование его функций в ПАКПЖ может выявить новые биологические маркеры этого типа опухолей и молекулярные механизмы, играющие критическую роль в развитии ПАКПЖ. Эта информация может быть использована для создания новых методов диагностики и разработки новых подходов к терапии ПАКПЖ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Нарушения экспрессии изоформ ядерного рецептора Н№4а играют важную роль в формировании злокачественного фенотипа ПАКПЖ;

2. Получены и охарактеризованы культуры низкодифференцированных клеток ПАКПЖ человека, экзогенно экспрессирующие изоформы НЫР4а1 и

HNF4a7, а также культуры высоко- и умереннодифференцированных клеток ПАКПЖ человека с подавленной экспрессией HNF4a;

3. Экзогенная экспрессия изоформ HNF4a в низкодифференцированных клетках ПАКПЖ приводит к их частичной редифференцировке и снижению злокачественного потенциала;

4. При подавлении синтеза HNF4a в высокодифференцированных клетках ПАКПЖ снижается уровень дифференцировки и усиливается злокачественный потенциал;

5. Подавление синтеза HNF4a в умереннодифференцированных клетках ПАКПЖ приводит к неоднозначным изменениям их дифференцировочного статуса и биологических свойств;

6. Нарушение экспрессии изоформ HNF4a является частым сбытием в клинических образцах ПАКПЖ человека;

7. Закономерности экспрессии HNF4a и ряда других панкреа-специфических генов в клинических образцах ПАКПЖ человека сходны с наблюдаемыми in vitro.

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась 26 сентября 2013 на объединенной конференции лабораторий механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, механизмов гибели опухолевых клеток, цитогенетики, регуляции клеточных и вирусных онкогенов и механизмов канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 сообщение на российской конференции, 2 сообщения на международных конференциях, 1 работа в сборнике научных трудов конкурса молодых ученых.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 312 источников, из которых 10 отечественных и 302 иностранных. Работа иллюстрирована 46 рисунками и 3 таблицами.

Материалы и методы исследования Клеточные линии: в работе использовали клеточные линии ПАКПЖ человека Panel, MiaPaCa2, СаРап2 и AsPCl.

Получение клеточных культур с экзогенной экспрессией или подавлением экспрессии изоформ HNF4a: культуры клеток Panel и MiaPaCa2, экзогенно экспрессирующих изоформы HNF4a, и клеток СаРап2 и AsPCl с подавленным синтезом HNF4a, получали с помощью транедукции лентивирусными векторами. Для экзогенной экспрессии HNF4a использовали векторы на основе pLenti6-V5-D-TOPO, кодирующие кДНК изоформ HNF4al или HNF4a7. Для подавления экспрессии HNF4a использовали векторы на основе pLKO.l-Puro, экспрессирующие 5 различных вариантов мшРНК, комплементарных различным участкам молекулы мРНК HNF4a.

Клинические образцы тканей: в работе использована 21 пара клинических образцов ткани ПАКПЖ человека и неопухолевой ткани ПЖ тех же пациентов, а также образцы условно нормальной ткани ПЖ, полученные при проведении гастропанкреатодуоденальной резекции пациентов с ПАКПЖ в отделении опухолей печени и поджелудочной железы ФГБУ «РОНЦ им. H. Н. Блохина» РАМН. Выделение суммарной РНК и ОТ: образцы суммарной РНК выделяли из клеток и образцов ткани при помощи набора «RNeasy Plus Mini Kit» (QIAGEN, Германия) согласно протоколу, предложенному производителем. Для проведения обратной , транскрипции 12,25 мкл смеси, содержащей 2 мкг РНК и 0,1 мкг случайных гексамерных праймеров, денатурировали при 72° С 10 мин и охлаждали на льду. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащем: смесь РНК и праймеров, 4 мкл 5-кратного буфера для MMLV-OT (Promega, США), 0,25 мМ каждого dNTP (Силекс, Россия), 0,1 мМ дитиотритола (Sigma, США), 50 ед. обратной транскриптазы MMLV (Promega, США) и 2,5 ед. ингибитора рибонуклеаз RNasin Ribonuclease Inhibitor (Promega, США). Схема реакции: [42°С - 60 мин]; [95°С - 10 мин]. ПЦР: праймеры для проведения ПЦР подбирали, используя программу Primer3. Праймеры для гена HNF4a фланкировали участки гена, принадлежащие разным изоформам HNF4a. ПЦР проводили в объеме 25 мкл, содержащем: образец кДНК, 2,5 мкл 10х буфера для проведения ПЦР с Taq-полимеразой, 50 нг каждого праймера, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 0,05 мМ каждого dNTP (реактивы фирмы Силекс, Россия), Н20. Схема реакции: 1 цикл - [95°С - 5 мин]; N циклов - [95°С - 50 сек, Т(отжиг) - 50 сек, 72°С - 50 сек]; 1 цикл - [72°С - 10 мин]. ПЦР-продукты анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. ПЦР-РВ: Реакцию проводили в объеме 25 мкл, содержащем: кДНК из расчета 20 нг исходной РНК на одну пробу, 2,5 мкл 10х Taq-буферэ с красителем SYBR Green I, 10 пкмоль каждого праймера, 1,5 ед. Тац-полимеразы, 0,25 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCb, НгО (все реактивы предоставлены компанией Синтол, Россия). Схема реакции: 1 цикл - [95°С - 5 мин]; 45 циклов - [95°С - 50 сек, Т(отжиг) - 50 сек, 72°С - 50 сек, 86°С - 20 сек]; 1 цикл - [72°С - 10 мин]. Сигнал регистрировали при 86°С, чтобы избежать образования димеров праймеров.

Иммуноблоттинг: образцы белка получали с помощью лизиса клеток в буфере RIPA (Roche, Швейцария). ДСН-электрофорез белков проводили в 10% полиакриламидном геле, после электрофореза переносили белки из геля на PVDF-мембрану Immobilon-P (Merck Millipore, США). Мембрану окрашивали моноклональными антителами мыши к GAPDH (клон ZG003, Invitrogen, США, 1:5000), HNF4aTOT (клон Н1415, R&D Systems, США, 1:4000) и моноклональными антителами к у-иммуноглобулину мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., США, 1:10000). Для детекции белков использовали систему «Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate» (Merck Millipore, США).

Иммунофлюоресцентная окраска клеток: для иммунофлюоресцентного окрашивания клетки фиксировали метанолом и окрашивали моноклональными антителами к HNF4aTOT (клон Н1415, R&D Systems, США, 1:400) и моноклональными антителами к у-иммуноглобулину мыши, конъюгированными с зеленой флуоресцентной меткой AlexaFIuor 488 (Invitrogen, США, 1:200). Дополнительно окрашивали клетки DAPI (Sigma, США).

Исследование кннетики роста клеточных культур: клетки исследованных культур вносили в лунки 96-луночного планшета и культивировали в течение 24, 48, 72 и 96

часов. Количество клеток после культивации определяли с помощью набора «CyQUANT NF Cell Proliferation Assay Kit» (Invitrogen, США) согласно протоколу, предложенному производителем.

Определение активности синтеза ДНК: клетки в логарифмической фазе роста инкубировали 2 часа в среде с 10 мМ 5-бромдезоксиуридином (5-BrdU). После инкубации клетки фиксировали метанолом, обрабатывали 1%-м раствором Triton X-100 на PBS 3 мин и 4 Н раствором HCl 10 минут. Препараты окрашивали моноклональными антителами мыши к 5-BrdU (ZBU 30, Zymed Laboratories Inc., США, 1:100) и моноклональными антителами к у-иммуноглобулину мыши, . конъюгированными с зеленой флуоресцентной меткой AlexaFluor 488 (Invitrogen, США, 1:200), после чего определяли долю меченых 5-BrdU клеток. Клоногенный тест: клетки культивировали в чашках Петри диаметром 3 см в условиях высокого разведения (1000 клеток на чашку для Panel, MiaPaCa2, AsPCl, 2000 клеток на чашку для СаРап2) до формирования выраженных колоний (14 суток для Panel, MiaPaCa2 и СаРап2, 21 сутки для AsPCl). Колонии фиксировали метанолом и окрашивали кристаллическим фиолетовым, фотографировали и анализировали с помощью пакета программ «Total Lab 2.01» (TotalLab Ltd., Великобритания). Миграционной тест: использовали камеры-вставки Бойдена для 24-луночных планшетов «BD Falcon Cell Culture Insert» (BD Biosciences, США) с размером пор 8,0 мкм. В верхний отсек камеры вносили клетки в среде без сыворотки, в нижний отсек -среду с 5% сыворотки. Планшет инкубировали 16 часов, после чего удаляли клетки с верхней стороны мембраны. Мигрировавшие на нижнюю сторону мембраны клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым и подсчитывали с помощью микроскопа. Статистическая обработка данных: при проведении экспериментов производили не менее трех независимых повторов. Данные обрабатывали в программных пакетах «Microsoft Office Excel 2003» (Microsoft Corporation, США) и Origin Pro 9.0 (OriginLab Corporation, США). Достоверность отличий проверяли с помощью t-теста с поправкой Уэлча, U-теста Манна-Уитни, и парного t-теста. Достоверными считали различия с уровнем значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор модельной системы и панели исследуемых генов.

Для исследования роли HNF4a в прогрессии ПАКПЖ в качестве модельных систем были выбраны четыре клеточных линии ПАКПЖ человека, отличающиеся уровнем дифференцировки и спектрами экспрессии изоформ HNF4a. В высокодифференцированных клетках СаРап2 экспрессируется только группа HNF4aP2; для умереннодифференцированных клеток AsPCl характерна гиперэкспрессия HNF4aPl и HNF4aP2; низкодифференцированные линии Panel и MiaPaCa2 не экспрессируют никаких изоформ HNF4a.

Для оценки уровня дифференцировки клеток исследуемых культур, была выбрана следующая панель генов, экспрессию которых определяли методом ОТ-ПЦР: PDX1, PTF1A, HNF1A, HNF1B, FOXA1, FOXA, HNF6, ОС2 (кодируют регуляторы дифференцировки ПЖ), AMY2A, ELA2A (кодируют секретируемые белки ПЖ), CDH1, CDH2 (кодируют Е- и N-кадхерины), CDKN1A (кодирует p21CIP1/WAF1).

2. Влияние экзогенной экспрессии изоформ HNF4a на злокачественный потенциал низкодифференцированных клеток ПАКПЖ Panel и MiaPaCa2.

Получение культур клеток Panel и MiaPaCal, экспрессирующих изоформы HNF4a. С помощью лентивирусной транедукции векторами, экспрессирующими изоформы HNF4al и HNF4a7, из клеток Panel и MiaPaCa2 были получены культуры Pancl-HNF4al, Рапс 1 -HNF4a7, MiaPaCa2-HNF4al и MiaPaCa2-HNF4a7. В качестве контрольных использовали культуры Pancl-ref и MiaPaCa2-ref, транедуцированные векторами, не экспрессирующими изоформы HNF4a.

Уровни синтеза HNF4a в полученных культурах исследовали с помощью иммуноблоттинга (Рисунок 1) и иммунофлюоресцентного окрашивания (Рисунок 2). Оба метода продемонстрировали, что суммарные уровни синтеза белка HNF4a (все изоформы) в клетках Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a значительно повышены по сравнению с контрольными культурами. Уровни экспрессии различных групп изоформ HNF4a исследовали с помощью ОТ-ПЦР (Рисунок 3).

Pancl-ref

Pancl-HNF4a1

Panel-HNF4a7

MiaPaCa2-ref

MiaPaCa2-HNF4a1

MiaPaCa2-HNF4a7

Рис. I. Уровни синтеза белка HNF4a в клетках ЬГЫР4а-экспрессируюицих культур Panel (А) и MiaPaCa2 (Б). Уровни синтеза белка GAPDH использовали для контроля общего количества белка, нанесенного на дорожки.

MiaPaCa2* ref

MiaPaCa2-HNF4a1

Рис. 2. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток НЫР4а-экспрессирующих культур Panel (А) и MiaPaCa2 (Б) моноклональными антителами HNF4aTOT к HNF4a. Ядра клеток окрашены DAP1.

Рис. 3. Уровни экспрессии изоформ HNF4a в клетках культур Panel (А) и MiaPaCa2 (Б), экзогенно экспрессирующих HNF4a. Данные по экспрессии PPIA приведены для контроля количества кДНК, взятой в реакцию. Слева указаны названия праймеров, сверху - названия исследованных культур, справа - длины ПЦР-продуктов в п. н.

Экзогенная экспрессия изоформ группы HNF4aPl в исследованных клетках не приводит к активации транскрипции эндогенных изоформ HNF4aP2; и наоборот, в Н№4аР2-экспрессирующих культурах не активируется транскрипция изоформ группы PTNF4aPl. В то же время экзогенная экспрессия HNF4al (продукт HNF4A2 длиной 133 п. н.) в клетках Panel приводит к активации экспрессии эндогенных изоформ HNF4a2 (продукт HNF4A2 длиной 163 п. н.), а в клетках MiaPaCa2 - HNF4a2 и HNF4a3. Аналогично, изоформа HNF4a7 активирует в Panel транскрипцию HNF4a8, а в MiaPaCa2 - HNF4a8 и HNF4a9. Экспрессии изоформ HNF4a4-a6 (продукт HNF4AP1 длиной 229 п. н.) и al0-al2 (продукт HNF4AP2 длиной 386 п. н.) выявлено не было.

Реактивация эндогенной экспрессии HNF4a указывает на обратимость подавления активности гена HNF4A в клетках Panel и MiaPaCa2, которое, по всей видимости, вызвано эпигенетическими механизмами.

Изменения экспрессии панкреа-спеиифических генов в клетках Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a. Чтобы исследовать возможное влияние экзогенной экспрессии HNF4a на дифференцировочный статус клеток Panel и MiaPaCa2, в полученных культурах методом ОТ-ПЦР были проанализированы уровни экспрессии важнейших регуляторов дифференцировки и функциональных генов. Результаты анализа приведены на Рисунке 4.

А

PPIA HNF4AP1 HNF4AP2 PDX1 PTF1A HNF1A HNF1B FOXA1 FOXA2 ОС2 A MY2A CDKN1A

Рис. 4. Уровни экспрессии регуляторов дифференцировки, а-амилазы-2а и CDKN1A в клетках НЫР4а-экспрессирующих и контрольных культур Panel (А) и MiaPaCa2 (Б). Данные по экспрессии PPIA приведены для контроля количества кДНК, взятой в реакцию. Слева указаны названия праймеров, сверху - названия исследованных культур, справа - длины ПЦР-продуктов в п. н.

Усиление синтеза изоформ как группы HNF4aPl, так и группы HNF4aP2 в клетках Panel и MiaPaCa2 сопровождается выраженной активацией экспрессии генов PDX1, PTF1A, FOXA2 и ОС2. В то же время транскрипция генов, кодирующих

10

с? <3>\ с?л &&

184

факторы HNFla и FOXA1, индуцируется только изоформами группы HNF4aP2. Экспрессия гена HNF1B наблюдается только в культуре Pancl-HNF4a. В обеих ШЧР4а-экспрессирующих культурах MiaPaCa2 наблюдается повышение активности гена AMY2A, в случае клеток Panel активация этого гена вызывается только изоформами HNF4aP2. Еще одной особенностью клеток MiaPaCa2-HNF4a является значительное повышение экспрессии гена CDKN1A относительно контрольной культуры. В клетках Pancl-ref уровень экспрессии CDKN1A изначально высок, его дальнейшего Н№4а-зависимого повышения не происходит.

В рассмотренных культурах были также проанализированы уровни экспрессии факторов HNF6 и HNF4y, эластазы-2а, Е- и N-кадхеринов. Значимых HNF4a-зависимых изменений экспрессии кодирующих их генов мы не обнаружили, поэтому на Рисунке 4 они не представлены.

ОТ-ПЦР анализ позволил выявить блок тканеспецифических генов, экспрессия которых может быть индуцирована в низкодифференцированных клетках ПАКПЖ повышением активности фактора HNF4a. Большая их часть относится к важным регуляторам дифференцировки панкреатических клеток: экспрессия PDX1, PTFla, HNFla, FOXA1, FOXA2 и ОС-2 характерна для нормальных экзо- и эндокринных клеток, HNFip активно экспрессируется в ПЖ во время эмбриогенеза. В исходных культурах Panel и MiaPaCa2 перечисленные факторы практически не экспрессируются. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что усиление синтеза HNF4a в клетках ПАКПЖ сопровождается повышением уровня их дифференцировки. Сделанный вывод подтверждается активацией гена а-амилазы-2а, фермента, синтезируемого дифференцированными экзокринными клетками. Наблюдаемая частичная редифференцировка является серьезным аргументом в пользу гипотезы об опухоле-супрессорной функции HNF4a в протоковых клетках ПЖ.

Важно отметить, что экспрессия факторов PDX1, PTFla, FOXA2 и ОС-2 может быть индуцирована как изоформами HNF4aPl, так и изоформами HNF4aP2, несмотря на их различные транс-активационные свойства. Такой результат может указывать на существование общего для них HNF4a-3aBHCHMoro регуляторного механизма; другим объяснением может быть то, что перечисленные факторы способны регулировать экспрессию друг друга. В таком случае повышение экспрессии HNF4a играет роль пускового стимула для включения комплексной системы панкреа-специфических ТФ, обеспечивающих поддержание частично дифференцированного статуса клеток.

В отличие от описанного блока генов, экспрессия генов HNF1A и FOXA1, свойственная взрослым панкреатическим клеткам, индуцируется только изоформами HNF4aP2. Аналогично, эмбриональные для ПЖ изоформы группы HNF4aPl активируют экспрессию эмбрионального же фактора HNF1 (3.

Необходимо обратить внимание, что описанный спектр экспрессии ТФ (особенно одновременная экспрессия PDX1 и PTF1A) характерен для панкреатических частично дифференцированных мультипотентных клеток. Возможно, свойства клеток Panel и MiaPaCa2 при экспрессии в них HNF4a становятся близки к свойствам, характерным для таких клеток-предшественников.

Важным наблюдением является Н№4а-зависимая индукция в клетках MiaPaCa2 экспрессии гена CDKN1A, кодирующего один из важнейших ингибиторов клеточного цикла

p2jC.Pl/WAF! регудяция

его экспрессии является наиболее вероятным механизмом влияния HNF4a на клеточную пролиферацию. НЫР4а-зависимая активация CDKN1А еще раз подтверждает гипотезу о его онкосупрессорной роли.

Влияние экзогенной экспрессии HNF4a на биологические свойства клеток Panel и MiaPaCa2. Чтобы понять, как реэкспрессия фактора HNF4a и сопровождающая его частичная редифференцировка влияют на злокачественный потенциал клеток Panel и MiaPaCa2, были исследованы следующие свойства культур Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a: скорость роста in vitro, интенсивность синтеза ДНК, способности к образованию колоний в условиях высокого разведения и к направленной миграции сквозь пористую мембрану.

• Культуры Pancl-HNF4a по скорости роста в условиях in vitro достоверно не отличаются от контрольной культуры (Рисунок 5А). Однако в клетках MiaPaCa2 усиление синтеза как изоформ HNF4aPl, так и HNF4aP2 приводит к достоверному замедлению роста клеток (Рисунок 5Б). Это наблюдение согласуется с описанными ранее изменениями экспрессии p21c,P1/WAF1: в культурах Pancl-HNF4a значительных изменений активности гена CDKN1A не происходит, в то время как в MiaPaCa2-HNF4a экспрессия этого ингибитора клеточного цикла усиливается.

13 11 9

£

Э

5 7 2 5

-*-Panc1-ref — Panc1-HNF4a1 — Panc1-HNF4a7

15

0

| 13 * 71

a V

° е9

I1;

1 3 ° 1

-»-MiaPaCa2-ref -*- MiaPaCa2-HNF4a1 — MiaPaCa2-HNF4a7

— ***

12 3 4

Время культивации, сут.

12 3 4

Время культивации, сут.

Рис. 5. Кинетика роста Н№4а-экспрессирующих культур Panel (А) и MiaPaCa2 (Б) и соответствующих контрольных культур. Данные нормированы относительно начального количества клеток. * * * - р<0,001 (t-тест).

• Активность пролиферативных процессов в исследуемых культурах определяли с помощью метода включения 5-BrdU в синтезирующуюся ДНК во время S-фазы клеточного цикла. На Рисунке 6 показано, что ни в клетках Pancl-HNF4a, ни в клетках MiaPaCa2-HNF4a не происходит значительного изменения доли клеток, активно синтезирующих ДНК, по сравнению с контрольными линиями. В случае культур Panel это наблюдение согласуется с отсутствием изменений кинетики роста и экспрессии

р2Г

. Замедление же роста, описанное в культурах MiaPaCa2-HNF4a, по-

видимому, не связано с их пролиферацией и вызывается другими механизмами; кроме того, в них не наблюдается эффектов каноничного действия белка р21аР|лл'АР1, который останавливает клеточный цикл в фазе О;.

А = ш

0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

0,42 0*46 0,44

т

I IZ ■

ш _

_ _

J L _ L

0,50

Panc1-ref

Pand-HNF4a1

Рапс1-HNF4a7

MiaPaCa2-ref

Рис. 6. Включение 5-BrdU в ДНК клеток Pancl-HNF4a (А) и MiaPaCa2-HNF4a (Б) и соответствующих контрольных культур, * - р<0,05 (U-тест Манна-Уитни).

• В условиях высокого разведения (1000 клеток на чашку Петри диаметром 3 см) клетки Н№4а-экспрессирующих культур Panel и MiaPaCa2 формируют меньшее количество колоний, чем клетки контрольных культур (Рисунок 7). При этом эффект HNF4a не зависит от того, какие изоформы экспрессируются в исследованных культурах. Ослабление колониеобразующей способности в клетках MiaPaCa2-HNF4a выражено сильнее, чем в Pancl-HNF4a; возможно, это вызвано замедлением их роста.

РапсЧ-HNF4a7

MiaPaCa2-ref

Рис. 7. Среднее количество колоний, формируемых клетками культур Pancl-HNF4a (А), MiaPaCa2-HNF4a (Б) и соответствующих контрольных культур. * - р<0,05, *** - р<0,001 (t-тест).

• Экзогенная экспрессия HNF4a в исследованных культурах Panel и MiaPaCa2

сопровождается достоверным повышением их способности к направленной миграции

в камерах Бойдена (Рисунок 8).

эоо 800 -700 600 500

597,0

347,0

_ ■

Рапс1-HNF4a7

600 500 -400

100 0

MiaPaCa2-ref

357,1

■ т 1

102,5

_

_

MiaPaCa2-HNF4a1

MiaPaCa2-HNF4a7

Рис. 8. Среднее количество клеток культур Рапс1-РГЫР4а (А), М1аРаСа2-НЫР4а (Б) и контрольных культур, мигрировавших в камере Бойдена. * - р<0,05, ** - р<0,01 (и-тест Манна-Уитни).

Этот результат оказался неожиданным и плохо согласуется с полученными ранее данными, указывающими на частичную редифференцировку и снижение злокачественности клеток Panel и MiaPaCa2 при экспрессии в них HNF4a. Как правило, повышение способности к миграции указывает на обратный эффект -усиление злокачественного потенциала. Однако в данном случае важно, что спектры экспрессии тканеспецифических ТФ в исследуемых культурах сходны с таковыми в панкреатических клетках-предшественниках. Для этих клеток на стадии частичной дифференцировки как раз характерна повышенная способность к миграции, необходимая для процессов роста и регенерации ПЖ. Поэтому наблюдаемое усиление миграционных свойств можно рассматривать как приближение свойств исследуемых клеток к свойствам клеток-предшественников, то есть частичную редифференцировку.

Итак, экзогенная экспрессия изоформ HNF4al и HNF4a7 в низкодифференцированных клетках ПАКПЖ сопровождается их частичной редифференцировкой, ослаблением клоногенного потенциала, а в случае клеток MiaPaCa2 - замедлением скорости их роста in vitro. Усиление способности к миграции в данном случае не обязательно указывает на усиление злокачественности. Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод, что повышение уровней синтеза HNF4a в клетках Panel и MiaPaCa2 приводит к ослаблению их злокачественного потенциала, что поддерживает гипотезу о том, что в протоковых клетках ПЖ HNF4a играет роль опухолевого супрессора.

3. Влияние подавления экспрессии HNF4a на злокачественный потенциал высокодифференцированных клеток ПАКПЖ СаРап2.

Получение культур клеток СаРап2 с подавленной экспрессией фактора HNF4a. Из исходной клеточной линии СаРап2 с помощью лентивирусной транедукции было получено 5 культур, экспрессирующих варианты мшРНК, комплементарные разным участкам последовательности мРНК HNF4a (далее CaPan2-shHNF4a). Параллельно в качестве контрольной культуры были получены клетки СаРап2, экспрессирующие мшРНК к мРНК зеленого флюоресцентного белка GFP (далее CaPan2-ref).

После оценки уровней синтеза белка HNF4a в полученных культурах методом иммуноблоттинга для дальнейшего исследования были выбраны культуры СаРап2-shHNF4a-l и CaPan2-shHNF4a-3, в которых подавление синтеза HNF4a было наиболее выражено по сравнению с контрольной культурой (Рисунок 9).

Рис. 9. Уровни синтеза белка ЬГЫР4а в клетках СаРап2-^ и СаРап2-511рГЫР4а. Уровни синтеза белка САРЭН использовали для контроля общего количества белка, нанесенного на дорожки.

Эффективность подавления Н№4а была подтверждена методами иммунофлюоресцентного окрашивания и ОТ-ПЦР (Рисунок 10). Оба метода подтвердили значительное снижение уровня экспрессии НЫР4а в выбранных культурах; ОТ-ПЦР анализ показал, что снижается экспрессия всех изоформ группы Н№4аР2, а повышения экспрессии НЫР4ссР1 не происходит.

14

Рис. 10. А. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток культур СаРап2-геГ и СаРап2-вЫ-ГМР4а моноклонапьными антителами РПЧР4аТОТ к НКР4а. Ядра клеток окрашены ЭАР1. Б. Уровни экспрессии изоформ Н№4а в клетках культур СаРап2-геГ и СаРап2-5ЬРПМР4а. Данные по экспрессии РР1А приведены для контроля количества кДНК, взятой в реакцию. Слева указаны названия праймеров, сверху - названия исследованных культур, справа - длины ПЦР-продуктов в п. н.

Изменения экспрессии панкреа-спеиифических генов в клетках СаРап2-5ЬНЫР4а. Для исследования дифференцировочного статуса клеток CaPan2-ref и СаРап2-5Ы-ШР4а мы использовали полуколичественный ОТ-ПЦР анализ. Результаты анализа уровней экспрессии тканеспецифических ТФ и функциональных генов показаны на Рисунке 11.

Рис. 11. Уровни экспрессии регуляторов дифференцировки и функциональных генов ПЖ в клетках СаРап2-геГ и СаРап2-8ЬН№4а. Данные по экспрессии РР1А приведены для контроля количества кДНК, взятой в реакцию. Слева указаны названия праймеров, сверху - названия исследованных культур, справа - длины ПЦР-продуктов в п. н.

Подавление экспрессии НМР4аР2 в клетках СаРап2 сопровождается снижением активности генов, кодирующих ТФ РЭХ1, РТР 1а и РОХА1. При этом уровень экспрессии гена РОХА2 и Н№1А не изменяется. Изменения уровней экспрессии РГЫР1(3 и ОС-2 неоднозначны. Активность гена НМПВ не меняется относительно контроля в СаРап2-81зН№4с1-1, но значительно повышается в СаРап2-зЬННР4а-3. Экспрессия ОС2 падает в культуре СаРап2-5ЬРГЫР4а-1, но незначительно повышается в клетках СаРап2-вИРГОТЧа-З. В обеих исследованных культурах СаРап2 с подавленным синтезом РПЧР4а наблюдается снижение экспрессии а-амилазы-2а, эластазы-2а и гена СОКЫ1А.

Для генов HNF6, HNF4G, CDH1 и CDH2 существенных НИРДа-зависимых различий обнаружено не было, поэтому на Рисунке 11 они не представлены.

Ранее при исследовании клеток Panel и MiaPaCa2 было показано, что повышение уровней синтеза изоформ HNF4a в клетках ПАКПЖ может сопровождаться их частичной редифференцировкой. Наблюдаемое в клетках СаРап2-shHNF4a снижение экспрессии таких важных регуляторов дифференцировки ПЖ, как PDX1, PTFla и FOXA1 подтверждает важную роль HNF4a в регуляции дифференцировки ПЖ. С другой стороны, отсутствие изменений экспрессии FOXA2 и неоднозначные изменения активности генов HNF1B и ОС2 указывают на существование более сложных механизмов регуляции этих генов. В частности, делавшееся ранее предположение о существовании общей НМР4а-зависимой системы регуляции активности PDX1, PTF1A, FOXA2 и ОС2 оказывается под сомнением.

На снижение уровня дифференцировки клеток CaPan2-shHNF4a указывает и подавление в них экспрессии AMY2A и ELA2A. Важнейшее значение имеет снижение активности гена CDKN1A при подавлении HNF4a. Это еще одно свидетельство того, что регуляция экспрессии этого гена - важный механизм влияния HNF4a на фенотип клеток ПАКПЖ; снижение активности такого важного регулятора клеточного цикла, как p21CIP1/WAF1, может сильно повлиять на их злокачественный потенциал.

Таким образом, мшРНК-опосредованное подавление синтеза HNF4a в клетках СаРап2 приводит к их частичной дедифференцировке.

Влияние подавления синтеза HNF4a на биологические свойства клеток СаРап2. Чтобы выявить возможные НЫР4а-зависимые изменения опухолевого фенотипа клеток СаРап2, мы исследовали пролиферативные, клоногенные и миграционные характеристики полученных культур.

• Скорость роста обеих исследованных культур CaPan2-shHNF4a в условиях in vitro достоверно повышена по сравнению с контрольными клетками (Рисунок 12А). При этом в клетках СаРап2 с подавленной экспрессией HNF4a повышена активность ДНК-синтетических процессов, что выражается в повышении доли клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла (Рисунок 12Б).

2,5

2,0

-«-CaPan2-ref -*-CaPan2-shHNF4a-1 ***

CaPan2-shHNF4a-3 ***

I X

***

V"—'=-1-T-1-1-1

12 3 4

Время культивации, сут.

Б ? 0,50 -

a

to 0,40 -

2

X Ф 0,30 -

tt

2 0,20 -

О

ь ф 0,10 -

§

D; с 0,00 -

CI

0,4 0

0,39

СаРап2-shHNF4a-3

Рис. 12. А. Кинетика роста клеток CаPаn2-ref и СаРап2-зЫ-ГЫР4а. Данные нормированы относительно начального количества клеток. *** - р<0,001 (1-тест). Б. Включение 5-Вг<Ш в ДНК клеток СаРагй-ге!'!! СаРап2-зЬНМР4а. *** -р<0,001 (и-тестМанна-Уитни).

По всей видимости, наблюдаемое ускорение роста культур СаРап2-8ЬН№4а вызвано усилением пролиферации клеток. Эти наблюдения согласуются со снижением в клетках СаРап2-8ЬНМР4а экспрессии р21С1р|ЛУДР1, ингибирующего циклин-зависимые киназы и останавливающего клеточный цикл на стадии в). Стоит отметить, что в

клетках СаРап2, в отличие от М1аРаСа2, изменения экспрессии Н1МР4а и СБШ1А влияют на интенсивность синтеза ДНК. Таким образом, Н№4а в клетках СаРап2 выполняет ярко выраженную антипролиферативную функцию; такое действие Н№4а описано в литературе для клеток печени, кишечника и почки.

• Колониеобразующая способность клеток СаРап2 значительно повышается при подавлении в них синтеза Н№4а (Рисунок 13). Одним из объяснений такого увеличения клоногенного потенциала может быть описанное выше усиление пролиферативной активности клеток СаРап2-зЬНЫР4а.

Рис. 13. Среднее количество колоний, формируемых клетками культур СаРап2-геГ и СаРап2-8Ш№4а. *** -р<0,001 К-тест).

CaPan2-shHNF4a-3

• Культуры СаРап2-зЬНЫР4а достоверно отличаются от клеток СаРап2-геГ повышенной способностью к направленной миграции (Рисунок 14).

Ш л 5 о о со

= 5

2500 2000 1500 1000 500 0

1664,9 ***

1663,0

1032,7 h L

га 1 г 1 1

1 □

_ _ _ _ _ _ _ -

Рис. 14. Среднее количество клеток культур СаРап2-ге1 и СаРап2-511НЫР4а, мигрировавших сквозь мембрану в камере Бойдена. ** - р<0,01, *** - р<0,001 (Ц-тест Манна-Уитни).

CaPan2-ref СаРап2- СаРап2-shHNF4a-1 shHNF4a-3

Наблюдаемое повышение миграционного потенциала клеток СаРап2 при подавлении HNF4a соответствует общей тенденции к их дедифференцировке и усилению злокачественного потенциала. Однако этот результат не согласуется с описанным ранее в клетках Panel и MiaPaCa2 эффектом усиления миграции при повышении экспрессии HNF4a. Однонаправленное действие противоположных изменений HNF4a является серьезным доводом в пользу того, что НОТ4а-зависимая регуляция миграции происходит не напрямую, а опосредуется более сложными механизмами и зависит от так называемого «клеточного контекста» (экспрессии генов, дифференцировочного статуса и других свойств конкретных клеток).

Суммируя полученные результаты, можно сказать, что подавление синтеза Н№4а в высокодифференцированной клеточной культуре ПАКПЖ вызывает снижение уровня их дифференцировки, усиление пролиферативной активности, способности к колониеобразованию и миграции. Другими словами, мшРНК-опосредованное подавление синтеза Н№4а в клетках СаРап2 сопровождается усилением их злокачественных характеристик, что указывает на его опухоле-супрессорную роль в протоковых клетках ПЖ.

17

3. Влияние подавления экспрессии НОТ4а на злокачественный потенциал умереннодифференцированных клеток ПАКПЖ АбРС1.

Получение культур клеток АзРС1 с подавленной экспрессией фактора НЫР4а. Культуры клеток А5РС1-5ЬНЫР4а, в которых был подавлен синтез НЫР4а, и контрольных клеток АзРС1-геР получали аналогично описанным выше культурам СаРап2. Для анализа эффективности мшРНК-опосредованного подавления Н№4а использовали метод иммуноблоттинга (Рисунок 15). Для дальнейших исследований были выбраны культуры А5РС1-8ЬНКР4а-2 и А5РС1-5ЬН№4а-3, характеризующиеся наиболее низкими уровнями синтеза РЮТ4а.

Л' г"4'л?' СК' г* ^

<?° о,оЧ^ <?Чь? оЧоЧ

Л4 ф Ф Ф

УО <0

вАРОН —<яшя» я^шт » 11

Рис. 15. Уровни синтеза белка РГЫР4а в клетках культур АэРСЛ-геР и АэРС!-вЫ-ГЫР4а. Уровни синтеза белка ОАРОН использовали для контроля общего количества белка, нанесенного на дорожки.

Эти результаты были подтверждены при анализе уровней экспрессии Н№4а и его изоформ в выбранных культурах методами иммунофлюоресцентного окрашивания и полуколичественного ОТ-ПЦР (Рисунок 16). Согласно ОТ-ПЦР анализу, мшРНК сильнее подавляют экспрессию изоформ группы Н1ЧР4аР2, чем Н№4аР1. Анализ экспрессии групп изоформ, содержащих специфические вставки (праймеры НЫР4А2 и НМР4АЗ) показал, что подавление экспрессии Н№4а происходит в основном за счет изоформ, содержащих 30-нуклеотидную вставку на З'-конце молекулы (РГЫР4а2 и а8).

Рис. 16. А. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток культур АэРО-геР и А5РС1-зЬН№4а моноклональными антителами НКР4аТОТ к РГЫР4а. Ядра клеток окрашены ОАР1. Б. Уровни экспрессии изоформ РПЧР4а в клетках культур АБРС1-геГ и А5РС1-з11Н1МР4а. Данные по экспрессии РР1А приведены для контроля количества кДНК, взятой в реакцию. Слева указаны названия праймеров, сверху - названия исследованных культур, справа - длины ПЦР-продуктов в п. н.

Изменения экспрессии панкреа-спеиифических генов в клетках А$РС1-$ЪНЫР4а. Влияние подавления синтеза Н№4а на уровень дифференцировки и экспрессию функциональных генов в клетках АвРС! исследовали методом ОТ-ПЦР (Рисунок 17).

Рис. 17. Уровни экспрессии регуляторов дифференцировки и функциональных генов ПЖ в клетках АвРО-геГ и А5РС1-5|1Н№4а.. Данные по экспрессии РР1А приведены для контроля количества кДНК, взятой в реакцию. Слева указаны названия праймеров, сверху - названия исследованных культур, справа - длины ПЦР-продуктов в п. н.

В отличие от ранее исследованных культур, в клетках AsPCl влияние изменения синтеза HNF4a на экспрессию тканеспецифических ТФ выражено значительно слабее. Так, в обеих исследованных культурах AsPCl-shHNF4a не выявлено значимых изменений экспрессии PDX1, PTFla, HNFlp и FOXA1 по сравнению с контрольными клетками. Транскрипция генов HNF1A и HNF4G при подавлении HNF4a снизилась пропорционально уровню экспрессии HNF4a. Изменения экспрессии факторов ОС-2 и FOXA2 не имеют четкой корреляции с уровнями экспрессии HNF4a: экспрессия ОС-2 усиливается в обеих культурах AsPCl-shHNF4a; уровень транскрипции FOXA2 значительно снижен в клетках AsPC 1 -shHNF4a-2 и повышен в AsPCl-shHNF4a-3. Как и в других исследованных культурах, в AsPCl-ref и AsPCl-shHNF4a не детектируется экспрессия HNF6.

Линия AsPCl - единственная из исследованных, в которой изменения экспрессии HNF4a оказывают выраженный эффект на экспрессию кадхеринов. В клетках AsPCl с подавленным синтезом HNF4a наблюдается снижение экспрессии гена CDH1 (Е-кадхерин) и активация гена CDH2 (N-кадхерин). Кроме того, подавление HNF4a приводит к значительной индукции экспрессии а-амилазы-2а и P21C,P1/WAFI. Активации гена ELA2A нами обнаружено не было.

Отсутствие корреляции между уровнями экспрессии HNF4a и генов PDX1, PTF1A и FOXA1 — одно из ключевых отличий клеток AsPCl от исследованных ранее линий, которое подтверждает гипотезу о том, что их ЬПЧР4а-зависимая регуляция осуществляется непрямыми механизмами. Так, экспрессия HNF1A, который является прямой мишенью HNF4a, четко коррелирует с экспрессией HNF4a. Как и в клетках СаРап2, в клетках AsPCl не наблюдается согласованного изменения экспрессии PDX1, PTFla, FOXA2 и ОС-2, описанного в клетках Panel и MiaPaCa2, что делает гипотезу о единой схеме их регуляции несостоятельной.

Изменения экспрессии функциональных генов в клетках AsPCl-shHNF4a

достаточно противоречивы. С одной стороны, подавление синтеза HNF4a приводит к ослаблению экспрессии Е-кадхерина и индуцирует экспрессию N-кадхерина, что характерно для эпителиально-мезенхимального перехода. С другой стороны, активация в этих же клетках гена AMY2A указывает на повышение уровня их дифференцировки, а усиление экспрессии CDKN1A может сопровождаться замедлением пролиферации, то есть ослаблением злокачественности. При этом индукция экспрессии р21CIP1/WAFI сама п0 cege является неожиданным результатом, так как ген CDKN1A может напрямую активироваться HNF4a, и в проведенных ранее экспериментах его активность прямо коррелировала с уровнями синтеза HNF4a.

Таким образом, мшРНК-опосредованное подавление синтеза HNF4a в клетках AsPCl сопровождается неоднозначными изменениями экспрессии панкреа-специфических генов, что не позволяет сделать четкого вывода относительно его влияния на дифференцировочный статус культур AsPCl-shHNF4a.

Влияние подавления синтеза HNF4a на биологические свойства клеток AsPCl. Так как анализ экспрессии тканеспецифических генов в исследуемых культурах AsPCl не смог дать однозначной информации о направлении изменения их дифференцировки, исследование влияния подавления HNF4a на их биологические характеристики представляло особый интерес. Используя тот же набор функциональных тестов, что и для других исследованных культур, мы проанализировали злокачественный потенциал клеток AsPCl-ref, AsPCl-shHNF4a-2 и AsPCl-shHNF4a-3.

• Снижение уровней синтеза HNF4a в клетках AsPCl привело к резкому замедлению их роста в условиях in vitro и значительному снижению доли клеток, активно синтезирующих ДНК и включающих в нее 5-BrdU (Рисунок 18). Этот результат прямо противоположен как полученным в ходе данной работы, так и литературным данным об антипролиферативном действии HNF4a. С другой стороны, наблюдаемые изменения согласуются с повышением в клетках AsPCl-shHNF4a экспрессии ингибитора пролиферации p21up"WAH.

Время культивации, сут. shHNF4a-2 shHNF4a-3

Рис. 18. А. Кинетика роста клеток АэРО-геГ и АзРС1-511НКР4а. Данные нормированы относительно начального количества клеток. *** - р<0,001 (1-тест). Б. Включение 5-ВгсШ в ДНК клеток АэРСЛ-геГи АзРС1-511Н№4а. * - р<0,05 (11-тест Манна-Уитни).

• Способность клеток АзРС1-зЬНЫР4а к формированию колоний в условиях высокого разведения достоверно снижена по сравнению с контрольной культурой (Рисунок 19). Вероятно, это связано с понижением их пролиферативной активности.

г во -i

I 38,4

а 50 "

I 40- ^^^

30- Н

ВрГЯ

0 20 -

10- I 1 I

1 о- Я , ■

38,4

Рис. 19. Среднее количество колоний, формируемых клетками культур АэРО-геГ и АзРС1-5ЬН№4а. *** -р<0,001 (М-ест).

AsPC1-ref AsPC1- AsPC1-

AsPC1-

вИН^а-г 8ИНЫР4а-3

• Клетки культур АвРС! с подавлением Н№4а отличаются от АвРСМ-геР ярко выраженным повышением способности к миграции в камере Бойдена (Рисунок 20).

Это изменение резко контрастирует с наблюдающимся в этих клетках ослаблением пролиферативного и клоногенного потенциала. При этом значительно более эффективное подавление синтеза HNF4a в клетках СаРап2 сопровождается намного более слабым повышением миграционной способности. В клетках Panel и MiaPaCa2 к усилению миграции приводит повышение, а не понижение экспрессии HNF4a. Таким образом, механизмы влияния HNF4a на миграционный потенциал клеток ПАКПЖ требуют дальнейшего изучения. Одним из таких механизмов может являться регуляция гена CDKN1A, так как одной из его функций является регуляция перестройки цитоскелета, что может влиять на подвижность и миграцию клеток.

Эффекты, вызываемые подавлением синтеза HNF4a в умереннодифференцированных клетках ПАКПЖ AsPCl, не позволяют сделать однозначного вывода о роли HNF4a в этой модельной системе. С одной стороны, клетки AsPCl-shHNF4a обладают пониженным пролиферативным и клоногенным потенциалом, в них повышена экспрессия генов CDKN1A, AMY2A и ОС2, что указывает на ослабление злокачественности. С другой стороны, в них наблюдается падение экспрессии HNFla и Е-кадхерина, резкое повышение способности к направленной миграции. Таким образом, в умереннодифференцированных клетках ПАКПЖ HNF4a может проявлять функции как онкосупрессора, так и онкогена.

Рис. 20. Среднее количество клеток культур AsPCl-ref и АвРСI-вЫЛ^П-Ча, мигрировавших сквозь мембрану в камере Бойдена. * - р<0,05 (и-тест Манна-Уитни).

5. Изменения экспрессии НОТ4а и других тканеспецифических генов в клинических образцах ПАКПЖ человека.

Изменения экспрессии изоформ НЫР4а в клинических образцах ПАКПЖ. С использованием метода количественного ОТ-ПЦР в реальном времени была проанализирована 21 пара образцов ткани ПАКПЖ человека и прилежащей неопухолевой ткани ПЖ тех же пациентов. Были исследованы общий уровень экспрессии Н№4(х и уровни экспрессии групп изоформ НЫР4аР1 и Н1ЧР4аР2. В качестве внутреннего контроля количества кДНК в реакционной смеси был использован ген РР1А. Результаты проведенного анализа обобщены на Рис. 21.

<

О. 1,6

О.

£ 1,4

О О 1,2

Ш О. 1 1,0

о о 0,8

о Л о 0,6

о X л 0,4

о о. ф 1- 0,2

X о 0,0

X

о

х х

0,30

0,25 и и

о X 0,20

| § 0,15 о о

л о о,10 0) л § 5 0,05

* 5 о,оо

НЫР4АР1

о и

* я

о о

* §

0) Л

Ш С

О 0)

о- Ь

1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

НЫР4АР2

Рис. 21. Уровни экспрессии НЫР4АТОТ, НЫР4АР1 и ШР4АР2 в образцах ткани ПАКПЖ и неопухолевой ткани тех же пациентов. Указаны медианы, нижние и верхние квартили, минимальные и максимальные значения. ОП - опухолевая ткань, ПТ - прилежащая неопухолевая ткань. * * - р<0,01, * * * - р<0,001 (парный |-тест для связанных выборок).

Для ткани ПАКПЖ характерно значительное снижение суммарного уровня экспрессии НЫР4а и уровня экспрессии изоформ группы НЫР4аР2 по сравнению с неопухолевой тканью ПЖ. В то же время в образцах опухолей происходит достоверное усиление экспрессии изоформ группы НЫР4аР1. Более детально эти изменения приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Изменения уровней экспрессии групп изоформ Н№4а в образцах ПАКПЖ по сравнению с образцами неопухолевой ткани тех же пациентов.

группа изоформ понижение Повышение нет изменений

НЫР4А ТОТ 67% 10% 23%

НЫГ4АР1 10% 62% 28%

НЫР4АР2 71% 10% 19%

Таким образом, основным типом нарушения экспрессии Н№4а в образцах ПАКПЖ является подавление экспрессии изоформ группы Н№4аР2; гиперэкспрессия изоформ этой группы наблюдается очень редко. В то же время в ткани ПАКПЖ с часто наблюдается гиперэкспрессия изоформ группы НЫР4аР1, почти не экспрессирующихся в нормальных клетках ПЖ. По всей видимости, как подавление экспрессии изоформ РШР4аР2, так и активация Н1МР4аР1 могут служить важными механизмами прогрессии ПАКПЖ. При этом уровень экспрессии РГЫР4аР1 остается значительно ниже, чем Н1МР4аР2, его изменения почти не влияют на суммарный уровень экспрессии НЫР4аТОТ.

Исследование корреляций между экспрессией HNF4a и панкреа-спеиифических генов в панели клинических образиов ПАКПЖ. На последнем этапе работы было проверено, насколько описанные в клеточных культурах НЫР4а-зависимые изменения экспрессии

22

панкреа-специфических генов соответствуют наблюдающимся в клинических образцах ПАКПЖ. Для этого уровни экспрессии групп изоформ НЫР4а и тканеспецифических генов были проанализированы методом полуколичественного ОТ-ПЦР на описанной выше панели из 21 пары клинических образцов и образце условно нормальной ткани ПЖ. На Рисунке 22 приведены результаты анализа нескольких образцов, наиболее точно отражающие результаты, полученные при анализе всей панели. Данные о том, насколько уровни экспрессии исследованных генов коррелируют с уровнями экспрессии НЫР4а, отражены в Таблице 2.

Таблица 2. Доли образцов, в которых наблюдаются корреляции между экспрессией изоформ Н№4сс и других панкреа-специфических генов.

Исследуемый ген HNFIA HNF1B FOX А 2 PDX1 HNF6 AMY2A ELA2A ОС2 FOXA1 CDKN1A

Доля образцов, в которых наблюдается корреляция 81% 100% 90% 85% 81% 76% 76% 43% 24% 38%

Уровни экспрессии генов HNF1B, FOXA2, PDX1, HNF6, AMY2A и ELA2A преимущественно коррелируют с уровнями экспрессии изоформ группы HNF4aP2. В случае HNFla наблюдаются более сложные закономерности. В тех образцах, в которых не наблюдается гиперэкспрессии HNF4aPl, изменения HNFla совпадают с изменениями HNF4aP2; однако повышение экспрессии HNF4aPl сопровождается значительной индукцией гена HNF1A, в результате чего на фоне снижения экспрессии HNF4aP2 и HNF4aTOT экспрессия HNFla не меняется или увеличивается.

1 2 5 7 8 12_ 14 20 18

УН пт оп пт оп пт оп пт оп пт оп п

PPIA

HNF4aTOT HNF4aP1 HNF4aP2 HNF1A HNF1B FOX А 2 PDX1 HNF6 AMY2A ELA2A OC2 FOXA1 CDKN1A

Рис. 22. ОТ-ПЦР анализ экспрессии панкреа-специфических регуляторов дифференцировки и функциональных генов в клинических образцах ПАКПЖ человека. Данные по экспрессии PPIA приведены для контроля количества кДНК, взятой в реакцию. Слева указаны названия генов, сверху - номера пар образцов, справа - длины ПЦР-продуктов в п. н. УН - условно нормальная ткань ПЖ, ОП - опухолевая ткань, ПТ - прилежащая неопухолевая ткань.

Результаты, полученные при исследовании клинических образцов ПАКПЖ, подтверждают описанные в клеточных линиях корреляции между уровнями

23

| 164

I 273

279 | 201

I 187 218 I 195 I 314

экспрессии HNF4a и генов PDX1, HNF1A, HNF1B, FOXA2, AMY2A и ELA2A. Более того, экспрессия HNF4a коррелирует с экспрессией фактора HNF6 - критического регулятора дифференцировки протоковых клеток. По всей видимости, изоформы HNF4aP2 играют более важную роль в регуляции активности генов; высокая степень корреляции с HNF4aPl отмечена только для HNFla —его прямой мишени.

Несмотря на то, что ранее нами были описаны НЫР4а-зависимые изменения экспрессии генов FOXA1, ОС2 и CDKN1A, анализ клинических образцов не выявил существенных корреляций между уровнями экспрессии этих генов и HNF4a. Вероятно, HNF4a может быть лишь одним из множественных компонентов регуляции экспрессии этих генов и не играет решающей роли в их активации. В особенности это касается p21CIP1AVAF1 - одного из важнейших регуляторных белков клетки, экспрессия которого контролируется множеством сигнальных путей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе исследована возможная роль нарушения экспрессии ядерного рецептора FTNF4a в прогрессии ПАКПЖ человека. В качестве модельной системы были использованы 4 клеточных линии ПАКПЖ, различающиеся уровнем дифференцировки и спектрами экспрессии изоформ FINF4a. В клетках Panel и MiaPaCa2, обладающих низким уровнем дифференцировки, были экзогенно экспрессированы изоформы HNF4al и HNF4a7; в высокодифференцированных клетках СаРап2 и умереннодифференцированных AsPCl экспрессия HNF4a была подавлена с помощью мшРНК.

Экзогенная экспрессия изоформ HNF4a в культурах Panel и MiaPaCa2 вызвала их частичную редифференцировку, что выразилось в индукции экспрессии генов, кодирующих регуляторы дифференцировки ПЖ (HNF4a, PDX1, PTFla, FINFla, HNFip, FOXA1, FOXA2, OC-2) и белок а-амилазу-2а. Способность HNF4a-экспрессирующих клеток Panel и MiaPaCa2 к формированию колоний значительно понизилась, а к направленной миграции - возросла по сравнению с контрольными культурами. Кроме того, в клетках MiaPaCa2 повышение экспрессии FINF4a привело к замедлению их роста и активации экспрессии p21CIP1 WAF1. Такое сочетание биологических свойств клеток и спектров экспрессии тканеспецифических ТФ (особенно одновременная экспрессия PDX1 и PTFla) характерно для панкреатических клеток-предшественников, находящихся на стадии частичной дифференцировки. Поэтому изменения, наблюдаемые в исследованных культурах Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a, можно рассматривать как ослабление злокачественных свойств и частичную реверсию их опухолевого фенотипа.

Подавление синтеза HNF4a в клетках СаРап2 с помощью мшРНК привело к снижению уровня их дифференцировки (падение экспрессии генов PDX1, PTF1A, FOXA1, AMY2A и ELA2A) и подавлению активности гена CDKN1A. Эти изменения сопровождались усилением пролиферативной, клоногенной и миграционной активности клеток CaPan2-shHNF4a. Такие изменения наблюдаются при опухолевой прогрессии и свидетельствуют о том, что подавление синтеза HNF4a в клетках СаРап2 привело к усилению их злокачественного потенциала. Суммируя вышеприведенные факты, можно сделать вывод, что HNF4a в клетках ПАКПЖ способен выполнять функции опухолевого супрессора, а его инактивация способствует прогрессии ПАКПЖ.

В клетках AsPCl, в отличие от других исследованных линий, подавление

синтеза изначально гиперэкспрессированного HNF4a вызвало неоднозначные изменения экспрессии регуляторов дифференцировки и функциональных генов ПЖ, которые могут указывать как на повышение уровня дифференцировки, так и на ослабление эпителиальных свойств. Более того, снижение уровня синтеза HNF4a сопровождалось ярко выраженным замедлением роста исследованных клеток и ослаблением их колониеобразующей способности; этот эффект прямо противоположен описанным ранее. При этом еще одним отличием клеток AsPCl-shHNF4a от контрольной культуры стало значительное усиление их способности к направленной миграции. Таким образом, подавление HNF4a в клетках AsPCl привело к усилению одних и ослаблению других злокачественных свойств. Возможно, в зависимости от уровня экспрессии, HNF4a в ПАКПЖ может выполнять как противо-, так и проопухолевую функцию.

Выявленная в ходе исследования клеточных культур связь экспрессии HNF4a с прогрессией ПАКПЖ и дифференцировочным статусом клеток была подтверждена на панели клинических образцов ПАКПЖ человека. В большинстве исследованных образцов наблюдается нарушение экспрессии групп изоформ HNF4a: активация экспрессии изоформ группы HNF4aPl, подавление экспрессии изоформ группы HNF4aP2, изредка - гиперэкспрессия всех изоформ HNF4a. Уровни экспрессии генов PDX1, HNF1A, HNF1B, FOXA2 и HNF6 коррелируют с уровнями экспрессии HNF4a, причем характер корреляции согласуется с закономерностями, описанными ранее в клеточных культурах ПАКПЖ.

Итак, фактор HNF4a является важным регулятором экспрессии генов, дифференцировки и злокачественного потенциала клеток ПАКПЖ и в большинстве модельных систем выполняет функции опухолевого супрессора. В то же время FTNF4a, гиперэкспрессированный в опухоли по сравнению с нормальной тканью ПЖ, может обладать рядом проонкогенных функций. Нарушения экспрессии его изоформ могут иметь большое значение в прогрессии этой опухоли, что делает его перспективной мишенью для дальнейших исследований, направленных на идентификацию механизмов развития ПАКПЖ.

ВЫВОДЫ

1. Нарушение экспрессии ядерного рецептора HNF4a является частым событием при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы человека. Впервые описана его опухоле-супрессорная функция в клетках ПАКПЖ.

2. Экзогенная экспрессия двух групп изоформ HNF4aPl и HNF4aP2 в культурах низкодифференцированных клеток ПАКПЖ человека Panel и MiaPaCa2 приводит к их частичной редифференцировке, выражающейся в активации экспрессии ключевых регуляторов дифференцировки панкреатических клеток PDX1, PTFla, FOXA1, FOXA2 и ОС-2, а также индукции синтеза панкреатической а-амилазы-2а.

3. Восстановление функции HNF4a в дедифференцированных культурах клеток ПАКПЖ человека Panel и MiaPaCa2 замедляет скорость роста этих культур и ослабляет их колониеобразующую активность, одновременно повышая способность к направленной миграции.

4. Подавление экспрессии HNF4a в высокодифференцированной культуре ПАКПЖ человека СаРап2 приводит к частичной дедифференцировке клеток и

повышению их злокачественного потенциала, выражающемуся в ускорении роста клеток, усилении их колониеобразующей и миграционной активности.

5. При подавлении экспрессии HNF4a в умеренно-дифференцированных клетках ПАКПЖ человека AsPCl значительно снижаются скорость роста и колониеобразующий потенциал клеток, в то время как миграционная способность резко возрастает.

6. Нарушение экспрессии HNF4a и связанного с ним блока панкреа-специфических генов являются частым событием в клинических образцах ПАКПЖ человека. Дерегуляция HNF4a может выражаться как в активации экспрессии нехарактерных для ПЖ изоформ группы HNF4aPl, так и в подавлении экспрессии изоформ группы HNF4aP2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В ЖУРНАЛАХ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК РФ

1. Чесноков, М. С. Частичная редифференцировка и понижение выраженности черт злокачественного фенотипа клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека при экспрессии ядерного рецептора HNF4a / М. С. Чесноков, И. Ф. Кустова, Д. А. Шавочкина, А. Г. Кузнецова, Н. Л. Лазаревич // Российский Биотерапевтический Журнал. — 2012. — Т. 11. —№ 3. — С. 17-23.

2. Чесноков, М. С. Молекулярные биомаркеры протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и возможности их использования в клинической практике / М. С. Чесноков, Д. А. Шавочкина, А. Д. Горев, Н. Л. Лазаревич // Молекулярная Медицина. — 2013. — №6. — С. 21-26.

ДРУГИЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Chesnokov, М. S. Exogenous expression of HNF4a nuclear receptor in dedifferentiated cell lines of human pancreatic ductal adenocarcinoma / M. S. Chesnokov, D. A. Shavochkina, I. F. Kustova, A. G. Kuznetzova, N. L. Lazarevich // FEBS Advanced Lecture Course «Spetses Summer School on Nuclear Receptor Signalling in Physiology and Disease». — 2011. — Island of Spetses, Greece. — August 28 - September 2. — C. 9.

2. Чесноков, M. С. Влияние экзогенной экспрессии ядерного рецептора HNF4a на свойства клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека / М. С. Чесноков, Д. А. Шавочкина, И. Ф. Кустова, А. Г. Кузнецова, Н. Л. Лазаревич // Тезисы докладов и сообщений, представленных на I Всероссийскую конференцию «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет». Цитология. —2012, —Т. 54, —№ 1, —С. 99-100.

3. Чесноков, М. С. Влияние экзогенной экспрессии ядерного рецептора HNF4a на свойства клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека / М. С. Чесноков // Сборник научных трудов конференции молодых ученых ФГБУ «НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова» Минздрава России. — Санкт-Петербург : Изд-во «Ладога», 2012. — стр. 109-113.

4. Chesnokov, М. Effects of nuclear receptor HNF4a repression in human pancreatic ductal adenocarcinoma cells / M. Chesnokov, A. Gorev, N. Lazarevich // 38th FEBS Congress. The FEBS Journal. — 2013. — T. 280. — Suppl. 1. — C. 388.

Заказ № 79-А/04/2014 Подписано в печать 23.04.14 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru