Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярные маркеры рака шейки матки

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР имени Н.Н.Блохина

" • •' На правах рукописи

2 3 АО? №

САМОЙЛОВА Элла Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ. (Специальность - 14.00.14)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Москва 1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии вирусов (руководител! - доктор биологических наук, профессор Ф.Л. Киселев)

НИИ Канцерогенеза (директор - академик РАЕН Д.Г.Заридзе) Онкологическое Научного Центра им. Н.Н.Блохина Российской Академии Медицинских Hayi (директор - академик РАМН Н.Н.Трапезников).

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Ф.Л.Киселев. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук К.В.Ильин - руководител! лаборатории иммунологии онкогенных вирусов НИИ Канцерогенеза OHL РАМН, доктор биологических наук В.С.Прасолов - руководитель лаборатории ^ блока клеточной инженерии и культур клеток Института Молекулярной Биологии им. В.А. Энгелыардта РАН.

Ведущее учреждение: Московский Научно-Исследовательский Онкологический институт им. П.А.Герцена МЗМП Российской Федерации.

Защита диссертации состоится иЗо "мая 1996 г. в "_" часов на заседании

Специализированного Ученого Совета по присуждению ученой степени кандидата наук в Онкологическом Научном Центре РАМН по адресу: г.Москва, 115478, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического Научного Центра РАМН.

Автореферат разослан 1996 года.

Ученый секретарь

Специализированного Ученого Совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ, ктуалыюсть проблемы. Высокий уровень заболеваемости (440.000 случаев в год) смертности женщин от рака шейки матки (II место после рака молочной елезы) (Zur Hausen & Rosi, 1995) привлекает внимание мировой науки и 5ставляет рассматривать его как одну из важнейших проблем здравоохранения, связи с этим изучение молекулярно-генетических маркеров рака шейки матки, ак отражение этапов его этиопатогенеза представляет актуальную задачу. В астоящее время, в результате накопления в мире большого количества пидемиологических й экспериментальных данных, рак шейки матки редставляет собой уникальную модель вирусного канцерогенеза, для которой: доказана ассоциация неоплазии с инфекцией вирусами папиллом человека, определены основные факторы риска и пути передачи инфекции, охарактеризованы трансформирующие вирусные гены Е6, Е7, Е5 и возможные механизмы их действия,

идентифицированы некоторые клеточные гены, нарушение функций которых, может приводить к возникновению благоприятных условий для реализации вирусными онкогенами их трансформирующего потенциала,-стимуляции клеточной пролиферации, мутагенеза с последующим развитием инвазивного, метастазирующего новообразования (Zur Hausen & Rosi, 1995).

В то же время многие вопросы остаются невыясненными. Длительный стентный период инфекции, продолжающийся обычно более 10 лет, тот факт, го лишь у небольшого числа инфицированных латентная инфекция приводит к 1звитню рака, моноклональность опухолей, содержащих интегрированные ярусные последовательности, дает основания предполагать, что инфекция лрусом папиллом является необходимой, но не достаточной для развития юкачественного новообразования. Совершенно очевидно, что в процесс )ансформации клеток вовлечены и другие клеточные факторы, участвующие в :гуляции клеточного цикла и дифференцировки клеток. В связи с этим редставлялось важным выяснить: является ли интеграция вирусных аследовательностей в ДНК клеток обязательным условием их >ансформации, как изменяется уровень экспресии белка р53 - продукта гена-шрессора опухолевого роста в клетках рака шейки матки по отношению к зовню экспресии его в морфологически нормальных тканях шейки матки, арушение функций белка р53 в клетке и трансформирующая активность эодуктов вирусных онкогенов Е6 и Е7 способствуют дестабилизации генома в тетках опухолей, проявляющейся в появлении модификаций за счет звышения уровня рекомбинаций ДНК и мутаций (точечных мутаций, :леций, вставок и перестроек в структуре клеточных генов) (zur Hausen, )94) Одними из маркеров плпимпрфизма генов и перестроек генома в 1етках опухолей являются некодирующие, повторяющиеся эследовательности, сцепленные с генами: мини- и микросателлиты. Исходя i этого в работе проведен анализ двух типов таких последовательностей - 28-1енных тандемных минисателлитных повторов (VTR) в локусе гена Ha-rasI на хромосоме и микросателлитных динуклеотидных повторяющихся

последовательностей в локусе генов фактора некроза опухоли (TNF) не хромосоме человека.

Таким образом, данное исследование было направлено на изучение р молекулярно-генетических маркеров, характерных для рака шейки матки целью выяснения их возможной практической и диагностической значимости

Цели и задачи исследования. Целью данной работы был молекуляр: биологический анализ клинического материала больных раком шейки матки ряду маркеров:

• исследование распространенности HPV инфекции и распределения тш вируса папилломы в опухолевых тканях рака шейки матки и морфологиче< нормальных тканях, прилегающих к опухолевым;

• сравнительный анализ физической формы ДНК вируса в опухолевой ткан зависимости от стадии опухолевой профессии и в морфологичес нормальных тканях, прилегающих к опухолевым;

• анализ экспрессии вирусного генома;

• исследование уровня белка-супрессора опухолевого роста р53 в опухолег клетках рака шейки матки и условно нормальных тканях, прилегающи; опухолевым;

• анализ полиморфизма рестрикционных фрагментов минисателлитг повторов в некодирующей области локуса гена Ha-rasI, как марке] предрасположенности к развитию неопластического процесса и генома перестроек на коротком плече 11 хромосомы;

• анализ полиморфизма микросателлита TNF-a локуса генов TNF, сцеплени с генами МНС (Major Histocompatibility Complex) на коротком плече хромосомы, как маркера нестабильности генома;

Научная новизна. Настоящая работа представляет собой фрагм! Международного проекта, направленного на изучение роли молекуляр! генетических детерминант, характеризующих как различные стадии опухолев! процесса, так и имеющих прогностическое и диагностическое значен Фактически исследование такого количества детерминант проводится в миро! практике впервые. Это позволяет на достаточно большой выборке больн оценить значимость определенных молекулярно-генетических детерминант i оценки клинического статуса больных.

Практическая значимость работы. В основном результаты работы име теоретическое значение. Последовательности вирусов папиллом выявляются всех исследованных в работе образцах тканей рака шейки матки, а такж! образцах прилегающих морфологически нормальных тканей. В последи вирусная ДНК выявляется как правило с помощью высокочувствительнс метода полимеразной цепной реакции. Это с одной сторо: свидетельствует о том, что персистенция вирусного генома не являет достаточным условием для инициации опухолевой трансформации, другой же стороны имеет важное практическое значение, посколг персистенция вирусного генома в морфологически нормальных ткан после проведенного курса лучевой терапии и оперативного вмешательств

предполагают возможность рецидивов заболевания и ставит вопрос о радикальности проведенного лечения.

Апробация работы. Диссертационная работа апробирована на совместной конференции лабораторий: иммунологии онкогенных вирусов, молекулярной биологии вирусов, регуляции вирусных и клеточных онкогенов, вирусного канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН 23 января 1996 года.

Материалы работы были представлены на 2 Международном конгрессе "Папилломавирусы в патологии человека" (Париж, 1994), на VIII республиканской научно-практической конференции по актуальным вопросам диагностики и лечения злокачественных новообразований "Онкология-95" (Казань, 1995), на 14 Международной конференции по папилломавирусам (Квебек, 1995), на 1 Съезде Международного союза ассоциаций патологоанатомов (Москва, 1995). По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов, эезультатов и выводов. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, включая 9 таблиц, 18 рисунков, 6 схем и список литературы из 320 источников.

Содержание работы.

Материалы.

Образцы опухолевых и морфологически нормальных тканей были толучены из клиник НПО "Онкология", г.Казань и ОНЦ РАМН, г.Москва, и побезно предоставлены д.м.н. Петровым C.B., д.м.н., проф. Козаченко В.П., I.M.H. Нечушкиным М.И. и к.м.н. Лебедевым А.И. Морфологический анализ материала проводился д.м.н. С.В.Петровым (кафедра патологической анатомии казанского медицинского университета) и д.м.н. A.B.Смирновым (отдел татоморфологии ОНЦ РАМН). Сбор материала и создание банка биопсийного материала осуществлялся к.б.н. Л.А.Семеновой. Всего было проанализировано 122 образца тканей, среди них - 65 образцов плоскоклеточного рака шейки латки, 4 случая аденокарциномы шейки матки, 42 образца морфологически юрмальных тканей, прилегающих к опухолевым, и 11 образцов нормальных "каней шейки матки от больных другими неопластическими заболеваниями юловых органов. Образцы опухолевой ткани были представлены случаями рака цейки матки с различными стадиями опухолевой прогрессии: Т1а-Т3. В работе ¡ыли использованы также, полученные из карцином шейки матки, клеточные [инии SiHa-17, С4-1 (DKFZ, Germany), HeLa (Biomedical Centre, University of Jppsala, Sweden) и линия клеток SW480, полученная из клеток карциномы :ишечника человека, экспрессирующих стабильный мугантный белок р53 [юбезно предоставленная Хохловой О.Г., лаборатория Пролиферации Клеток, Институт Молекулярной Биологии им. Энгельгардта.

Методы.

Препараты ДНК и РНК из тканей получали гуанидинтиоцианатным 1етодом, предварительно разрушив образец тканей на микродисмембраторе до

порошкообразного состояния в условиях глубокой заморозки. Суспензи порошка в 4.5 М лизирующем гуанидинтиоционатном буфере раздели; центрифугированием через "подушку" CsCl. Фракцию ДНК отбирали подвергали стандартной очистке смесью изоамилового спирта и хлорофорь (24:1) по методике Спитковского (1986), осаждали и хранили при -20°С. Осадс РНК после переосаждения растворяли в тридистиллированной воде и храни; при -70°С. Концентрацию препаратов ДНК и РНК определя; спектрофотометрически.

ДНК, выделенную из тканей (10 мкг) обрабатывали рестриктазами Psl HindIII, Bgll, BglII, BamHI, EcoRI, Mspl и Hpall, фрагменты ДНК разделяли агарозном геле. Перенос ДНК на фильтр осуществляли по стандартному мето; Саузерна. В качестве зондов были использованы полноразмерные геном вирусов папилломы 16 и 18 типов, клонированные в pBR 322, которые бы; любезно предоставлены Dr. Е.М. de Villiers (DKFZ, FRG)-pHPV 16, 18 и E Orth (Inst. Pasteur, Paris, France)-pHPV33. Плазмида pVTR, содержащая облас VTR гена Ha-rasI, была любезно предоставлена Dr. Lidereau (Paris, France Трансформацию бактерий и выделение плазмид осуществляли по стандартнс методике (Sambrook et al, 1989). Мечение зондов осуществляли стандартны к методами ник-трансляции или синтеза ДНК с использованием случайнь праймеров. Гибридизацию ДНК на фильтрах проводили в жестких условиях мечеными 32Р пробами, с удельной активностью 5х108 имп/мин/мкг ДНК. IIocj отмывки фильтры экспонировали с рентгеновской пленкой при -70°С.

Для поиска последовательностей генома HPV и определения его тиг ДНК образцов (1нг) анализировали методом полимеразной цепной реаквд (ПЦР) с 2 парами универсальных праймеров, подобранных к консервативны участкам открытых рамок считывания (ОРС) L1 и Е7-Е1 генома вирусс папиллом 6, 11, 16, 18, 33 типов (Ting & Manos 1990; Evander & Wedell, 1991) и парами типоспецифических праймеров (Young, 1988; Anceschi, 1990), к наибол! вариабельным участкам ОРС Е6 HPV16 и 18 типов по стандартной методш (Saiki et al., 1988) с некоторыми модификациями авторов (Ting & Manos 199 Evander & Wedell, 1991; Young, 1988; Anceschi, 1990). Продукты ПИ анализировали в окрашенном бромистым этидием 2% агарозном геле, в ря} случаев с последующей блот-гибридизацией продуктов ПЦР с меченной 3' пробой HPV16 типа для подтверждения специфичности реакции.

Для анализа нестабильности генома клеток опухоли в локусе генов TN методом ПЦР были использованы праймеры, подобранные группе "Цитокины" (Nedospasov et al., 1991): a) IRI-IR3 в 1-ой реакции, к участка! фланкирующим близко-расположенные микросателлиты TNFa и TNFb, б) IR IR4-bo второй реакции, к повтору (GT)13 -микросателлиту TNFa, использ; продукты I реакции в качестве ДНК-матрицы.

РНК анализировали стандартным методом Норсерн-блот-гибридизаци с использованием меченных 32Р полноразмерных геномов HPV16 и 18 типов.

Исследование экспрессии белка р53 осуществляли методо иммунопреципитации с последующим иммуноблоттингом. Для получения

белковых лизатоп часть разрушенного до порошкообразного состояния материала, лизировали в буфере RIPA и хранили при -70°С. Концентрацию белка определяли методом Лоури (Lowry et al., 1979). Белок р53 преципитировали из лизата, содержащего бООмкг белка моноклональными антителами Pabl22, распознающими карбоксильный конец белковой молекулы, способными выявлять дикий и мутантный типы белка (Wade-Evans & Jenkins, 1985), любезно предоставленными П.М.Чумаковым. Для осаждения комплексов антиген-антитело использовали белок A St.aureus (Sigma). Преципитаты анализировали в иммуноблоттинге моноклональными антителами РАЬ 122 в разведении 1:5000. В качестве вторичных антител использовали коммерческие (ECL, Amersham) антимышиные поликлональные антитела в разведении 1:10000. Проявление осуществляли с помощью коммерческой системы ECL (Amersham) и экспонировали с пленкой ECL (Amersham).

Результаты исследований.

Выявление последовательностей генома вирусов папилломы в опухолевых и прилегающих тканях, анализ распределения типов вируса. Последовательности вирусов папиллом человека, а также тип вирусного генома определяли в образцах опухолевых и прилегающих морфологически нормальных тканей. ДНК, выделенная из образцов, была исследована методом блот-гибридизации по Саузерну, который позволяет определить не только тип вирусного генома, но и форму персистенции вирусной ДНК (см. раздел исследование формы персистенции вирусной ДНК), а также методом ПЦР с двумя парами универсальных праймеров, позволяющих выявить консервативные последовательности ОРС LI и E7-EJ вирусов папиллом 6, 11, 16, 18, 31, 33 типов, и методом ПЦР с использованием 2 пар типоспецифических праймеров, позволяющих идентифицировать геном 16 и 18 типов HPV.

Блот-гибридизация по Саузерну (выполнено совместно с Н.П.Киселевой). ДНК обрабатывали диагностической эндонуклеазой Pstl, которая специфически рестрицирует ДНК различных типов HPV (схема 1). В случае персистенции полноразмерного генома вируса 16 типа в результате рестрикции по Pstl сайтам и блот-гибридизации в жестких условиях со специфичным зондом определяются фрагменты 2.8; 1.8; 1.5; 1.1; 0.5; 0.2 (рис. 1, 2А, фрагменты A-F), а в случае HPVlS-фрагменты размерами: 7.3; 0.6; 0.5; 0.4; 0.1 тыс.п.н.(пар нукл.) (рис. 2Б), которые принято считать диагностическими (низкомолекулярные фрагменты не всегда видны). В ряде случаев обнаруживаются дополнительные фрагменты, необычного для рестрикции генома HPV16 по Pstl сайтам размера (рис. 1, дорожки 1, 7, 8 рис. 2А, дорожки 1, 5), которые представляют собой фрагменты вирусной ДНК, интегрированной в геном клетки. В некоторых случаях, помимо появления дополнительных, нетипичного размера фрагментов, отсутствуют фрагменты, размерами 2.8 тыс.п.н. (рис. 1, дорожки 1, 7, 8), соответствующие области ранних вирусных генов El и Е2, что также свидетельствует об утрате этой области вирусного генома в процессе интеграции вирусной ДНК п клеточную,

A7905 BamHI

A 1 В 1 A6602 EcoRI

В181 1 1 D |E| A2795 1 C18S1 1 в Hpall

B2634 I A4498 1 в Kpnl

С IFI В1776 1 A2818 1 D1063 E C912 Pstl

1-—I-1-г

О 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

Размеры фрагментов ДНК HPV 16 (пар нукл.) после обработки различными

рестриктазами.

BamHI Hindi I EcoRI Hpal I Kpnl Pstl

A 7905 7905 7270 2795 4498 2818

В 635 2586 3407 1776

С 1881 1549

D 444 1063

E 199 483

F 216

Не имеют сайтов рестрикции в геноме HPV16 следующие рестриктазы: Bgll, BglH, Hindlll, Hpal, Pvul.

Сайты рестрикции Pstl и BamHI в геноме HPV!6.

I El I ГЕП Eil I Li I

П I E2 I _

L 2

3

T"

T T ^

I I BamHI

Pstt Pstl (6150) Pstl Pstl

(4755) <5238) (6787) (7003)

TT"

Рестриктная карта кольцевой формы генома HPV 18.

A7857 EcoRI

A44S9 ¡ В1047 ! А2321 BamHI

1 DI133 1 CXS39 A3371 1 В1784 Hindll

A2806 11 с В 1 D 1 А3531 Pstl

A4033 1 В2235 1 С1249 1 А PvuII

2000

6000

Не имеют сайтов рестрикции в геноме HPV18 следующие рестриктазы:

Ava I, Bgl II, Hind III, Pvu I, Sac I, Sac II, Sal I, Sma I, Xho I.

Размеры фрагментов ДНК HPV18 (пар нукл.) после обработки различными

рестриктазами. Bgll EcoRI Hindll Hpal 7857 7857 3371 7857 1814 1539 1133

BamHI 6810 1047

Pstl

6337

555

457

441

67

Pvu 11 4373 2235 1249

Сайты рестрикции Pstl и EcoRI в геноме HPV18.

'I E6 I

fW

J

UH

EcoRI

Pstl Pstl Pstl Pstl Pstl

23.1 9.4 6.6

2.3 2.0

•* в

•4 с

-4 Э

0.5 —

I 2 3 4 5 6 1 8 9 10 11 12 Рис. 1. Блот гибридизация полноразмерной ДНК НРУ16 с ДНК из опухолевой ткани рака шейки натки и тканей, прилегающих к опухолевым, гидролизоваииой эндонуклеазой 1 - ДНК клеток %На17, 2 - ДНК клеток С-4-1, 3 - ДНК из крови здорового донора, 4-8 и 10-12 - ДНК из тухолевых тканей рака шейки матки, случаи: 3, 17, 23, 25, 27 и 30, 31, 34 соответственно; 9 -ЧДК выделенная из тканей, прилегающих к опухоли 3. Стрелки указывают специфичные для 7естрикции по сайтам фрагменты. Фрагмент А, размером 2.8 тыс.п.н., соответствует области ранних генов НРУ16, ОРС Е1+2/ЗЕ2+1/2Е7+Е4; фрагмент В размером 1.8, - области ОРС Е6 и Е7; фрагмент С, размером 1.5, - участку ОРС Ы+1/2Ь2 (см схему 1).Маркеры молекулярного ?еса, указанные слева, соответствуют фрагментам ДНК фага лямбда, гидролизованной тдонуклеазой НШ-Ш.

т

I 2 3 4 5 6 7 8

12 3 4 5

'ис. 2. Блот гибридизация А Р полноразмерной ДНК НРУ16 с ДНК из опухолевой ткани рака шейки ютки и тканей, прилегающих к опухолевым, гидролизованной эндонуклеазой А/-/' дорожки 4. 5, 8 - ДНК з опухолевых тканей, случаи: 81, 82, 90 соответственно; дорожка 6 ~,ДНК из тканей, прилегающих к пухоли 81, дорожка 7 - ДНК из тканей, прилегающих к опухоли 90. Б: Р полноразмерной ДНК НРУ18 с ЩК из ткани, прилегающей к опухоли 90 - дорожка 4; с ДНК из ткани рака шейки матки 90 - дорожка '. На рисунках А и Б: 1 - ДНК клеток ЭШаП, 2 - ДНК из клеток С-4-1, 3 - ДНК из крови здорового Онора, гидролизованная эндонуклеазой Р&1. Стрелками указаны характерные для рестрикции по Р&1 айтам фрагменты геномов НРУ16 и НРУ18; Б: фрагмент А соответствует области Т.1+Е2+Е4+Е5+Е6+Е7+2/ЗЬ2+1/4Ы генома НРУ18 типа. Маркеры молекулярного веса, указанные слева оответствуют фрагментам ДНК фага лямбда, гидролизованной эндонуклеазой НШ-Ш.

9

как в случае клеток SiHa-17, содержащих ДНК HPV 16 типа исключительно интегрированной форме (рис.1 и 2А, дорожки 1). В 2 случаях карцином соответствующих им прилегающих тканей отсутствовал специфичный фрагме1 размером 1.5 тыс.п.н., соответствующий участку ОРС LI вирусного генома (ри 2А, дорожки 4, 6, 7, 8), которая также нередко утрачивается в процеа интеграции вирусной ДНК (Evander et al., 1992). Данные по обнаружени вирусных последовательностей и определения типов HPV методом бло' гибридизации по Саузерну представлены в таблице 1. Таблица 1

Результаты анализа вирусных последовательностей и определения типов ДНК Ш методом блот-гибридизации по Саузерну в образцах рака шейки матки, в тканя прилегающих к опухолевым, и в нормальном эпителии шейки матки от больных

тип HPV Ткани Прилегающие Нормальный эпителий

карцином* ткани* шейки матки*

HPV-16 44/69 17/42 4/11

HPV-18 6/69 1/42 0/11

HPVs 16/18 1/69 0/42 0/11

Всего 51/69 18/42 4/11

Количество образцов, содержащих ДНК HPV/Общее количество исследованных образцов.

Методом блот-гибридизации по Саузерну, ДНК HPV обнаружена в 73 (51 из 69) случаев карцином шейки матки, в 48% (18 из 42) случа( морфологически нормальных тканей, прилегающих к опухолевым и в 4 из 1 случаев нормального эпителия шейки матки от больных с другими опухолевым заболеваниями половой сферы. Последовательности вируса 16 типа определен в 86% случаев, вируса 18 типа - в 12% случаев и в 1 случае обнаруже? смешанная инфекция 16 и 18 типами вирусов. По данным друп исследователей, использовавших в своих работах метод блот-гибридизации г Саузерну, последовательности вирусов 16 и 18 типов обнаруживались в 73 (Beaudenon et al., 1986), в 70% (Zur Hausen 1989), в 66% (Fukushima et al., 1991 инвазивных карцином шейки матки. Таким образом, полученные даннь согласуются с результатами других авторов.

Метод ПЦР с универсальными праймерами: Работа выполнена совмести с Г.О. Шайхаевым, НИИ Биологии Гена. Пара праймеров MY11-C амплифицирует область рамки LI вирусного генома HPV 6, 11, 16, 18, 31 и ; типов, с образованием в результате реакции продукта амплификации размером ~450п.н. (рис. ЗА). Все образцы ДНК из опухолевых, прилегающих к опухолевы и нормальных тканей были исследованы в ПЦР с этой парой праймеров. результате реакции амплификации вирусные последовательности был обнаружены в 90% случаев рака шейки матки (в 62 из 69), в 75% образце тканей, прилегающих к опухолевой (в 31 из 42) и в 8 из 11 случаев нормально цервикального эпителия от больных с другими опухолевыми заболеваниям половой сферы.

Пара праймеров GP60-124 амплифицирует область, включающую участки рамок Е7 и Е1 указанных выше типов HPV. Все образцы ДНК из опухолевых, прилегающих к опухолевым нормальных тканей были исследованы в ПЦР с этой парой праймеров. При разделении продуктов ПЦР в 2% агарозном геле были получены 2 отличающихся размерами амплифицированных фрагмента вирусной ДНК (рис. ЗБ). Больший по размерам продукт реакции ~ 650п.н. (рис. ЗБ, дорожки 4, 6, 7, 11, 12) соответствует по длине исследуемой области вирусных ДНК HPV 16, 31, 33, 6, 11 типов, а меньший ~ 540п.н., соответствует по размеру, определяемой данной парой праймеров, области генома HPV18 типа (рис. ЗБ, дорожки 5, 9, 13), что подтверждается исследованием контрольных проб ДНК, содержащих рекомбинантные плазмиды HPV 16, 18 и 33 типов (рис. ЗБ, дорожки 4, 5, 6, соответственно). В ряде исследованных образцов одновременно определялись 2 продукта амплификации указанных размеров (рис. ЗБ, дорожки 9, 13), что свидетельствует о персистенции в тканях последовательностей по меньшей мере двух типов вирусов. В результате исследования всех образцов ДНК в ПЦР с данной парой универсальных праймеров вирусные последовательности обнаруживались в 96% случаев рака шейки матки (65 из 69), в 85% случаев тканей, прилегающих к опухолевым (36 из 42) и в 8 из 11 случаев нормального эпителия шейки матки от больных другими онкологическими заболеваниями половой сферы.

Известно, что области открытых рамок считывания Е1 и L1 могут утрачиваться вследствие интеграции вирусной ДНК в клеточную и в результате геномных перестроек, происходящих в процессе опухолевой профессии (Lehn et al., 1985; Takebe et al., 1987; Choo et al., 1987; Shirasawa et al. 1988). Вероятность получения ложноотрицательных результатов может уменьшаться за счет одновременной персистенции в тканях эписомальных молекул вирусной ДНК, а также при использовании в реакции праймеров к открытым рамкам считывания (ОРС) Е6 и Е7, которые всегда обнаруживаются интактными независимо от стадии опухолевой профессии и интефации вируса в клеточную ДНК (Wilczynski et al., 1988; Shirasawa et al., 1988; Crum et al., 1989; Cornelissen et al., 1990; Stoler et al., 1990a; Higgins et al., 1991; Van den Brule, 1993). В связи с этим для определения типа HPV были использованы праймеры к ОРС Е6 и Е7 HPV.

Метод ПЦР с типоспецифическими праймерами. Две пары типоспецифических праймеров (Young et al., 1988; Anceschi et al., 1990), амплифицируют вариабельные, уникальные последовательности ОРС Е6 геномов HPV 16 и 18 типов с образованием продуктов реакции размерами 120 и 140 п.н. соответственно (пиг 3BV

Вирусные последовательности HPV 16 и 18 типов обнаружены во всех (100%) исследованных опухолях шейки матки, в 88% случаев (37 из 42) тканей, прилегающих к опухолевым, и в 9 из 11 случаев нормального эпителия шейки матки (табл. 2).

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 3. Анализ ДНК методом ПЦР с использованием А: универсальных праймеров к ОРС , HPV6, 11, 16, 18, 31, 33; Б: универсальных праймеров к ОРС Е7-Е1 HPV6, И, 16, 18, 31, 1 В: 2 пар типоспецифических праймеров к ОРС Е6 HPV16 и 18. Дорожка 1 (А,Б,В) - Д1 pBR-322, обработанная эндонуклеазой НаеШ; 2 - реакционная смесь без ДНК; 3 - ДНК плаценты человека; 4 - рНРУ16; 5 - pHPV18; 6(А, Б) - рНРУЗЗ, 6(B)- pHPV16+pHPV18; 711, 12, 13(А, Б) и 14(B) - ДНК, из образцов рака шейки матки, 13(B) - ДНК из прилегающ ткани; 10 (А,Б,В) - ДНК ткани рака тела матки. Справа указан размер продукта ПЦ слева-размеры фрагментов маркера молекулярного веса.

Таблица 2.

Результаты анализа вирусных последовательностей и определения типов HI методом ПЦР в образцах рака шейки матки, в тканях, прилегающих к опухолевы и в нормальном эпителии шейки матки от больных с другими опухолевьи заболеваниями половой сферы.

тип HPV Ткани Прилегающие Нормальный эпителий

карцином* ткани* шейки матки*

HPV-16 57/69 32/42 9/11

HPV-18 3/69 2/42 0/11

HPVs 16/18 9/69 3/42 0/11

Всего 69/69 37/42 9/11

* Количество образцов, содержащих ДНК НРУ/Общее количество исследованных образцов.

Таким образом, метод ПЦР с использованием типоспецифических праймеров оказался более чувствительным, чем ПЦР с универсальными праймерами. Следует отметить, что последовательности HPV были обнаружены в 2 образцах тканей, полученных от больных, прошедших предоперационный курс лучевой терапии, в результате которого на месте опухоли сформировалась зона лучевого фиброза, не содержащая опухолевых клеток по данным морфологического исследования. Только используя метод ПЦР удалось определить, что последовательности HPV продолжали персистировать в фиброзно-измененных тканях шейки матки.

Высокий процент обнаружения вирусных последовательностей в тканях рака шейки матки методом ПЦР согласуется с данными других исследователей (Evander et al., 1992; Van den Brule, 1993)-100%, (Gissman et al., 1987)-95%, более того, практически в 100% случаев эпителиальных дисплазий шейки матки (CIN) этим методом обнаруживаются папилломавирусные последовательности (Sherman et al., 1994; Kurz et al., 1993). Случаи же рака шейки матки, в которых не удается обнаружить папилломавирусные последовательности, встречаются крайне редко (Van den Brule, 1993).

Полученные результаты подтверждают очевидное преимущество полимеразной цепной реакции в обнаружении вирусных последовательностей в клиническом материале и идентификации типа ДНК HPV (табл.3).

Таблица 3. Результаты определения последовательностей НРУ в тканях рака шейки и нормальном эпителии методами ПЦР и Саузерна.

HPV положит. HPV положит.

тип стадии опухолевой случаи в ПЦР случаи по Саузерну

ткани прогрессии ( + / всего) ( + / всего)

Т1а№Мх 11/11 9/11

опухолевые Т1ЬЫхМх 24/24 16/24

ткани Т2№Мх 28/28 22/28

ТЗШМх 6/6 4/6

морфологи- ТОМОШ после радиотерапии 2/2 0/2

чески

нормальные прилегающие ткани 35/40 18/40

ткани нормальные эпителиальные

шейки ткани от больных с другими 9/11 4/11

матки опухолевыми заболеваниями полового тракта

л не. пом 1 1^/П")

Чувствительность метода Саузерна ограничена 1 копией вирусного енома на 1-2 клетки исследуемого образца. Принимая во внимание етерогснность популяции клеток в исследуемом образце, содержащем помимо >пухолевых клеток эпителия шейки матки, соединительную ткань стромы, )бнаружение вирусных последовательностей будет зависеть от соотношения

13

опухолевых клеток и стромальных элементов. Преимущество ПЦР заключаете в том, что этот метод позволяет обнаружить 1 копию вирусной ДНК на 100-1 клеток исследуемого материала и проводить достаточно быстрый скрин большого количества образцов.

Специфичность и корректность результатов, полученных в П подтверждается обнаружением одних и тех же типов вирусов в опухоля: соответствующих образцах прилегающих тканей, равно как и идентичнь результатами, полученными при использовании обоих методов - ПЦР и Саузерну. Обнаружение вирусных последовательностей в 48% случаев (MeToj Саузерна) и в 88% случаев (методом ПЦР) морфологически нормальных ткан прилегающих к опухолевым, а также в фиброзно-измененных морфологиче нормальных тканях после эффективного курса лучевой терапии свидетельстг о персистенции ДНК HPV в тканях, окружающих опухолевую. Это наблюде] необходимо учитывать при ведении больных с предзлокачественными злокачественными неоплазиями шейки матки, что следовательно, может им определенное клиническое значение.

Распределение типов HPV в исследованной группе больных раком inei матки. Согласно результатам ПЦР с использованием типоспецифичес! праймеров все исследованные в данной работе опухоли (100%) содержали Д HPV16 или HPV18 типов. Известно, что эти онкогенные типы вируса наибо распространены. По данным различных авторов с ними ассоциировано 67-9 цервикальных карцином (обзор Zur Hausen, 1991; Van den Brule, 1993). Ана распределения типов HPV в исследуемой группе показал, что наиболее чаете 57 из 69 (83%) исследованных случаев рака шейки матки, определяется Д] вируса 16 типа (табл.2). Вирусные последовательности 18 типа обнаружены (4%) случаях карцином (табл.2).

Полученные данные о распределении ДНК 16 и 18 типов HPV в тка] карцином в исследованной группе больных раком шейки матки в не/ согласуются с данными других исследователей, согласно которым вирус 16 ti наиболее распространен и обнаруживается более чем в 40% случаев рака iuei матки (Wilczinzski et al., 1988; Koutsky et al., 1988; De Villiers, 1989; Vousden et 1989; Resnick et al., 1990; Stanley, 1990; Lorincz et al., 1992). Случаи персистенции генома вируса 18 типа встречаются примерно в 2 раза реже (17 (Lorincz et al., 1992), однако в разных работах соотношение этих двух тиг варьирует (Zur Hausen, 1991; Van den Brule, 1993). Среди исследованн образцов в четырех случаях аденокарциномы шейки матки были обнаруже последовательности вируса 16 типа, что не согласуется с данными некотор исследователей (King et al., 1989; Bjersing et al., 1991), согласно котор] аденокарциномы шейки матки преимущественно ассоциированы персистенцией ДНК HPV 18 типа.

Использование метода ПЦР позволило обнаружить 9 (13%) случ; смешанной инфекции двумя онкогенными типами HPV 16 и 18 типов (табл. В литературе имеются сообщения об одновременной инфекции более ч одним типом папилломавируса (De Villiers, 1994). Частота обнаружен одновременной инфекции несколькими типами HPV значительно возрастает

14

использованием метода цепной полимеразной реакции и составляет 20-30% от всех инфицированных (De Villiers, 1994).

Исследование формы персистенции вирусной ДНК.

Предполагается, что интеграция вирусной ДНК в геном клетки представляет собой активационный механизм, необходимый для профессии неоплазии от преинвазивного состояния (CIN-III) к цервикальному раку (Schwarz et al., 1985; Schneider-Maunoury et al., 1987). Сообщения ряда исследователей (Matsukura et al., 1989; Fuchs et al., 1989; Cullen et al., 1991) подвергли сомнению абсолютную зависимость процесса трансформации клеток и их злокачественной прогрессии от интеграции вирусных последовательностей в клеточную ДНК. Целью данного исследования явилось определение формы персистенции вирусной ДНК в образцах карцином шейки матки на различных стадиях опухолевой профессии и в тканях, прилегающих к опухолевым. Анализ ДНК, обработанной рестриктазой Pstl, не дал исчерпывающей информации о форме персистенции вирусной ДНК в исследуемых образцах. В связи с этим, было проведено рестриктное картирование ДНК, выделенной из 31 образца, 25 из которых были представлены карциномами шейки матки, а другие 6 -тканями, прилегающими к опухолевым. С этой целью ДНК образцов обрабатывали ферментами, не имеющими сайтов рестрикции в геноме HPV (Hindlll, Bgll и BglH для HPV 16 типа, и Hindlll, Bglll для HPV 18 типа), а также ферментами, имеющими единственный сайт рестрикции в геноме HPV (BamHI для HPV16 и EcoRI для HPV18) (см. схему 1 А,Б; рис. 4). Анализ ДНК не обработанной ферментами и рестрикционных фрагментов ДНК проводили в 0.8% агарозном геле с последующей блот-гибридизацией с мечеными 32Р полноразмерными геномами вирусов папиллом человека 16 и 18 типов. Кольцевая, неинтефированная вирусная ДНК может персистировать в мультимерной форме, подвижность которой в агарозном геле соответствует линейным фрагментам размерами ~ 16 тыс.п.н. и более (рис.4, А,В), в форме релаксированной кольцевой молекулы с разрывом 1 цепи ДНК с подвижностью в геле, соответствующей линейному фрагменту размерами 11 тыс.п.н. (рис.4, С), в форме линейной молекулы, имеющей размер - 8 тыс.п.н. (рис.4, D), и в форме суперскрученной кольцевой молекулы, соответствующей на рисунке 4 линейному фрагменту - 4.4 тыс.п.н.(рис.4(Е), дорожки 11, 12, 13, 14, 16). При обработке ДНК ферментами, не имеющими сайтов рестрикции в геноме HPV, эти формы вирусной ДНК не меняют своей повижности в геле (рис. 4, дорожки 2-4, 12-14, 17-19), как и в случае ДНК, не обработанной рестриктазами. В случае интефации вирусной ДНК в клеточную, размеры фрагментов, образующихся при рестрикции ферментами, не имеющими сайтов узнавания внутри генома HPV определяются положением сайтов узнавания и клешчной ДНК, в связи с чем они могут варьировать (рис. 4, дорожки 7-9). При рестрикции вирусной ДНК по единственному в геноме сайту узнавания (BamHI в геноме HPV16 и EcoRI в геноме HPV18) в случае персистенции исключительно эписомальных форм вся вирусная ДНК становится линейной (рис. 4, дорожки 5, 20 - фрагмент 8 тыс.п.н.), в случае интефированных вирусных последовательностей характерно появление

фрагментов отличного размера (рис.4, дорожка 10). В случае тандемнс организации интегрированных копий ДНК HPV и в случае одновременнс персистенции эписомальных и интегрированных форм эти дополнительнь интегративные фрагменты сочетаются с мажорным фрагментом размере 8тыс.п.н., соответствующим линейной молекуле ДНК HPV (рис. 4, дорожки 1 15).

23.1 —

94 — 6.6 —

4.4 —

2.3 — 2.0 —

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Рис. 4. Блот-гибридизация 32Р полноразмерной ДНК HPV16 с ДНК из опухолевой ткани pai шейки матки. 1-5 - образец 24, 6-10 - образец 41, 11-15 - образец 34, 16-20 - образец 39; i дорожках 1, 6, 11, 16 представлена тотальная ДНК, не обработанная эндонуклеазами; 5, 1 15, 20 -ДНК, гидролизованная BamHI; 2-4, 7-9, 12-14, 17-19 - рестрикция ДЬ эндонуклеазами Bgl-II, Bgl-I, Hind-III, соответственно. Маркеры молекулярного вес указанные слева соответствуют фрагментам ДНК фага лямбда, гидролизованш эндонуклеазой Hind-III. Стрелками справа показаны различные формы эписом и линейнь молекул вирусной ДНК.

Таким образом, представленные на рисунке 4 образцы 39 и 24 содержат тольк эписомальную форму ДНК HPV16, образец 41 - только интегрированнь вирусные последовательности HPV16, а образец 34 - обе формы вирусной ДН одновременно.

Из 25 случаев рака шейки матки в 10 (40%) определялась исключительи эписомальная форма ДНК HPV16: в 8 случаях на ранней стадии опухолево профессии (Т1а-5; Tlb-З) и в 2 случаях рака на поздней стадии ТЗ. В остальнь 15 случаях (60%) обнаружена интеграция вирусной ДНК в геном клеток. В 11 i них одновременно определялись обе формы: эписомальная и интегрированна: Интеграция вирусной ДНК обнаружена в обоих исследованных данным методо случаях рака шейки матки, в тканях которых определяются последовательное! 18 типа вируса, при этом в обоих случаях в тканях персистируют обе форм вирусной ДНК. Из 6 исследованных образцов прилегающих тканей, в обнаружены исключительно эписомальные формы вирусной ДНК HPV16, других 3 случаях - интегрированные вирусные последовательности HPVli Таким образом, интеграция вирусной ДНК в клеточную не являете определяющей для индукции трансформации клетки, поскольку не только г ранних стадиях опухолевого роста, но и на поздних стадиях опухолево прогрессии (2 случая) ДНК HPV16 типа обнаруживается в эписомальной форм И наоборот, в 3 случаях морфологически нормальных тканей, прилегающих опухолевым, интеграция вирусной ДНК в клеточную не сопровождалас морфологическими проявлениями трансформации клеток.

16

Интеграция вирусных последовательностей всегда обнаруживается в эпухолевых клетках рака шейки матки, ассоциированного с инфекцией HPV18 типа (Cullen et al., 1991; Berumen et al., 1994). Одновременное обнаружение двух J)opM вирусной ДНК также не противоречит данным других авторов (Durst et al., 1985; Lehn et al., 1985, 1988; Pater & Pater, 1985; Yee et al., 1985; Di Luca et al., 1986; Shirasawa et al., 1986; Matsukura et al., 1989; Cullen et al., 1991; Ka-Chung Yiu :t al., 1991).

Изучение экспрессии генома вирусов папилломы 16 и 18 типов.

Для подтверждения роли HPV в развитии рака шейки матки было троведено исследование экспрессии вирусного генома.

Определение экспрессии вирус-специфических мРНК проводили методом Норсерн-блот-гибридизации. В качестве зондов были использованы толноразмерные вирусные ДНК 16 и 18 типов, меченые 32Р. Экспрессия зирусных генов была проанализирована в клеточной РНК 38 образцов, в которых вирусные последовательности 16 и 18 типов обнаруживаются методом ПЦР или одновременно в ПЦР и по Саузерну: 22 образца тканей рака шейки матки, 11 образцов тканей, прилегающих к опухолевым и 5 образцов юрмального эпителия шейки матки от больных с другими опухолевыми )аболеваниями половой сферы. Экспрессия генома HPV, сравнимая по уровню с жспрессией вирус-специфической мРНК в клеточных линиях, полученных из гервикальных карцином, использованных в качестве контрольных, определялась i 16 из 22 исследованных образцов опухолевой ткани (73%) и в 1 образце ткани, грилегающей к опухолевой.

А

4.7 —

12 3 4 5 6 7

В

1.9 —

ÜÉ 'Щ^Ш »•»

i 2 3 4 5 6 7

>ис. 5. Анализ клеточной РНК, из опухолевых и морфологически нормальных прилегающих тканей, lemodoM Норсерн-блот-гибридизации А: с меченным Р полноразмерным геномом HPV16, дорожка 1 клетки SiHa-17, 2 - РНК из ткани рака молочной железы, 3- РНК из нормальной ткани, ¡рилегаюшей к опухоли 34. 4-12 - РНК ¡л тклнрй pnvn щойуи «<"">.<:", образцы 34, 50, 30, 31, 33, 27, 'Я 47, 48 соответственно; Б: с меченным 32Р полноразмерным геномом HPV18; дорожка 1 - клетки нНа-17, 2, 3 - клетки С4-1 и HeLa, соответственно, 4-6 - РНК из тканей рака шейки матки, образцы 37, 17, 90, соответственно; В, Г: с меченым 32Р геном глицеральдегид-фосфат-Iегидрогеназы (GAPDH). Номера на рисунках А, В и Б, Г соответствуют. Справа, на рис. А и Б казаны размеры определяемых транскриптов. Слева - размеры РНК субъединиц (18S и 28S).

12.0 80 6.0

2.3 1.8 1.5

4.71.9-

8 9 10 ii 12

Г

*».>«**# -«gapdh 198 9 10 ii 12

12 3 4 5 6

щm _ -.сарпн 1 2 3 4 5 6

Б

Размеры транскриптов, определяемых методом Норсерн-бл гибридизации были гетерогенны (рис 5 А, Б). Во всех случаях карцин содержащих ДНК HPV 16 типа (рис. 5А), были обнаружены 3 мажор1 транскрипта размером 1.8, 2.3 и 3.5 тыс.п.н., которые также определялис клетках линии SiHal7, содержащих ДНК вируса 16 типа (рис. 5А, дорожка Согласно данным Shirasawa с соавторами (1989), транскрипты размером 3.6 и тыс.п.н., содержат как гены Е6/Е7, так и клеточные последовательное Известно, что в результате потери "раннего" сайта полиаденилированш процессе интеграции вирусной ДНК, могут образовываться высокомолекулярг транскрипты, также содержащие фланкирующие клеточные последовательно (Shirasawa et al., 1989). В тканях нескольких, исследованных в данной рабе случаев рака шейки матки обнаружены высокомолекулярные транскрш размером порядка 7.0-7.5 тыс.п.н. (рис. 5А, дорожки 4, 9; рис. 5Б, дорожки 4, Подобного рода транскрипты были недавно описаны для HPV6 (Snijders et 1994) и квалифицированы как типичные для клеток HPV 6 - ассоциирован} карцином гортани. В тканях карцином, содержащих геном HPV18 (рис. общими являются транскрипты размером 3.4 и 1.6 тыс.п.н. (рис. 5Б, дорожи 4), обнаруживаемые также в случае клеток HeLa (Sang & Barbosa, 19! использованных в качестве положительного контроля. В пробе, содержав последовательности HPV 16 и 18 типов, был обнаружен единственн транскрипт HPV 18 размером 2.9 тыс.п.н., (рис 5Б, дорожка 6) при эт транскрипция генома HPV 16 не определялась (данные не представлены). Гетерогенность обнаруживаемых вирус-специфических мРНК обусловле очевидно, отсутствием специфичного сайта интеграции ДНК HPV в ген клеток (Durst, 1986; Awady et al., 1987; Zur Hausen, 1989; Wagatsuma et al., 1990 также, возможно, является следствием альтернативного сплайсинга (Sherman Alloul, 1992). Вирусный геном в клетках рака шейки матки актш транскрибируется, указывая тем самым на возможную роль вируса в проце канцерогенеза.

Изучение экспрессии белка р53.

Белок р53 выполняет в клетке функцию супрессора опухолевого роста литературе имеются противоречивые данные об изменении уровня экспресс р53 в клеточных линиях, полученных из карцином шейки матки (Hubbert et 1992; Lechner et al., 1992; Komissarova et al., 1995), а также в тканях рака шей матки (Tervahauta et al., 1993). Это может быть связано как с выбором мет< определения экспрессии белка, так и с изменением скорости деградации бел либо другими механизмами действия Е6 на р53.

Уровень экспрессии белка р53 в клетках рака шейки матки морфологически нормальных, прилегающих тканей был исследован метод иммунопреципитации. Работа была выполнена в лаборатории пролиферац клеток (руков. д.б.н. П.М.Чумаков) Института Молекулярной биологии г В.А.Энгельгардта. Метод иммунопреципитации белка р53 моноклональны антителами с последующим иммуноблоттингом позволил обнаружить белок г практически во всех случаях рака шейки матки, уровень экспрессии

18

:оторого был сравним с уровнем р53 в морфологически нормальных тканях, [рилегающих к опухолевым. Лишь в одном случае рака шейки матки, ссоциированного с инфекцией вирусом 18 типа, этим методом не удалось обнаружить р53 в опухолевых клетках (рис.6, дорожка 12), как и в клетках линии 1еЬа, содержащих ДНК вируса 18 типа. В клетках линии НеЬа данным методом ¡елок р53 не определяется вследствие значительного укорочения периода юлужизни белка (ЬесЬпег е1 а1., 1992), в связи с чем, они были выбраны в :ачестве отрицательного контроля (рис. 6, дорожка 1). В качестве юложительного контроля служили клетки линии 5\¥480, экспрессирующие табильный белок р53 (рис.6, дорожка 2).

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

'ис. 6. Анализ белка р53 методом иммунопреципитации с последующим иммуноблоттингом с юноклоналъными антителами РАЫ22, в лизатах опухолевых и прилегающих к ним •орфологически нормальных тканей. Дорожка 1 - клетки линии HeLa; 2 - клетки линии 'W480; 3, 5, 7, 9, 11 преципитаты р53 из морфологически нормальной ткани, 4, 6, 8, 10, 12 -реципитаты р53 из соответствующих им опухолевых тканей. Слева указаны маркеры олекулярного веса. Стрелка указывает на белок молекулярного веса 53.

Обнаружение эквивалентных количеств р53 как в опухолевых тканях так в тканях, прилегающих к ним, позволяет предположить, что индукция ирусным белком Е6 деградации р53 очевидно не является основным [еханизмом подавления функций р53.

Модификация некоторых клеточных генов в ткани рака шейки матки.

Длительный латентный период инфекции и тот факт, что лишь небольшая асть HPV-инфицированных женщин впоследствии заболевают раком шейки матки ает основание полагать, что помимо персистенции генома HPV, необходимым зловием является изменение функций других клеточных генов. Поиски этих генов :дугся достаточно активно, и одним из реальных подходов в этом направлении вляется исследование генома клетки с помощью анализа микро- и инисателлитных последовательностей. Этот метод позволяет проводить широкий крининг практически всех хромосом человека с целью выявления в различных их метках как потерю гснстического материала и связи с утратой одного из аллелей ..ОН), что в свою очередь открывает пути к идентификации супрессорных генов, 1к и структурные перестройки внутри аллелей (Loeb et al., 1994). Этот подход был спользован в настоящей работе для анализа полиморфизма минисателлитного овтора (VTR) локуса гена Ha-rasI (11 хромосома) и микросателлита локуса генов актора некроза опухолей (TNF) (6 хромосома).

19

Исследование полиморфизма области УТИ гена На-гаэ1. Этот разд работы по изучению полиморфизма области УТИ гена На-газ1 в популящ больных раком шейки матки явился продолжением исследования, начато к.б.н. И.Б.Зборовской на популяции больных раком легких.

Локус протоонкогена На-га$1, располагающийся на коротком плече хромосомы (11р15) сцеплен с минисателлитом. (см. схему 2).

Схема 2. Структура локуса гена Ha-rasI (Krontiris et ai, 1993). Локус Гена Ha-Ras-1

BamHI |-> PofyA Mspl минисателлит BamHI

5: ^

ССАССССАССССАСАСТСССССТТСТСТ

В настоящее время описано 30 аллелей области вариабельш тандемных повторов (УТЯ), размером -от 1,0 до 3,0 тыс.п.н., локуса На-гс (КгопИпб е1 а1., 1986). Из них 4 основных - а1, а2, аЗ и а4 (рис.7) составляют 94 всех аллелей белой расы и являются предшественниками остальных аллел! (КгопИп5 ег а1., 1990; КгопИпб е1 а1., 1993), которые являются редкими (рис.8).

ДНК обрабатывали смесью эндонуклеаз Мзр1 и Нра11 (с учете возможного метилирования по одному из цитозинов в сайте узнавания). Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) проводил с помощью гель-электрофореза в 1,2% агарозном геле и последующей бло гибридизацией с меченой методом ник-трансляции ДНК рУТЯ.

3.25 —

2.35 — 1.77 —

1.36 —

— 2.5 (а4) 2.1 (аЗ)

— 1.5 (а2)

1.08 — „ »<и> •- » « з»* énémm-m-m- — í.o (ai)

0.87 —

12 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14

Рис. 7. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) области V, локуса гена Ha-rasí. Блот-гибридизация 32Р pVTR с ДНК из опухолевой и прилегающей к н ткани больных раком шейки матки, обработанной эндонуклеазами Mspl и Hpall. Дорожки 2 - морфологически нормальная прилегающая ткань и опухолевая ткань, генотип а ]/а2; 3, ' генотип al/al; 5, 6 - генотип al/a4; 7, 8 - генотип al/a3; 9, 10 - генотип аЗ/а4; 11, 11 генотип а2/а2; 13 - генотип а4/а4; 14 - генотип аЗ/аЗ. Справа указан размер общих аллел al-1.0, а2-1.5, аЗ-2.1, аЗ-2.5. Маркеры молекулярного веса, указанные слева, соответствук фрагментам ДНК фага лямбда, гидролизованной эндонуклеазой Нае-Ш.

- 2 5 (»«>

— ''

mm® — 1 65 <al 6S>

' S«. i - ' 5

.., ... »-«tat „.«.„„,«j*^ ^ = !?!j|i! ' " ' * w --0 9 (a0.9)

1 2 345678 9 10 11

'ис. 8. Варианты редких аллелей, обнаруженных при анализе ПДРФ области VTR локуса гена la-rasl. Блот-гибридизация 32Р pVTR с ДНК из опухолевой и прилегающей к ней ткани ольных раком шейки матки, обработанной эндонуклеазами Mspl и Hpall. Дорожки 1,2-енотип а 1/а( 1.1); 3, 4 - генотип а(1.2)/аЗ; 5, 6 - генотип al/a(l.l); 7- генотип а(1.1)/а4; 8, 1 - генотип а(1,1)/а2; 10 - генотип al/a(1.4); 11 - генотип а(0.9)/а(1.6). Справа указан азмер общих и представленных редких аллелей. Маркеры молекулярного веса, указанные слева, оответствуют фрагментам ДНК фага лямбда, гидролизованной эндонуклеазой Нае-Ш.

5 качестве контрольных использовались любезно предоставленные к.б.н. И.Б. 1боровской, A.B. Гаспарьяном и к.б.н. М.А.Якубовской данные исследования гопуляции здоровых доноров, полученные в лаборатории вирусных и клеточных нкогенов под руководством д.б.н. А.Г. Татосяна, и лаборатории химического анцерогенеза под руководством д.б.н. Г.А.Белицкого. (Zborovskaya et al., in ress). Результаты анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов [редставлены в таблице 4, где указан размер аллелей и частота встречаемости аждого из них.

"аблица 4. Частота общих и редких аллелей у больных раком шейки матки.

Размер аллеля (т.п.н.) Рак шейки матки Контрольная группа* Критерийх2, оценка достоверности

al - 1.0 88 / 60.3% 60 / 63.9% У2 =0.47, Р<0.4 Х2 =6.4 РС0.02

а2 - 1.5 17 / 11.6% 20 /21.3% у2 =4.8. РС0.04

аЗ - 2.1 19 / 13.0% 8 / 8.5% у2 =0.75. РС0.2 %2 =5.2 Р<0.03

а4 - 2.5 14 / 9.6% 3 / 3.2% у2 =4.6. Р<0.05

Всего обших 1.18 / 94 5% 91 /96.8%

я - 0.9 1 1

а - 1.1 4 _

а - 1.2 1 2

а - 1.4 1 -

а -1.65 1 -

Всего пелких 8 / 5.5% 3 / 1.7% v2=1.3. Р=0.3 Р=0.3

В этой графе представлены данные, полученные И.Б.Зборовской, ..В.Гаспаряном и М.А.Якубовской в лабораториях "Вирусных и клеточных нкогенов" под руководством д.б.н. А.Г.Татосяна и "Химического анцерогенеза" под руководством д.б.н. Г.А.Белицкого.

3.25 — 2.35 — 1.77 — 1.3S — 1.08 — 0.87 —

На основании полученных данных, генотип 66 из исследованных 73 ольных раком шейки матки был представлен общими аллелями а1-а4

21

размерами 1.0; 1.5; 2.1; 2.5 тыс.п.н. (рис. 7). В 7 случаях (5.5%) обнаруживай редкие аллели размерами 0.9; 1.1; 1.2; 1.4; 1.65, в 6 из них, в комбинаци общими аллелями al-a4 (рис. 8), и лишь в одном случае определж комбинация 2 редких аллелей размерами 0.9/1.65 (рис. 8, дорожка 11).

Таким образом, частота редких аллелей у больных раком шейки ма оказалась несколько выше по сравнению с контрольной группой (3.2%), оди это повышение частоты встречаемости редких аллелей в популяции боль раком шейки матки не имеет достаточной значимости (х2=1.3; Р=0.3). В 19 Riou с соавторами сообщал о повышении частоты встречаемости редких алле в 1.18 раз среди больных раком шейки матки по сравнению с контроль группой. Увеличение в 1.73 раза частоты встречаемости редких аллеле] исследованной группе больных раком шейки матки, несмотря на то, размеры выборки не позволяют рассматривать это увеличение как статистиче достоверное, согласуется с результатами масштабного исследования боль раком различных локализаций и гистологических типов, представлен Krontiris с соавторами (1993), где отмечалось двухкратное увеличение част встречаемости редких аллелей по сравнению с контрольной группой.

Сравнительный анализ распределения общих аллелей выя статистически достоверное повышение частоты встречаемости крупного ал/ а4 в исследуемой группе - до 9.6% (х2 =4.6; Р<0.05) относительно дан распределения аллелей в группе здоровых доноров - 3.2% (табл. 4) и достовер уменьшение частоты встречаемости аллеля а2 (х2=4.8; РС0.04) (табл. 4). Бс того, суммарный процент встречаемости крупных аллелей аЗ и а4 (22.6% группе больных раком шейки матки почти в 2 раза выше, чем в группе здоро доноров (11.6%), (х2 =5.2; Р<0.03) (табл.4). Статистически значимое увелнче частоты встречаемости крупных аллелей аЗ и а4 сопровождается снижением 13.3% частоты аллелей al и а2 в исследуемой группе больных (х2=6.4; Р<0 (табл.4). Для оценки генетической предрасположенности к заболеванию i определен относительный риск заболеваемости раком шейки матки ср носителей аллелей а2 и а4 (табл.4). Минимальный относительный р заболевания выявлен в группе носителей аллеля а2 - 0.4, максимальный - ср носителей аллеля а4 - 3.2. Увеличение относительного риска заболевания ра шейки матки среди носителей аллеля а4 в 3.2 раза свидетельствует о том, аллель а4 можно рассматривать как эндогенный фактор риска развития рака.

Ранее ПДРФ локуса гена Ha-rasI был исследован в популяции болы раком различных локализаций, в том числе раком легких (Knyazev et 1990; Zborovskaya et al., in press), где наблюдалось статистиче достоверное увеличение частоты встречаемости аллеля а4. В литерат отмечено существование общей тенденции в распределении общих алле VTR al-a4 в популяциях больных раком различных локализаций ( легких, яичника, гепатоцеллюлярный рак), а именно - увеличение часто

стречаемости аллеля а4 и уменьшение частоты встречаемости аллеля al (Wyllie t al., 1988; Knyazev et al., 1990; Thelu et al., 1993; Zborovskaya et al., in press).

Среди исследованных методом ПДРФ 68 образцов тканей рака шейки [атки, лишь в 2 из них выявлены делеции локуса гена Ha-ras 1, проявляющиеся отерей гетерозиготности по одному из аллелей (рис. 9).

О н

2.35 — ^^ 1.77 —

1.36 — 1.08 — **«* 0.87 —

I 2

ис. 9. Случай потери гетерозиготности, обнаруженный при анализе ПДРФ области VTR экуса гена Ha-rasl. Блот-гибридизация 32Р pVTR с ДНК из опухолевой (О) и прилегающей к ей ткани (Н) больных раком шейки матки, обработанной эндонуклеазами MspI и Hpall. 'орожка 1 - ДНК полученная из опухолевой ткани, дорожка 2 - ДНК из прилегающей к ней орфологически нормальной ткани, генотип а1/аЗ. Справа указан размер аллелей. Маркеры олекулярного веса, указанные слева, соответствуют фрагментам ДНК фага лямбда, идролизованной эндонуклеазой Нае-Ш.

Используя область VTR гена Ha-rasl в качестве маркера, Busby - Earle с оллегами в 1993 году обнаружил потерю гетерозиготности по одному из аллелей ;на в 1 случае из 15 исследованных образцов ДНК из тканей рака шейки матки, едкость делеций этого района в клетках рака шейки матки дает основания редполагать, что подобная перестройка не является характерной для анцерогенеза рака шейки матки, а очевидно представляет собой один из озможных вариантов генетических нарушений, с которыми нередко оррелирует трансформированный фенотип клеток (Altmann, 1994).

Полиморфизм микросателлита TNFa локуса генов TNF (ФНО-фактор екроза опухоли). В качестве другого маркера нестабильности генома был сследован микросателлит локуса генов TNF (6р21.3) в ДНК из клеток рака [ейки матки и морфологически нормальных прилегающих тканях (схема 3). абота была выполнена в группе "Цитокины" (руков. д.б.н. С.А.Недоспасов), нституга Молекулярной Биологии им. В.А.Энгельгардта, совместно с к.б.н. Л.Турецкой.

С целью оптимизации условий ПЦР, с использованием [33P]a-dATP, гакция амплификации исслелуемпго микппг.ятегтпитя TNFa осуществлялась 2 этапа. Пара праймеров (IR1-IR3) гомологичная участкам, фланкирующим □ласть близкорасположенных микросателлитов TNFa и TNFb локуса генов NF (схема 3) была использована в 1-ой реакции, продукты которой ^aлизиpoвaлиcь в 2% агарозном геле. Они имели подвижности, эответствующие длинам фрагментов около 200 п.н. (рис. 10). Продукты ервой реакции амплификации были использованы в качестве ДНК-матрицы

23

— 2.0

— 1.0

Схема 3.

Структура локуса генов TNF.

С2, Bf, С4А С4В, 21-ОН,

DP DO DR HSP70 TNFa.ß ВС А

Chromosome 6

Centromere

-dM—H—С-fZe+HD-

онононон

242 -190-

I * * INI м- И

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ii 12 Рис. 10. Случаи несоответствия аллелей в опухолевой (О) и соответствуюи морфологически нормальной (Н) ткани при исследовании полиморфизма микросателлитов Т а+в (локус генов TNF) в ДНК больных раком шейки матки методом ПЦР с праймерами IR IR3. Дорожка 1-pBS, гидролизованная эндонуклеазой Mspl; дорожка 2- реакционная смесь ДНК; дорожка 3 - космидный- клон 031А; дорожки 4, 6, 8, 10 -ДНК из тканей рака uiei матки, случаи 259, 233, 212, 210: соответственно. Дорожки 5, 7, 9, 11 -ДНК соответствующих морфологически нормальных тканей, прилегающих к опухолевым, случ, 234, 233, 212, 210 соответственно. Слева указаны размеры двух фрагментов маркера.

fi

m hi -

И" - •

•7 ► »%•»<■»

Рис. 11. Случаи несоответствия аллелей в опухолевой и сооветствующей морфологичес нормальной ткани при исследовании полиморфизма микросателлита TNFa (локус генов TNF больных раком шейки матки при анализе продуктов ПЦР, меченых 33Р, в 5% ПА/ Продукты второго этапа ПЦР, определяемые праймерами IR4-IR3 (область микросатеми, TNF а): дорожки 1, 2 - опухоль 212 и соответствующая морфологически нормальная тка генотип al/all; дорожки 3, 4 - опухоль 210 и соответствующая морфологически нормалм ткань, генотип а2/а10. Стрелками указаны аллели микросателлита.

во 2-ой ПЦР с добавлением меченого [33Р] a-dATP. Во 2 реакщ амплификации использовались внешний праймер IR3 в сочетании с

внутренним праймером IR4. Эта комбинация праймеров (IR3-IR4) фланкирует простой повтор (GT)|3 - микросателлит TNFa (см. схему 3). Меченные по [33Р] a-dATP продукты второй реакции анализировались в 5% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (рис. 11).

Полиморфизм микросателлитного маркера TNFa локуса генов TNF был исследован в ДНК, полученной из опухолевой ткани 60 образцов рака шейки матки и в 35 образцов морфологически нормальных тканей, прилегающих к опухолевой. В 9 случаях рака шейки матки (15%) картирование области микросателлита TNFa выявило признаки нестабильности генома в клетках опухоли: утрату одного из аллелей гетерозиготного генотипа, а в ряде случаев -дисбаланс аллелей микросателлита. Последний проявлялся изменением уровня амплификации одного из аллелей микросателлита относительно второго (рис.11, дорожки 1, 3) по сравнению с контролем (рис.11, дорожки 2, 4). На рисунке 11 стрелками указаны мажорные фрагменты, соответствующие аллелям микросателлита. Остальные же полосы представляют собой неспецифические продукты реакции, обусловленные ошибками Taq полимеразы. Снижение уровня амплификации одного из аллелей, а не полное отсутствие продукта реакции объясняется, очевидно, гетерогенностью популяции клеток опухолевой ткани, а именно, соотношением опухолевых клеток, стромальных элементов и, инфильтрирующих опухолевую ткань, клеток иммунной системы, имеющих неизмененный генотип. В некоторых случаях, когда разрешающая способность 1гарозного гель-электрофореза позволяла разделить аллели, потеря гетерозиготного генотипа (рис. 10, дорожки 4, 8) и дисбаланс аллелей в клетках эпухолевой ткани (рис. 10, дорожки 6, 10) в отличие от контролей (рис. 10, юрожки 5, 7, 9, 11) обнаруживались уже на I этапе амплификации с праймерами [R1-IR3, амплнфицирующих область двух близкорасположенных чикросателлитов TNFa и TNFb. Таким образом, в 15% случаев рака шейки чатки выявлен как дисбаланс аллелей, так и утрата отдельных аллелей микросателлитного повтора в локусе генов TNF на коротком плече 6

фОМОСОМЫ.

Выводы:

1. Методом блот-гибридизации по Саузерну последовательности вируа папиллом (HPV) 16 и 18 типов обнаружены в 73% случаев карцином шей! матки и в 48% случаев морфологически нормальных тканей, прилегающих опухолевым.

2. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) последовательности HPV и 18 типов обнаружены во всех (100%) случаях рака шейки матки, и в 88 случаев морфологически нормальных тканей, прилегающих к опухолевы Вирус папилломы 16 типа является наиболее распространенным исследованной популяции больных (86%).

3. В 60% исследованных карцином шейки матки последовательности HI интегрированы в геном клетки, при этом наряду с интегрированныл молекулами в 44% случаев одновременно определяется персистенщ эписомальных форм вирусной ДНК. В 40% случаев рака шейки матк ассоциированных с инфекцией 16 типом вируса, в опухолевой тка! обнаруживается персистенция исключительно эписомальных форм вирусн« ДНК.

4. Несмотря на наличие открытой рамки считывания Е6 вирусного геном продукт которой обладает способностью деградировать белок р53 в систем in vitro, в клетках рака шейки матки определяется экспрессия белка р5 эквивалентная экспрессии его в клетках морфологически нормально эпителия шейки матки, прилегающего к тканям опухоли.

5. Исследование 2-х типов повторяющихся последовательносте локализованных на разных хромосомах, как маркеров полиморфизма нестабильности генома в клетках опухолей, выявило следующ] закономерности:

• в популяции больных раком шейки матки выявляется статистичеа достоверное увеличение частоты встречаемости аллеля а4 облас варибельных 28-членных тандемных минисателлитных повторов (VTR) локу гена Ha-rasI (хромосома lip) и увеличение показателя относительного рис развития рака шейки матки среди носителей этого аллеля в 3.2 раза.

• в 15% случаев рака шейки матки выявлен как дисбаланс аллелей, так и утра отдельных аллелей микросателлитного повтора в локусе генов TNF i коротком плече 6 хромосомы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

'Consensus and type specific amplification in studying of HPV infection in women ivith cervix cancer in Russia." Samoylova E., Gratchev A., Petrov S., Shaikhaiev 3., Abstracts of 2nd International Congress of Papillomavirus in Human Pathology, Paris, 1994.

'Выявление онкогенных типов вируса папилломы человека при патологии лейки матки." Габитов Н.А., Самойлова Э., Фросина Е.В., Петров С.В., Гезисы докладов VIII республиканской научно-практической конференции ю актуальным вопросам диагностики и лечения злокачественных новообразований "Онкология-95", Казань, 1995, стр.79-80.

'HPV infection in patients from Russia with cervical lesions and tumors." Kisseljov ~.L., Samoylova E., Semjonova L., Kozachenko V., Lebedev A., Kozachenko M., Metchuskin M., Makarov E., Kisseljova N., Abstracts of 14th International 'apillomavirus Conference, Quebec, 1995, p42.

'Клеточная дифференцировка и экспрессия клеточных онкогенов при татологии шейки матки: ультраструктурный и иммуно-гистохимический шалнз плоскоклеточной метаплазии, дисплазии и плоскоклеточного рака." 1етров С.В., Райхлин Н.Т., Сухова Н.М., Мазуренко Н.Н., Самойлова Э., Сиселев Ф.Л., Сборник тезисов I Съезда Международного союза ассоциаций татологоанатомов, Москва, 1995, стр. 123-124.

HPV infection in cervical cancer cases in Russia." Samoylova E.V., Shaikhaiev j.O., Petrov S.V., Kisseljova N.P., Kisseljov F.L., Int. J. Cancer61, 337-341, 995.