Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение структурно-функциональных характеристик фермента Tag ДНК-полимеразы с помощью моноклональных антител

На правах рукописи

ШЕРШАКОВА Надежда Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ФЕРМЕНТА Тщ ДНК-ПО ЛИМЕ РАЗЫ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2006 год

Работа выполнена в ГНЦ «Институте иммунологии Федерального медико-биологического агентства»

НаучиыН руководитель:

доктор биологических наук А.В.Фнлатов

Официальные оппоненты:

доктор биологический наук И.А.Николаева

доктор биологический наук, профессор А.М.Сапожников

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им.И.М.Сеченова Росздрава

Защита диссертации состоится МАЛЛА-г 2006 г. в

14 часов на заседании диссертационного совета Д 208,017.01 в ГНЦ «Институте иммунологии Федерального медико-биологического агентства» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ «Института иммунологии Федерального медико-биологического агентства»

Автореферат разослан « » 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.С.Сеслав]

Актуальность темы диссертации

Полнмеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее совершенным диагностическим методом молекулярной биологии, молекулярной генетики и клинической лабораторной диагностики. Для проведения ПЦР наиболее широко используется фермент Taq ДНК-полимераза (TaqPol) [Bernard et at., 1999]. Данный фермент проявляет одновременно два вида активности - полимеразную и экзонуклеазную, он является термостабильным и высокопроцессивным. Несмотря на все положительные свойства, проявляемые TaqPol, продолжается поиск разновидностей этого белка и создание новых форм, обладающих улучшенными потреб ительскнмн качествами. Для целенаправленной модификации фермента необходимо глубокое изучение структуры данного белка. Одним из инструментов исследования структуры белка являются моноклональные антитела. Кроме того, с помощью антител возможно не только изучение строения фермента, но и направленная регуляция его активности [Кохен Ф. и соавт., 1991].

ДНК-полимераза начинает работать уже при комнатной температуре сразу после приготовления ПЦР-смссн, еще до нагревания. Это может приводить к образованию неспецифнческих продуктов реакции, что существенно снижает чувствительность реакции. Для того чтобы исключить этот нежелательный эффект, применяют несколько способов. Наиболее традиционным подходом является физическое разделение ПЦР-смеси парафиновой прослойкой. Другой возможный метод - это использование специфических антител, блокирующих активность фермента до температуры денатурации антител, что позволяет инициировать начало реакции только после нагревания смеси. Применение антител по сравнению с физическим разделением реакционной смеси дает ряд преимуществ. Во-первых, использование антител уменьшает количество операций при приготовлении ПЦР-смеси, сокращая время подготовки к анализу. Во-вторых, поскольку температура плавления

парафиновой прослойки ниже, чем температура распада комплекса антител с ТачРо!, то использование моноклонапьных антител обеспечивает уменьшение количества неспецифнческих продуктов реакции, увеличивая специфичность анализа.

В связи с этим представляется актуальным изучение структуры и свойств Тач ДНК-полнмеразы, а также путей регуляции ее активности с помощью моноклональных антител.

Цель работы

Целью дайной работы являлось получение моноклональных антител, реагирующих с Taq ДНК-пол имеразой, способных регулировать активность фермента и перспективных для использования в диагностических ПЦР тсст-систсмах для создания условий «горячего старта».

Задачи исследования

1. Создать гибридом и ые линии, продуцирующие моноклональные антитела к Тац ДНК-полимеразе.

2. Определить эпитопиую структуру Taq ДНК-полнмеразы и доменную специфичность антител.

3. Изучить перекрестную реактивность полученных антител с другими термостабильными Д Н К-по л и м ср азам и.

4. Определить константы аффинности антител.

5. Изучить влияние моноклональных антител на функциональную активность Тац ДНК-полимсразы.

Научная новизна

Впервые проведено систематическое исследование эпитопной и доменной структуры Тач ДНК-полимеразы.

Впервые проведено исследование влияния антител на ферментативную активность ДНК-полимеразы при помощи ПЦР в режиме «реального времени» с использованием праймеров с заменами нуклеотидов.

Впервые найдено антитело, увеличивающее сродство Тац ДНК-полимеразы к дуплексам неспецифических праймеров с ДНК-матрицей.

Теоретическая и практическая значимость работы Настоящая работа выполнена в рамках программы фундаментальных исследований. Научная значимость настоящего исследования заключается в получении новых сведений об эпитопной и доменной структуре Тац ДНК-полимеразы. Полученные данные позволяют более целенаправленно вести поиск новых модификаций Taq ДНК-полимеразы, обладающих повышенными реакционными свойствами. Созданные антитела могут найти практическое применение в качестве компонента новых более совершенных ПЦР тест-систем.

Апробация работы Результаты исследований докладывались на П-ом Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 14-17 мая 2004 г.), на Ш-ем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, 25-27 октября 2005 г.), на 10-ой пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 17-21 апреля 2006 г.), на конкурсе научных работ молодых специалистов Института иммунологии (Москва, 14-15 декабря 2005 г.)*.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Объем и структура Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 122 источника, в том числе 15 отечественных, 107 зарубежных. Работа содержит 22 рисунка и 5 таблиц.

* - присуждено второе место.

Материалы и методы исследования

1. Получение и очистка рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы

ДНК-полимеразу получали из клеток E.coli штамма DH1,

содержащих рекомбинантную плазмиду с геном ДНК-пол имеразы Thermus aquaticus. Клетки лнзнровалн в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCI рН 7,9, 50 мМ KCI, 1 мМ EDTA, 1 мМ PMSF, 0,5% Tween 20, 0,5% NP-40. Полнмеразу выделяли на колонке BioRex 70. Активность фермента определяли при постановке ПЦР. Чистоту белка контролировали методом электрофореза в SDS-ПААГ. На электрофореграмме наблюдали единственную полосу, соответствующую молекулярной массе 94 кДа.

2. Получение и выращивание клеток, продуцирующих моноклональные антитела к Taq нолммерлзе

Мышей линии BALB/c иммунизировали рекомбинантным белком Taq ДНК-полнмсразой в/б по 100 мкг на мышь. Через 4-5 дней после последней (бустерной) иммунизации проводили гибридизацию. Слияние клеток проводили с помощью ПЭГ с молекулярной массой 1000 кДа.

Клетки после гибридизации разносили по 200 мкл в лунки 96-луиочных панелей и инкубировали их во влажной атмосфере с 5% СОг при 37 °С. Положительные культуры клонировали методом лимитирующих разведений и криоконсервировали. Для получения препаративных количеств антител гибридомы вводили мышам в/б, через 1-2 недели собирали асцитическую жидкость.

3. Выявление специфических антител к Taq ДНК-полимеразе методом твердофазного ИФА

К иммобилизированной на твердой фазе TaqPol (2 мкг/мл) добавляли культуральный супернатант, разведенный 1:1 в PBS, содержащим 0,25% желатина. Реакцию связывания первичных антител определяли добавлением козьих антител против мышиного иммуноглобулина, конъюгнрованных с перокендазон хрена. После удаления коньюгата в лунки вносили хромоген-субстратный раствор ТМБ. Результаты

ферментативной реакции регистрировали фотометрически на аппарате Titertek Multiscan 340, измеряя поглощение при 450 нм. При изучении доменной структуры на твердую фазу вместо полноразмерного фермента сорбировали отдельно синтезированный полимеразный домен TaqPol.

4. Взаимные блокировки антител

К иммобилизованной на твердой фазе TaqPol добавляли блокирующее мкАТ и инкубировали в течение I ч. Далее добавляли блокируемое мкАТ, коньюшрованное с биотином, а затем вносили стрептавидии, меченный пероксидазой хрена. После удаления конъюгата в лунки добавляли хромоген-субстратный раствор ТМБ. Концентрацию образовавшегося продукта определяли спектрофотомстрическн по поглощению при 450 им.

5. Иммуноблот

Электрофорез в восстанавливающих условиях проводили в 10% SDS-ПААГ. Белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану полусухим способом в течение 1 ч при постоянной силе тока 180 шА. Мембраны блокировали 1% раствором казеина на PBS и инкубировали с супернатантами гибридом, содержащих антитела к исследуемому белку. Реакцию связывания антител определяли добавлением козьих антител против мышиного иммуноглобулина, конъюгированных с пероксидазой хрена. Полосы визуализировали с помощью хемилюминесценции, используя набор Immun-Star HRP (Bio-Rad).

6. Постановка ПЦР

Активность TaqPol определяли методом полимеразной цепной реакции в модельной системе для выявления ДНК цитомегаловнруса (CMV) с внутренним контролем (ВК). Результаты ПЦР анализировали методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в присутствие бромистого этидня. Продукт амплификации ВК (900 bp) достоверно отличался по длине фрагмента от специфического продукта реакции (356 bp). В случае отсутствия в реакционной среде специфической

матрицы образовывался только фрагмент ВК, что свидетельствовало об отрицательном результате реакции при успешной постановке ПЦР. При положительной реакции наблюдалась либо единственная полоса специфического продукта, либо две полосы - ВК и специфического фрагмента, что зависело от соотношения концентраций ДНК-матриц. Реакционная смесь объемом 35 мкл содержала 20 мМ Трис-НС1 (рН 8.6 при 25 °С), 30 тМ КС1, 2,5 мМ М&С\2, 0,2 мМ каждого из (ШТРз, 0,4 мкМ специфических праимеров, 0,4 мкМ праймеров ВК, плазмиду ВК, 2,5 ед. (0,5 мкл) TaqPo!. Реакцию проводили либо в присутствие мкАТ при соотношении фермента и антитела 1/1, либо без мкАТ. В последнем случае так называемый «горячий старт» реакции реализовывали путем отделения нолимераэы парафиновой прослойкой (20 мкл) от остальных компонентов ПЦР-смсси. В отрицательном контроле парафиновой прослойки не было. В качестве образца использовали плазмиду со встроенным специфическим участком генома СМУ. Программа амплификации включала 35 циклов: 95 *С-5 с, 55 °С-5 с, 72 °С-5 с.

7. ПЦР в режиме «реального времени»

Для постановки эксперимента синтезировали одноцепочечную ДНК-матрицу, флуоресцентный зонд, а также фрагмент длиной 20 нуклеотидов, гомологичный 5'-концевому участку ДНК-матрицы, который впоследствии становился нраймером для второй цепи ДНК, образующейся в ходе ПЦР. Кроме того, использовались два вида праимеров, комплементарных 3'-концу ДНК-матрицы, однако отличающихся тем, что один из них являлся полностью комплементарным (т0), а другой содержал в своей последовательности четыре одионуклеотидых замены (гп4). Реакционная смесь содержала также 20 мМ Трис-НС1 (рН 8.6 при 25 °С), 30 шМ КС1, 2.5 мМ М§СЬ, 0,2 мМ каждого из сИЧТРз, 0,4 мкМ праймеров, от 0,1 до 0,4 мкМ флуоресцентного зонда, 2,5 сд, (0,5 мкл) ТацРо1 в комплексе с различными антителами. Смесь выдерживали при 35 °С в течение 15 мин, затем прогревали при 95 °С в течение 4 мин, далее 50 циклов: 93 °С-15 с,

62 °С-30 с. С каждым антителом проводили серию постановок, где присутствовал лишь один из синтезированных праймеров на 3'-конец ДНК-матрицы. Учитывая наличие или отсутствие продукта реакции, определяли способность антител блокировать активность фермента и сравнивали антитела относительно друг друга по эффективности блокировки полимеразы.

8. Определение аффинности мкАТ методом конкурентного ИФА

В предварительном эксперименте определяли концентрацию

исследуемых антител, необходимую для последующего конкурентного ИФА. За искомую концентрацию принимали ту, при которой сигнал в ИФА составлял 80% от сигнала плато. При проведении конкурентного анализа к иммобилизированной на твердой фазе TaqPol (2 мкг/мл) вносили смесь, содержащую разные концентрации полимеразы и определенное ранее количество мкАТ. Для выявления образования комплекса добавляли козьи антитела против мышиного иммуноглобулина, меченные пероксидазой хрена. За константу равновесия (IQ) принимали значение концентрации TaqPol, которая обеспечивала уровень реакции, соответствующий 50 % от сигнала реакции при нулевом содержании полимеразы. Константу аффинности (Ка) рассчитывали как величину, обратную значению константы равновесия (Ка).

9. Определение аффинности методом плазмонного резонанса

Исследование проводили на двухканальном биосенсоре «IASys»

(Affinity Sensors), используя кюветы с карбоксиметилдекстрановым покрытием. Карбоксильные группы декстрана активировали путем добавления смеси 0,4 М этиламинопропилкарбодиимид и ОД М N-гидроксисукцинимид. Иммобилизацию антигена (антител) проводили в PBS в течение 10 мин при концентрации белка 0,7 мкМ/л. Свободные валентности сенсора блокировали 1М этаноламином рН 8,5. На ассоциативном этапе опыта к ковалентно посаженому антигену (антителу) добавляли антитело (антиген) в различных концентрациях. В канал

отрицательного контроля антитело (антиген) не вносили. После каждого этапа связывания антигена (TaqPol) поверхность кюветы в течение 2 мин. промывали 10 мМ НС1, а после реакции с антителами - 1 М NaCl с 2 % дезоксихолатом натрия. Диссоциативный этап реакции индуцировали путем добавления PBS/T буфера.

Результаты экспериментов отражались на графике зависимости сигнала, выраженного в RU (response units, единицы ответа), от времени t (с). Единица RU соответствовала изменению массы связавшегося компонента на 5 пг/мм2. Полученные данные обрабатывались в программе «Fast fit».

10. Изучение термостабильности моноклональных антител

Эксперименты по методу дифференциальной сканирующей микрокалориметрии проводили на микрокалориметре DASM-4 с объемом ячейки 0.47 мл при скорости нагрева 0,5-2 К/мин. Антитела использовали в концентрации от 0,5 до 10,8 мг/мл. Перед экспериментами, образцы диализовались против 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,2, который служил также в качестве отрицательного контроля. На приборе регистрировали кривую плавления, т.е. зависимость теплоемкости раствора образца от температуры. Теплоемкость измерялась при постоянном давлении и являлась производной энтальпии по температуре: С=5Н/5Т. Энтальпию рассчитывали по формуле: Н(Т)= J С(Т) dT+H(To).

Результаты исследований и их обсуждение

1. Получение антител, специфичных к Taq полимеразе

После серии иммунизации мышей Taq ДНК-полимеразой, было проведено пять циклов гибридизаций, в результате которых получили несколько сотен первичных культур. Гибридомы скринировали на Taq ДНК-полимеразе методом ИФА. Были выбраны 22 первичные культуры, показавшие наибольшую связывающую активность. При последующем клонировании были отобраны клоны, стабильно продуцирующие мкАТ к

TaqPol. В конечном счете, было получено 15 гибридом, дающих стабильно положительный сигнал в ИФА с TaqPol.

В качестве позитивного контроля использовали анти-TaqPol мкАТ MGTP («Имтек», Москва). Две трети всех антител давали реакцию на уровне положительного контроля или выше, и лишь треть антител реагировала слабее положительного контроля. Это свидетельствует об удачном отборе антител и о высокой степени их связывания с TaqPol. Следует заметить, что фермент Taq ДНК-полимераза имеет бактериальное происхождение. Он был выделен из термостабильного микроорганизма Termus aquaticus. Филогенетическая удаленность белка объясняет обнаруженную высокую иммуногенность TaqPol.

2. Взаимные блокировки мкАТ

В экспериментах по взаимным блокировкам использовались все полученные антитела (Ро2, РоЗ, Роб, Poll, Ро12, Pol4-23) в немеченой форме и 4 антитела (Ро2, РоЗ, Ро14 и MGTP) в форме конъюгата с биотином.

Нами была выявлена группа из семи антител, в которой антитела в той или иной степени блокировали связывание друг друга с полимеразой (Ро2, Pol4, Po 19, Ро20, Ро21, Ро23 и MGTP). По-видимому, антитела данной группы реагируют с одной антигенной детерминантой. Следует отметить, что антитело Ро2 блокировало связывание антитела MGTP на 100 %, хотя в обратной ситуации блокировка отсутствовала не только с MGTP, но и со всеми другими антителами, мешающими взаимодействию MGTP с TaqPol. Таким образом, между Ро2 и MGTP наблюдается асимметричная блокировка, которую наиболее часто объясняют разницей в аффинитете антител. По всей видимости, антитело Ро2 обладает более высоким сродством к TaqPol и оно вытесняет все конкурирующие антитела при связывании.

Три пары антител РоЗ с Ро2, Ро2 с Ро14 и РоЗ с MGTP не мешали связыванию друг друга с ферментом, что свидетельствует о существовании, по крайней мере, трех не перекрывающиеся эпитопов.

На основании полученных данных, можно предположить схему взаимного перекрывания эпитопов TaqPol, распознаваемых разными антителами, которая представлена на рисунке 1.

Ро2

Рис, 1. Карта эпитопов ТацРо1, полученная на основании взаимных блокировок в ИФА.

3. Определение аффинности мкАТ к Тад ДНК-пол им еразе

Аффинность антител, которая определяется константой аффинности

(Ка), является важной характеристикой мкАТ, показывая степень сродства

с антигеном. Для иммупохимнческих приложений наиболее интересны

в |

высоко аффинные антитела, К, которых больше 10 М'.

Для того чтобы оценить перспективность использования полученных нами антител были определены соответствующие константы связывания двумя независимыми методами: конкурентным иммуноферментным методом и методом плазмонного резонанса.

Методом конкурентного ИФА были определены К. трех моноклональных антител (Ро2, РоЗ и Ро14) (рис. 2).

110 -

100 -

90-

80-

70 -

Со4 60-

< 50 -

40-

30-

20 -

10-

0-

-9,8 -9,35 -8,9 -8,4 -7,9 -7,4 -6,9 -6,5 к^ТачРо!], М

Рис. 2. Определение аффинности мкАТ методом конкурентного ингибироваиия. По оси ординат - оптическое поглощение, выраженное в % от максимальной адсорбции.

Было обнаружено, что при связывании антител с TaqPol,

адсорбированной на пластике для 50 % ингибироваиия реакции необходимы концентрации свободной полимеразы в пределах 0,15-320 нМ. Как было определено, наибольшей аффинностью к ТацРо1 обладали антитела Ро2 и РоЗ, К, для которых составляли 1,15хШ9 М*1 и 1,2x10* М"1 соответственно. Константа аффинитета (Ка) антитела Ро14 была существенно меньше и равнялась 4х108 М'1.

Определение аффинности методом плазмонного резонанса проводили на оптическом биосенсоре «1АБу5» для четырех моноклональных антител (Ро2, РоЗ, Ро14 и Ро15) (рис. 3), После иммобилизации TaqPol на поверхности сенсора добавляли специфические антитела в различных концентрациях. Экспоненциальное нарастание

единиц ответа (1Ш) на сенсорограммах отражало кинетику специфического связывания антител с ТачРо!.

70-

Ответ (RU)

РоЗ

40 -

30"

60-

50"

20"

10"

0

5

10

Бр емя (мин)

15

20

Рис. 3. Результаты определения аффинности мкАТ на оптическом биосснсоре «lASys».

Видно, что кривые ассоциации, полученные за время наблюдения 10

мин, для антител Ро14 и Pol5 практически выходили на уровень насыщения. Ссисорограмма Ро2 за такое же время только приближалась к уровню насыщения, а амплитуда кривой ассоциации РоЗ являлась самой большой и по прошествии 10 мин была далека от насыщения. После стадии ассоциации антител, индуцировали диссоциативный этап путем добавления буфера PBS/T. При этом наблюдали падение сигнала, что соответствовало частичному распаду комплекса антигена и антитела. Скорость диссоциации была наивысшей для антител Ро14 и Ро15, а наименьшей - для РоЗ. Расчет констант ассоциации и диссоциации проводили в программе «Fast fit», а Ка определяли по формуле: Ка=Касс/Кдисс.

Абсолютные значения К„, определенные методом ИФА и на приборе «lASys», были близки друг к другу. Порядок расположения антител по увеличению К, был следующим: Pol4, Pol5, Ро2 и РоЗ. Взаимные

соотношения констант антител, определенные двумя методами, коррелировали между собой (табл. 1).

Табл. 1. Сравнение констант аффннноетп антител, определенных методом ИФЛ и на приборе «1А5у$».

Антитела К», полученная методом ИФА (М*') Ка, полученная на приборе «IASys» (М*')

Ро2 l,15xlOv (2,0±0,7)xl0v

РоЗ 1,2x10* (З.НШхЮ"

Ро14 4x10s О,0±0,2)х10'

Pol 5 - (1,4±0,1)х10в

Следует отметить, что значения К„, полученные для антител Ро2 и РоЗ превышали 109 М*', и их по праву можно отнести к высокоаффинным антителам.

4. Доменная специфичность моиоклональных антител

Для определения доменной специфичности антител была изучена их реактивность с полимеразным доменом в сравнении со связыванием с полноразмерным белком TaqPol. В качестве полимеразного домена использовался фрагмент KlenTaq. Молекулярные массы указанных белков составляют 94 и 63 кДа, соответственно. Исследование проводились иммуноферментным методом и методом иммуноблота (рис. 4).

Было обнаружено, что 11 антител в равной степени реагировали как с полной последовательностью TaqPol, так и с полимеразным доменом фермента. Три антитела (Poll, Ро12 и Ро15) связывались исключительно с цельным белком. Некоторую особенность проявляло антитело Ро16, которое при нормальной реакции с цельным ферментом слабо распознавало фрагмент KlenTaq.

Очевидно, что большинство полученных антител специфично к полимеразному домену фермента, и лишь малая часть распознает нуклеазный домен. Что касается антитела Pol6, то оно, вероятно, связывается с эпитопом, находящимся па границе полимеразного и нуклеазного доменов.

кДа 1 2 1 2 1 2 1 2

94 63

Рис. 4, Определение доменной специфичности мкАТ в иммуноблоте полноразмерного TaqPol (1) и полимеразного домена KlenTaq (2). Реакцию проявляли специфическими антителами РоЗ, Poll и Po 16. Отрицательный контроль - нормальный иммуноглобулин мыши (Nig). Молекулярные массы TaqPol (94 кДа) и KlenTaq (63 кДа) показаны слева.

Таким образом, более 80 % полученных антител обладали

специфичностью к полимеразному домену фермента. Несмотря на то, что молекулярная масса нуклеазного домена составляет более 30 % от массы полноразмерного TaqPol, тем не менее, доля антител, распознающих аминокислотные последовательности вне полимеразного домена, составляет всего лишь 14 % от общего количества полученных антител. Можно предположить, что неравная представленность антител различной специфичности является следствием большей иммуногенности полимеразного домена, по сравнению с нуклеазным.

5. Изучение взаимодействия полученных антител с другими видами ДНК-пол им ер аз методом ИФА и иммуноблота

Кроме Taq ДНК-полимеразы описан ряд других ДНК-полимераз, которые пока не получили широкого распространения, но в силу ряда свойств, представляют интерес для изучения. В данной работе были исследованы два препарата Taq ДНК-полимеразы (TaqPol 0112 и BioTaqPol), полученные из разных источников, а также две других ДНК-полимеразы TthPol и PfuPof.

Методом ИФА была определена способность связывания всей панели полученных антител с указанными ДНК-полимеразами (рис. 5).

Все 15 антител давали положительную реакцию с препаратами TaqPol, полученными из различных источников. Ни одно из антител не

I I I I I Nig РоЗ Poll Ро16

реагировало с РШРо!, а три антитела (Ро2, РоЗ и Ро14) распознали ТЧЬРоЬ Полученные результаты были подтверждены в иммуноблотс. Подобная кросс-реактивность антител между двумя полимеразами (ТШРо! и ТП1Ро1) отмечалась ранее [БсаНсе Е.Я. е1 а1., 1994] и легко объясняется при сравнении аминокислотных последовательностей различных полимераз.

1,8 i,6 1,4 1.2 1 -

3. 0.8 <

0,6 - ■

0,4 -

0,2 --

0 +

ilk

к

дЫЁ

BTaqPol 0112 dBioTaq OTlhPol ■PfuPol

к ni

к

t

1

Po2 РоЗ Poll Po 12 Po 14 Pol5 Pol« Po 17 Po 18 Po 19 Po20 Po21 Po22 Po23

mkAT

Рис. 5. Взаимодействие антител с различными ДНК-полимеразами в ИФА. Различные ДНК-полимеразы иммобилизировалн на твердой фазе (в лунках полистироловых планшетов), после чего вносили супернатанты, содержащие мкАТ. Образование комплекса выявляли с помощью антимышиных антител.

Аминокислотные последовательности ТацРо1 и ТЧЬРо! совпадают между собой более чем на 87 %. ТЧИРо! отличается от TaqPol, прежде всего, точечными заменами аминокислот. Кроме этого, последовательность ТЧЬРо! длиннее ТаяРо1 на 3 аминокислоты. Белок РШРо! по своей аминокислотной последовательности практически на 100 % отличается от ТаяРо! и НИРоК Таким образом, полимеразы ТацРо1 и Т1ЬРо1 проявляют гомологию и несут некоторые общие эпитопы.

6. Исследование влияния моноклональных антител на полнмеразную активность Тац ДНК-полимер азы

Влияние трех выделенных антител (Ро2, РоЗ и Ро15) на активность Taq ДНК-полимеразы было изучено в классической ПЦР и ПЦР в режиме «реального времени».

При постановке классической ПЦР амплификацию положительного контрольного образца СМУ, проведенной в условиях «горячего старта», сравнивали с результатами полимеразной реакции в присутствие антител в режиме «холодного старта». В качестве контроля использовался коммерческий препарат антител к Тац ДНК-полимеразе МОТР («Имтек», Москва).

На полученных электрофореграммах полосы внутреннего контроля присутствовали во всех вариантах постановки ПЦР, за исключением экспериментов, выполненных при «холодном старте». Это свидетельствовало об успешном проведении реакции. Специфические полосы амплифицпрованной последовательности СМУ были хорошо видны при проведении реакции в условиях «горячего старта», а при «холодном старте» специфические полосы проявлялись менее отчетливо, и элсктрофореграмма искажалась наличием дополнительных неспецифическнх полос. При добавлении в реакционную смесь антител Ро2 и РоЗ, несмотря на то, что условия соответствовали «холодному старту», наблюдалась картина, характерная для «горячего старта».

Таким образом, в присутствие антител ПЦР, по-видимому, начиналась после специфического отжига праймеров (~60 °С), а до этой температуры полимеразная активность Taq ДНК-полимеразы была эффективно заблокирована. В отличие от этого добавление антитела Ро15 не оказывало на ход реакции заметного влияния, и интенсивность зарегистрированных специфических и неспецифических полос амплификации была такая же, как при отсутствии «горячего старта». Что

касается антитела Ро14, то после проведенной с ним ПЦР, было выявлено заметное увеличение образования неспецифических продуктов реакции,

С помощью ПЦР в режиме «реального времени» было проведено исследование характера влияния антител к Тац ДНК-полимеразе на кинетику полимеразной цепной реакции. Амплификацию фрагмента 1-цепочечной ДНК-матрицы инициировали либо полностью комплементарными праймерами (шО), либо праймерами с заменами нуклеотидов (ш4). Для указанных вариантов праймеров была предварительно определена примерная температура присоединения к ДНК-матрице (температура отжига), которая отражает степень их специфичности. Специфические праймеры (шО) отжигались при высокой температуре (60 °С), а неспецифические (ш4) - при более низкой (44 °С).

Реакцию амплификации с праймерами т0/ш4 проводили с разделением и без разделения компонентов ПЦР-смеси парафиновой прослойкой. В последнем случае ПЦР осуществляли как при добавлении, так и в отсутствие различных антител. При проведении ПЦР в режиме «холодного старта» или с антителами Ро15/Ро14 наблюдалось образование и специфических (с праймером шО), и неспецифических (с праймером ш4) продуктов реакции (рис. 6). Наличие реакции со всеми видами праймеров свидетельствует о том, что антитела Ро15 и Ро14 не блокировали полимеразную активность фермента, и Тац ДНК-полимераза беспрепятственно работала, присоединяясь ко всем отжигавшимся праймерам. При проведении реакции с участием Ро14 интервал между «специфическими» и «неспецифическими» кривыми заметно сокращен. Такой эффект может объясняться тем, что образование комплекса между Тач ДНК-полимеразой и антителом Ро14 повышает сродство фермента к дуплексам неспецифических праймеров с ДНК-матрицей, что, возможно, является следствием изменения ферментом своей конформации.

Рис. б. Сравнение хода реакции амплификации без разделения компонентов ПЦР-смеси парафиновой прослойкой в отсутствие антител (А) и с добавлением антитела Ро15 (Б). Реакцию проводили с праймерами шО (сплошные линии) и ш4 (пунктирные линии). По оси абсцисс - номер цикла, по оси ординат — интенсивность флуоресценции (отн.ед.).

700 -г 600 -500 -400 -300 -200 -100 -о 4-о

Рис. 7. Сравнение хода реакции амплификации при разделении компонентов ПЦР-смеси парафиновой прослойкой (А) и без парафиновой прослойки,, но с добавлением мкАТ РоЗ (Б). Реакцию проводили с праймерами шО (сплошные линии) и т4 (пунктирные линии). По оси абсцисс - номер цикла, по оси ординат - интенсивность флуоресценции (отн.ед.).

При ПЦР образцов с парафиновой прослойкой неспецифические продукты не образовывались, а кривые амплификации практически

20

совпадали с таковыми, полученными для образцов без парафиновой прослойки, но с добавлением антитела Ро2 или РоЗ (рис. 7).

Итак, результаты, полученные с помощью классической ПЦР и ПЦР в режиме «реального времени» хорошо согласуются между собой. Показано, что наличие в ПЦР-смеси антитела Ро15, не реагирующего с полимеразным доменом ТацРо1, не влияло на активность ТацРо! и не изменяло ход ПЦР. Антитела Ро2 и РоЗ, распознающие эпитопы на полимеразном домене, блокировали полимеразную активность ТацРо! вплоть до температуры собственной денатурации, и в результате ПЦР наблюдалось образование только специфических продуктов. Для антитела Ро14, специфичного к полимеразному домену, было показано, что оно увеличивало активность фермента, поскольку наблюдалось примерно одинаковое количество продуктов реакции как с полностью комплементарными, так и с измененными праймерами,

7. Исследование термостабильности мкАТ методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии

Температура денатурации является важной характеристикой моноклональных антител, использующихся для блокирования активности термостабилыюй Тац ДНК-полнмеразы в ПЦР. Процесс денатурации антител исследовали методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, который широко применяется для изучения кинетики плавления макромолекул. Эксперименты проводили с антителами Ро2, РоЗ, Ро14 и Ро15.

На рисунке 8 приведена кривая плавления для наиболее интересующего нас антитела РоЗ, из которой видно, что антитело РоЗ денатурирует при температуре 349 К или 76 °С. Высокая температура денатурации РоЗ позволяет сделать вывод о перспективности его использования в ПЦР, поскольку чем устойчивее антитело, блокирующее полимеразную активность ТацРо!, к нагреванию, тем меньше будет образовываться неспецифичсских продуктов ПЦР,

т, К.

Рис. 8. Определение температуры денатурации моноклонального антитела РоЗ методом дифференциальной сканирующей микро калориметрии.

8. Исследование термостабилыюсти комплекса ДНК-

полимеразы с мкАТ

ТацРо1 является более термостабильным белком по сравнению с иммуноглобулином. Поэтому при нагревании в ПЦР антитело, находящееся в комплексе с ферментом, денатурирует, и фермент высвобождается. С целью определения температуры распада комплекса, на него воздействовали различными температурами в диапазоне от 37 до 87®С в течение 15 минут. Эксперимент проводили с антителами Ро2, РоЗ и Ро14.

Тестирование высвобождавшейся ТачРо1 проводили методом ИФА. Было определено, что распад комплексов полимеразы с антителами Ро2 или РоЗ происходил при температуре 70 °С, а из комплекса с Ро14 фермент высвобождался при 67 °С. Этн результаты показывают, что комплекс полимеразы с исследованными антителами являлся стабильным в диапазоне температур ниже 60 °С, что должно исключать образование неспецнфических продуктов реакции при условии блокирования антителами активного центра ТацРоЬ

22

Обращает на себя внимание тот факт, что комплекс полимеразы с антителом РоЗ распадается при более низкой температуре (70 °С), чем происходит денатурация самого антитела (76 *С). По-видимому, связь между ТацРо1 и антителом разрывается быстрее, чем происходит полная денатурация антитела. Однако, возможно, что распад комплекса обусловлен увеличением константы диссоциации при повышении температуры.

Таким образом, антитела Ро2 и РоЗ являются перспективными для использования в ПЦР-наборах, поскольку их комплекс с полимеразой оказался стабильным при нагревании по крайней мере до 70 °С, что обеспечивает образование только специфических продуктов полнмеразной реакции.

Выводы

1. Получена панель из 15 гибридом, сскретирующих моноклональные антитела к ферменту Тац ДНК-полимсразе.

2. Определена эпитопная и доменная специфичность полученных антител. Построена антигенная карта белка ТачРо!, включающая в себя, по крайней мере, три группы взаимно не перекрывающихся эпитопов. Три антитела реагировали с нуклеазным доменом Тач ДНК-иолнмеразы, 11 антител — с полимеразным, а одно антитело распознавало эпитоп, находящийся на границе доменов.

3. Для трех антител обнаружена перекрестная реактивность с ТШ ДНК-пол и меразой, выделенной из термофильной бактерии ТЬегшиз ШегторЬПиБ.

4. Методом плазменного резонанса, а также методом конкурентного ннгибнрования определены константы аффинности антител, которые соответствовали друг другу и находились в области от 107 до 3,1 * Ю9 М'1. Измерены также константы ассоциации и диссоциации комплексов антиген-антитело.

5. Показано, что антитело Pol5, взаимодействуя с TaqPol, не блокирует полимеразную активность фермента и никак не влияет на ход ПЦР. При взаимодействии полимеразы с антителом Ро14 наблюдалось увеличение ферментативной активности TaqPol, что приводило к образованию большего количества неспецифических продуктов реакции.

6. Антитела Ро2 и РоЗ блокировали полимеразную активность Taq ДНК-полимеразы. Блокировка активности фермента снималась после распада комплекса при нагревании реакционной смеси до 70 *С.

7. Получены гибридомы, продуцирующие антитела, которые обеспечивают условия «горячего старта» и являются перспективными для использования в качестве компонентов ПЦР-диагностикумов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Семенихина H.H., Храмцов A.B., Филатов A.B. Изучение антигенной структуры белка р24 ВИЧ-1. Аллергология и иммунология, 2004, т. 5, № 1, с. 110.

2. Семенихина H.H., Храмцов A.B., Абрамов Д.Д., Павлова ОХ., Трофимов Д.Ю. и Филатов A.B. Получение антител к Taq ДНК-полимеразе. Материалы третьего съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва, 2005, с. 20.

3. Семенихина H.H., Абрамов Д.Д. Изучение структурно-функциональных характеристик Taq ДНК-полимеразы. Материалы 10-ой пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века». Пущино, 2006, с. 47.

4. Семенихина H.H., Павлова О.Г., Храмцов A.B., Савилова A.M. и Филатов A.B. Получение гибридом, секретирующих специфические антитела к Taq ДНК-полимеразе, и изучение структурной характеристики фермента. Физиология и патология иммунной системы, 2006, т. 10, № 5, с. 3-10.

Подписано в печать 11.10, 06 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 514 . Отпечатано а службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН

11S47S, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы диссертации

Taq ДНК-полимераза (TaqPol) - фермент, который в настоящее время широко используется при ПЦР-диагностике различный заболеваний, генотипировании и во многих молекулярно-биологических приложениях [25]. Данный фермент проявляет одновременно два вида активности - полимеразную и экзонуклеазную, является термостабильным и высокопроцессивным. Несмотря на все положительные свойства TaqPol, ведется поиск и создание новых форм этого белка, обладающих улучшенными потребительскими качествами. Для целенаправленной модификации фермента необходимо глубокое изучение структуры данного белка. Одним из инструментов исследования структуры белка являются моноклональные антитела. С помощью антител возможно не только изучение строения фермента, но и направленная регуляция его активности [5].

ДНК-полимераза проявляет заметную активность уже при комнатной температуре и начинает работать сразу после приготовления ПЦР-смеси, еще до нагревания. Это может приводить к образованию неспецифических продуктов реакции, что существенно снижает чувствительность реакции. Для того, чтобы исключить этот нежелательный эффект, применяют несколько способов, одним из которых является использование специфических антител, блокирующих активность фермента до температуры денатурации антител, что позволяет инициировать начало реакции только после нагревания смеси. Применение антител в ПЦР дает ряд преимуществ, например, по сравнению с широко используемым физическим разделением смеси парафиновой прослойкой. Во-первых, применение антител уменьшает количество операций при приготовлении ПЦР-смеси, сокращая время подготовки к анализу. Во-вторых, поскольку температура плавления парафиновой прослойки ниже, чем температура распада комплекса антител с TaqPol, то использование моноклональных антител 6 обеспечивает уменьшение количества неспецифических продуктов реакции, увеличивая специфичность анализа.

В связи с этим представляется актуальным изучение структуры и свойств фермента, а также регуляции его активности, с помощью моноклональных антител.

Цель работы

Целью данной работы являлось получение моноклональных антител, реагирующих с Taq ДНК-полимеразой, способных регулировать активность фермента и перспективных для использования в диагностических ПЦР тест-системах для создания условий «горячего старта».

Задачи исследования

1. Создать гибридомные линии, продуцирующие моноклональные антитела к Taq ДНК-полимеразе.

2. Определить эпитопную структуру Taq ДНК-полимеразы и доменную специфичность антител.

3. Изучить перекрестную реактивность полученных антител с другими термостабильными ДНК-полимеразами.

4. Определить константы аффинности антител.

5. Изучить влияние моноклональных антител на функциональную активность Taq ДНК-полимеразы.

Научная новизна

Впервые проведено систематическое исследование эпитопной и доменной структуры Taq ДНК-полимеразы.

Впервые проведено исследование влияния антител на ферментативную активность ДНК-полимеразы при помощи ПЦР в режиме «реального времени» с использованием праймеров с заменами нуклеотидов.

Впервые найдено антитело, увеличивающее сродство Taq ДНК-полимеразы к дуплексам неспецифических праймеров с ДНК-матрицей.

Теоретическая и практическая значимость работы

Настоящая работа выполнена в рамках программы фундаментальных исследований. Научная значимость настоящего исследования заключается в получении новых сведений об эпитопной и доменной структуре Taq ДНК-полимеразы. Полученные данные позволяют более целенаправленно вести поиск новых модификаций Taq ДНК-полимеразы, обладающих повышенными реакционными свойствами. Созданные антитела могут найти практическое применение в качестве компонента новых более совершенных ПЦР тест-систем.

Публикации

1. Семенихина Н.Н., Храмцов А.В., Филатов А.В. Изучение антигенной структуры белка р24 ВИЧ-1. Аллергология и иммунология, 2004, т. 5, № 1, с. 110.

2. Семенихина Н.Н., Храмцов А.В., Абрамов Д.Д., Павлова О.Г., Трофимов Д.Ю. и Филатов А.В. Получение антител к Taq ДНК-полимеразе. Материалы третьего съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва, 2005, с. 20.

3. Семенихина Н.Н., Абрамов ДД Изучение структурно-функциональных характеристик Taq ДНК-полимеразы Материалы 10-ой пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2006, с. 47.

4. Семенихина Н Н., Павлова О.Г., Храмцов А.В., Савилова A.M. и Филатов А.В. Получение гибридом, секретирующих специфические антитела к Taq ДНК-полимеразе, и изучение структурной характеристики фермента. Физиология и патология иммунной системы, 2006, т. 10, № 5, с. 3-10.

1. Обзор литературы

Выводы

1. Получена панель из 15 гибридом, еекретирующих моноклональные антитела к ферменту Taq ДНК-полимеразе.

2. Определена эпитопная и доменная специфичность полученных антител Построена антигенная карта белка TaqPol, включающая в себя, по крайней мере, три группы взаимно не перекрывающихся эпитопов. Три антитела реагировали с нуклеазным доменом Taq ДНК-полимеразы, 11 антител-с полимеразным, а одно антитело распознавало эпитоп, находящийся на границе доменов.

3. Для трех антител обнаружена перекрестная реактивность с Tth ДНК-полимеразой, выделенной из термофильной бактерии Thermus thermophilus.

4. Методом плазмонного резонанса, а также методом конкурентного ингибирования определены константы аффинности антител, которые соответствовали друг другу и находились в области от 107 до 3,1*109 М'1. Измерены также константы ассоциации и диссоциации комплексов антиген-антитело.

5. Показано, что антитело Pol5 взаимодействует с TaqPol, но не блокирует полимеразную активность фермента и никак не влияет на ход ПЦР. При взаимодействии полимеразы с антителом Pol4 наблюдалось увеличение ферментативной активности TaqPol, что приводило к образованию большего количества неспецифических продуктов реакции.

6. Антитела Ро2 и РоЗ блокировали полимеразную активность Taq ДНК-полимеразы. Блокировка активности фермента снималась после полной денатурации антител при нагревании реакционной смеси до 70 "С.

7. Получены гибридомы, продуцирующие антитела Ро2 и РоЗ, которые обеспечивают условия «горячего старта» и являются перспективными для использования в качестве компонентов ПЦР-диагностикумов.