Изучение особенностей селекции аутореактивных Т-клеток

Звездова, Екатерина Сейрулловна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Изучение особенностей селекции аутореактивных Т-клеток

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Звездова, Екатерина Сейрулловна Москва 2008 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение особенностей селекции аутореактивных Т-клеток

На правах рукописи

ЗВЕЗДОВА ЕКАТЕРИНА СЕЙРУЛЛОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СЕЛЕКЦИИ АУТОРЕАКТИВНЫХ Т-КЛЕТОК

14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

||||||11111111111111!1Ц11»

□03450272

МОСКВА, 2008

003450272

Работа выполнена в НИИ Канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Д.Б. Казанский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор H.H. Тупицин доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин

Ведущая организация:

Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.

Защита состоится '51" UOib^ 2008 г. в \ О "часов на заседании диссертационного совета (К.001.017.01) РОЩ им. H.H. Блохина РАМН (115478 Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. H.H. Блохина

РАМН

Автореферат разослан " X " .£_ 2008 г.

Учёный секретарь

специального диссертационного совета

доктор медицинских наук

Ю.А. Барсуков

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1 Актуальность проблемы.

Как сказал Ганс Стаусс, "Antitumor immunity is beneficial autoimmunity." -«Противоопухолевый иммунитет это полезный аутоиммунитет.» Действительно, работы последних лет привели к пониманию того факта, что большинство антигенов опухолевых клеток представляют собой нормальные белки организма, экспрессируемые аберрантно, т.е. не в то время и не в том месте. В процессе своего нормального развития иммунная система теряет способность к распознаванию таких антигенов, как и прочих собственных антигенов организма. Центральная роль в этом разграничении распознавания «своего» и «чужого» принадлежит внутритимусной негативной селекции, устраняющей клоны Т-клеток с высокой авидностью к «своему». Этот процесс охватывает и широчайший спектр Т-клеток, специфичных к стадио- и органоспецифическим антигенам, включая «забарьерные» антигены тестиса, что обусловлено способностью тимусного эпителия? к их стохастической экспрессии.

1.2 Цель и задачи исследования.

Целью данной работы является исследование природы аутореактивных Т клеток и механизмов избегания ими негативной селекции. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить аир цепи Т- клеточных рецепторов аутореактивных гибридом и проанализировать их CDR районы.

2. Определить специфичность TCR аутореактивных гибридом путем создания трансфектантов на основе линии тимомы 4G4, эскпресирующих аир цепи TCR полученных аутоиммунных гибридом в паре с корецепторами CD4 и CD8.

3. Выяснить роль корецептора CD4 в распознавании молекул МНС класса I.

4. Создать трансгенных животных, экспрессирующих TCR аутореактивной гибридомы 7.

5. Провести иммунофенотипирование и функциональный анализ Т клеток мышей, трансгенных по TCR ауторективной гибридомы 7.

1.3 Научная новизна.

Впервые в России нами были созданы трансгенные животные, экспрессирукмцие а-цепь аутореактивного TCR, проанализирован репертуар Т-клеток трансгенных животных, селектированных в присутствии и отсутствие делегирующего лиганда- молекул МНС класса II, были выяснены возможные принципы внутритимусной селекции аутоиммунных Т-клеток и их миграции на периферию и детально исследована роль а-цепи TCR в формировании специфичности TCR к антигенам. Нами было выяснено, что основным механизмом избегания аутореактивными Т-клетками негативной селекции является реаранжировка двух а-цепей и последующая экспрессия двух Т-клеточных рецепторов на поверхности одной Т-клетки. Показана доминирующая роль корецептора CD4 над CD8 за проведение сигнала через TCR, что проясняет многие эффекты, наблюдаемые при селекции и дифференцировки Т-клеток в тимусе. Было выяснено, что а-цепь TCR существенно влияет на его специфичность к аллельным вариантам молекул МНС. Причем наблюдаемый эффект обусловлен врожденным предпочтением вариабельных регионов TCR к взаимодействию с аллельными формами молекул МНС. Все это может иметь важное значение для выяснения способов управления специфичностью развивающихся Т-клеток и способов лечения, как аутоиммунных заболеваний, так и онкологических заболеваний.

1.4 Научно-практическая значимость исследования.

Результаты, полученные в ходе даной работы, могут быть использованы в фундаментальных исследованиях. Полученные данные способствуют пониманию особенностей селекции аутореактивных клеток и вносят новый вклад в представления о механизмах развития иммунопатологических состояний.

1.5 Апробация работы.

Диссертационная работа апробирована 25 июня 2008 года на совместной конференции лабораторий механизмов гибели опухолевых клеток, иммунологии онкогенных вирусов и механизмов регуляции иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина.

Результаты опубликованы в 6 научных статьях в рецензируемых журналах и представлены 13 сообщениями на международных конференциях.

1.6 Структура и объём работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 150 странице машинописного текста и включают 30 рисунков, 3 таблицы и список литературы из 177 источников.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

2.1 Обзор литературы.

Обзор литературы посвящён описанию этапов созревания предшественников Т-лимфоцитов в тимусе и механизмов формирования разнообразия Т-клеточных рецепторов в процессе взаимодействия с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Описаны механизмы детерминации Т-клеточных предшественников и их негативной и позитивной селекции..

2.2 Материалы и методы.

Лабораторные животные. В работе использованы мыши инбредных линий, полученные из разведения вивария Российского Онкологического Научного Центра РАМН: C57BL/6 (KbI-AbDb), C57BL/10 (KbI-AbDb),

Bi0.D2(R101) (KdI-AdI-EdDb), C57BL/6J-H2bm!/ER(H-2bml),C57BL/6J-H2bm 12/ER(H-2bml2), C57BL/6J-H-2bm3 (Kbm3I-AbDb). Мыши, нокаутные по ; молекулам р2-микроглобулина - C57BL/6J-B2mtm,Unc (H-2b), транспортеров, ассоциированных с процессингом (ТАР) - С5ТВЫ61-Тар1ш1Лгр были получены из Jackson Laboratory (Bar Harbor, Main, USA) и поддерживались в лаборатории механизмов регуляции иммунитета НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН. Выделение ДНК проводили по стандартной методике с использованием протеиназы К (Maniatis, 1989). Выделение РНК проводили с помощью реагента TRIZOL LS в соответствии с рекомендациями производителя (GibcoBRL, USA). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в следующем режиме: денатурация 94 °С - 2 мин; далее следовало 35 циклов: 94 °С - 1мин, 55 °С -1мин, 72 °С - Шин; последний синтез 72 °С - Юмин. Для ОТ-ПЦР (ПЦР после обратной транскрипции) использовали обратную транскриптазу SuperScript II и oligo (dT)i5.

Клонирование с использованием ТА (pTZ57RT) вектора. Для клонирования TCR использовали ТА Cloning Kit (Invitrogen, USA). Фрагменты ДНК, амплифицированные с помощью ПЦР, без предварительной очистки клонировали в вектор pCR 2.1 по протоколу, предложенному фирмой производителем.

Реакция MLR. Для постановки MLR 3x106 отвечающих спленоцитов (респондеров) инкубировали в присутствии аллогенных или сингенных стимуляторов, обработанных митомицином С ( 25 мкг/мл, 37°С, 30 мин ), в количестве 5x106 клеток на лунку 24-луночного плоскодонного планшета или 5x105 клеток в лунку 96-луночного круглодонного планшета. Для избирательной активации клеток памяти стимуляторы подвергали острому тепловому шоку инкубацией спленоцитов при 45°С в течение 60 минут, затем их добавляли в культуру в количестве 4x106 в лунку на лунку 24-луночного плоскодонного планшета или 4x105 клеток в лунку 96-луночного круглодонного планшета. Клетки инкубировали в полной ростовой среде: RPMI-1640 (ПанЭко, Россия), содержащей 5% сыворотки человека, 0.016%

гентамицина сульфата, 4 ммоль L-глутамина (Serva), 20 ммоль HEPES (Sigma) и 5 х 10"5 М 2-меркаптоэтанола (Merck) при 37°С в атмосфере с 5% С02 и абсолютной влажностью в течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценивали по включению 3Н-тимидина за последние 8 ч. Аллогенный ответ подсчитывали как разность между включением [3Н]-тимидина в культуры с аллогенными и сингенными стимуляторами.

Цитотоксический тест (CTL). Цитотоксический тест. Активированные клетки из регионарных лифатических узлов после инкубации в течение 72 часов в полной среде и активированные клетки памяти из MLR очищали от погибших клеток центрифугированием (200g) на ступенчатом градиенте плотности фикол-верографина с плотностью 1,09 в течение 15 мин 200g. В качестве мишеней использовали трансфицированные белком GFP мастоцитому Р815 и тимому EL-4 в количестве 5х104 клеток на лунку. Клетки переносили в 96-луночный круглодонный планшет, осаждали центрифугированием (200g, 5 мин) и инкубировали в термостате при 37°С, 5% СОг и 100% влажности 4 часа, затем анализировали количество оставшихся клеток-мишеней, экспрессирующих GFP, на проточном цитофлуориметре.

Окрашивание антителами и анализ на проточном цитофлуориметре. Для анализа клеток на проточном цитофлуориметре (FACScan, FACStar, FACSCalibur, Becton Dickinson, USA) использовали следующие моноклональные антитела фирмы PharMingen, USA: анти-TCR a/ß (Clone H57-597), ати-С1>4 (Clone RPA-T4), анти-СОЗ (Clone 145-2С11), airra-CD8a (Clone 53-6.7), aHTH-CD8ß (Clone H35-17.2), анти-убТСЯ (Clone V65), анти-СБ5 (Clone 53-7.3), анти-СБ25 (Clone 2A3), анти-СБ44 (Clone G44-26), анти-СБ62Ь (Clone Dreg56), анти-С069 (Clone FN50), анти-PD-l (Clone J43), анти-Vall (Clone RR8-1), анти-УЗЗ (Clone KJ25), анти-VßS. 1/5.2 (Clone MR9-4), антиЛф8.3 (Clone 1B3.3), анти-Vßll (Clone RR3-15). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре (Becton Dickinson, Mountain View, CA) с использованием программного обеспечения CellQuest.

Клонирование полноразмерных цепей TCR и корецепторов CD4/CD8 в экспрессионные векторы. Продукты амплификации кДНК из гибридом, поднятые праймерами к полноразмерным цепям TCR обрабатывали рестриктазами, очищали с помощью набора фирмы QIAGEN (USA) выделяя их из агарозного геля и клонировали в ретровирусные экспрессирующие векторы pMigRI (а-цепь) (Invitrogen, USA) и pMINV (ß-цепь) (Invitrogen, USA) Последовательности аир цепей корецептора CD8, были любезно предоставлены Деном Литтманом в векторе pBS. Из вектора pBS последовательность CD8a и CD8b переклонировали в векторы pMSCVpuro(Clontech, USA) и pMSCVhygro(Clontech, USA), соответсвенно. Последовательность корецептора CD4 была любезно предоставлена Червонским A.B. в векторе pcDNA3.1 (+/-). Кодирующую последовательность CD4 переклонировали в лентивирусный вектор pLenti6/V5 -D-TOPO(Invitrogen, USA).

Клонирование реаранжированной геномной ДНК а и ß цепей TCR гибридомы 7 в кассетные векторы рТа и pTß. Продукты амплификации геномной ДНК из гибридомы 7, поднятые праймерами, специфичными к V и J сегменту а и ß-цепи, обрабатывали рестриктазами клонировали в кассетные векторы рТа и pTß и секвенировали[Кошко£Г V., et al., 1995].

Трансфекция линий пакующих фибробластов векторами и сбор вируса. Трансфекцию для векторов pMINV(Invitrogen) и pMigRI (Invitrogen) проводили на специальной линии пакующих фибробластов 293.1 (Invitrogen), для вектора pLenti Topo-V6-D5 проводили на линии пакующих фибробластов 293FT, для векторов pMSCVpuro и pMSCVhygro проводили на линии пакующих фибробластов GP293.

Для трансфекции использовали Escort 4 transfection reagent (Sigma, USA), трансфекцию проводили в соответствие с рекомендациями фирмы производителя.

CTLL тест. 100 мкл супернатанта переносили в лунки 96 луночного круглодонного плэйта к 7-10 тыс. клеткам линии CTLL-2 в объеме 50 мкл.

Предварительно клетки CTLL-2-3 раза отмывали от IL-2 в 1х ФСБ. Через 18 часов в лунки капали 10% по объему ALAMAR BLUE(Gibco), аналог НАДН-дегиброгеназы. Через 24 часа данные снимают на приборе MULTI SCAN при 540 и 620 длинах волн. Данные анализировали в программе Excel.

Получение транкированной формы CD4. С этой целью во фрагмент последовательности гена CD4 вместо триплета, кодирующего цистеин в позиции 420, ответственный за связывание с тирозиновой киназой Lck, вводили stop-кодой. Небольшой фрагмент кДНК гена CD4 около 300 пн поднимали праймерами, содержащими нативный сайт рестрикции к ферменту ВатШ и искуственно введений сайт рестрикции к ферменту Xhol, а также стоп-кодон. ПЦР продукт клонировали в вектор pTZ57RT и секвенировали во избежание мутаций. Последовательность кДНК оставшегося гена вырезали из вектора pcDNA при помощи ферментов Xho I и BamH I, сайты рестрикции которых находятся в векторе и гене CD4, соответственно. В последующем оба фрагмента клонировали в вектор pLenti6/V5-D-TOPO (Invitrogen, USA).

Результаты работы. 2.2.1 Клонирование и анализ TCR аутореактивных гибридом.

В нашей лаборатории был разработан метод получения Т-гибридом, экспрессирующих аутореактивные TCR, из Т-лимфоцитов мышей дикого типа, у которых все этапы дифференцировки тимоцитов проходили в отсутствие генетических изменений, что имеет большое преимущество перед моделями генномодифицированных животных, используемых как источник аутореактивных Т-клеток.

Нами был использован следующий метод получения Т-клеточных гибридом: клетки лимфатических узлов мышей линии C57BL/6 в смешанной культуре лимфоцитов(М1Л1) in vitro стимулировали аллогенными спленоцитами мышей линии C57BL/6J-H2 bm3/ER(H-2 Ьш3) предварительно

ЪхлЗ ЬгоЗ

обработанными митомицином "С. Линия мышей C57BL/6J-H2 /ER(H-2 ) отличается от линии C57BL/6 двумя точечными мутациями в молекуле Кь МНС класса I. С целью получения гибридом, бластные Т- клетки CD8+ сливали с

клетками тимомы BW5147, экспрессирующей корецептор CD4 и CD8. Корецептор CD4 позволял Т- клеткам CD8+ распознавать молекулы МНС класса II. Полученные гибридомы тестировали по продукции IL-2 в ответе на сингенные молекулы Аь МНС класса II и отбирали аутореактивные гибридомы. Таким образом, нам удалось получить Т гибридомы из Т-клеток CD8, распознающих аллогенные молекулы КЬт3 МНС класса I и в тоже время способных распознавать сингенные молекулы Аь МНС класса II в присутствии корецептора CD4.

Чтобы более детально изучить особенности аутореактивных Т-клеточных рецепторов полученных аутореактивных гибридом, их специфичность и зависимость проведения активационного сигнала от корецепторов, из клеток гибридом выделяли мРНК. Методом RT-PCR с использованием праймеров для определения вариабельных сегментов а и р-цепей TCR анализировали, какие а и |3-цепи экотрессируют гибридомы. Чтобы определить последовательности V(D)J сегментов TCR продукты амплификации клонировали в вектор pTZ57RT с последующим секвенированием реаранжированной области. Нами был произведен анализ Т- клеточных рецепторов 18 аутореактивных гибридом.

У двух гибридом 7 и СИ обнаружилась экспрессия двух альфа цепей, ассоциированных с одной и той же р цепью, причем у гибридомы 7 обе а цепи принадлежат к одному семейству Vail и отличаются лишь точечными мутациями в вариабельном районе и J сегментом.

Чтобы исследовать специфичность аутореактивных TCR и зависимость проведения ими сигнала от наличия определенного корецептора, мы использовали систему in vitro, в которой в клетках тимомы 4G4 при помощи ретровирусной трансдукции индуцировали экспрессию аутореактивных TCR и корецепторов CD4/CD8. Ответ полученных трансфектантов оценивали по продукцию IL-2 в ответе на сингенные молекулы Аь МНС класса II спленоцитов мышей C57/BL6, аллогенные молекулы КЬш3 МНС класса I мышей C57BL/6J-H2bm3/ER(H-2bm3). Для того, чтобы доказать специфичность TCR именно к молекуле Аь, клетки трансфектантов стимулировали в присутствие

аллогенных молекул Abm12 МНС класса II мышей мышей C57BL/6J-H2bml2/ER(H-2bm12), отличающихся от молекулы Аь МНС класса II тремя точечными мутациями. Выяснилось, что трансфектант 4G47A1, экспрессирующий одну из а-цепей гибридомы 7 в совокупности с ß-цепью, отвечает на сингенные спленоциты мышей C57BL/6, экспрессирующие молекулы Аь МНС класса II, в то время как вторая а-цепь гибридомы 7 придает специфичность TCR к аллогенным молекулам КЬш3 МНС класса I (рис.1).

Анализ специфичности TCR гибридомы al.l, полученной путем слияния BW5147 с CD8+ Т-клетками из мышей с искусственным аллельным исключением а цепи (TCRa+/-), показал, что клетки трансфектантов, экспрессирующих данный TCR, активируются в ответе как на сингенные спленоциты мышей C57BL/6, так и на аллогенные спленоциты мышей C57BL/6J-H2bm3/ER(H-2bm3) (рис.2).

Из полученных результатов можно высказать предположение, что аутореактивные Т-клетки, выявляемые на периферии у мышей C57BL/6, дифференцируются по пути Т-клеток CD8+ и делятся на две популяции: Т-клетки, экспрессирующие два TCR, обладающие разной специфичностью в распознавании молекул МНС класса I и II, и Т-клетки, экспрессирующие один TCR, обладающий двойной специфичностью в распознавании как молекул МНС класса I, так и молекул МНС класса II. 2.3.2. Роль корепептота CD4 в распознавании молекул МНС класса I.

Одним из гипотетических механизмов избегания негативной селекции аутореактивными Т-клетками, рассмотренных ранее, является смена экспрессии корецептора CD4 на CD8 и изменение связываемого TCR лиганда в зависимости от экспрессии соответствующего корецептора. Такой механизм возможен в случае экспрессии двойного рестриктированного TCR, где экспрессия корецептора позволяет Т-клетке сделать выбор, будет ли она активированна за счет взаимодействия с молекулами МНС класса I, в случае экспрессии корецептора CD8, или за счет взаимодействия с молекулами МНС класса II, в случае экспрессии корецептора CD4. Мы решили выяснить,

способен ли корецептор CD4 активировать Т-клетки, TCR которых специфически распознает молекулу МНС класса I или же корецептор CD4 способен выполнять роль корецептора CD8 в активации Т-клеток, распознающих молекулы МНС класса I. С этой целью была создана экспериментальная система, в которой на клетках трансфектантов 4G4, экспрессирующих TCR, специфичный к молекулам МНС класса I, помимо корецептора CD8 или вместо него экспрессируется корецептор CD4, создав такую ситуацию, когда TCR и корецептор специфичны к разным молекулам МНС. В качестве источника TCR, распознающего молекулы МНС класса I, был взят TCR гибридомы 1D1, которая была получена в результате слияния CD8+ Т-клеток. Активация клеток гибридомы 1D1 зависит от присутствия молекул КЬМНС класса I и наличия корецептора CD8. Анализ трансфектантов 4G4, экспрессирующих TCR гибридомы 1D1, показал, что вне зависимости от наличия или отсутствия корецепторов, трансфектанты 4G4 специфично распознают молекулы МНС класса I, так как активация не наблюдается при инкубации клеток с АРС мышей ТАР"'" и р2т'/". Причем, в случае экспрессии : корецептора CD8, распознавание зависит от него, в случае экспрессии корецептора CD4, распознавание зависит от корецептора CD4, что определялось в тесте блокированием активации антителами к соответствующим молекулам (рис.3). Эти результаты показывают, что Т-лим'фоцит, специфичный к молекуле МНС класса I может успешно ' активироваться в присутствии корецептора, не совпадающего по специфичности с TCR. Удивительным оказалось то, что ответ трансфектанта 4G41D1DP, экспрессирующего оба корецептора, на молекулы МНС класса I блокируется антителами к молекуле Аь МНС класса II или антителами к молекуле CD4, но не антителами к молекуле CD8 (рис.3). Таким образом, в системе, где на клетках тимомы экспрессируется TCR и оба корецептора, корецептор CD4 функционально доминирует над корецептором CD8 за проведение активационного сигнала и активация клеток трансфектантов

требует одновременного связывание TCR с молекулами МНС класса I и корецептора CD4 с молекулами МНС класса II.

Трансфектанты, экспрессирующие мутантный корецептор CD4, сохраняют способность к активации в ответе на молекулу МНС класса I, что свидетельствует о независимости активации трансфектантов 4G4 от сигнальной функции корецептора CD4. По всей видимости, реализация эффекта доминирования обусловлена конкурентными взаимоотношениями корецепторов CD4 и CD8 в ходе формирования иммунологического синапса. 2.3.3 Анализ периферического пула Т-лимфоцитов мышей 7Altg а-цепи

аутореактивного TCR. Создание мышей трансгенных по a-цепи TCR. Реаранжированная геномная ДНК аир цепей TCR гибридомы 7 клонировали в специальные кассетные векторы для создания TCR трансгенных мышей рТа и рТЬ.

Полученные конструкции аутореактивной а- цепи TCR гибридомы 7 инъецировали в ооциты мышей C57BL/6, оплодотворенные самцами той же линии. Было получено пять независимых трансгенных линий мышей-7А13048, 7А13000, 7А12997, 7А12993, 7А13069 одна из которых линию 7А12997 использовали в экспериментах. Экспрессию трансгенной альфа-цепи определяли методом PCR и окрашиванием лимфоцитов моноклональными антителами к семейству Val 1 и последующим анализом на FACScan (см. рис. 4).

Фенотипирование Т-клеток трансгенных мышей. 70-87% клеток CD3+ лимфоидных органов трансгенных по a-цепи TCR экспрессируют трансгенную Vail цепь, ассоциированную с разнообразными ß-цепями TCR Vß8.3, Vß3, Vßl l,Vß5.1/5.2. В тимусе трансгенных мышей выявлено значительно сниженное количество клеток на стадии DP и повышенное количество тимоцитов DN по сравнению с мышами дикого типа C57BL/6 (рис. 5).

В периферическом пуле CD3+ Т-клеток трансгенных мышей обнаруживаются двоекратное снижение Т-клеток CD8+ и CD4+ и 10 кратное увеличение популяции Т-клеток DN (рис.5). Повышенное количество тимоцитов

БЫ не связано с неэффективной позитивной селекцией, так как больших различий в уровне экспрессии маркеров зрелости лимфоцитов ША и СБ69 между трансгенными и мышами дикого типа не наблюдается. Повышенное количество тимоцитов БЫ не связано с усиленной негативной селекцией Т-клеток на основе линии С57ВЬ/6, так как окрашивание клеток тимуса Аппехт V не выявило увеличения количества апоптозирующих клеток в тимусе мышей 7а^(Н-2ь) по сравнению с мышами С57ВЬ/6. Цитофлуориметрический анализ показал накопление тимоцитов на стадии БШ и снижение количества клеток на стадии БЫ4 у мышей 7АИ§(Н-2Ь). На стадии БШ тимоциты начинают экспрессировать реаранжированную р-цепь ТСЯ в комплексе с сурогатной а-цепью рТа. У мышей с трансгенной экспрессией а-цепи ТСЯ, комплекс преТСЯ замещается на ТСЯ. Повышенное количество клеток в стадии БШ у мышей 7АН§(Н-2Ь) наводит на мысль о том, что эти БЫ тимоциты, экспрессирующие полностью реаранжированный ТСЯ, могут связываться с внутритимусными лигандами и дифференцироваться в зрелые Т-клетки без перехода в стадию ПР.

Одним из механизмов подавления активации аутореактивных Т-клеток является экспрессия ингибиторных рецепторов СТЬА-4 и РБ-1, которые активируются на Т-лимфоцитах в ответ на активацию. В мышах, дефицитных по экспрессии СТЬА-4 и РБ-1 наблюдается массивная аккумуляция Т-клеток реактивных к «своему» в периферических лимфоидных и нелимфоидных органах, что приводит к гибели в течении 3-4 недель жизни. Окрашивание клеток тимуса и лимфатических узлов на молекулы СТЬА-4 и РБ-1 выявило повышенную экспрессию молекул РБ-1 и СТЬА-4 на тимоцитах СБ4+ и в периферических Т-клетках СБ4+ трансгенных животных 7А^(Н-2Ь). У мышей 7АЬ§Ьт12, которые отличаются от мышей 7АН§(Н-2Ь) тремя точечными мутациями в молекуле р-цепи Аь (аминокислотные остатки 67, 70, 71) и у которых селекция трансгенных Т-клеток в тимусе мышей Ьш12 происходит в отсутствие делегирующего лиганда в виде молекул Аь МНС класса, экспрессия молекул СТЬА-4 и РБ-1 на тимоцитах и Т-клетках мышей схожа с экспрессией этих же молекул на тимоцитах и Т-клетках мышей С57ВЬ/6(рис. 7).

Молекула CD5 функционирует как негативный регулятор сигнала через TCR. У мышей с трансгенной экспрессией TCR, в отсутствие экспрессии молекулы CD5, наблюдается усиленная негативная селекция тимоцитов. Окрашивание клеток тимуса и лимфатических узлов молекулу CD5 выявило повышенную экспрессию данной молекулы в клетках на всех стадиях развития тимощтов, за исключением стадии DN, а также на периферических Т-клетках CD4+ у мышей 7Altg(H-2b) (рис.6). Это свидетельствует о том, что селектирующиеся тимоциты, экспрессируют TCR, включающий в себя трансгенную а-цепь Vail, обладающий высокой авидностью к сингенной молекуле Аь МНС.

Таким образом, у мышей 7altg(H-2b) с трансгеннои экспрессией только а-цепи аутореактивного TCR наблюдается селекция Т-клеток CD4 с фенотипом клеток высокоафинных к собственным лигандам.

Функциональность Т-клеток трансгенных мышей. Двумя независимыми группами ученых было показано, что TCR обладает врожденной способностью распознавать молекулы МНС. Это сродство определяется CDR1 и CDR2 районами (районы, определяющие комплементарность) вариабельных участков альфа- и бета-цепей TCR, кодированных в геноме. До сих пор остается неизвестным какой вклад в распознавание молекул МНС вносят CDR районы альфа- и бета-цепей в отдельности. Полученные в нашей лаборатории животные с трансгенной экспрессией а-цепи TCR служат удобной моделью для изучения вклада а-цепей в распознавание молекул МНС. Поэтому, мы решили оценить ответ Т-лимфоцитов трансгенных мышей в реакции MLR на аллогенные молекулы МНС классов I и II. Удобной системой для исследования данного вопроса служит панель линий мышей-мутантов, отличающих от мышей C57BL/6 точечными мутация в молекулах МНС класса I и II. Т-клетки трансгенных мышей активировали в присутствие сингенных спленоцитов мышей C57BL/6, а также аллогенных стимуляторов- мышей C57BL/6J-H2bml/ER(H-2bml), C57BL/6J-H-2bm3 (Kbm3I-AbDb), экспрессирующих аллогенные молекулы МНС класса I-Kbml, КЬш3 мышей C57BL/6J-ffibmI2/ER(H-2bm12), экспрессирующих аллогенные

молекулы МНС класса П-АЬю12, и мышей B10.D2(R101), экспрессирующих аллогенные молекулы МНС класса I(Kd) и II(Ad, Ed). Т-клетки трансгенных мышей как не способны пролиферировать в ответ на сингенные молекулы МНС мышей C57BL/6 и на аллогенные молекулы МНС класса I- Kbml и КЬш3, ответ на аллогенные молекулы МНС класса II- AbmI2 значительно снижен, в то время как ответ на спленоциты мышей B10.D2(R101)(KdDbId) превышает ответ Т-клеток мышей дикого типа в 2-4 раза (рис.7). Цитофлуориметрический анализ клеток, пролиферирующих в MLR, показал, что в ответ на спленоциты мышей B10.D2(R101) усиленно пролиферируют трансгенные Т-клетки с фенотипом Vall+CD8+ и Vall+DN, тогда как активации Т-клеток CD4+ не наблюдается (рис.8). Усиленный ответ Т-лимфоцитов трансгенных мышей на молекулы Kd может быть связан с преобладанием в периферическом пуле Т-клеток 7Altg клонов Т-клеток, специфичных к данной молекуле. Так как каждый клон Т-клеток у трансгенов 7AI, экспрессирует TCR, состоящий из одной и той же а-цепи Vail, ассоциированной с разнообразными ß-цепями, можно заключить, что а-цепь существенно влияет на специфичность TCR к аллельным вариантам молекул МНС. Более того, Т-клетки мышей трансгеннов 7Altg способны проявлять цитотоксическую функцию против мастоцитомы Р815, экспрессирующей аллогенные молекулы МНС класса I KdD4, а также формировать Т-клетки памяти.

Чтобы выяснить формируется ли специфичность репертуара к молекулам МНС во время позитивной селекции или же она является врожденной, мы скрестили мышей 7Altg(C57BL/6) с мышами линии C57BL/6J-H2bm3/ER(H-2bm3) с целью оценки ответа трансгенных Т-клеток, прошедших селекцию в присутствии молекул МНС класса I. Линия мышей C57BL/6J-H2bm3/ER(H-2bm3) отличается от линии мышей C57BL/6 двумя точечными мутациями в аминокислотных остатках 77 и 89 а-цепи молекулы Кь МНС класса I.

Пролиферативный ответ Т-клеток трансгенных животных 7Altg(H-2bm3) и 7AItg(H-2b), 7Al(tgbl6/bm3) схож, активации на аллогенные спленоциты мышей bm3, bml не наблюдается, тогда как ответ на спленоциты мышей B10.D2(R101)

неизменно высок. Таким образом, вне зависимости от вида позитивно селектирующих молекул трансгенный TCR распознает аллогенные молекулы МНС сходным образом, что прямо подтверждает гапотезу Ерне о том, что специфичность TCR к молекулам МНС заложена в структуре V-генов, а не формируется во время позитивной селекции в тимусе, как это предполагалось ранее.

Распознавание молекул Аь МНС класса II Т-тетками трансгенных мышей 7Altg. Трансгенные мыши 7Altg были сделаны на основе линии C57BL/6, которая несет молекулы МНС класса II-Ab, являющиеся делегирующим лигандом для TCR, в состав которого входит Vail цепь. В силу негативной селекции, которой подвергаются трансгенные Vall+ клетки, нам не удается увидеть ответ на сингенные молекулы МНС класса II и выяснить какие Т-клетки активируются в данном ответе. С этой целью мы перевели трансгены 7Altg(C57BL/6) на кинию мышей bml2, что позволит трансгенным Т-клеткам селектироваться в отсутствие делетирующего лиганда в виде молекул Аь МНС класса II.

Как видно из рис.9 Т-клетки мышей 7Al(H-2bml2) пролиферируют в ответ на спленоциты мышей C57BL/6, ЬшЗ, bml и B10.D2(R101). Чтобы проверить, в ответе на какие молекулы МНС-класса I или II- активируются Т-клетки мышей 7Al(H-2bml2), в качестве стимуляторов использовали спленоциты мышей ТАР"'" (Н-2Ь) и p2m_/"(H-2b), дефицитных по молекулам МНС класса I. Как видно трансгенные Т-клетки пролиферируют в ответ на спленоциты мышей ТАР"'" и Р2т"/_, следовательно, Т-клетки 7Al(H-2bml2) активируются в ответе на молекулы Аь МНС класса II. Цитофлуориметрический анализ клеток, пролиферирующих MLR, показал, что в ответ на спленоциты мышей C57BL/6 и ТАР-/- практически вдвое увиличивается количество Val 1+CD4+ Т-клеток, в 3 раза Val 1+CD8+ и в 1.5 раза- Val 1+DN Т-клеток. (рис. 10).

Таким образом, Т-лимфоциты мышей 7Altgbml2, селектированные в отсутствие делетирующего лиганда в виде молекул Аь МНС класса II сохраняют

способность к активации в ответ на спленоциты, экспрессирующие данные молекулы МНС класса II.

3. выводы.

1. В периферическом пуле Т клеток CD8+ мышей C57BL/6(H-2b) дикого типа присутствуют аутореактивные Т клетки, распознающие сингенные молекулы МНС класса II. Часть этих клеток экспрессирует два TCR, один из которых способен к распознаванию аллогенной молекулы МНС класса I, в то время как другой-сингенной молекулы МНС класса П. Другая часть клеток экспрессирует один TCR, обладающий двойной специфичностью в распознавании аллогенной молекулы МНС класса I и сингенной молекулы МНС класса И.

2. Корецептор CD4 может замещать корецептор CD8 Т клеток в ответе на молекулу МНС класса I. При экспрессии обоих корецепторов на поверхности Т-клетки наблюдается функциональное доминирование корецепгора CD4 над корецептором CD8.

3. Ограничение разнообразия Т-клеток по а-цепи TCR Vail приводит к усилению ответа репертуара Т-лимфоцитов на молекулу Kd МНС класса I и угнетению ответа на молекулы МНС линий мышей bml, ЬтЗ, Ьт12. Наблюдаемый эффект обусловлен врожденным предпочтением вариабельных регионов TCR к взаимодействию с аллельными формами молекул МНС.

4. У мышей с трансгенной экспрессией а-цепи аутореактивного TCR наблюдается селекция Т-клеток CD4 с фенотипом клеток высокоафинных к собственным лигандам.

Е1С57ВЬ/10сел.

Рис.1. Зависимость распознавания клеток АРС, экспрессирующих молекулы МНС класса 1-КЬш3 и молекулы МНС класса II- Аь и АЬш12 трансфектантами 4G47A1 и 4G47A2, от экспрессии корецепторных молекул. Реактивность измеряли по продукции IL-2 в CTLL-2 тесте. В качестве стимуляторов использовали спленоциты мышей C57BL/10, C57BL/6J-H2bml2/ER и фибробласты линии bm3.SV Для контроля использовали клетки 4G4(Mock), трансдуцированные пустыми векторами pMSCVMigRl и pMSCVMINV и клетки гибридомы 3D12, экспрессирующий аутореактивный TCR, специфичный к молекулам Аь МНС класса II. По оси ординат % редукции аламара.

Mock al.l al.lcd4 al.lcd8<xP

Рис.2. Распознавание клеток АРС, экспрессирующих молекулы МНС класса 1-КЬт3 и молекулы МНС класса II- Аь и АЬт12 трансфектантами 4С4а1.1.

Реактивность измеряли по продукции 11,-2 в СТ1Х-2 тесте. В качестве стимуляторов использовали спленоциты мышей С57В1Л0, С57ВЬ/61-Н2Ьт3, С57ВЬ/61-Н2Ьт12/ЕК и Р2т_/".Для контроля использовали клетки 404(Моск), трансдуцированные пустыми векторами рМ8СУМ1§Я1 и рМвСУМГИУ. По оси ординат % редукции аламара.

Ш ТАР-/- сел. IHI C57BL/10 сел. CZ3 B10.D2(R101) сел.

Моек

1D1DN 1D1CD4 1D1CD8a|3 1D1DP

3D12rn6p

Б)

-|C57BU6spl +antiCD8a ^C57BL/6spl +antiCD4

В C57BL/6spl

В)

C57BL/6spl +antiCD8a Щ C57BL/6spl +antiCD4

BC57BL/6spl +antiAb C57BL/6spl

1D1СD8aP ЗЫ2 гибр. Mock

Mock

ID1DP

3D12 гибр.

Рис.3. Зависимость распознавания молекул МНС класса 1-Кь клетками тимомы 4G4, экспрессирующей TCR гибридомы 1D1, от экспрессии корепторных молекул.

А) Распознавание клеток АРС, экспрессирующих молекулы МНС класса 1-Кь вариантами клеток тимомы 4G4, экспрессирующей TCR гибридомы 1D1 и корецепторы CD4/CD8.

Б и В) Блокирование ответа трансфектантов 4G41DlCD8a(5 ? 4G41D1CD4CD8 на молекулы МНС класса 1-Кь антителами к молекулам CD4, CD8, Аь. Реактивность измеряли по продукции IL-2 в CTLL-2 тесте. В качестве стимуляторов использовали спленоцигы мышей C57BL/10, C57BL/6, ТАР''-, B10.D2(R101). Для контроля использовали клетки 4G4(Mock), транедуцированные пустыми векторами pMSCVMigRl и pMSCVMINV, и клетки гибридомы 3D12, экспрессирующий аутореактивный TCR, специфичный к молекулам Аь МНС класса II. По оси ординат % редукции аламара.

C57BL/6(H-2ь) тимус лимф, узлы

7А1 (Н-2Ь) тимус лимф.узлы

6.7<1р/о

Рис. 4. Экспрессия аутореактивной а-цсни Vail в трансгенных мыша 7Altg(H-2b)

Цигофлуориметрическое окрашивание С D3+Т клеток тимуса, лимфатических узлов и мышей, трансгенных по аутореактивной цепи Vcxll гибридомы 7. тимус лимф . узлы селезенка

7А1 (Н-2 ь)

BL/6(H-2b)

CD8

Рис.5 Субпопуляции Т клеток в лимфоидных органах мышей 7Altg(H-2b).

Цигофлуориметрическое окрашивания клеток тимуса и CD3+ клеток лимфатических узлов и селезенки антителами к молекулам CD4, CD8. Цифры указывают процентное соотношение клеток.

37.84% 1.39%

— C57BL/6

-7Altg(H-2b)

"™~"7Altgbml2

Рис.6. Экспрессия PD-1, CTLA-4 и CDS в субпопуляциях

периферических Т- клеткок гаышей "Aiig(H-zb).

60000 ■

50000 -I 40000 ■

I зоооо ■

Bt «

f 20000 I

10000

o-M

|] c:s" hi ,14.11-2»)

| 7Altg(H-2b)

100000 90000 80000

? 70000

]f 60000

| 50000 s 40000 & 30000 20000 10000 0

Рис 7. Пролиферация клеток мышей 7Altg(H-2b) в ответе на аллогеиные стимуляторы в Зх дневной смешанной культуре лимфоцитов (MLR). Пролиферацию оценивали по включению 3Н-тишщша. В качестве респондеров использовали клетки лимфотических узлов мышей С57В1/6 и 7Altg(H-2b), в качестве стимуляторов-спленоциты мышей C57BL/10, B10.D2(R101), C57BL/6J-H2bm3, C57BL/6J-H2bmU/ER, C57BL/6J-H2to"/ER(H-2tol1}, обработанные митомицином С (MitC) По оси ординат СРМ.

C57BIV6 a С57ВЫ6 MytC

C57BL/6aBJ0.D2(R]0i) MytC

33.78 6.99

Я ......4,53...

40.26 9.43

. ¿яуйё ШкА jP&fv-

iggf'

7Altg(H-2b) a CS7BL/6 MytC 7Altg(H-2b) aB10.D2(R101) MytC

30.70 ■ ¿¿£¡5 2.78

- ,.....W

7Altg(H-2b) aC57BL/6MytC 7A1tg(H-2b) aB10.D2(Rl01) MytC

-ЮТ1

5.20

Рис. 8. Цитофлуорнметрический анализ клеток мышей 7А^(Н-2Ь), пролиферирующих в Зх дневной МЬН в ответе па аллогенные стимуляторы.

В качестве респондеров использовали сингенные спленоциты С57ВЬ/10 и аллогенные

В1(Ш2(1Ш1), обработанные митомицином С (МпС).

Цифры указывают процентное соотношение клеток в культуре.

80000

Рис 9. Пролиферация клеток мышей 7Altgbml2 в ответе на аллогенные стимуляторы в Зх дневной смешанной культуре лимфоцитов (MLR). Пролиферацию оценивали по включению 3Н-тимидина. В качестве стимуляторов использовали спленоциты мышей C57BL/10, B10.D2(R10I), ТАР''", p2mJ", обработанные митомицином С (MitC). По оси ординат СРМ.

Vail

Рис. 10. Цитофлуориметрический анализ клеток мышей 7Altgbml2, пролнферирующнх в Зх дневной MLR мышей 7Altg(H-2b) в ответе на аллогенные стимуляторы.

Цифры указывают процентное соотношение клеток в культуре.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Е. Л. Побезинская, Л. А. Побезинский, Ю. Ю. Силаева, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, Т. С. Терещенко, Е. С. Звездова, Д. Б. Казанский. Кросс-реактивность Т-клеточного рецептора клона клеток памяти CD8+, полученного в ответе на иммунизацию клетками аллогенной опухоли. Бюлл. Эксп. Биол. и мед., 2004, Т. 137, №5, С. 563-568.

2) Л.АЛобезинский, Е.Л.Побезинская, Е.С.Звездова, В.НЛетрищев, Т.С.Гриненко, И.А.Батурина, Т.В.Анфалова, Л.М.Хромых, Т.В.Васильева, Д.Б.Казанский. Накопление нейтрофилов в селезенке мышей, иммунизированных клетками аллогенных опухолей. Докл. Акад. Наук, 2005, Т. 402, № 3, С. 421-426.

3) Т.С.Гриненко, Е.ЛЛобезинская, Л.АЛобезинский, И.А.Батурина, Е.С.Звездова, Д.Б.Казанский. Подавление клетками памяти CD8+ первичного аллогенного ответа. Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 2005, Т. 140, № 11, С. 556-561.

4) Звездова Е.С.. Гриненко Т.С., Хромых Л.М., Побезинский Л.А., Побезинская Е.Л., Казанский Д.Б. Структура и специфичность аутореактивных рецепторов Т-лимфоцитов. Русский журнал СПИД, рак и общественное здоровье. 2006, Т. 10, №1, С. 69-76.

5) Е.В.Марюхнич, Е.С.Звездова. Т.В.Анфалова, Л.М.Хромых, Д.Б.Казанский. Функциональная роль нейтрофилоподобных клеток селезенки в иммунном ответе на клетки аллогенных опухолей. Докл. Акад. Наук, 2007, Т. 414, Хв 1, С. 126-129.

6) Е.С.Звездова. Т.С.Гриненко, Е.ЛЛобезинская, Л.АЛобезинский, Д.Б.Казанский. Корецепторная функция CD4 в ответе на молекулу МНС класса I. Мол.Биол.,2008, Т.42, №4, с.1-12

7) Grinenko T.S., Baturina I.A., Zvezdova E.S.. Kazansky D.B. Suppression of the primary allogenic response by memory CD8+ cells. 14е1 International conference on AIDS, Cancer, and Public Health, 2005, Sankt Petersburg, 23-27 May, p.108.

8) Zvezdova E. S.. Pobezinsky L. A., Pobezinskaya E. L., Grinenko T. S„ Baturina I. A., Vasileva Т. V., Kazansky D. B. The Role of Innate Immunity in Allogeneic Immune Response. 14th International conference on AIDS, Cancer, and Public Health, Sankt Petersburg, 2005,23-27 May, p. 54.

9) Kazansky D.B., Grinenko T.S., Zvezdova E.S.. Petrishchev V.N., Skliarov L.Yu., Kopina N.A., Sidorovich I.G. Dendrimeric peptides with a sequences of contact site of MHC molecule: influence on thymic selection and antitumor activity. 7th John Humphrey advanced summer programme in immunology, "The interphace between immunology and medicine", September 5-9,2005, Moscow, P.18.

10) Grinenko T.S., Pobezinsky L.A., Zvezdova E.S., Kazansky D.B. The role of CD4+ T cells in allogeneic immune response. 7th John Humphrey advanced summer programme in immunology, "The interphace between immunology and medicine", September 5-9,2005, Moscow, P.14.

11) Zvezdova E.S.. Pobezinsky L.A., Pobezinskaya E.L., Grinenko T.S., Baturina I.A., Vasilieva T.V., Kazansky D.B. The role of innate immunity in allogenic immune response. 7lh John Humphrey advanced summer programme in immunology, "The interphace between immunology and medicine", September 5-9,2005, Moscow, P. 66.

12)Grinenko T.S., Zvezdova E.S.. Kazansky D.B. Two pathways for recognition of tumor antigens by T lymphocytes. Abstracts of the Congress "Immune-mediated diseases: from theory to therapy", 3-8 October 2005, Moscow, Russia, P. 30.

13) E.S. Zvezdova. T.S. Grinenko, L.A. Pobezinsky, E.L. Pobezinskaya,D.B. Kazansky. Peripheral pool of CD8+ T lymphocytes contains T cells that recognize syngeneic MHC class II molecules. Abstracts 31st FEBS Congress, 24-29 June 2006, Istanbul, Turkey, Blackwell Publishing, FEBS Journal, 2006, V.273, Sup. 1, P. 49.

14) E.V. Maryukhnich, E.S.Zvezdova.L.A. Pobezinsky, D.B. Kazansky. A role of neutrophils in allogeneic immune response. Abstracts 31st FEBS Congress, 24-29 June 2006, Istanbul, Turkey, Blackwell Publishing, FEBS Journal, 2006, V.273, Sup. 1, P. 93.

15)Zvezdova E.. Grinenko T., Pobezinsky L., Kazansky D. Intratbymic selection preserves self MHC class II specific CD8+ T lymphocytes. 16th European Congress of Immunology, September 6-9,2006, Palais des Congres, France, P. WB81-490.

16) Maryukhnich E., Zvezdova E., Pobezinsky L., Kazansky D. Immune response to allogeneic tumors: adaptive immunity function, prior to innate immunity. 16th European Congress of Immunology, September 6-9,2006, Palais des Congres, France, Poster PD-2859.

17) Zvezdova E. S.. Grinenko T. S., Kadulin S. G., Kazansky D. B. Skewed V-alpha repertoire hardly affects the recognition of MHC molecules of bm-mutants. 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology. «Immunology and viral infection», British Society for Immunology and Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, September 10-14,2007, P. 68.

18) Vagida M. S., Zvezdova E. S.. Grinenko T. S., Kazansky D. B. Peripheral pool of DN T-lymphocytes in CD8 deficient mice. 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology. «Immunology and viral infection», British Society for Immunology and Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, September 10-14, 2007, P. 61.

19) Zvezdova E.S.. Grinenko T.S., Kazansky D.B. Coreceptor function of CD4 in response to allogeneic MHC class I molecules, «Gene expression & signaling in immune system», USA, Cold Spring Harbor, 2008

Участок множительной техники ГУ POHII РАМН им. Н.Н. Блохина

подписано в печать 26.09.2008 Заказ № 239 тираж 100 экз.

Оглавление диссертации Звездова, Екатерина Сейрулловна :: 2008 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Этапы дифференцировки предшественников Т-клеток. Формирование разнообразия TCR.

2. Структура молекул МНС и их созревание.

3. Структурная организация взаимодействия молекул МНС и TCR.

4. Внутриклеточные сигналы, вовлеченные в активацию Т-клетки.

5. Зависимость развития Т-клеток от экспрессии молекул МНС в тимусе.

6. Развития Т-клеток в отсутствие экспрессии корецепторов.

7. Позитивная и негативная селекция тимоцитов.

8. Гипотезы, объясняющие детерминацию путей развития тимоцитов в Т-клетки CD4+ и CD8+.

9. Механизмы индукции толерантности Т-клеток к собственным антигенам.

10. Предположительные гипотезы, объясняющие селекцию аутореактивных Т-клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

ГЛАВА 1. Изучение особенностей аутореактивных рецепторов Т-клеточных гибридом.

1.1. Клонирование и анализ TCR аутореактивных гибридом.

1.2. Специфичность аутореаткивных TCR Т гибридом. Зависимость от корецепторных молекул CD4 и CD8.

ГЛАВА 2. Роль корецептора CD4 в распознавании молекул МНС класса 1.

ГЛАВА 3. Анализ периферического пула Т-лимфоцитов мышей 7Altg а-цепи аутореактивного TCR.

3.1. Клонирование геномной ДНК реаранжерованного TCR аутореактивной гибридомы 7. Создание мышей трансгенных по а цепи

3.2. Фенотипирование Т-клеток трансгенных мышей.

3.3. Функциональность наивных Т-клеток трансгенных мышей.

3.4. Цитотоксичкая функция Т-клеток CD8+ трансгенных мышей.

3.5 ФункциональностьТ-клеток памяти трансгенных мышей.

3.6 Распознавание молекулы Аь МНС класса II Т-клетками трансгенных мышей 7Altg.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение диссертации по теме "Онкология", Звездова, Екатерина Сейрулловна, автореферат

Как сказал Ганс Стаусс, "Antitumor immunity is beneficial autoimmunity." -«Противоопухолевый иммунитет это полезный аутоиммунитет.» Действительно, работы последних лет привели к пониманию того факта, что большинство антигенов опухолевых клеток представляют собой нормальные белки организма, экспрессируемые аберрантно, т.е. не в то время и не в том месте. В процессе своего нормального развития иммунная система теряет способность к распознаванию таких антигенов, как и прочих собственных антигенов организма. Центральная роль в этом разграничении распознавания «своего» и «чужого» принадлежит внутритимусной негативной селекции, устраняющей клоны Т-клеток с высокой авидностью к «своему». Этот процесс охватывает и широчайший спектр Т-клеток, специфичных к стадие- и органоспецифическим антигенам, включая «забарьерные» антигены тестиса, что обусловлено способностью тимусного эпителия к их стохастической экспрессии [Magalhaes DA., et al., 2006; Cloosen S, et al., 2007; Derbinski J., et al., 2008].

Вместе с тем дефекты тимусной селекции могут приводить к опасным заболеваниям, которые связаны с выживанием и активацией аутоиммунных клеток на периферии. То, каким образом аутореактивные Т-клетки избегают негативной селекции в тимусе, остается неясным. Понимание закономерностей этого процесса позволит найти способы управления специфичностью развивающихся Т-клеток, - а значит, с одной стороны, научиться лечить аутоиммунные заболевания, а с другой стороны, сделать аутоиммунитет действительно полезным для лечения опухолей. Таким образом, изучение селекции аутореактивных TCR, присутствующих в репертуаре нормальных животных, является актуальным направлением современной иммунологии. Используя метод получения Т-гибридом в нашей лаборатории удалось попучить Т-гибридомы, экспрессирующие аутореактивные TCR, из репертуара Т-клеток CD8+ мышей дикого типа C57BL/6. TCR полученых гибридом обладали двойной специфичностью, способных распознавать аллогенные молекулы Kbm3 МНС класса I и сингенные молекулы А МНС класса II в присутствие корецептора CD4 [Побезинский Л.А., 2004].

Целью данной работы является исследование природы аутореактивных Т клеток и механизмов избегания ими негативной селекции. С целью выяснить это в работе были поставлены следующие задачи:

1. Определить а и |3 цепи Т- клеточных рецепторов аутореактивных гибридом и проанализировать их CDR районы.

2. Определить специфичность TCR аутореактивных гибридом путем создания трансфектантов на основе линии тимомы 4G4, эскпресирующих а и (3 цепи TCR полученных аутоиммунных гибридом в паре с корецепторами CD4 и CD8.

3. Выяснить роль корецептора CD4 в распознавании молекул МНС класса I.

4. Создать трансгенных животных, экспрессирующих TCR аутореактивной гибридомы 7. /

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Иммунная система служит средством защиты организма от чужеродных агентов- вирусов, бактерий, грибов. Т и В-лимфоциты составляют основу адаптивного иммунного ответа. Т- клетки несут на своей поверхности рецепторы, позволяющие им распознавать антигены, процессированные в антигенпрезентирующих клетках (АРС — дендритных клетках, В-клетках и макрофагах) и представленные в виде пептидов, связанных в комплексы с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Т- и В-лимфоциты обладают свойствами, отличающими их от Т-клеток врожденного иммунитета. Во-первых, они клональны, то есть, каждый клон, например, Т-лимфоцитов, имеет уникальный TCR, образованный путем случайной реаранжировки генных сегментов. Во-вторых, в ходе процессов позитивной и негативной селекции формируются лимфоциты, толерантные к собственным антигенам организма, но способные реагировать на чужеродные. В-третьих, лимфоциты обладают "иммунологической памятью", обеспечивающей более быстрый и эффективный ответ при вторичной встрече с тем же антигеном. Т-лимфоциты подразделяют на подклассы в зависимости от фенотипа и выполняемых ими функций. Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) несут на своей поверхности корецептор CD8 и осуществляют прямой антигенспецифический лизис инфицированных клеток. Т-хелперы (Th) экспрессируют на поверхности корецептор CD4 и участвуют в активации макрофагов, дендритных клеток, В клеток, в некоторых случаях, CD8+ клеток. Корецепторы представляют собой гликопротеиды, содержащие иммуноглобулиноподобные домены. Молекулы CD4 экспрессируются в мономерной форме, a CD8 в виде гомо- или гетеродимеров (CD8aa или CD8aP). Внеклеточная часть этих белков имеет сайты связывания с молекулами МНС, причём CD4 связывается с молекулами MTIC класса II, а CD8 связывается с молекулами МНС класса I.

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение особенностей селекции аутореактивных Т-клеток"

выводы j L.

1. В периферическом пуле Т клеток CD8 мышей C57BL/6(H-2 ) дикого типа присутствуют аутореактивные Т клетки, распознающие сингенные молекулы МНС класса II. Часть этих клеток экспрессирует два TCR, один из которых способен к распознаванию аллогенной молекулы МНС класса I, в то время как другой-сингенной молекулы МНС класса II. Другая часть клеток экспрессирует один TCR, обладающий двойной специфичностью в распознавании аллогенной молекулы МНС класса I и сингенной молекулы МНС класса II.

БЛАГОДАРНОСТИ Я глубоко благодарна своему научному руководителю -Казанскому Д.Б. - за мудрое руководство и всестороннюю помощь на всех этапах работы. Я очень признательна Побезинскому Л.А. и Побезинской Е.Л., обучивших меня многим методам и оказывававшим всестороннюю поддержку на всем протяжении работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Главной задачей данной работы было изучение принципов селекции аутоиммунных Т-клеток у мышей дикого типа C57BL/6. Мы предположили, что в Т-клетках CD4+, получивших слишком сильный сигнал, вызванный взаимодействием TCR с собственными молекулами МНС класса II в тимусе, \ происходит замена экспрессии корецептора CD4 на CD8, что приводит к дифференцировки их в цитотоксические Т-клетки. Таким образом, в периферическом пуле Т-клеток CD8+ должны существовать аутореактивные Т-клетки, способные распознавать сингенные молекулы МНС класса II.

В нашей лаборатории были получены Т-гибридомы из клеток CD8+, экспрессирующие TCR, аутореактивные к молекулам МНС класа II в присутсвие корецептора CD4. Гены TCR были клонированы и секвенированы, определена их специфичность. Нами было выяснено, что часть из полученных гибридом экспрессируют два TCR, каждый из которых обладает индивидуальной специфичностью: один-к сингенным молекулам Аь МНС класса II, второй-к аллогенным молекулам

Kbm3 МНС класса I. Экспрессия двух TCR, обладающих индивидуальной специфичностью, по-видимому, помогает аутореактивным Т-клеткам избежать негативной селекции.

Изучая специфичность и рестрикцию TCR гибридомы клеток памяти 1D1 на трансфектантах линии 4G4, было обнаружено необычное свойство корецептора CD4. Оказалось, что корецептор CD4 не менее эффективно способствует активации трансфектантов, специфичных к молекуле МНС класса I, чем CD8. При одновременной экспрессии обоих корецепторов на поверхности трансфектанта мы наблюдали эффект функционального доминирования корецептора CD4 над корецептором CD8 за проведение сигнала через TCR.

Впервые в России мы создали мышей с трансгенной экспрессией а-цепи аутореактивного TCR. Было установлено, что у таких мышей около 90% Т-клеток экспрессируют исследуемую а-цепь. На периферию у таких животных селектируются Т-клетки CD4+, CD8+ и DN. Нами было обнаружено, что на Т-клетках CD4+ обнаруживается повышенная экспрессия ингибиторов костимуляции PD-1h CTLA-4, а также повышенная экспрессия молекул CD5, что говорит о том, что данные Т-клетки экспрессируют TCR, высокоавидный к «своему».

Исследуя функциональные особенности Т-клеток трансгенных мышей, мы выяснили, что ограничение разнообразия Т-клеток по а-цепи TCR Val 1 приводит к усилению ответа репертуара Т-лимфоцитов на молекулу Kd МНС класса I и угнетению ответа на молекулы МНС линий мышей bml, ЬтЗ, Ьт12. Таким образом, а-цепь TCR существенно влияет на его специфичность к аллельным вариантам молекул МНС. Причем наблюдаемый эффект обусловлен врожденным предпочтением вариабельных регионов TCR к взаимодействию с аллельными формами молекул МНС, так как при переводе мышей 7Altg на линию мышей ЬтЗ, отличающейся от линии мышей C57BL/6 двумя точечными мутациями в молекуле L к°мнс класса I, специфичность Т-клеток трансгенных животных 7Altg(H-2bm3) в отношении аллогенных молекул МНС осталась той же.

Таким образом в данной работе были выяснены возможные принципы внутритимусной селекции аутоиммунных Т-клеток и их миграции на периферию и детально исследована роль а-цепи TCR в формировании специфичности TCR к антигенам. Все это может иметь важное значение для выяснения способов управления специфичностью развивающихся Т-клеток и способов лечения как аутоиммунных заболеваний, так и онкологических заболеваний.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Звездова, Екатерина Сейрулловна

1. Казанский Д.Б., Петрищев В.Н., Штиль А.А., и др. Использование теплового шока антигенпрезентирующих клеток для функционального тестирования аллоспецифических Т-клеток памяти.// Биоорг. Химия. 1996 Т. 256 С. 117-128.

2. Побезинский Л.А. 2003. Иммунорегуляторные аспекты взаимодействия Т-клеточного рецептора с естественными и искусственно синтезированными лигандами. Автореферат.

3. Гриненко Т.С. 2005. Изучение функциональных особенностей и антигенспецифических рецепторов клеток памяти CD8+. Автореферат

4. Abarrategui I, Krangel MS. 2006. Regulation of T cell receptor-alpha gene recombination by transcription. Nat Immunol. V.l0:1109-15.

5. Aebischer T, Oehen S, Hengartner H. 1990. Preferential usage of V alpha 4 and V beta 10 T cell receptor genes by lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein-specific H-2Db-restricted cytotoxic T cells. Eur J Immunol. 20(3):523-31.

6. Al-Alwan M.M., Rowden G., Lee T.D., West K.A. 2001. The dendritic cell cytoskeleton is critical for the formation of the immunological synapse. ./. Immunol. V. 166. P. 1452-1456

7. Anderson MS, Venanzi ES, Klein L, Chen Z, Berzins SP, Turley SJ, von Boehmer H, Branson R, Dierich A, Bcnoist C, Mathis D. 2002. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. Nov 15;298:1395-401.

8. Anderson M.K. 2006. At the crossroads: diverse roles of early thymocyte transcriptional regulators. Immunol Rev. 209, 191—211.

9. Arsov I, Vukmanovic S. 1999. Dual MHC class I and class II restriction of a single T cell receptor: distinct modes of tolerance induction by two classes of autoantigens. J Immunol. 1999 162(4):2008-15.

10. Azzam H. S, Alex Grinberg, Kin Lui, Howard Shen, Elizabeth W. Shores, and Paul E. Love. CD5 Expression Is Developmentally Regulated By T Cell Receptor (TCR) Signals and TCR Avidity. 1998. J. Exp. Med., V. 188, 2301-2311.

11. Azzam, H. S., J. B. DeJarnettc, K. Huang, R. Emmons, C. S. Park, C. L. Sommers, D. El-Khoury, E. W. Shores, P. E. Love. 2001. Fine tuning of TCR signaling by CD5.,J. Immunol. V.166: 5464-5472.

12. Bachmann M. B. A Oxenius, TW Мак, and RM Zinkernagel. 1995. T cell development in CD8-/- mice. Thymic positive selection is biased toward the helper phenotype. J Immunol. 155: 3727-3733.

13. Baldwin ТА, Sandau MM, Jameson SC, Hogquist KA. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J Exp Med. 2005 V.202(l):lll-21.

14. Bennett CL, Ochs HD. 2001. IPEX is a unique X-linked syndrome characterized by immune dysfunction, polyendocrinopathy, enteropathy, and a variety of autoimmune phenomena. Curr Opin Pediatr. 13 V.(6):533-8.

15. Benoist, C. and Mathis, D. 2001. Autoimmunity provoked by infection: how good is the case for T cell epitope mimicry? Nature Immunol. ,V.9, p.797-801

16. Blank C, Brown I, Marks R, Nishimura H, Honjo T, Gajewski TF. 2003. Absence of programmed death receptor 1 alters thymic development and enhances generation of CD4/CD8 double-negative TCR-transgenic T cells. J Immunol. V.171(9):4574-81.

17. Bogue M, Gilfillan S, Benoist C, Mathis D. 1992. Regulation of N-region diversity in antigen receptors through thymocyte differentiation and thymus ontogeny. Proc Natl Acad Sci U SA, Nov 15;89(22): 11011-5

18. Boissier MC, Carlioz A, Fournier C. 1988. Experimental autoimmune arthritis in mice. II. Early events in the elicitation of the autoimmune phenomenon induced by homologous type II collagcn. Clin Immunol Immunopathol. 48(2):225-37.

19. Peptide: Evidence for a Dominant Role of a Germline-encoded V Region in Antigen/Major Histocompatibility Complex Recognition. J. Exp. Med. V. 175, p. 765-777

20. Bouneaud C., Philippe Kourilsky, and Philippe Bousso. 2000. Impact of Negative Selection on the T Cell Repertoire Reactive to a Self-Peptide: A Large Fraction of T Cell Clones Escapes Clonal Deletion. Immunity., V.13., 829-840

21. Borowski Christine, Xiaoyan Li, Iannis Aifantis, Fotini Gounari, and Harald von Boehmer. 2004. Pre- TCRa and TCRa are not interchangeable partners of TCRp during T lymphocyte development. J. Exp. Med, V. 199, N.5, 607-615

22. Bosselut R, Feigenbaum L, Sharrow SO, Singer A. 2001. Strength of signaling by CD4 and CD8 coreceptor tails determines the number but not the lineage direction of positively selected thymocytes. Immunity. Apr;14(4):483-94.

23. Bouneaud C, Kourilsky P, Bousso P. 2000. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. Dec;13(6):829-40.

24. Bour-Jordan H, Salomon BL, Thompson IIL, Santos R, Abbas AK, Bluestone JA. 2007. Constitutive expression of B7-1 on В cells uncovers autoimmunity toward the В cell compartment in the nonobese diabetic mouse. J Immunol. V.l 79(2): 1004-12.

25. Bruno L., Hans Jorg Fehling, and Harald von Boehmer. 1996. The сф T Cell Receptor Can Replace the y8 Receptor in the Development of y5 Lineage Cells. Immunity. V.5 (4) 343

26. Budd RC, Mixter PF. 1995. The origin of CD4-CD8-TCR alpha beta+ thymocytes: a model based on T-cell receptor avidity. Immunol Today. 16(9):428-31.

27. Buch T, Rieux-Laucat F, Forster I, Rajewsky K. 2002. Failure of HY-specific thymocytes to escape negative selection by receptor editing. Immunity. May;16(5):707-18.

28. Burns R.P., Kannan Natarajan, Nicola J.H. LoCascio,David P. O'Brien, Joan A. Kobori.Nilabh Shastri, Richard K. Barth. 1998. Molecular analysis of skewed Tcra-V gene use in T-cell receptor b-chain transgenic mice. Immunogenetics 47: 107-114

29. Cabaniolis Jean-Pierre, Nicolas Fazilleau, Armanda Casrouge, Philippe Kourilsky, and Jean M. Kanellopoulos. 2001. Most a/13 T Cell Receptor Diversity Is Due to Terminal Deoxynucleotidyl Transferase. J. Exp. Med., Nov; 194: 1385 1390.

30. Casrouge, A., E. Beaudoing, S. Dalle, C. Pannetier, J. Kanellopoulos, and P. Kourilsky. 2000. Size estimate of the alpha beta TCR repertoire of naive mouse splenocytes. J. Immunol. 164:5782-5787.

31. Chambers C. A., Dragana Cado, Thien Truong, and James P. Allison. 1997. Thymocyte development is normal in CTLA-4-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 94, pp. 9296-9301.

32. Chao DL, Davenport MP, Forrest S, Perelson AS. 2005. The effects of thymic selection on the range of T cell cross-reactivity. Eur J Immunol. V. 12,p.3452-9

33. Chi TH, Wan M, Zhao K, Taniuchi I, Chen L, Littman DR, Crabtree GR. 2002. Reciprocal regulation of CD4/CD8 expression by SWI/SNF-like BAF complexes. Nature. Jul 11;418(6894): 195-9.

34. Chmielowski В, Muranski P, Ignatowicz L. 1999. In the normal repertoire of CD4+ T cells, a single class II МНС/peptide complex positively selects TCRs with various antigen specificities. J Immunol. Jan 1;162(1):95-105

35. Correia-Neves M, Mathis D, Benoist C. 2001. A molecular chart of thymocyte positive selection. Eur J Immunol. Sep;31(9):2583-92

36. Coss R.A., Linnemans W.A. 1996. The effects of hyperthermia on the cytoskeleton. Int. J. Hyperthermia. V. 12. P. 173-96

37. Curtsinger J. M., Debra C. Lins, Christopher M. Johnson, and Matthew F. Mescher. 2005. Signal 3 Tolerant CD8 T Cells Degranulate in Response to Antigen but Lack Granzyme В to Mediate Cytolysis. The Journal of Immunology, 2005, 175: 4392-4399.

38. Dent Alexander L., Fink Pamela J., Hedrick Stephan M. 1989. Characterization of an alternative exon of the murine T cell receptor beta-chain. Pattern of expression and evolutionary conservation J Immunol,, V. 143, N.l, 322-328

39. Derbinski J, Pinto S, Rosch S, Ilexel K, Kyewski B. 2008. Promiscuous gene expression patterns in single medullary thymic epithelial cells argue for a stochastic mechanism. Proc Natl Acad Sci USA. 105(2):657-62.

40. Ding YH, Smith KJ, Garboczi DN, Utz U, Biddison WE, Wiley DC. 1998 Two human T cell receptors bind in a similar diagonal mode to the IILA-A2/Tax peptide complex using different TCR amino acids. Immunity. Apr;8(4):403-11.

41. Dudley DD, Sekiguchi J, Zhu C, Sadofsky MJ, Whitlow S, DeVido J, Monroe RJ, Bassing CH, Alt FW. 2003. Impaired V(D)J recombination and lymphocyte development in core RAG 1-expressing mice. J Exp Med. Nov 3;198(9): 1439-50.

42. Delaire S, Huang YH, Chan SW, Robey EA. 2004. Dynamic repositioning of CD4 and CD8 genes during T cell development. J Exp Med. Dec 6;200(11):1427-35.

43. Egawa Т., Tillman R.E., Naoe Y., Taniuchi I., Littman D.R. 2007. The role of the Runx transcription factors in thymocyte differentiation and in homeostasis of naive T cells. J Exp Med. 204, 1945-1957.

44. Ellmeier Wilfried., Sawada Shinichiro, Littman Dan R. 1999. The regulation of CD4 and CDS coreccptor gene expression during T cell development. Annu. Rev. Immunol.,, V. 17, 523554

45. Erman В, Feigenbaum L, Coligan JE, Singer A. 2002. Early TCRalpha expression generates TCRalphagamma complexes that signal the DN-to-DP transition and impair development. Nat ImmunolV.3(6):564-9

46. Filipp D, Zhang J, Leung BL, Shaw A, Levin SD, Veillette A, Julius M. 2003. Regulation of Fyn through translocation of activated Lck into lipid rafts. ./ Exp Med. May 5;197(9): 1221-7.

47. Filipp D, Leung BL, Zhang J, Veillette A, Julius M. 2004. Enrichment of lck in lipid rafts regulates colocalized fyn activation and the initiation of proximal signals through TCR alpha beta. J Immunol. Apr l;172(7):4266-74.

48. Fournier C. 2005 K/BxN T-cell-receptor transgenic mice Where do T cells stand in rheumatoid arthritis? Joint Bone Spine. 72(6):527-32.

49. Furmanski AL, Ferreira C, Bartok I, Dimakou S, Rice J, Stevenson FK, Millrain MM, Simpson E, Dyson J. 2008. Public T cell receptor beta-chains are not advantaged during positive selection. J Immunol. 180(2): 1029-39

50. Garcia КС, Degano M, Pease LR, Huang M, Peterson PA, Teyton L, Wilson IA. 1998. Structural basis of plasticity in T cell receptor recognition of a self peptide-МНС antigen. Science. Feb 20;279(5354):1166-72.

51. Gavin MA, Bevan MJ. 1995 Increased peptide promiscuity provides a rationale for the lack of N regions in the neonatal T cell repertoire. Immunity. Dec;3(6):793-800

52. Gerdes Tobias& Matthias Wabl. 2004. Autoreactivity and allclic inclusion in а В cell nuclear transfer mouse. Nature Immunology 5, 1282-1287

53. Germain R., N. 2002. T cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nature, V. 2, 309-322

54. Gilfillan S, Waltzinger C, Benoist C, Mathis D. 1994. More efficient positive selection of thymocytes in mice lacking terminal deoxynucleotidyl transferase. Int Immunol. Nov;6(l l):1681-6

55. Goldrath AW, Hogquist KA, Bevan MJ. 1997. CD8 lineage commitment in the absence of CD8. Immunity. May;6(5):633-42.

56. Goldrath A. W., Bevan M. J. 1999. Selecting and maintaining a diverse T- cell repertoire. Nature, V.402, 255-262

57. Guo Jian, Abbas Hawwari, Hong Li, Zuoming Sun, Sanjeev K. Mahanta, Dan R. Littman, Michael S. Krangel, You-Wen He. 2002. Regulation of the TCR repertoire by the survival window of CD4+CD8+ thymocytes. Nature Immunology,3, 469 476

58. Haks MC, Lefebvre JM, Lauritsen JP, Carleton M, Rhodes M, Miyazaki T, Kappes DJ, Wiest DL. Attenuation of gammadeltaTCR signaling efficiently diverts thymocytes to the alphabeta lineage.Immunity. 2005 May;22(5):595-606

59. Hawwari A. &Krangel M.S. 2007. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. PNAS, V. 104(3):903-7.

60. Hayday A. C. 2000. Cells: A right time and a right place for a conserved third way of protection. Annu. Rev. Immunol, V. 18, 975- 1026

61. Hayes SM, Li L, Love PE. TCR signal strength influences alphabeta/gammadelta lineage fate. Immunity. 2005 May;22(5):583-93

62. He X., Kappes D.J. 2006. CD4/CD8 lineage commitment: light at the end of the tunnel? Curr Opin Immunol. 18, 135—142.

63. Heath WR, Carbone FR, Bertolino P, Kelly J, Cose S, Miller JF. . 1995. Expression of two T cell receptor alpha chains on the surface of normal murine T cells. Eur J Immunol. V. 25(6): 1617-23.

64. Hedrick S. M. 2002. T cell development: bottoms- up. Immunity,V. 16, 619- 622

65. Hernandez-Hoyos G, Sohn SJ, Rothenberg EV, Alberola-Ila J. 2000. Lck activity controls CD4/CD8 T cell lineage commitment. Immunity. Mar; 12(3):313-22.

66. Hernandez-Hoyos G, Anderson MK, Wang C, Rothenberg EV, Alberola-Ila J. 2003. GATA-3 expression is controlled by TCR signals and regulates CD4/CD8 differentiation. Immunity. Jul;19(l):83-94.

67. He X, Janeway CA Jr, Levine M, Robinson E, Preston-Hurlburt P, Viret C, Bottomly K. 2002. Dual receptor T cells extend the immune repertoire for foreign antigens. Nat Immunol. Feb;3(2): 127-34

68. He X, He X, Dave VP, Zhang Y, Hua X, Nicolas E, Xu W, Roe BA, Kappes DJ. 2005. The zinc finger transcription factor Th-POK regulates CD4 versus CD8 T-cell lineage commitment. Nature. Feb 24;433(7028):826-33.

69. Ho I.C, Glimcher LH. 2002. Transcription: tantalizing times for T cells. Cell. Apr; 109 Suppl:S 109-20.

70. Hogquist KA. 2001. Signal strength in thymic selection and lineage commitment. Curr Opin Immunol. Apr;13(2):225-31.

71. Hsu Lih-Yun, Josh Lauring, Hong-Erh Liang, Stephen Greenbaum, Dragana Cado, Yuan Zhuang, and Mark S. Schlissel. 2003. A Conserved Transcriptional Enhancer Regulates RAG Gene Expression in Developing В Cells. Immunity, V.19,105-117

72. Huang Ching-Yu & Osami Kanagawa. 2001. Ordered and coordinated rearrangement of the TCRa Locus: role of secondary rearrangement in thymic selection. J Immunol., V.166, 2597-2601

73. Huseby ES, Crawford F, White J, Kappler J, Marrack P. 2003. Negative selection imparts peptide specificity to the mature T cell repertoire. Proc Natl Acad Sci USA. Sep 30;100(20):11565-70.

74. Huseby E. S., Janice White, Frances Crawford, Tibor Vass, Dean Becker, Clemencia Pinilla, Philippa Marrack, and John W. Kappler. 2005. How the T Cell Repertoire Becomes Peptide and MHC Specific. Cell. V. 122: 247-260

75. Janeway C. A., Travers P., Walport M., Capra J.D. 1999. Immunobiology. The immune system in health and disease.

76. Johnson NA, Carland F, Allen PM, Glimcher LH. 1989 T cell receptor gene segment usage in a panel of hen-egg white lysozyme specific, I-Ak-restricted T helper hybridomas.J/mmM«o/.V142(9):3298-304.

77. Kang J, Raulet DH. 1997. Events that regulate differentiation of alpha beta TCR+ and gamma delta TCR+ T cells from a common precursor. Semin Immunol. V.9(3): 171-9.

78. Kang J, Fehling HJ, Laplace C, Malissen M, Cado D, Raulet DH. 1998. T cell receptor gamma gene regulatory sequences prevent the function of a novel TCRgamma/pTalpha pre-T cell receptor. Immunity. V. 8(6):713-21.

79. Karges W, Rajasalu T, Spyrantis A, Wieland A, Boehm B, Schirmbeck R. 2007. The diabetogenic, insulin-specific CD8 T cell response primed in the experimental autoimmune diabetes model in RIP-B7.1 mice. Eur J Immunol. 37(8):2097-103

80. Keir ME, Liang SC, Guleria I, Latchman YE, Qipo A, Albacker LA, Koulmanda M, Freeman GJ, Sayegh MH, Sharpe AH. 2006. Tissue expression of PD-L1 mediates peripheral T cell tolerance. J Exp Med. V. 203(4):883-95.

81. Keir ME, Freeman GJ, Sharpe AH. 2007. PD-1 regulates self-reactive CD8+ T cell responses to antigen in lymph nodes and tissues. J.Immunol. V.179(8):5064-70

82. Kouskoff V., Kathy Signorelli , Christophe Benoist, Diane Mathis. 1995. Cassette vectors directing expression of T cell receptor genes in transgenic mice. J Immunol Methods. Mar 27;180(2):273-80

83. Lacorazza HD, Tucek-Szabo C, Vasovic LV, Remus K, Nikolich-Zugich J. 2001. Premature TCR alpha beta expression and signaling in early thymocytes impair thymocyte expansion and partially block their development J Immunol. V.166(5):3184-93

84. Lacorazza H. D. and Janko Nikolich-Zugich. 2004. Exclusion and Inclusion of TCR Proteins during T Cell Development in TCR-Transgenic and Normal Mice. J Immunol., 173: 55915600

85. Leiter EH. Curr Protoc Immunol. 2001 The NOD mouse: a model for insulin-dependent diabetes mellitus. Chapter 15:Unit 15.9.

86. Leng Q, Ge Q, Nguyen T, Eisen HN, Chen J. 2007. Stage-dependent reactivity of thymocytes to self-peptide-MHC complexes. Proc Natl Acad Sci USA. V. 104(12):5038-43.

87. Li QJ, Chau J, Ebert PJ, Sylvester G, Min H, Liu G, Braich R, Manoharan M, Soutschek J, Skare P, Klein LO, Davis MM, Chen CZ. 2007. miR-181a is an intrinsic modulator of T cell sensitivity and selection Cell. Apr 6; 129(1): 147-61

88. Liston A, Lesage S, Wilson J, Peltonen L, Goodnow CC. 2003. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat Immunol. Apr;4(4):350-4.

89. Liu X. & Bosselut R. 2004. Duration of TCR signaling controls CD4-CD8 lineage differentiation in vivo. Nat. Immunology, V. 5, N. 3, 280- 288.

90. Logunova NN, Viret C, Pobezinsky LA, Miller SA, Kazansky DB, Sundberg JP, Chervonsky AV. 2005. Restricted МНС-peptide repertoire predisposes to autoimmunity. J Exp Med. Jul 4;202(l):73-84.

91. Magalhaes DA, Silveira EL, Junta CM, Sandrin-Garcia P, Fachin AL, Donadi EA, Sakamoto-Hojo ET, Passos GA. 2006. Promiscuous gene expression in the thymus: the root of central tolerance. Clin Dev Immunol. 13(2-4):81-99.

92. Mason D.1994. Allelic exclusion of alpha chains in TCRs.Jnt.ImunoL V.6, N.6, pp881-885

93. Masuda K., Manami Itoi, Takashi Amagai, Nagahiro Minato, Yoshimoto Katsura and Hiroshi Kawamoto. 2005. Thymic Anlage Is Colonized by Progenitors Restricted to T, NK, and Dendritic Cell Lineages. The Journal of Immunology, V. 174: 2525-2532.

94. Merkenschlager M, Graf D, Lovatt M, Bommhardt U, Zamoyska R, Fisher AG. 1997. How many thymocytes audition for selection? J Exp Med. Oct 6;186(7):1149-58

95. Merkenschlager M, Amoils S, Roldan E, Rahemtulla A, O'connor E, Fisher AG, Brown KE. 2004. Centromeric repositioning of coreceptor loci predicts their stable silencing and the CD4/CD8 lineage choice. J Exp Med. Dec 6;200(11): 1437-44.

96. Munir Alam S. and Nicholas R. J. Gascoigne. 1998. Posttranslational Regulation of TCR V Allelic Exclusion During T Cell Differentiation. J Immunol. 160: 3883-3890

97. Nishimura H, Nose M, Hiai H, Minato N, Honjo Т. 1999Development of lupus-like autoimmune diseases by disruption of the PD-1 gene encoding an ITIM motif-carrying immunoreceptor. Immunity. V. 11 (2): 141 -51.

98. Nishimura H, Okazaki T, Tanaka Y, Nakatani К, Нага M, Matsumori A, Sasayama S, Mizoguchi A, Hiai H, Minato N, Honjo T. 2001. Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice. Science. V.291(5502):319-22.

99. Ono Т., Teresa P. DiLorenzo, Fuming Wang, Alexis M. Kalergis, and Stanley G. Nathenson. 1998. Alterations in TCR-MHC Contacts Subsequent toCross-Recognition of Class I MHC and Singly Substituted Peptide Variants. Journal of Immunology, 161: 5454-5463.

100. Padovan E, Casorati G, Dellabona P, Meyer S, Brockhaus M, Lanzavecchia A. 1993. Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells. Science. V.262:422-4.

101. Phadke K, Fouts R, Parrish J, Baker RS. 1984. Autoreactivity to collagen in a murine lupus model. Arthritis Rheum. 27(3):313-9

102. Punt JA, BA Osborne, Y Takahama, SO Sharrow, and A Singer .1994. Negative selection of CD4+CD8+ thymocytes by T cell receptor-induced apoptosis requires a costimulatory signal that can be provided by CD28. J. Exp. Med. 179: 709-713

103. Regner, M. and Lambert, P. II. 2001. Autoimmunity through infection or immunization? Nature Immunol., V.3, p. 185-188.

104. Robey E. The alphabeta versus gammadelta T cell fate decision: when less is more. Immunity. 2005 May;22(5):533-4

105. Robey, E. & Fowlkes, B. J. Selective events in T-cell development. Annu. Rev. Immunol. V.12, p.675-705 (1994).

106. Rock EP, Sibbald PR, Davis MM, Chien YH. . 1994. CDR3 length in antigen-specific immune receptors. J Exp Med. 1994 Jan l;179(l):323-8.

107. Salmon P, Mong M, Kang XJ, Cado D, Robey E. 1999. The role of CD8 alpha' in the CD4 versus CD8 lineage choice. J Immunol. Nov 15;163(10):5312-8.

108. Sant'Angelo DB, Cresswell P, Janeway С A Jr, Denzin LK. 2001. Maintenance of TCR clonality in T cells expressing genes for two TCR heterodimers. Proc. Natl. Acad. Sci. 98(12):6824-9.

109. Sarukhan A., Corinne Garcia, Astrid Lanoue, and Harald von Boehmer. 1998. Allelic Inclusion of T Cell Receptor a Genes Poses an Autoimmune Hazard Due to Low-Level Expression of Autospecific Receptors. Immunity, V.8, 563-570

110. Schwartz RH. 2003. T cell anergy. Annu Rev Immunol. V. 21:305-34.

111. Sharpe AH, Freeman GJ. 2002. The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol. Feb;2(2): 116-26.

112. Sim Bee- Cheng, Najla Aftahi, Christina Reilly, Bjarne Bogen, Ronald H. Schwartz, Nicholas R. J. Gascoigne and David Lo. 1998a. Thymic skewing of the CD4/CD8 ratio maps with the T cell receptor a chain locus. Curr. Biol., 8: 701-704.

113. Sim Bee- Cheng, David Lo, Nicholas R. J. Gascoigne, 1998b. Preferential expression of TCR Va regions in CD4/CD8 subsets: class discrimination or coreceptor recognition? Immunol Today 19(6):276-82

114. Sim Bee- Cheng, Jay L. Wung, and Nicholas R. J. Gascoigne. 1998. Polymorphism Within a TCRAV Family Influences the Repertoire Through Class l/II Restriction. J Immunol. 160: 1204-1211

115. Sim Bee-Cheng and Nicholas R. J. Gascoigne. 1999. Reciprocal Expression in CD4 or CD8 Subsets of Different Members of the Vo-11 Gene Family Correlates with Sequence Polymorphism. J Immunol. 162: 3153-3159

116. Subudhi SK, Zhou P, Yerian LM, Chin RK, Lo JC, Anders RA, Sun Y, Chen L, Wang Y, Alegre ML, Fu YX. 2004 Local expression of B7-H1 promotes organ-specific autoimmunity and transplant rejection. J Clin Invest. V.l 13(5):694-700.

117. Takahama Y., A Kosugi, and A Singer. 1991. Phenotype, ontogeny, and repertoire of CD4-CD8- T cell receptor alpha beta + thymocytes. Variable influence of self-antigens on T cell receptor V beta usage. J Immunol. 146: 1134-1141

118. Tarakhovsky, A., S. B. Kanner, J. Hombach, J. A. Ledbetter, W. Muller, N. Killeen, K. Rajewsky. 1995. A role for CD5 in TCR-mediated signal transduction and thymocyte selection. Science 269: 535-537

119. Teh HS, Kishi H, Scott B, Von Boehmer H. 1989. Deletion of autospecific T cells in T cell receptor (TCR) transgenic mice spares cells with normal TCR levels and low levels of CD8 molecules. J Exp Med. V. 169(3):795-806.

120. Torres-Nagel N, Deutschlander A, Herrmann T, Arden B, Hunig T. 1997. Control of TCR V alpha-mediated positive repertoire selection and alloreactivity by differential J alpha usage and CDR3 alpha composition. Int Immunol. 0ct;9(10): 1441-52.

121. Torres-Nagel N, Mehling B, LeRolle AF, Joly E, Hunig T. 2001. Genetic control of peripheral TCRAV usage by representation in the preselection repertoire and MHC allele-specific overselection. Int Immunol. Jan;13(l):63-73

122. Tyznik AJ, Sun JC, Bevan MJ. 2004. The CD8 population in CD4-deficient mice is heavily contaminated with MHC class II-restricted T cells. J Exp Med. Feb 16;199(4):559-65.

123. Uematsu Y, Donda A, De Libero G. 1997. Thymocytes control the CD4 gene differently from mature T lymphocytes. Int Immunol. Jan;9(l): 179-87.

124. Viret С, Janeway CA Jr. 2003. Self-specific MHC class II-restricted CD4-CD8- T cells that escape deletion and lack regulatory activity. J Immunol. Jan l;170(l):201-9.161. von Boehmer H. 1994. Positive selection of lymphocytes. Cell V. 76: 219-228.

125. Wada H, Masuda K, Satoh R, Kakugawa K, Ikawa T, Katsura Y, Kawamoto H. 2008. Adult T-cell progenitors retain myeloid potential. Nature. V.452(7188):768-72

126. Waterhousc P, Penninger JM, Timms E, Wakeham A, Shahinian A, Lee KP, Thompson CB, Griesser H, Мак TW. 1995. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. V. 270(5238):985-8.

127. Wucherpffennig Kay W. 2004. T cell receptor crossreactivity as a general property of T cell recognition. Mol. Immunology, V. 40, 1009-1017

128. Yan J. and Mamula M. J., 2002 Autoreactive T cells revealed in the normal repertoire: escape from nagative selection and peripheral tolerance. J Immunol. V. 168, 3188-3194

129. Yanagi Y, Maekawa R, Cook T, KanagawaO, Oldstone MB. 1990. Restricted V-segment usage in T-cell receptors from cytotoxic T lymphocytes specific for a major epitope of lymphocytic choriomeningitis virus. J Virol. Dec;64(12):5919-26

130. Yasutomo К, Doyle С, Miele L, Fuehs C, Germain RN. 2000. The duration of antigen receptor signalling determines CD4+ versus CD8+ T-cell lineage fate. Nature. 404(6777):506-10.

131. Yoshida T, Jiang F, Honjo T, Okazaki T. 2008. PD-1 deficiency reveals various tissue-specific autoimmunity by H-2b and dose-dependent requirement of H-2g7 for diabetes in NOD mice. Proc Natl Acad Sci USA. V.105(9):3533-8.

132. Yu Q, Erman B, Bhandoola A, Sharrow SO, Singer A. 2003. In vitro evidence that cytokine receptor signals are required for differentiation of double positive thymocytes into functionally mature CD8+ T cells. J Exp Med. Feb 17;197(4):475-87.

133. Yu W, Misulovin Z, Suh H, Hardy RR, Jankovic M, Yannoutsos N, Nussenzweig MC. 1999. Coordinate regulation of RAG1 and RAG2 by cell type-specific DNA elements 5' of RAG2. Science. Aug 13;285(5430):1080-4.

134. Zal T, Weiss S, Mellor A, Stockinger B. 1996. Expression of a second receptor rescues self-specific T cells from thymic deletion and allows activation of autoreactive effector function. Proc Natl Acad Sci USA. 93(17):9102-7

135. Zamoyska R, Basson A, Filby A, Legname G, Lovatt M, Seddon B. 2003. The influence of the sre-family kinases, Lck and Fyn, on T ccll differentiation, survival and activation.Immunol. R e v. 191:107-18.

136. Zerrahn Jens, Werner Held, and David H Raulet. 1997. The MHC Reactivity of the T Cell Repertoire Prior to Positive and Negative Selection. Cell, V. 88, 627-636