Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Диагностика цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ) у реципиентов после аллотрансплантации органов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

¡^ч

СГ.

^МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ^-НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ 3 И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

со СЧ1

На правах рукописи УДК: 616-089. 843

Ведяков Анатолий Михайлович

ДИАГНОСТИКА ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ (ЦМВ) У РЕЦИПИЕНТОВ ПОСЛЕ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ ОРГАНОВ МЕТОДОМ ПОЛИМЕР АЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)

14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в Научно-Исследовательском Институте Трансплантологии и Искусственных Органов Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

кандидат биологических наук М.С. Долгих Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор H.A. Томилина Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Р.Я Войяокова

доктор биологических наук А.А Кущ

Ведущее учреждение:

НИИ физико-химической медицины МЗ РФ

Защита диссертации состоится "_" _ 1997 г. в 14 часов

на заседании Диссертационного Совета Д.074.34.01 при НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, д. 1.

Автореферат разослан "_" _1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Е.А. Селезнева

Актуальность исследования

Цитомегаловирусная (ЦМВ) инфекция остается одной из причип заболеваемости и смертности реципиентов после оллотралсплантации органов. ЦМВ-ипфекция встречается у 44% - 85% реципиентов после пересадки органов и костного мозга. Симптоматическая ЦМВ-инфекция среди реципиентов после пересадки почки, печени, сердца и комплекса сердце-легкие встречается с частотой 8, 29, 25 и 39% соответственно. ЦМВ- пневмония в перечисленных группах пациентов встречается с частотой 2%, 3%, 8%, и 32%. Летальность от ЦМВ-пневмонии составляет 48% для реципиентов почки и 75% - для реципиентов сердца и комплекса сердце-легкие (Но М. 1994). Имеются сведения относительно ассоциации цитомегаловирусной инфекции с эпизодами отторжения трансплантата (Gorfll S. and Helderman J.H. 1994; Lewis R.M. et al., 1988; Choi S.J.N. et al., 1996). Цигомегаловирус оказывает

иммуносупресеивное воздействие па организм больного, что увеличивает риск развития оппортунистических инфекций (Paya C.V. 1994).

На сегодняшний день нет абсолютно надежных средств профилактики развития симптоматической ЦМВ-инфекции (Мойеюк Я.Г. и др., 1996). Даже при профилактике гаицикловиром, ацикловиром и ЦМВ гипериммунным глобулином частота развития ЦМВ-болезпи у больных после аллотрансплаптации органов остается высокой (Martin M. 1996). Остается открытым вопрос относительно момента начала и оптимальной продолжительности профилактики и терапии (Iberer F. et al .,1996 ).

До сих пор диагностика ЦМВ-инфекции осуществлялась общепринятыми вирусологическими и серологическими методами. Одпако, данные методы диагностики имеют ряд существенных недостатков. Вирусологический метод является длительным (10 дней и более) и имеет низкую чувствительность (Landini М.Р. 1993). Серологическая диагностика затруднена из-за высокого уровня икфицированности населения (Choen J. et al.,1985; Pass R.K. and Stango S. 1988; Wolff С. at al., 1996) и трудности интерпретации результатов серологических методов у реципиентов после трансплантации вследствие неадекватного иммунного ответа, а также вследствие профилактического назначения ЦМВ гипериммунного глобулина (Landini М.Р 1993; Schmidt С. et al., 1995). У пациентов после трансплантации продукция ЦМВ-

специфических иммуноглобулинов IgM класса наблюдается при первичной ипфекции, реинфекции и реактивации ЦМВ-инфекции без клинических проявлений (Landini М-Р. 1993).

В последние годы, преимущественно в зарубежной литературе, опубликовано много работ по использованию полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики ЦМВ-инфекции у больных с аллогрансплантатами органов. Показаны преимущества метода ПЦР перед другими методами диагностики ЦМВ-инфекции (Gerna G. et al., 1991; Kuhn J.E. et al., 1994; Schmidt C. et al.,1995; Peins J.S.M. et al., 1995; Abecassis M.M. et al., 1997).

ПЦР - это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно размножить определенную

специфичную последовательность генома возбудителя (ДНК или РНК) в

g

количестве, превышающем исходное в 10 раз и более. Таким образом, возбудитель можно обнаружить, имея всего несколько копий его генома в исходном материале.

Предпосылкой для нашей работы послужила необходимость внедрения в клиническую практику современного метода (ПЦР) диагностики ЦМВ-инфекции.

Цель работы

Цель настоящей работы - оценка возможностей метода полимеразной цепной реакции для диагностики цитомегаловирусной инфекции у реципиентов после аллотрапеплантации органов и внедрение метода в повседневную клиническую практику.

Задачи исследования

1. Отработать оптимальный протокол полимеразной цепной реакции для выявления ДНК ЦМВ и оцепить возможности метода для диагностики ЦМВ-инфекции у здоровых доноров, пациентов на гемодиализном лечении и больных с аллотрансплантатами органов.

2,Оценить диагностическую и прогностическую ценность метода полимеразной цепной реакции в отношении ЦМВ-болезни и возможности метода для контроля за эффективностью противовирусной терапии.

3.Оценить возможность использования различного биологического материала в качестве образца для ПЦР.

-1.Сравнить ПЦР с другими методами диагностики ЦМВ инфекции.

Научная новизна

Впервые в отечественной трансплантологии на клиническом материале проведена работа по оценке возможностей ПЦР для диагностики ЦМВ инфекции у реципиентов после аллотрансплантации органов.

Практическое значение работы

Внедрен в повседневную практику ПИИТ и ИО современный метод для диагностики ЦМВ-инфскции - полимеразная цепная реакция. Показаны возможности ПЦР для диагностики активной и латентной ЦМВ-инфекции. Изучено диагностическое и прогпостическое значение детекции ДНК ЦМВ в лейкоцитах периферической крови и плазме в отношении симптоматической ЦМВ-инфекции. Показано значение метода ПЦР для контроля за эффективностью противовирусной терапии. Проведено сравнение диагностической и прогностической ценности определения ДНК ЦМВ методом ПЦР с определением ЦМВ-специфических антител 1ёМ и класса методом ИФА. Проведено

сравнение метода ПЦР с кульгуральным методом определения цитомегаловируспых антигенов р72 и рр65 с использованием моноклональных антител.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования нашли клиническое применение в НИИТ и ИО, в Московском нефрологическом центре и в 7-ой городской больнице.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на V Международной конференции по проблемам цитомегаловирусной инфекции (Стокгольм, Швеция 1995 г.), на IX Международном симпозиуме по инфекциям у иммуиодефицитных "хозяев" (Ассизи, Италия 1996 г.), на 6 Международном семинаре по цитомегаловирусу (Алабама, США, 1997 г.), на 8 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Лозанна, Швейцария1997 г.), на семинаре "Современные методы диагностики ЦМВ-ивфекции"(НЙИТ и ИО, Москва, март 1996 г.), на заседании общества трансплантологов Москвы и Московской области (Май 1997 г.).

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов я методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Объем работы

составляет ..... страниц машинописного текста. Полученные результаты

иллюстрированы 7 таблицами и 14 рисунками. Список литературы состоит из.....источников.

Содержание работы

Общая характеристика материалов и методов исследования

Характеристика больных

В работе представлены клинические наблюдения и исследования, выполненные в НИИТ и ИО МЗ РФ , Московском лефрологическом центре и в 7 городской больнице с декабря 1994 года по май 1997 года.

Для решения поставленных задач нами было обследовано240 пациентов (710 образцов крови): 199 больных с аллотрансплантатом почки (650 образцов крови), 6 больных после ортотопической трансплантации сердца (15 образцов крови), 35 пациентов, находящихся на программном гемодиализе (45 образцов крови). Средний возраст пациентов 39 лет (от 14 до 60 лег). Для большинства трансплантационных пациентов обследования приходились в первые 4 месяца после трансплантации. В качестве контрольной группы были исследованы 67 здоровых допоров крови.

Большинство больных после трансплантации органов получали трехкомпопентную иммупосупресеивную терапию:

1. Циклоспорин (СуА) в дозе 2-4 мг/кг, в соответствии с концентрацией в крови 150-200 нг/мл в течение первых 3-х месяцев после операции (при трансплантации сердца 200 -400 нг/мл в течение 6 месяцев), с последующим постепенным снижением дозы препарата.

49 пациентов после трансплантации почки и 6 пациентов после трансплантации сердца получали СуА в комбинации с низоралом (кетоконазолом) в дозе 100 - 200 мг/сутки.

2. Азатиоприн в дозе 1.5 - 2 мг/кг веса с постепенным снижением дозы до 0.5 мг/кг веса к 6 неделе после трансплантации.

3. Преднизолоп в дозе 0.8 мг/кг веса со снижением ее до 0.5 мг/кг веса к концу первого месяца.

77 пациентов в качестве четвертого компонента иммуносупрессивной терапии в раннем послеоперационном периоде получали антилимфоцитарный глобулин (АЛГ, АТГ, ОКТЗ).

Диагностика ЦМВ-инфекции

Латентную ЦМВ-инфекцию определяли по наличию у пациента низких уровней ЦМВ-специфических антител IgG класса в отсутствие антител IgM класса, без роста уровней в двух соседних определениях.

Активную ЦМВ-икфекцию определяли по наличию

цитомегаловирусной ДНК в лейкоцитах периферической крови, а также по появлению анти-CMV IgM, либо по 4 х-кратиому и более подъему титра антя-ЦМВ IgG, по сравнению со средним титром (van den Berg 1989).

ЦМВ-болезнь определяли по наличию у пациента лабораторных признаков активной ЦМВ-инфекции в сочетании с лихорадкой > 38® более 3-х дней и с одним или несколькими из следующих наиболее характерных клинических признаков: пневмония, острая патология со стороны желудочно-кишечного тракта, гепатит, лейкопения < 5000 /мм , тромбоцитопения, признаки нарушения функции печени без других видимых причин (van den Berg 1989; Peiris et. al., 1995).

Субфебрилитет, лейкопению (с учетом дозы азатиоприна), поражения желудочно-кишечного тракта относили к ЦМВ-ассоциированными, если не было других явных причин для их развития (Iberer et ah, 1996).

Эффективность специфической противовирусной терапии являлась критерием, подтверждающим диагноз.

Проводились следующие исследования:

1. Определение цитомегаловирусной ДНК методом полимеразной цепной реакции в лейкоцитах периферической крови или в цельной крови у 199 реципиентов почки, б реципиентов сердца, 35 пациентов на гемодиализном лечении и 67 здоровых доноров крови.

2. Определение цитомегаловирусной ДНК в плазме крови у 65 реципиентов почки и 3 реципиептов сердца.

3. Определение цитомегаловирусной ДНК в моче и слюне. Исследовано 26 пациентов после аллотрансплантации органов ( по 30 образцов мочи и слюны).

4. Определение антител к ЦМВ IgG и IgM класса в сыворотке крови методом иммунофермеятного анализа (ИФА). Исследовано 96 пациентов с аллотранеплантатом почки (198 образцов), 3 пациента после трансплантации сердца (9 образцов), 16 гемодиализных пациентов (26 образцов), 14 здоровых доноров крови (14 образцов).

5. Культуральный метод выявления ЦМВ антигонов р72 и рр65 с использованием моноклопальных антител. У 12 пациентов после трансплантации органов исследованы 16 образцов крови и по 8 образцов мочи и слюны.

6. Определение состояния Т-клеточного иммунитета методом проточной цитоспсктрофлюометрии. Исследовано 14 пациентов после аллотрапсплантации почки, 1 пациент после аллотрапсплантации сердца и 2 пациента на гемодиализном лечении.

Полимеразная цепная реакция

ДНК выделяли с помощью сорбента (наборы для выделения ДНК Дентального Научно-Исследовательского Института Эпидемиологии (ЦНИИЭ), или DNAattraction", CLONOGENE, Ltd., С-Петербург), а также методом фенольной экстракции из 10е лейкоцитов или 100 мкл цельпой крови, 200 мкл плазмы, осадкаЮ мл мочи, осадка 2 мл слюны в день забора клинического материала. Эффективность выделения ДНК, определяемая спектрофотометрическим методом, составляла 45-60% для набора ЦНИИЭ, 60-70% для набора "DNAattraction" и 70-85% при выделении методом фенольной экстракции. ДНК для первого раунда ПЦР брали из расчета 100 тыс. лейкоцитов или 10-15 мкл цельной крови или 50 мкл плазмы, осадка клеток из 1 мл мочи или осадка клеток 0,2 мл слюны.

При отработке метода были опробованы 6 пар праймеров на сверхранний (Demmler G.J. et al., 1988; Shibata D. et al.,1988; Bevan I.S. et al.,1991; Шипулина О.Ю. и др., 1997) и поздний регионы (Demniler G.J. et al., 1988; Bevan I.S. et al.,1991) вирусного генома.

Для амплификации участка ДНК ЦМВ были использованы 2 пары прайморов на 4 экзоп сверхраннего (MIE) региона генома ЦМВ: (5'-3 ) CCA AGC GGC СТС TGA ТАА CCA AGC

(5'-3') CAG САС CAT ССТ ССТ СТТ ССТ CTG - с продуктом 435 п.о

(Demmler G.J. et al., 1988);

(5'-3-) CCA AGC GGC CTC TGA TAA CCA AG

(5'-3") TAC TGG TCA GCC TTG СТТ СТА GTC АС - с продуктом 501 п.о. (Шипулина О.Ю. и др., 1997). Пара праймеров с большей длиной продукта выбрана с учетом вариабельности MIE региона на основании анализа нуклеотидной последовательности различных штаммов ЦМВ. Часть работы была выполнена с использованием тест-системы ПЦР

Центального Научно-Иееледовательского Института Эпидемиологии (Шипулина О.Ю и др., 1997).

Для повышения чувствительности и в целях идентификации продуктов реакции, в случае необходимости, проводили второй раунд амплификации (nested-ПЦР) с внутренними цраймерами с продуктом-368 п.о.

(5'-3') AAG ССТ GAG GTT ATG AGT GTA AT,

(5'-3') ACT GGC ТСА GAC TTG АСА GAC (Demmler G.J. et al., 1988). Внутренняя пара праймеров была общей для двух пар внешних праймеров. Амплификация образцов выделенной ДНК проводилась в объеме 50 мкл. Стандартная реакционная смесь включала 67 мМ трис, 16.7 мМ сульфата аммония, 0,1 мМ меркаптоэтанола, 3 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов дНТФ (дАТФ, д ЦТФ, дТТФ, дГТФ), 0,5 мкМ праймеров, 0.15 мг/мл БСА и 10 мкл ДНК образца. 5 Ед (10-5 мкл) термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-полимеразы) добавляли после 3 минут предварительного прогревания смеси при 95°С. Реакцию проводили на отечественных амплификаторах -Cyclotemp или МС-2 (Москва). Первый рауид амплификации проводили в следующем температурном режиме: 1. 95° - 3 мин; 2. 95°-1 мин., 68°-40 сек., 72°-40 сек. -Юциклов; 3. 95°-30 сек., 65°-30 сек., 72°-30 сек. -35 циклов. В качестве ДНК- матрицы для второго раунда амплификации брали 1 мкл. продукта первого раунда амплификации. Температурный режимы па втором раунде амплификации был следующим: 1. 95°-1 мин; 2. 95°-30 сек., 60°-30 сек., 72°-30 сек - 25 циклов.

Детекцию продуктов реакции проводили методом электрофореза в 2% агарозе с 0,001% этидиум бромида, с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете. В качестве положительного контроля, использовали ДНК, выделенную из ЦМВ (штамм AD-169), выращенного на культуре фибробластов эмбриона человека. Отрицательные и положительные контроли включали в каждое определение. Отрицательные контроли проходили все стадии обработки клинического материала. В качестве маркера молекулярной массы ДНК использовали плазмиду pUC18, рестрицированную Hinfl. Для исключения ложноотрицательных результатов вследствие ингибирования Tag-полимеразы, параллельно с амплификацией генома ЦМВ проводили амплификацию участка гена С8 компонента системы комплемента человека.

Для оценки чувствительности ПЦР были приготовлены десятикратные разведения ДНК, выделенной из культуры фибробластов,

4

инфицированных штаммом AD-169 с инфекционным титром 10 ТЦД50/0.2 мл. Абсолютную чувствительность метода определяли при амплификации очищеппой стандартной ДНК ЦМВ (Sigma) в ЦНИИЭ (Шипулина О.Ю и др.,1997) по методике Simmonds Р. et al., 1990.

Специфичность метода проверяли, проводя ПЦР, где в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из культур клеток, зараженных другими герпесвирусами (вирусы простого герпеса 1 и 2 типов, вирус Эпштейн-Барра), а также ДНК вируса гепатита В. При этом не происходило образование специфических продуктов амплификации.

Количественную оценку результатов ПЦР проводили методом десятикратных разведепий образца перед амплификацией при известной чувствительности.

Иммуноферменгный метод Определение апти-ЦМВ иммуноглобулинов IgG и IgM класса проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) с наборами MEDIX BIOTECH (USA). Результаты оценивали полуколичесгвенгго по методике, предлагаемой фирмой.

Культуральный метод выявление вирусных антигенов р72 и рр65 с помощью моноклональных антител Культуральное выявление вирусных антигенов р72 и рр65 с помощью моноклональных антител проводили совместно с сотрудниками Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Метод проточной цитоспектрофлюорометрии Определение состояния Т-клеточного иммунитета методом проточной цитоспектрофлюорометрии проводили совместно с научным сотрудником лаборатории трансплантационной иммунологии НИИТ и ИО Багдаповой Н.Б. Субпоцуляции лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD3+DR+ идентифицировались с помощью моноклональных антител, меченых флюорисцирующими метками, на приборе FACScan.

Статистическая обработка результатов При статистической обработке материала применяли критерий %2 Пирсона, который, при п=1, для р< 0,05, р< 0,02, р< 0,01 и р<0,001 принимали соответственно > 3,841, >5,412, > 6,635 и >10,8, а при п=2 -> 5,991, > 7,824, >_9,210.

Результаты исследования и их обсуждение

Отработка протокола ПЦР для выявления ДНК цитомегаловируса. Определение специфичности и чувствительности метода.

Отработка протокола ПЦР включала подбор оптимальных условий проведения ПЦР и выбор оптимального количества клеточной ДНК для амплификации.

Условия проведения ПЦР были подобраны по следующим параметрам, оказывающим влияние на специфичность и количество

»г 2+

получаемого продукта: концентрация М^ , концентрация праимеров и температура их отжига, количество фермента, количество циклов амплификации.

Для выбора оптимального количества клеточной ДНК для ПЦР мы провели амплификацию контролей, содержащих большое и малое число копий вирусной ДНК (штамм Л1) 169) с различной нагрузкой клеточной ДНК. Нагрузка клеточной ДНК в количестве 0,7-1,4 мкг (ДНК из 100200 тыс. лейкоцитов) не оказывала влияния на количество специфического продукта амплификации. В целях стандартизации количества клеточной ДНК для ПЦР мы проводили подсчет лейкоцитов (в камере Горяева) перед выделением ДНК.

Для оценки чувствительности ПЦР были приготовлены

десятикратные разведения ДНК, выделенной из культуры фибробластов,

4

инфицированной штаммом ДГ)-169 с инфекционным титром 10 ТЦД50/0.2 мл.

Специфичность метода проверяли, проводя ПЦР, где в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из культур клеток,

зараженных другими герпесвирусами (вирусы простого герпеса 1 и 2 типов, вирус Эпштейн-Барра), а также ДНК вируса гепатита В.

Из опробованных 6 пар праймеров 2 пары (на 4 окзон сверхранпего (MIE) региона гепома ЦМВ: Demmler G.J. et al., 1988; Шипулина О.Ю и др., 1997) показали в 1ЩР наиболее высокую чувствительность и специфичность и были использованы для выполнения осповного исследования.

При определении чувствительности ПЦР с использованием

выбранных праймеров положительный результат всегда получали при

g

тестировании ДНК исходной культуры, разведенной в 10 раз в одном

6 « раунде и в 10 раз в nested-ПЦР. Начиная с разведения 10"° в одном

раунде ПЦР всегда получали отрицательный результат. При постановках

nested-ПЦР с ДНК в разведении 10"^, положительный результат

получали примерно в 40% случаев. Чтобы показать, что это связано с

предельным разведением, 100 мкл ДНК исходной культуры, разведенной

в 107 раз, были разделены на 10 частей, и использованы в 10 реакциях

nested ПЦР. Положительный результат получали в 4 случаях.

Интенсивность амплификации при этом не отличалась от интенсивности

амплификации ДНК, разведенной в 108 раз, что говорит о детекции

единичных копий вирусного гепома в nested-ПЦР. Абсолютную

чувствительность определяли при амплификации стандартной,

очищенной ДНК ЦМВ ( фирма Sigma) в ЦНИИЭ (Шипулина О.Ю. и

др.,1997) по методике Simmonds P. et al., 1990, а также при

сравнительной- амплификации десятикратных разведений ДНК,

выделенной из культуры фибробластов, инфицированной штаммом AD-

4

169 с инфекционным титром 10 ТЦД50/0.2 мл. тест-системой Г1ЦР НИИ молекулярной генетики. Чувствительность тест-системы НИИ молекулярной генетики определялась с использованием сконструированной плазмиды pS MIE4, несущей амплифицируемый участок гена ЦМВ. Чувствительность ПЦР с использованием выбранных праймеров составляла <100 копий для первого раунда ПЦР и <10 копий для nested ПЦР.

При постаповке ПЦР с образцами ДНК простого герпеса 1 и 2 типов, вируса Эпштейп-Барра, а также ДНК вируса гепатита В пе происходило образование специфических продуктов амплификации.

Таким образом, были выбраны праймеры для амплификации ДНК цитомегаловируса, показывающие в ПЦР высокую чувствительность; и специфичность .

Определение ДНК цитомегаловируса методом ПЦР в лейкоцитах крови

Выявление ДНК цитомегловируса методом ПЦР в лейкоцитах крови доноров, пациентов па программном гемодиализе и реципиентов после аллотрапеплантации органов Среди 205 обследованных реципиентов эпизоды ЦМВ ДНКемии выявлены у 90(43,9%) человек. Среди обследованных 35 пациентов на гемодиализаоы лечении у 5 (14%) в лейкоцитах крови была обнаружена ДНК ЦМВ (р< 0,001). 4 из них впервые были обследованы немедленно после удаления почки вследствие некупируемого отторжения. Ни у одного из 67 доноров не была найдена ЦМВ ДНК в лейкоцитах крови.

В группе 95 пациентов, позитивных на ДНК ЦМВ (90 реципиентов органа и 5 пациентов на программном гемодиализе) 34(35,8%) имели острые клинические симптомы в виде лихорадки - Т^ >38^ ( 17 случаев) или лихорадки в сочетании: с пневмонией (9 случаев), с острой патологией со стороны желудочно кишечного тракта (6 случаев), с гепатитом (1случай), со значительным снижением функции трансплантата (1 случай). 46 (48,4 %) пациентов имели подострые симптомы. У 18 (18,9 %) пациентов наряду с клиническими симптомами наблюдалась лейкопения (<4 • 109/л). 15 (15,8 %) пациентов не имели симптомов па момент обследования. ДНК ЦМВ выявлена у трех пациентов с сепсисом. 47 (49,5%) пациентам, позитивным на ДНК ЦМВ, по клиническим и лабораторным показаниям лечащими врачами была назначена специфическая противовирусная терапия ганцикловиром. В результате проведенной терапии клинические симптомы исчезли у 44 пациентов. Продолжительность терапии в большинстве случаев составляла 1-3 недели ( до исчезновения симптомов) и зависела от исходной тяжести состояния пациента. Три пациента умерли, несмотря на проводимую противовирусную и антибактериальную терапию.

В группе 145 пациентов, негативных на ДНК ЦМВ (115 реципиентов органа и 30 пациентов на программном гемодиализе), 15(10,3%) человек имели острые клинические признаки на момент обследования, 27 (18,6%) - подострые клинические признаки и 103 (71%) - были бессимптомны. Статистический анализ выявил достоверно более высокую частоту встречаемости пациентов с симптомами в группе пациентов, позитивных на ДНК ЦМВ (р<0,001).

Клинические симптомы у пациентов, негативных па ДНК ЦМВ, по были связаны с ЦМВ и разрешились без специфической противовирусной терапии.

Для исключения отрицательных результатов ПЦР на ДНК ЦМВ вследствие ингибирования реакции, мы провели амплификацию участка гена С8 компонента системы комплемента человека в образцах ДНК 42 пациентов, негативных па ДНК ЦМВ и имевших клинические симптомы. Во всех образцах амплификация участка человеческого генома прошла интенсивно.

Данные, полученные при серологическом исследовании (ИФА) говорят о инфицированносги ЦМВ большинства из обследуемых. ЦМВ-специфические антитела IgG класса были выявлены у 90,9% обследованных реципиентов органа, у 87,5% гемодиализных пациентов и у 85,7% здоровых доноров крови. Следовательно, ДНК ЦМВ была обнаружена в лейкоцитах крови у пациентов после аллотрансплантации органов и пациентов на программном гемодиализе, входящих в группу риска реактивации ЦМВ, и не выявляли у практически здоровых допоров крови, инфицированных ЦМВ латентно (Doerr H.W. and Albert S. 1990).

Таким образом, используемый нами протокол ПЦР позволяет выявлять только активную ЦМВ-инфекцию. Отрицательный результат ПЦР в 100% случаев гарантировало отсутствие ЦМВ-болезни. Между выявлением ДНК ЦМВ и развитием клинических симптомов имеется высокая степень корреляции (р<0,001). 84,2% пациентов, позитивных на ДНК ЦМВ, на момент обследования имели клинические симптомы, среди них 35,8% - острые симптомы и 48,4 % - подострые симптомы. Мы не исключаем, что в некоторых случаях симптомы обусловлены другими причинами (чем ЦМВ), например, бактериальной инфекцией или другими вирусными инфекциями, а активация ЦМВ является следствием ослабления иммунитета. Однако, исчезновение клинических симптомов у пациентов с ЦМВ ДНКемией после специфической противовирусной терапии ганцикловиром свидетельствует в пользу цитомегаловируспой природы большинства симптомов.

Количественная оценка уровней ДНК цитомегаловируса в лейкоцитах периферической крови

Для количественной оценки результатов определяли титр вирусной ДНК путем амплификации 10-кратных разведений образца при известном

порядке чувствительности метода (<100 копий для первого раунда амплификации и <10 копий для nested ПЦР).

Среди 95 пациентов с ЦМВ ДНКсмией 38 (40%) имели уровни <100 копий, 30 (31,6%) - >100<1000 копий и 27(28,4%) - > 1000 копий ДНК ЦМВ на 10 лейкоцитов. В группах пациентов с уровнями ДНК ЦМВ <100, >100<1000 и >1000 копий, количество пациентов с острыми клиническими симптомами было соответственно 2 (5,3%), 9(30,0 %) и 23(85,2 %). Между уровнями ДНК ЦМВ и частотой развития острых клинических признаков имеется высокая степень корреляции (р<0,001). Специфическая противовирусная терапия ганцикловиром проводилась 22 (81,5%) пациентам с высоким уровнем ДНК ЦМВ в лейкоцитах (>1000 копий), 15(60,0%) пациентам со средним уровнем ДНК ЦМВ (>100<1000 копий ) и 10 (26,3 %) пациентам с низким уровнем ДНК ЦМВ (<100 копий)( р< 0,001) (Таб.1).

Таблица1. Клинические признаки у пациентов с уровнями ДНК ЦМВ <100, >100<1000 и >1000 копий (на 10^ лейкоцитов ) и терапия ганцикловиром.

ДНК ЦМВ(копий) п Острые симптомы Подострые симптомы Без симптомов Терапия (ганцикловир)

<100 38 (100 %) 2 (5,3%) 24 (63,1%) 12 (31,6%) 10 (26,3 %)

>100<1000 30 (100 %) 9(30,0 %) 19(63,3 %) 2(6,7 %) 15 (50,0%)

>1000 27 (100 %) 23(85,2 %) 3 (11,1 %) 1 (3,7 %) 22 (81,5 %)

р<0,001 р<0,001 р<0,01 р<0,001

Всего 95 (100 %) 34 (35,8%) 46 (48,4%) 15 (15,8%) 47 (49,5 %)

Примечание: п - число пациентов; р- вероятность для X •

Таким образом, 96,3% нациейтов с высокими уровнями ДНК ЦМВ в лейкоцитах имели клинические симптомы, среди них 85,2% - ЦМВ-болезнь. 14,8% пациентов с высоким уровнем ДНК ЦМВ в крови не имели острых клинических симптомов на момент обследования. Полученные результаты совпадают с данными других авторов (Kuhn J.E. et al., 1994; Gerna G. et al., 1995).

Активная ЦМВ-инфекция и сроки после трансплантации Среди 205 обследованных реципиентов 31 были обследованы в сроки до 0.5 месяца после трансплантации (I группа), 57- от 0.5 до 1 месяца (II группа), 56- от 1 до 2 месяцев (III группа), 61- более 2 месяцев

(IV группа). Количество пациентов с ЦМВ ДНКемией в них было выявлено 7, 26, 35, и 22 соответственно. Статистический анализ выявил достоверные различия частоты встречаемости пациентов, позитивных на ДНК ЦМВ, в группах I и II, III и IV (р< 0,05). Различие частоты встречаемости позитивных в группах II и III статистически не достоверно(р>0,05). Высокие уровни ДНК ЦМВ (>1000 копий) в группах II, III и IV выявлено соответственно у 6, 13 и 7 пациентов (р>0,05). У 31 пациента, обследованного в первые 0.5 месяца после трансплантации, высокие уровни ДНК ЦМВ в крови (>1000 копий) не обнаружены ни в одном случае .

Таким образом, наблюдается увеличение частоты встречаемости ПЦР-позитивных пациентов, в том числе с высоким уровнем ДНК ЦМВ в крови (>1000 копий) к 1-2 месяцу после трансплантации. Вероятно, это связано с более мощной иммуносупрессией (высокими дозами азатиоприна и метилпреднизолона, назначением антилимфоцитарных глобулинов) в первые 6 недель после трансплантации по сравнению с последующим послеоперационным периодом. Полученные результаты согласуются с данными литературы (Но М. 1991).

Влияние различных схем иммуносупрессии на частоту развития активной

ЦМВ-инфекции

Для изучения влияния различных схем иммуносупрессиии на частоту развития активпой ЦМВ-инфекции были проанализированы 2 группы больных с аллотрансплантатами органов, одна из которых (77 человек) получала препараты антилимфоцитарных глобулинов ( АЛГ, АТГ, ОКТЗ), а вторая (49 человек) - СуА в комбинации с низоралом (кетоконазолом).

Из 77 реципиентов, которым назначались препараты антилимфоцитарного глобулина, эпизоды ЦМВ ДНКемии выявлены у 50 (64,9%). 15 (30%) из них имели высокие уровни ДНК ЦМВ в крови (>1000 копий). Среди 128 пациентов, которым не назначались препараты антител, ДНК ЦМВ обнаружена у 40(31,3%). Из них 11 (27,5%) имели высокие уровни ЦМВ ДНКемии. Между терапией антителами (АТГ, АТГ, ОКТЗ) и частотой развития активной ЦМВ-инфекции имеется высокая степень корреляции (р< 0,001).

Для изучения влияния комбинированного использования СуА с низоралом (кетоконазолом) на частоту развития активной ЦМВ-инфекции у реципиентов с аллогрансплантатом почки мы проанализировали две

группы реципиентов почки, одна из которых (102 человека) оперирована в НИИТ и ИО и получала СуА без пизорала, а вторая (49 человек), оперированная в 7 городской больнице, получала СуА в комбинации с низоралом. Из 102 пациентов, не получающих низорал, ДНК ЦМВ выявлена у 39(38,2%). В группе из 49 пациептов, получающих СуА в комбинации с низоралом, ДНК ЦМВ обнаружена у 24(49,0%). Полученные различия статистически недостоверны (р>0,05). Среди 49 реципиентов почки, направленных на обследование из 7 городской больницы и получавших низорал, уровни ДНК ЦМВ >1000 копий выявлены у 10 человек (20,4%). Из 102 реципиентов почки, оперированных в НИИТ и ИО высокие уровни ЦМВ ДНКемии обнаружены у 8 пациентов (7,8%) (р<0,02).

Таким образом, терапия АТГ значительно увеличивает риск развития активной ЦМВ-инфекции (р<0,001). Использование СуА в комбинации с низоралом не влияет на частоту встречаемости ЦМВ ДНКемии (р>0,05), однако, статистический анализ показал достоверно более высокую частоту встречаемости высоких уровней ДНК ЦМВ (>1000 копий) среди пациентов, получавших СуА в комбинации с низоралом, по сравнению с реципиентами почки, не получавших низорал (р<0,02). Возможно, данные различия обусловлены и другими причинами, такими как более тщательный контроль дозировки СуА по концентрации в крови и ранняя диагностика активной ЦМВ-инфекции с использованием ПЦР в группе пациентов НИИТ и ИО.

Исследование пациентов методом ПЦР в динамике (мониторинг ЦМВ-инфекции). Контроль за эффективностью специфической противовирусной

терапии

45 пациентов были обследованы в динамике с интервалом 6-20 дней, начиная с первой недели после операции. 27 из них (60%) стали позитивными на ДНК ЦМВ в среднем на 37 сутки после трансплантации. У 21 (77,7%) наблюдались клинические симптомы. Интервалы между исследованиями часто были нестандартными , поэтому в большинстве случаев больные поступали на очередное обследование уже при наличии выражепных клинических и лабораторных (ПЦР, серология) признаков ЦМВ-инфекции. В трех случаях положительный результат ПЦР получен на 24, 6 и 7 дней раньше появления клинических симптомов.

В процессе терапии ганцикловиром симптоматической ЦМВ-инфекции было обследовано 37 пациентов. После проведенной терапии до

исчезновения клинических признаков отрицательный результат ПДР получен у 26 (67,6%) из них. У 12 (32,4%) пациентов ДНК ЦМВ после терапии обнаруживали длительное время ( по меньшей мере 1-7 педель) с уровпями ниже исходных более чем в 100 раз, уже без выраженных клинических симптомов. Было отмечено, что для купирования клинических признаков у пациентов с высоким уровнем ДНК ЦМВ (>1000 копий) требовалась более продолжительная терапия и данные пациенты чаще оставались позитивными па ДНК ЦМВ после проведенпой терапии (8 из 12 случаев). В ряде случаев мы наблюдали падение уровней и даже исчезновение ДНК ЦМВ из крови при ослаблении иммуносупрессии ( снижение доз иммуносупрессивпых препаратов, отмены препаратов антилимфоцитарного глобулина) или отмены иммуносупрессии после удаления трансплантата.

Таким образом, метод ПЦР позволяет выявлять ДНК ЦМВ за 1-3 недели до клинических манифестаций ЦМВ-инфекции. После специфической противовирусной терапии наблюдается исчезновение или значительное спижепие уровней ДНК ЦМВ в крови. Отсюда следует, что метод ПЦР является надежным методом мониторинга ЦМВ-инфекции, а также контроля эффективности лекарственной терапии.

Исследование методом ПЦР различного биологического

материала

Сравнение результатов ПЦР-анализа лейкоцитов и плазмы крови у реципиентов после аллотрансплантации органов

У 68 пациентов после аллотрансплантации органов методом ПЦР одновременно исследовали плазму и лейкоциты крови. Из 68 обследованных пациентов у 32(47,0%) ДНК ЦМВ в плазме и лейкоцитах не обнаружена; у 22(32,4%) - обнаружена в лейкоцитах и отсутствовала в плазме; у 14(20,6%) пациентов ДНК ЦМВ обнаружена и в плазме, и в лейкоцитах. Позитивный результат ПЦР в плазме и негативный в лейкоцитах пе обнаружен ни в одном случае. Все пациенты, позитивные в плазме, имели высокие уровни ДНК ЦМВ в лейкоцитах (>1000 копий на 10^ лейкоцитов), при этом у 12 (85,7%) из них была ЦМВ-болезнь, в связи с чем проводилась специфическая противовирусная терапия ганцикловиром. ДНК ЦМВ в плазме исчезала немедленно после

проведения терапии, в то время как в лейкоцитах определялась длительное время у 9(75 %) пациентов (от 1 до 20 недель). Среди 54 пациентов, негативных на ДНК ЦМВ в плазме, 22 - были позитивны в лейкоцитах (40,7%) и 16(29,6%) из них имели клинические симптомы па момент исследования (3 пациента с 1;>38 ; 13 пациентов с 1,<38 ). 8(36,4%) из этих пациентов была проведена терапия ганцикловиром в результате которой клинические симптомы были купированны. Результаты исследований представлены в таблице 2. Из данных, приведенных в таблице, следует, что результаты ПЦР-анализа, полученные при исследовании лейкоцитов и плазмы, совпадали в 67,6% случаев.

Таблица 2. Выявление ДНК ЦМВ в плазме и лейкоцитах крови.

N 68 ПЦР Симптомы Терапия

лейкоц. плазма острые подострые без симпт. ганцикловир

22 + 3(13,6%) 13(59,1%) 6(27,3%) 8(36,4%)

14 + + 12(85,7%) 1(7,1%) 1(7,1%) 12(85,7%)

р<0,001 р<0,01 р<0,01

32 _ 3(9,4%) 7(21,9%) 22(68,7%) 0(0,0%)

0 - + 0(0,0%) 0(0,0%) 0(0,0%) 0(0,0%)

Примечание: п - число пациентов; р - вероятность для %

Таким образом, результаты ПЦР-апализа плазмы лучше коррелируют с развитием ЦМВ-болезни по сравнению с данными, полученными па лейкоцитах крови. Однако, результаты ПЦР-апализа плазмы не имели абсолютной негативной предикативной ценности в отношении симптоматической ЦМВ-инфекции как это показано при исследовании лейкоцитов. Следовательно, определение ДНК ЦМВ в плазме является менее чувствительным способом мониторинга ЦМВ инфекции, чем выявление в лейкоцитах периферической крови и может давать ложноотрицательные результаты. Полученные нами данные совпадают с результатами других авторов (Ishigaki S. et al., 1991; Gerna G. et al.,1995), хотя в некоторых лабораториях предпочтение отдают исследованиям плазмы или сыворотки (Wolf D.G. end Spector S.A. 1993; MutimerD. et al., 1997).

При многочисленных сравнениях, результаты амплификации образцов ДНК, выделенных из лейкоцитов и цельной крови практически не отличались. Для исключения ингибировапи Tag-полимеразы образцами ДНК, выделенных из цельной крови, при необходимости проводили амплификацию участка гепа С8 компонента комплемента человека. Ile было выявлено ни одного случая ингибирования. Исходя из этого, в дальнейшей работе ДНК для ПЦР в осповпом выделяли из цельной крови.

Сравнение результатов ПЦР-аяализа лейкоцитов крови, мочи слюны у больных после аллотрапеплантации органов

У 30 пациентов после аллотрансплаптации органов и 14 здоровых доноров крови методом ПЦР проведены исследования крови, мочи и слюны. В группе обследованных больных с аллотрансплантатами органов 1 пациент имел лихорадку неизвестной этиологии на фоне лейкопении, 4 пациента имели субфебрильную температуру и 25 были без симптомов на момент обследования.

Среди 30 обследованных больных с аллотрансплантатами органов результат ПЦР-анализа крови был позитивным у 12(40,0%), мочи - у 11(36,7%), слюны - у 14(46,7%). При сравнении данных ПЦР-анализов кровь/моча и кровь/слюна результаты совпадали в 86,7% и 76,7% случаях соответственно. Три пациента с симптоматической ЦМВ-инфекцией имели положительный результат ПЦР во всех трех образцах. Среди бессимптомных пациентов ПЦР-анализ крови был позитивен в 9 случаях, мочи - в 8 случаях, слюны - в 11 случаях. ДНК ЦМВ была обнаружена в моче у одного здорового донора (7,1%). 8 (26,7%) из 30 пациентов были обследованы после терапии гапцикловиром. Среди них ДНК ЦМВ выявлена в крови у 3 пациентов в крови, у 3 пациентов в моче и у 5 в слюне.

Амплификация участка гена С8 компонента системы комплемента человека прошла интенсивно во всех образцах крови, мочи и слюны, позитивных на ДНК ЦМВ и не прошла или прошла слабо в 8 (42,1%) образцах ДНК мочи и в 2 (12,5%) образцах слюны, негативных на ДНК ЦМВ. Во всех 18 образцах ДНК, выделенных из цельной крови и негативных на ЦМВ, амплификация участка человеческого генома прошла интенсивно

Таким образом, результаты ПЦР- анализа образцов крови мочи и слюны могут не совпадать. После специфической противовирусной терапии, а также при бессимптомной ЦМВ-инфекции ДНК ЦМВ чаще обнаруживалась в слюне, чем в моче и крови. ДНК, выделенная из образцов мочи и слюны, может содержать компоненты, ингибирующие ДНК-пол имеразу. Учитывая перечисленные расхождения, мы считаем, что кровь является более подходящим образцом для диагностики активной и симптоматической ЦМВ-ипфекции.

Сравнение ПЦР с другими методами диагностики ЦМВ-

инфекции

Определение ДНК цитомегаловируса методом ПЦР и выявление ЦМВ-специфических антител IgM и IgG методом ИФА

232 образца крови, среди которых 198 образцов от 96 пациентов после аллотрапеплантации почки, 9 образцов от 3 пациентов после трансплантации сердца, 25 образцов от 16 гемодиализных пациентов были исследованы параллельно методом ПЦР на ДНК ЦМВ и методом ИФА на ЦМВ-специфические антитела IgG и IgM класса.

Из 232 образцов крови 77 (33,2%) были позитивны и 155 (66,8%) негативны на ДНК ЦМВ. 120 (51,7%) образцов крови были позитивны на анти-ЦМВ IgM и 209 ( 90,1%) позитивны на анти-ЦМВ IgG. Результаты исследования представлены в таблице 3. Из данных, представленных в таблице, следует, что результаты ПЦР и ИФА на IgM совпадали лишь в 55,6 %. 30 (39%) образцов крови, позитивных на ДНК ЦМВ, были негативны на анти-ЦМВ IgM. У 10 из этих пациентов была симптоматическая ЦМВ-инфекция, в связи с чем проводилась терапия ганцикловиром. С другой стороны, 73 (47,1%) образца, негативных на ДНК ЦМВ, были позитивны на анти-ЦМВ IgM при отсутствии клинических симптомов у пациентов на момент исследования.

Таблица 3. Сравнительная диагностика ЦМВ-инфекции ПЦР и ИФА.

ПЦР п IgfM + IgM - % + IgG + IffG- % +

ДНК ЦМВ + 77 47 30 61,0% 70 7 90,9%

ДНК ЦМВ - 155 73 82 47,1% 139 16 89,7%

Всего 232 120 112 51,7% 209 23 90,1%

Р р<0,05 р>0,05

Примечание: п - число пациентов; р- вероятность для % ; % +- проценты положительного результата.

Выявление анти-ЦМВ 1§М в образцах крови, негативных на ДНК ЦМВ, означало длительную циркуляцию и даже рост титров антител после подавления активности ЦМВ инфекции в результате терапии ганцикловиром или снижения иммуиосупрессии. Обнаружение ДНК ЦМВ в образцах крови, негативных па анти-ЦМВ 1§М, означало медленный рост титров ЦМВ-специфических иммуноглобулинов 1&М класса после активации цитомегаловирусной инфекции. После терапии ганцикловиром имело место значительное снижение уровней или исчезновение ДНК ЦМВ из крови и клиническое излечение пациентов. В то же время в большинстве случаев наблюдался рост уровней анти-ЦМВ 1уМ и Г^О и длительная циркуляция высоких титров антител.

Таким образом, определение ДНК ЦМВ методом ПЦР имеет ряд существенных преимуществ перед выявлением ЦМВ-специфических антител методом ИФА: ЦМВ-специфические антитела класса

выявляются у 90% реципиентов органов и гемодиализных больных; при активации цитомегаловирусной инфекции ДНК ЦМВ в крови определяется до появления анти-ЦМВ ^М или роста титров и/или Гйв; появление и рост уровней ДНК ЦМВ в крови предшествуют развитию клинических симптомов, в то время как появление и/или рост титров аяти-ЦМВ 1§М и нередко происходит ужо после развития

клинических признаков; после специфической противовирусной терапии происходит значительное снижение уровней или исчезновение ДНК ЦМВ из крови, в то время как ЦМВ специфические антитела 1йМ и класса в высоких титрах могут циркулировать в крови длительное время после специфической противовирусной терапии.

Определение ДНК цитомегаловируса методом ПЦР и культуральный метод выявления белков ЦМВ р72 и рр65 с использованием моноклопальных антител

Метод ПЦР имеет высокую чувствительность и специфичность и может быть выполнен в течение одного рабочего дня. Однако, выявление ДНК ЦМВ само по себе не означает наличия инфекционного вируса. Выявление вирусных белков р72 и ррб5 после сокультивирования пермиссивных к ЦМВ фибробластов и исследуемого материала является доказательством инфекционпости вируса. Данный метод занимает как

минимум 2-4 дня, что делает его малопригодным для мониторинга и диагностики ЦМВ-болезни. Культивирование вируса и последующую детекцию вирусных белков проводили совместно с сотрудниками Института вирусологии им. Д.И. Ивановского.

Параллельно с ПЦР 16 образцов крови и по 8 образцов мочи и слюпы от 12 пациентов после трансплантации органов исследованы культуралышм методом с последующим выявлением белков ЦМВ р72 и рр65 с использованием моноклональных антител. Результаты ПЦР и культурального метода выявления вирусных белков р72 и ррбб совпали в 81,3 %. При исследовании образцов крови метод ПЦР показал более высокую чувствительность по сравнению с культуральным методом детекции вирусных белков. ДНК, выделяемая из образцов мочи, может содержать компоненты, ингибирующие ДНК-полимеразу. Культуральный метод так же, как и ПЦР может выявлять ЦМВ в образцах крови, мочи и слюны бессимптомных пациетов. Получепные результаты совпадают с данными литературы ( Prosch S. et al., 1992; Imbert-Marcille B.M. et al., 1995; Choi S.J.N, et al., 1996).

Выводы

1. Изучены возможности ПЦР как метода диагностики активной ЦМВ-инфекции у пациентов после аллотрансплантации органов. Показано, что ПЦР является надежным методом диагностики, обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

2. Показана высокая степень корреляции между ЦМВ ДНКемией и развитием клинических симптомов, а также между уровнями ДНК ЦМВ и тяжестью клинических симптомов (р<0,001). Отрицательный результат ПЦР-анализа на ДНК ЦМВ в крови означает отсутствие активной ЦМВ-инфекции.

3. Определение ДНК ЦМВ в плазме является менее надежным и чувствительным способом диагностики активной ЦМВ-ипфекции по сравнению с определением ДНК ЦМВ в лейкоцитах крови.

4.Наличие анти-ЦМВ антител дает ретроспективную информацию и не отражает интенсивности реактивации вируса на момент обследования. 39% образцов, позитивных на ДНК ЦМВ, были негативными на ЦМВ-специфические антитела IgM класса.

5. Сравнительный анализ результатов диагностики ЦМВ-ипфекции методом ПЦР и культуральным методом выявления вирусных белков р72 и рр65 свидетельствует о более высокой чувствительности метода ПЦР.

6. ПЦР является удобным методом мониторинга ЦМВ-инфекции и позволяет надежпо контролировать эффективность противовирусной терапии.

Практические рекомендации

1. Для обеспечения надежной и быстрой диагностики активной ЦМВ-ипфекции у пациентов после аллотрансплантации органов рекомендуется использовать полимеразную цеппую реакцию.

2. Поскольку положительный результат ПЦР предшествует развитию клинических признаков активной ЦМВ-ипфекции, рекомендуется проводить ПЦР-мониторинг, особенно среди пациентов, имеющих наибольший риск развития ЦМВ-болезни: получающих терапию препаратами антилимфоцитарных глобулинов и со сроками после трансплантации 1-2 месяца.

3. Показанием для начала противовирусной терапии служит наличие высоких уровней ДНК ЦМВ в лейкоцитах (>1000 копий на 10^ лейкоцитов) или положительный результат ПЦР в плазме в сочетании с клиническими признаками. Лабораторным показанием эффективности терапии служит исчезновение или значительное снижение уровней ДНК ЦМВ в лейкоцитах (в 100 раз и более) или негативный результат ПЦР в плазме.

4. Выявление ДНК ЦМВ в плазме в одном раунде амплификации может служить признаком симптоматической ЦМВ-инфекции. Однако, отрицательный результат ПЦР-анализа плазмы не означает отсутствия активной ЦМВ-инфекции и необходимо подтверждать анализом ДНК, выделенпой из лейкоцитов, поскольку отрицательный результат ПЦР-аяализа лейкоцитов гарантирует отсутствие активной ЦМВ-инфекции.

5. Кровь является оптимальным биологическим материалом для мониторинга и диагностики ЦМВ-инфекции по сравнению с мочой и слюной.

6. Наличие анти-ЦМВ антител дает ретроспективную информацию и не отражает интенсивности реактивации вируса па момент обследования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Dolgikh M.S., Kiseleva V.I., A.M.Vedjakov. "PCR standardization by ELISA quantification of DNA". // The Fifth International Cy tomegalovirus Conference "A multidisciplinary approach towards controlling cytomegalovirus disease". -1995. Stockholm, May 21-24, p.N.090. - P.105.

2. Dolgikh M.S., Vedjakov A.M. "PCR for detection of HCMV in fection in renal transplant patients". // FEMS Symposium on recent advances in the diagnosis of viral diseases. -1995 Istanbul, Turkey, July 20-22. - P.70.

3. Vedjakov A., Dolgikh M. "PCR for rapid diagnosis of cytomega lovirus disease in renal allograft recipients". // The Ninth Inter national Symposium on infections in the Immunocompromised Host. - 1996. Assisi, Italy, June 23-26, p.N.l58.

4. Долгих M.C., Ведяков A.M., Шипулина О.Ю., Баранова Ф.С. Диагностика ЦМВ-инфекции у реципиентов после аллотрансплантации почки методом полимеразпои цепной реакции (ПЦР). // Трансплантология и искусственные органы. - 1996. - N3. - С. 25-29.

5. Dolgikh M.S., Vedjakov A.M., Baranova F.S. "CMV-infection diagnostics in post transplant recipients". // 6th International Cytomegalovirus Workshop. Alabama, U.S.A. - 1997. March 5-9, p.N.A-69.

6. Vedjakov A.M., Dolgikh M.S., Baranova F.S. Cytomegalovirus infection in renal transplant recipients. // Clinical Microbiology end Infection. 8 th European Congress of Clinical Microbiology and Infection Diseases. Lausanne, Switzerland May 25-28. -1997. - V. 3. Sup.2, p.N.1036. -P.254

7. Dolgikh M.S., Vedjakov A.M., Baranova F.S. Monitoring of cytomegalovirus infected patients after renal, hart and bone marrow transplantation by PCR and ELISA. // Clinical Microbiology end Infection. 8 th European Congress of Clinical Microbiology and Infection Diseases. Lausanne, Switzerland May 25-28. -1997. - V. 3. Sup.2. p.N.1037. -P.254.

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии НИИТ и ИО. Автор выражает глубокую благодарность зав. лабораторией кандидату биологических наук Ф.С. Барановой за оказание постоянной помощи в исследованиях и обсуждение материала диссертации.