Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Иммунорегуляторные аспекты взаимодействия Т-клеточного рецептора с естественными и искусственно синтезированными лигандами

В последние годы знания об иммунной системе пополнились новыми фундаментальными представлениями, которые позволяют лучше понять ее работу и связать воедино накопленный фактический материал. По современным представлениям иммунный ответ можно разделить на врожденный и адаптивный. В отличие от врожденного иммунитета, адаптивная иммунная система использует уникальные рецепторы, которые формируются в ходе случайной соматической реаранжировки иммуноглобулиновых генов. В этом случае в ответе принимают участие лимфоциты двух типов - Т-клетки и В-клетки. Клеточный адаптивный иммунный ответ опосредован действием Т-клеток, которые проходят основные этапы своего развития в тимусе. Основная функция иммунитета - это защита организма хозяина от агрессии чужеродных форм жизни. Кроме того, иммунитет осуществляет внутренний контроль, который выражается в выявлении и устранении клеток, экспрессирующих измененные антигенные детерминанты. Чтобы приобрести способность к этому, Т-клетки проходят стадии позитивной и негативной селекции в тимусе, где выживают только те из них, которые способны распознавать свои антигены в контексте молекул МНС с промежуточной аффиностью. Таким образом, Т-клетки становятся способными отличать свои антигены от чужих.

С одной стороны, селекция приводит к делеции Т-клеток, которые могуг вызвать ответ на собственные антигены, что делает бесперспективными попытки создания противоопухолевых вакцин, стимулирующих ответ на опухолеассоциированные антигены. В связи с тем, что периферический пул Т-клеток несет "отпечаток" тимусной селекции, изучение принципов внутритимусного развития Т- клеток является первоочередной задачей онкомммунологим. Понимание закономерностей позитивной и негативной селекции позволит управлять специфичностью развивающихся Т-клеток, что приблизит исследователей к созданию противораковых вакцин.

С другой стороны, дефекты селекции могут приводить к не менее опасным заболеваниям, которые связаны с выживанием и активацией на периферии аутоиммунных клеток. Более 5 % населения Земного Шара страдает теми или иными аутоиммунными заболеваниями. Тем не менее, до сих пор остается неизвестной причина большинства аутоиммунных процессов. Установлено, что на периферии всегда присутствует небольшое количество аутореактивных Т-клеток. Один из фундаментальных вопросов иммунологии - каким образом аутореактивным Т-клеткам удается избегать негативной селекции в тимусе - остается нерешенным.

Развитие и интеграция молекулярно-биологических методов исследования в современную иммунологию позволяет создать биологические модели, способные ответить на поставленные вопросы. Наиболее эффективные методы изучения процессов селекции Т-клеток это создание ТСК-трансгенных животных. С их помощью можно выявить закономерности селекции Т-клеток, которые экспрессируют только один Т-клеточный рецептор.

Таким образом, изучение селекции Т-клеток у ТСЯ-трансгенного животного является очень перспективным направлением современной иммунологии, изучающей механизмы и закономерности развития Т-клеток.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Ад - антиген (от англ. antigen)

CD - кластер дифференцировки (от англ. cluster differentiation)

CDR - район определяющий комплементарность (от англ. complementarity determining region)

CFSE - 5,6carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester CLIP - от англ. class II-associated invariant chain peptide CTL - цитогоксические T лимфоциты (от англ. Cytotoxic T lymphocyte)

DEPC - diethylpyrocarbonate

DN - двойные негативные (от англ.Double negative) dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфат

DP - двойные позитивные (от англ. Double positive) FCS - фетальная телячья сыворотка (от англ. fetal calf serum) FGF - фактор роста фибробластов (от англ. fibroblast growth factor)

FL - флуоресценция (от англ. fluorescence)

FTOC - фетальные органные культуры тимуса (от англ. Fetal thymic organ culture)

HLA - главный комплекс гистосовместимости человека (от англ.

Human leucocyte antigen)

IFN - интерферон (от англ. interferon)

Ii - инвариантная цепь(от англ. invariant chain)

IL - интерлейкин (от англ. interleukin)

МНС - главный комплекс гистосовместимости (от англ. major histocompatibility complex)

MLR - смешанная культура лимфоцитов (от англ. mixed lymphocyte reaction)

Mis - согласно разным источникам, от англ. mixed lymphocyte stimulation или minor lymphocyte stimulating antigen

MMTV - вирус рака молочной железы мышей (от англ. mouse mammary tumor virus)

МФ - макрофаги

PBS - фосфатный буфер (от англ. phosphate buffer saline) PI - йодид пропидия (от англ. propidium iodide)

RTE - ранние тимусные эмигранты (от англ. Recent thymic emigrants)

Sag - суперантиген (от англ. superantigen)

SDS - додецилсульфат натрия (от англ. sodium dodecyl sulphate) SP - однопозитивные (от англ. Single positive)

ТАР - переносчики ассоциированные с антигенным процессингом (от англ. Transporters associated with antigen processing) TCR - Т-клеточный рецептор (от англ. Т cell receptor) TNF - фактор некроза опухолей (от англ. tumor necrosis factor) V D J - гены TCR (от англ. Variable Diversity Joining) АПК - антиген-презентирующие клетки p2m - (32-микРоглобулин (от англ. p2~niicroglobulin) мАТ - моноклональные антитела ОТ-ПЦР - обратнотранскриптазная ПЦР ПЦР - полимеразная цепная реакция

Обзор литературы.

Судьба клетки является ключевым моментом в развитии ткани и организма в целом. Физиологическое функционирование многоклеточного организма зависит от создания определенного количества и разнообразия клеточных типов. Адаптивная иммунная система зависит от функций Т и В клеток, которые зкспрессируют уникальные рецепторы на своей поверхности. Такие рецепторы формируются в ходе случайной соматической реаранжировки ДНК. Эти клональные рецепторы помогают определить дальнейший путь дифференцировки и созревания клеток иммунной системы. Для Т лимфоцитов такими клональными рецепторами являются молекулы Т-клеточного рецептора (TCR).

Т-клетки являются клеточной компонентой адаптивного иммунитета. Репертуар периферических Т лимфоцитов несет на себе отпечаток пройденной им селекции в тимусе. Благодаря этому Т-клетки на периферии способны отличать чужеродные антигены от своих собственных и отвечать только на первые. Таким образом, тимусная селекция является самой важной стадией жизненного цикла лимфоцитов, формирующей будущее разнообразие специфичностей зрелых Т-клеток. В ходе развития Т-клеток различают как минимум 6 ключевых этапов (рис. 1) :

1. Миграция и дифференцировка ранних предшественников Т-клеток (стадии DN1-4).

2. р-селекция (между DN и DP стадиями).

3. Смерть от забвения (death by neglect).

4. Позитивная селекция (стадия DP).

5. Негативная селекция (стадия DP).

6. Детерминация путей развития тимоцитов (Lineage commitment )(между стадиями DP в клетки CD4 + и CD8 + и -SP) .

Однако, следует отметить, что стадии дифференцировки, указанные в пунктах с 3 по б, видимо, протекают одновременно и параллельно или существенно перекрываются во время развития Т-клеток в тимусе.

Ранние этапы дифференцировки предшественников Т-клеток и TCR р-селекция.

Комитированные лимфоидные предшественники мигрируют из костного мозга через кровеносное русло в тимус. В тимусе такие клетки теряют способность к В клеточной [Radke, F. et al., 1999; Pui, J. С. et a 1. , 1999; Wilson, A. et al. , 2001] и NK клеточной [Michie, A. M. et al. , 2000] дифференцировке. В результате образуются двойные негативные (DN), или как их ещё называют тройные негативные (TN), предшественники Т-клеток, которые не экспрессируют ни Т-клеточного рецептора (TCR") , ни корецепторов CD4 и CD8. В свою очередь дифференцировку тимоцитов на стадии DN можно разделить на четыре последовательных этапа, которые различаются по экспрессии на поверхности клеточных маркеров CD44 (рецептор гиалуроновой к-ты) и CD25 (а цепь рецептора к IL-2): DN1, CD4 4+CD2 5~; DN2, CD44+CD25+; DN3, CD44~CD25 + ; DN4, CD44~CD25~ [Godfey, D.I. et al. , 1993].

Полипотентные клетки DN могут дать начало как Т-клеткаму8, так и ар. Лимфоциты, дифферецирующиеся в Т-клетки а,р, на стадии DN3 впервые начинают экспрессировать инвариантную цепь npe-TCR-cc, которая кодируется нереаранжируемым локусом [Groettrup, М. et al., 1997; von Boehmer, H. et al., 1997; Aifantis, I. et al., 1999]. Цепь пре-TCR-a связывается с р-цепью TCR, которая является продуктом ряда успешных соматических рекомбинаций генов (VDJ) из локуса р цепи TCR. Затем комплекс npe-TCR-оф экспрессируется на поверхности лимфоцитов. Процесс VDJ-рекомбинации требует наличия белков recombination-activating gene (RAG1 и RAG2) [Mombaerts, P. et al., 1992; Shinkai, Y. et al., 1993]. Если экспрессия генов Rag дефектна, то происходит блокирование дифференцировки пре-Г-клеток. Предотвращается реаранжировка генов (3-локуса и, следовательно, сборка комплекса npe-TCR и его экспрессия на поверхности.

Для дальнейшего созревания клеток необходим сигнал от npe-TCR ((3-селекция). На клеточной поверхности комплекс npe-TCR-ap ассоциируется с белками комплекса CD3 ГС,, которые вовлечены в передачу сигнала внутрь клетки [van Oers, N. S. et al., 1995]. Мутации, предотвращающие экспрессию ключевых ферментов и адаптерных белков, которые участвуют в активации вторичных месенджеров комплексом npe-TCR, приводят к аресту развития клеток на стадии DN3 [Negishi, I. et al., 1995; van Oers, N. S. et al., 1996; Clements, J. L. et al., 1998]. Сигнал от пре-TCR-a контролирует реаранжировку (3-цепи [von Boehmer, Н. et al. , 1999]. Для р-цепи действует правило аллельного исключения, в силу которого успешной реаранжировке подвергается только один из двух аллелей р-локуса TCR [Uematsu, Y. et al., 1988]. Таким образом, предотвращается экспрессия двух разных р-цепей TCR на одной клетке. Этому способствует прекращение экспрессии белков RAG под действием сигнала от npe-TCR. Кроме того, npe-TCR, возможно, регулирует индукцию реаранжировки а-локуса TCR (см. ниже). Видимо, для комплекса npe-TCR-оф не существует лиганда. Это вытекает из ряда публикаций, в которых изучалось развитие Т-клеток, у которых экспрессируются только транкированные по внеклеточному домену цепи TCRPи пре-TCRa [Irving, В.A. et al., 19 98].В этом случае тимоциты DN способны дифференцироваться в клетки DP.

В ходе ß-селекции на стадии DN3-DN4 Т-клетки проходят от б до 8 делений, после чего восстанавливается экспрессия RAG белков и соматической рекомбинации подвергается локус а цепи (см. ниже), второго компонента зрелого TCR aß. При этом происходит утрата экспрессии комплекса npe-TCR-aß, в связи с чем наблюдается снижение экспрессии комплекса CD3 на поверхности, который теперь ассоциирован с TCR aß. В это же время тимоциты начинают экспрессировать корецепторы CD4 и CD8. Стоит отметить, что часто первым экспрессируется лишь один из корецепторов (зависит от генетической основы животного) . Этот факт позволил исследователям выделить особую промежуточную стадию (ISP) в развитии лимфоцитов [Robey, Е. et а1., 1994] . Затем тимоциты становятся двойными позитивными (CD4+CD8+, стадия DP). В тимусе Т-клетки на стадии DP составляют до 90% от всех клеток.

Так как дальнейшее развитие Т-клегок зависит от структуры TCR и его взаимодействия с лигандами- молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), необходимо подробнее рассмотреть структуру TCR и принципы взаимодействия Т-клеточного рецептора с молекулами МНС.

Формирование разнообразия TCR.

Как и в случае с антителами, функциональные гены TCR собираются с помощью генетической рекомбинации из отдельных сегментов V, D и J [Davis, М. М. et al., 1988]. Процесс генетической реаранжировки TCR Т-клеток происходит в тимусе. В геноме содержится большое количество вариантов V сегментов, которые кодируют первые 90 аминокислотных остатков зрелых цепей TCR а и ß. Как уже отмечалось ген TCRß цепи собирается в тимусе на стадии DN. Вначале короткий D сегмент соединяется с J сегментом, после чего происходит последующая рекомбинация V сегмента с DJ сегментом, что и приводит к формированию Р цепи ТСИ. Локус а-цепи ТСИ, которая реаранжируются позже, на стадии ЭР, не содержит Э сегментов. Гены а-цепей ТСИ формируются в ходе соматических рекомбинаций только V и Л сегментов. Цепи ТСБ. имеют имммуноглобулиноподобную структуру. Каждая из цепей образует по три петли, содержащих три района, определяющих комплиментарность (С0И1, С0И2 и СОИЗ), которые находятся рядом друг с другом и создают поверхность связывания, которая будет контактировать с антигеном (рис. 2А). Две петли СБК1 и С0И2 закодированы в генах V сегментов. В геноме мыши и человека содержится около 20-70 генов V сегментов для ТСЯ а и (3 цепей. Третья петля СБИЗ возникает в месте соединения сегментов У^Л'. Из-за того, что этот участок наиболее изменчив, СОИЗ привносит наибольшее разнообразие в структуру ТСК. Дополнительную вариабельность в него вносят N и Р нуклеотиды, которые случайным образом добавляются или убираются в ходе рекомбинации в места контактов между V, {О) и J сегментами |^апе\^ау, С. А. et а1. , 1999]. Рекомбинация генов V, Э и J приводит к формированию большого разнообразия ТСБ. (до 1013).

Молекулы МНС и их взаимодействие с ТСЕ.

Структура молекул МНС:

Работы по кристаллографии помогли понять принцип действия молекул МНС как первого, так и второго класса (МНС класса I и МНС класса II). Молекула МНС класса I состоит из а-цепи, которая содержит 3 иммуноглобулиноподобных домена [си\, «2 и аз), а также нековалентно связанного с ней (32-микроглобулина. Молекула МНС класса II состоит из двух полипептидных цепей а и (3, содержащих по два иммуноглобулиноподобных домена. Несмотря на то, что молекулы различаются в деталях, обе молекулы МНС класса I и МНС класса II имеют пептид-связывающий желобок, который необходим для презентации антигенов Т-клеткам [Bjorkman, P. J. et al., 1987; Brown, J. H. et al., 1993; Scott, C. A. et al., 1998]. В каждом случае дно желобка сформировано ß-слоями, а стенки протяженными районами а-спиралей. Считается, что наиболее полиморфные аминокислотные остатки находятся в желобке молекул МНС, что позволяет изменять спектр связываемых пептидов. Замечательным свойством связывания молекулы МНС с пептидом является то, что такое взаимодействие одновременно очень стабильное и в то же время вырожденное, что позволяет разным пептидам связываться с одним аллельным вариантом молекул МНС. Такое стабильное взаимодействие обусловлено присутствием на дне желобка специальных карманов для определенных аминокислот (якорных аминокислотных остатков) в пептидной цепочке. Созревание молекул МНС первого класса :

Молекулы МНС класса I нагружаются пептидом вскоре после синтеза в эндоплазматическом ретикулуме. В этом случае пептиды представляют собой фрагменты эндогенных белков, процессированных с помощью протеазного белкового комплекса в цитоплазме. Такой комплекс состоит из 2 8 субьединиц, которые формируют цилиндрическую структуру (протеосому). Пептиды транспортируются с помощью ÄTP-зависимых белков транспортёров, ассоциированных с антигенным процессингом (TAPI и ТАР2), в эндоплазматический ретикулум. Там с помощью вспомогательных белков шаперонов происходит правильная укладка и связывание молекул МНС класса I с пептидами. В начале этого процесса только что синтезированные тяжелые цепи МНС класса I связываются с белком калнексином, который их стабилизирует. После того, как тяжелая цепь нековалентно свяжется с молекулой микроглобулина (Ргт) происходит отсоединение калнексина. Далее гетеродимер a:ß2m связывается с белками калретикулином и тапазином, которые также связаны с гетеродимерным комплексом

ТАР1:ТАР2. Такое взаимодейсвие обеспечивает связывание пептида с продуктами МНС класса I и формирование правильной третичной структуры молекул МНС класса I. Затем комплексы молекул МНС класса I с пептидами мигрируют на поверхность клетки. Созревание молекул МНС второго класса:

Синтезированные цепи молекулы МНС класса II в эндоплазматическом ретикулуме, напротив, вначале предохраняются от связывания с собственными пептидами белком- шапероном - инвариантной цепью (Ii) . Молекула Ii имеет сигнальный домен в цитоплазматическом участке, который определяет другую важную функцию Ii, транспорт всего комплекса в эндосомный компартмент. Продукты МНС класса II попадают в эндосомы, где и происходит связывание с чужеродными пептидами. Во время этого процесса молекула Ii, находящаяся в гетеродимере с молекулой МНС класса II, подвергается деградации, в результате чего остается короткий фрагмет Ii, который остается в пептид-связывающем желобке молекулы МНС класса II. Этот пептид носит название: класс II ассоциированный пептид инвариантной цепи или CLIP. Чтобы произошло замещение CLIP на посторонний пептид, необходима специальная молекула МНС класса II, которая у человека называется HLA-DM, а у мыши Н-2М [Riberdy J.M. et al., 1992; Romagnoli P. et al., 1994; Denzin L. K. et al., 1995; Sloan V. S. et al., 1995]. Эти молекулы никогда не экспрессируются на поверхности клеток. Молекулы DM взаимодействуют с комплексом CLIP:МНС класс II и катализируют обмен CLIP на другие пептиды. Интересно отметить, что молекулы DM способны заменять пептиды, которые нестабильно связываются с молекулами МНС класса II. Это свойство является чрезвычайно важным, во-первых, потому что молекулы МНС без пептидов нестабильны, а, во-вторых, необходимо, чтобы презентируемый антиген существовал достаточное время для активации Т-клеток. В отличие от молекул МНС класса I молекулы МНС класса II связываются фрагментами экзогенных белков, которые были предварительно разрезаны ферментами лизосом. Эти ферменты представляют собой ацидофильные белки, которые относятся к цистеиновым протеазам, катепсинам. Основную роль в процессинге антигенов играют два катепсина Б и Ь.

Структурная организация взаимодействия молекул МНС и ТСИ:

Молекулы МНС презентируют Т-клеткам пептиды как собственных белков организма, так и чужеродных. Желобок МНС с пептидом направлен в сторону межклеточного пространства и представляет собой относительно плоскую поверхность, сформированную а-спиралями МНС и самим пептидом. На сегодняшний день известны кристаллические структуры нескольких комплексов ТСВ.-пептид-МНС. Топология взаимодействия между молекулами во всех случаях, в основном, совпадает. Т-клеточный рецептор ориентирован по диагонали относительно внешней поверхности комплекса пептид:МНС (см. рис 2Б) . В пространственной структуре контакта ТСИ-пептид-МНС петли СВВ.1 и СБИ2 а-цепи ТСИ располагаются около 1\1-концевой части пептида и сходные участки (3-цепи находятся около С-концевой части пептида. В основном, петли СБЕ! и СПИ2, кодируемые V-регионом, взаимодействуют с аминокислотными остатками молекул МНС. Наибольшей вариабельностью обладает третий регион ТСИ, определяющий комплементарность взаимдействия с молекулой МНС -СБИЗ. Эти регионы альфа- и бета-цепей ТСИ ориентированы по центру контакта (ТСИ-пептид-МНС) и, в основном, взаимодействуют с центральной частью пептидной цепи. Несколько аминокислотных остатков пептида формируют внешнюю поверхность комплекса молекула МНС-пептид и, таким образом, доступны для взаимодействия с ТСЯ. По этой причине наиболее вариабельные регионы молекулы ТСК (СОКЗ петли а и (3 цепи) обладают наилучшим доступом к наиболее вариабельной части лиганда (пептиду) (см. рис 2В) .

Внутриклеточные сигналы, вовлеченные в активацию Т-клетки:

Генерация вторичных месенджеров, которая происходит после распознавания лиганда (молекул МНС в комплексе с пептидом) Т-клеточным рецептором, играет важнейшую роль в развитии Т лимфоцитов. Физиологическим лигандом для активации Т-клеток является комплекс, состоящий из молекулы МНС и пептида. Молекулы TCR, специфичные к данному комплексу, распознают его и передают сигнал на белки CD3 (8, у, 6 и Q. Далее активируется киназа Lck, которая нековалентно ассоциирована с цитоплазматическими доменами белков CD3 и корецепторов CD4 и CD8. Активированная киназа Lck фосфорилирует мотивы в молекулах CD3 (Q , содержащие аминокислотные остатки тирозина (ITAMs) [Weiss, А. et al., 1994 ; Kane, L. P. et al., 2000]. Конформационные изменения молекул CD3 приводят к вовлечению в сигнальные события киназы семейства SYK -ZAP-70 [Weiss, А. et al., 1994 ; Kane, L. P. et al., 2000]. Функциональная киназа Lck фосфорилирует, и таким образом активирует, киназу ZAP-70. Активная молекула ZAP-70, в свою очередь, фосфорилирует один из ключевых адапторных белков для Т-клеточной активации - LAT, а также множество других ферментов и адапторных белков [Zhang, W. et al., 1998]. Это приводит к увеличению концентрации внутриклеточного Са2+, который способствует миграции в ядро ядерного транскрипционного фактора Т-клеточной активации (NF-AT) и активации МАР-киназного пути. В результате индуцируется экспрессия генов, необходимых для развития и функционирования Т-клеток [Кио, С. Т. et al., 1999]. Здесь необходимо отметить особую роль корецепторов CD4 и CD8. Эти молекулы представляют собой гликопротеиды, содержащие иммуноглобулиновые домены. Молекулы CD4 экспрессируются в мономерной форме, a CD8 в виде гомо- или гетеродимеров (CD8oca или CD8aß). Внеклеточная часть этих белков имеет сайты связывания с молекулами МНС, причём CD 4 связывается с молекулами МНС класса II, а CD8 связывается с молекулами МНС класса I. Условия активации Т-клетки становятся оптимальными, если при распознавании комплексов МНС-пептид, наряду с ТСК, участвуют корецепторы (в зависимости от рестрикции ТСИ к молекулам МНС), которые приводят к локализации киназы Тек в зоне контакта ТСК с лигандом.

Т-клеточный репертуар до селекции.

Двойные позитивные (DP) гимоциты способны дифференцироваться в однопозитивные (SP), которые экспрессируют либо корецептор CD4, либо CD8 и распознают молекулы МНС класса II или МНС класса I, соответственно. Данный процесс сопровождается распознаванием Т-клеточным рецептором собственных молекул МНС организма в комплексе со своими пептидами. В ходе этих процессов Т-клетки претерпевают позитивную и негативную селекцию, при которой основная масса тимоцитов погибает, а оставшиеся представляют собой зрелые лимфоциты CD4 и CD8, готовые к миграции на периферию. Иными словами, процессы селекции в тимусе формируют репертуар Т-клеток на периферии. В настоящее время репертуар периферических Т-клеток достаточно хорошо изучен, однако почти ничего не известно о репертуаре до прохождения им селекции внутри тимуса. На стадии DP тимусного развития на Т лимфоцитах начинается ко-экспрессия цепей TCR, рекомбинированных случайным образом. Такие тимоциты формируют преселектированный репертуар. Однако только очень небольшая часть клеток (менее 5%) покидает тимус и заселяет периферические органы.

Давно существовали предположения о том, что TCR обладает врожденной аффинностью к молекулам МНС. Такая точка зрения основывалась на том, что очень высокий процент зрелых Т-клеток отвечает на аллогенные молекулы МНС (т. е. на те молекулы, на которых они не проходили селекцию) [Jerne, N. К. et al., 1971]. Рядом авторов было установлено, что молекулы TCR взаимодействуют с доменами al и a2 молекул МНС класса I [Hong, S. С., et al., 1992; Ehrich, E. W. et al., 1993; Garboczi, D. N. et al., 1996; Garcia, К. С. et al., 1996; Sim, В. С. et al., 1996]. Кроме того, были найдены участки TCR, которые непосредственно участвуют в контакте (CDR1, CDR2 и CDR3) с молекулами МНС. Двумя независимыми группами исследователей было показано, что в тимусе неселектированный репертуар Т-клеточных рецепторов обладает врожденной способностью к распознаванию МНС [Merkenschlager, M. et al., 1997/ Zerrahn, J. et al., 1997]. Первая группа показала, что более 2 0% тимоцитов до прохождения позитивной и негативной селекции способны распознавать молекулы МНС. Авторы основывались на том, что на клетках, распознавших молекулы МНС, индуцируется экспрессия поверхностного активационного маркера CD69 [Merkenschlager, M. et al., 1997]. Другая группа исследователей в качестве модели использовала Т-клетки из тимусов мышей, которые лишены экспрессии молекул МНС. Такие клетки представляют собой DP лимфоциты, имеющие репертуар рецепторов, не прошедший ни позитивную, ни негативную селекцию на молекулах МНС. Как и у нормальных мышей, эти клетки не являются зрелыми. С помощью моноклональных антител (mAbs) к молекулам TCR а/р и CD4 в органных культурах тимуса (FTOC) авторы эффективно индуцировали созревание таких тимоцитов. Анализ специфичности TCR этих клеток показал наличие большого количества МНС-реактивных рецепторов в преселектированиом репертуаре Т лимфоцитов (такое же количество, как и в репертуаре, селектированном на молекулах МНС) . Такую большую частоту реактивных клонов было бы трудно ожидать при случайной рекомбинации цепей TCR, что наводит на мысль о врожденной предрасположенности к взаимодействию с молекулами МНС. Эволюция сформировала гены TCR так (в особенности CDR1 и CDR2 районы V-сегментов), что их продукты предпочтительно взаимодействуют с молекулами МНС.

Кроме того, рядом исследователей показано, что определенные варианты Va предпочитают взаимодействовать с молекулами определенного класса МНС. Т-клетки, несущие такие TCRVa предпочтительно дифференцируются в клетки CD8 (ре активные к молекулам МНС класса I) либо в CD4+ (реактивные к молекулам МНС класса II) [Sim, В. et а1., 1996; Sim, В. et а!., 1998; Sim, В. et al., 1999; Sim, В. et а1., 1998]. Установлено, что такое врожденное свойство кодируется в районах CDR1 и CDR2 цепи Va. Точечные мутации в этих районах способны поменять дифференцировку клеток с CD4+ на CD8+ [Sim, В. et al., 1996].

Из изложенного выше можно заключить, что кодируемые в геноме участки V районов молекулы TCR (CDR1 и CDR2) во многом определяют судьбу тимоцита.

Детерминация путей развития тимоцитов в клетки CD4+ и CD8+. Позитивная и негативная селекция Т-клеток.

Зависимость развития Т-клеток от экспрессии молекул МНС в тимусе:

Как уже отмечалось, дальнейшая судьба Т-клеток CD4+CD8+ в тимусе зависит от взаимодействия TCR-MHC. В отсутствие экспрессии молекул МНС клетки DP подвергаются апоптозу, даже если на поверхности Т лимфоцитов экспрессируется TCR. Мыши, дефицитные по обоим классам молекул МНС, не имеют SP Т-клеток ни на периферии, ни в тимусе [Grusby, М. J. е al., 1993]. У мышей, дефицитных по молекуле Ii, количество клеток CD4+ резко снижено из-за низкой экспрессии молекул МНС класса II (до 10 раз) [Bikoff Е. К. et al., 1996].

В течение трёх дней жизни DP тимоциты продолжают экспрессировать гены RAG и, таким образом, продолжают реаранжировку генов а-цепей TCR [Goldrath A. W. et al., 1999]. Взаимодействие молекул TCR с продуктами генов МНС класса I или II, которые экспрессируются на клетках кортикального эпителия тимуса, необходимо тимоцитам, чтобы избежать гибели и выключить механизм дальнейшей рекомбинации генов а-цепей TCR. Однако, избежать гибели удаётся только тем Т-клеткам, которые распознают свои молекулы МНС с достаточно низкой аффиностью. В отличие от этих клеток, тимоциты, которые экспрессируют высокоаффиные рецепторы, элиминируются, подвергаясь негативной селекции. Более половины Т-клеток, реагирующих на собственные молекулы МНС организма, гибнут в ходе этого процесса [van Meerwijk, J. P. M. et al., 1997; Bouneaud C. et al., 2000]. В свою очередь, тимоциты, полностью неспособные к распознаванию собственных молекул МНС, также погибнут от апоптоза (рис. 3). Этот процесс носит название смерть от забвения (death by neglect). Более 2/3 тимоцитов гибнет именно в силу неспособности распознать молекулы МНС внутри тимуса [van Meerwijk, J. P. M. et al., 1997].

Компартментализация позитивной и негативной селекции:

Эксперименты, проведённые на костномозговых химерах, показали, что для прохождения эффективной позитивной селекции необходимо взаимодействие TCR с молекулами МНС, которые экспрессируются клетками кортикального эпителия тимуса [Lo, D. et al., 1986; Berg, L. J. et al., 1989; Benoist, C. et al. , 1989; von Boehmer, H., 1990; Cosgrove, D. et al., 1992]. Недавно другие авторы показали такую же компартментализацию позитивной селекции, используя очень элегантную систему. Были получены трансгенные мыши, экспрессирующие Г-Аь под промотором кератина-14 [Laufer, Т. М. et al., 1996]. Таким образом, поверхностная экспрессия молекул МНС класса II имела место только на клетках эпителия. В тимусе она была ограничена кортикальным эпителием, и этого было достаточно для позитивной селекции клеток CD4.

Из других экспериментов стало очевидным, что негативная селекция проходит в медуллярном отделе тимуса, антигенпрезентирующие клетки которого происходят из гематопоэтических предшественников костного мозга. Это было показано, используя костномозговые химеры. Костный мозг выделяли из самцов, Т-клетки которых несли TCR, специфичный к H-Y антигену самцов, и вводили облучённым мышам различных гаплотипов МНС. Исследователи наблюдали полную делецию трансгенных донорских Т-клеток у облученных реципиентов любого гаплотипа МНС [Kisielow, P. et al., 1988]. Клональной делеции подвергались как незрелые, так и созревающие (CD4+CD8-, HSA+) тимоциты и этот процесс зависел от костимуляции [Sprent, J. et al., 1995; Kishimoto, H. et al., 1997 ; Page, D. M. et al., 1994; Aiba, Y. et al., 1994]. Таким образом, сложилось мнение, что негативная селекция протекает в медуллярном отделе тимуса с участием клеток костного мозга. Подтверждение этому можно найти в исследованиях, описывающих негативую селекцию, вызванную эндогенными суперантигенами (SAG) и циркулирующими антигенами. В этих случаях наблюдается массовая гибель тимоцитов от апоптоза в медуллярной части тимуса [Zal, Т. et al., 1994 ; Surh, С. D. et al., 1994; Punt, J. A. et al., 1994; Douek, D. C. et al., 1996]. Однако, на сегодняшний день нет уверенности в том, что клональная делеция (негативная селекция) происходит только в медуллярной зоне тимуса. Результаты, полученные на модели с эндогенным суперангигеном, могут быть отличными от клональной делеции собственными антигенами из-за различной локализации делетирующего агента. Экспрессия суперантигена мышиного вируса опухолей молочных желез (MMTV) наблюдается в клетках костномозгового происхождения [Moore, N. С. et al., 1994]. Неясно, можно ли сравнивать делецию, вызванную SAG, с делецией, индуцированной эндогенным пептидом, представленным в контексте собственных молекул МНС. Установлено, что у мышей, нокаутированных по гену CD30, не наблюдается ярко выраженной негативной селекции, вызванной комплексами МНС-пептид, тогда как клональная делеция, вызванная SAG, происходит [Amakawa, R. et al. , 1996]. Сходные наблюдения получены при исследовании влияния экспрессии других генов селекцию в тимусе. Многочисленные модели с использованием трансгенных животных также показывают, что негативная селекция может проходить не только в медуллярной зоне тимуса. [Kisielow, Р. et al., 1988; Pircher, Н. et al., 1989; Speiser, D. E. et al., 1992; Murphy, К. M. et al . , 1990; Wack, A. et al. , 1996]. Тимоциты на стадии DP с низкой экспрессией TCR преимущественно погибают в кортикальной зоне тимуса. Делеция медулярных тимоцитов при инъекции антигена или антигенного пептида тоже имеет свое объяснение. При распознавании антигена созревшие Т-клетки могут продуцировать растворимые факторы (глюкокортикоиды, TNF), которые токсичны для незрелых тимоцитов [Iwata, М. et al. , 1994; Rueff-Juy, D. et al., 1991]. Таким образом, создается впечатление, что негативная селекция не имеет анатомической локализации в тимусе и может протекать одновременно или параллельно с позитивной селекцией.

Особенности реаранжировки а-цепи TCR при негативной и позитивной селекции:

Интересно отметить, что в ходе позитивной и негативной селекции реаранжировка а-цепи TCR контролируется по-разному. Как уже ранее отмечалось, продуктивная VDJ рекомбинация ß-цепи Т-клеточного рецептора ингибирует вторичную реаранжировку генов ß цепи TCR (аллельное исключение). Следовательно, Т-клетки могут экспрессировать только по одной ß-цепи. Аллельного исключения не существует для VJ- рекомбинации а-цепи TCR: экспрессия функционально реаранжированного сегмента Va-Ja не может блокировать рекомбинацию другого гена TCRa [Petrie, Н. Т. et al., 1993; Malis sen, M. et al., 1988 ; Borgulya, P. et al. , 1992]. Это предполагает возможность рекомбинации генов TCRa на другой хромосоме и экспрессии двух a цепей на одной Т-клетке. Несколькими группами описаны такие лимфоциты на периферии (до 30% Т-клеток несут две цепи а) . Оказалось, что такие клетки функциональны и, возможно, играют существенную роль во вторичном ответе на антиген [McGargill, M. A. et al., 2000; Не, X. et al., 2002].

Рядом исследователей было установлено, что уже существующий функционально реаранжированный сегмент Va-Ja может быть вырезан во время вторичной рекомбинации на той же хромосоме [Wang, F. et al., 1998; Buch, Th., et al., 2002]. Эти исследования были проведены с использованием мышей, трансгенных по TCR. В работе, где использовали мышей, трансгенных по 2B4-TCR (рестриктирован по молекуле МНС класса II гаплотипа Н-2к) , авторы установили, что у таких мышей гаплотипа Н-2к происходит позитивная селекция Т-клеток с трансгенным TCR и вторичная реаранжировка блокируется. Однако, эти же трансгенные мыши на гаплотипе H-2b, у которых не происходит позитивной селекции этого трансгенного TCR, имеют Т лимфоциты с разными TCR. Следовательно, в этом случае позитивая селекция индуцирует вторичную рекомбинацию. Этими же авторами установлено, что негативная селекция (в присутствии антигена), так же как и позитивная селекция, может индуцировать вторичную рекомбинацию генов TCRa на той же хромосоме [Wang, F. et al., 1998]. В то же время, другая группа исследователей, используя мышей, трансгенных по HY-TCR (рестриктирован по молекулам МНС класса I гаплотипа Н-2Ь) , показала, что только при позитивной селекции (на «неселектирующем» гаплотипе H-2d) может происходить вторичная рекомбинация в той же хромосоме [Buch, Th., et al., 2002]. В этом случае негативная селекция (в присутствии антигена) приводит к апоптозу. Это кажущееся противоречие легко снимается, если предположить, что развитие клеток CD4 и CD8 идет по разным законам. Таким образом, можно заключить, что во время позитивной селекции Т-клетка рекомбинирует TCRa локус до тех пор, пока не добьется экспрессии такого TCR, который может взаимодействовать с молекулами МНС и позволяет пройти позитивную селекцию. Детерминация путей развития тимоцитов в Т-клетки CD4+ и CD8+: Низкоаффинное распознавание собственных молекул МНС в тимусе приводит к выживанию Т-клеток и, видимо, определяет их дифференцировку в лимфоциты CD4+ или CD8+ [Jamenson, S. С. et al., 1995; Kisielow, P. et al., 1995; Robey, E. et al. , 1994]. Клетки, распознавшие молекулы МНС класса I, развиваются в тимоциты CD8+, в то время как распознавание молекул МНС класса II приводит к дифференцировке в клетки CD4+. Таким образом, функция и путь развития Т-клеток зависит от распознавания молекул МНС. На первый взгляд все выглядит логично и просто. Вначале Т-клеточный рецептор на Т-клетке DP взаимодействует с молекулами МНС, которые экспрессируются на стромальных клетках тимуса и запускает некий сигнальный механизм, который координирует их дифференцировку в лимфоциты SP. Очень важно, чтобы Т-клетка с рецептором, рестриктированным по молекуле МНС первого класса, экспрессировала корецептор CD8 и, наоборот, Т-клетка с рецептором, рестриктированным по молекуле МНС второго класса, экспрессировала корецептор CD4 . Это становится понятно при детальном разборе сигнальных путей, задействованных в активации Т-клетки. Эффективность взаимодействия ТСК-пептид-МНС напрямую зависит от корректного связывания лиганда с корецептором (корецептор CD8 имеет сайт связывания с молекулами МНС класса I, a CD4 взаимодействует с молекулами МНС класса II) . Без такого связывания, где TCR, рестриктированный по молекулам МНС класса I, и корецептор CD8 на Т-клетке взаимодействуют с одной и той же молекулой МНС класса I, корректная активация и дифференцировка Т лимфоцита в зрелую Т-клетку невозможна. То же самое относится к

Т-клеткам CD4 + . Тем не менее до сих пор в научной среде нет единого мнения и ответа на вопрос: Как происходит координация экспрессии корецепторв и специфичности TCR в Т-клетках во время развития в тимусе?

Дифференцировка в тимусе двойных позитивных клеток в одно-позитивные происходит благодаря ингибированию транскрипции одного из корецепторов [Sawada,S. et al. , 1991; Sawada,S., et al., 1994 ; Ellmeier, W., et al., 1997; Ellmeier, W. et al., 1999; Hostert, A. et al. , 1997A; Hostert, A. et al. , 1997Б; Adlam, M. et al. , 1997; Hostert, A. et al., 1998 ; Kim, H. K. et al. , 1998; Zou, Y. R. et al. , 2001; Leung, R. K. et al., 2001] . Были высказаны две взаимно конкурирующие гипотезы, которые объясняли, как возникает такая поляризация. Первая предполагала случайный процесс ингибирования одного из корецепторов, который никак не связан со специфичностью TCR. Такая модель получила название "стохастической" или "селекционной". В этом случае в ходе дифференцировки довольно часто возникают клетки с несогласованной экспрессией TCR и корецептора. Однако, только те Т-клетки, которые несут совместимые пары TCR и корецептора, могут успешно завершить развитие. Альтернативная гипотеза предполагала, что процесс детерминации развития тимоцитов в клетки CD4 и CD8 регулируется природой первичного сигнала, который Т-клетка на стадии DP получила через TCR. Иными словами сигнал должен отличаться в случае, когда TCR рестриктирован по молекулам МНС класса II, от сигнала, когда TCR рестриктирован по молекулам МНС класса I. Такая модель носит название "инструктивной" гипотезы. Селекционная модель предполагает, что часть Т-клеток гибнет из-за неправильного выбора корецептора. Следовательно, если ввести правильный трансгенный корецептор в такие клетки, то количество выживших клеток в тимусе должно возрасти. Такие клетки будут экспрессировать оба рецептора: "неправильный" эндогенный и "правильный" трансгенный. Однако, первые эксперименты по экспрессии трансгенных корецепторов CD4 и CD8 не дали ожидаемых результатов. Только небольшая часть зрелых Т-клеток имела фенотип DP [Guidos, С. J. et al., 1990; Chan, S. H. et al., 1993]. Эти данные были представлены как веское доказательство инструктивной модели селекции в тимусе. Дальнейшие эксперименты с использованием достаточно высокого уровня экспрессии трансгенного корецептора на Т-клетках, а также модели, использующие мышей, трансгенных по TCR, показали возможность накопления Т-клеток DP в некоторых случаях. Иными словами были накоплены факты, которые не могут объясняться как стохастической, так и инструктивной моделями.

Тем не менее, работы, проведенные с использованием мышей, дефицитных по экспрессии молекул МНС класса I или МНС класса II, ненадолго склонили исследователей к мнению о справедливости стохастической модели. Одной группой авторов [Guidos, С. J. et al., 1990] было описано промежуточное состояние развития Т-клеток в тимусе (из стадии DP в стадию SP) . Ими был установлен ряд промежуточных стадий, где экспрессия корецепторов постепенно снижается. При дифференцировке в клетки CD8 постепенно снижается уровень CD4, а при дифференцировке в клетки CD4 снижается уровень CD8. Однако, когда исследовали тимоциты мышей, дефицитных по молекулам МНС класса I, было обнаружено некоторое количество клеток с фенотипом CD4intCD8hi [Chan, S. Н. et al., 1993; van Meerwijk, J. P. et al., 1993]. Для гимодитов мышей, дефицитных по молекулам МНС класса II, тоже была идентифицирована промежуточная стадия (CD4hiCD8int) [Chan, S. Н. et al., 1993; Crump, A. L. et al., 1994]. Такая промежуточная стадия не может существовать, если следовать логике инструктивной гипотезы.

К этому времени была предложена третья модель развития тимоцитов в одно-позитивные Т лимфоциты. Она получила название "default model" (по умолчанию). Основываясь на своих данных, группа исследователей предположила, что тимоциты DP не способны идентифицировать, какой класс молекул МНС распознает их TCR (т. к. оба корецептора экспрессируются на поверхности Т-клеток). Такие Т-клетки просто получают положительный сигнал, если происходит продуктивное взаимодействие. Чтобы идентифицировать рестрикцию своего рецептора, Т-клетки включают генетически детерминированную программу, которая не зависит от рестрикции TCR. В начале этого процесса снижается экспрессия корецептора CD8. Если сигнал от TCR не меняется, то это означает, что TCR рестриктирован по молекулам МНС класса II, и клетка дифференцируется в лимфоциты CD4. Однако, если сигнал исчезает при снижении экспрессии корецептора CD8, то клетка развивается в лимфоцит CD8. Авторы этой гипотезы разработали метод обработки тимоцитов проназой (pronase stripping). Такой подход позволяет наблюдать изменения синтеза корецептора на тимоцитах в реальном времени. Используя этот метод, Singer с соавторами показали, что Т-клетки DP сначала двигаются по пути дифференцировки клеток CD4, даже без сигнала через молекулы TCR. Затем, если происходит успешное взаимодействие TCR (рестриктированного по молекулам МНС класса I) с молекулами МНС класса I, они уклоняются от этого пути развития в сторону клеток CD8 [Suzuki, Н. et al., 1995]. Другими авторами также было показано, что промежуточная популяция тимоцитов CD4hlCD8lnt развивается как в Т-клетки CD4, так и в CD8 [Suzuki, Н. et al. , 1995; Lundberg, К. et al. , 1995]. Отсутствие чётких доказательств регулирования экспрессии корецепторов дало повод отдельным исследователям сомневаться в правильности данной модели. Наличие промежуточной популяции можно было объяснить простым несинхронным и постепенным уменьшением экспрессии одного из корецепторов в ходе дифференцировки [Lucas, В. et al. , 1996] . Такое объяснение подтверждал и тот факт, что сигнал через TCR на тимоцитах DP ведет к уменьшению экспрессии обоих корецепторов. Ряд исследователей предположили, что после этой стадии наступает просто асимметричная ре-экспрессия корецепторов на поверхности Тклеток [Gemain, R. N. et al., 2002]. Кроме того, уменьшение экспрессии обоих корецепторов зависит от силы сигнала, переданного через молекулы МНС, и не зависит от того, какой из классов молекул МНС вызвал это явление. Некоторые исследователи предполагают, что слабый сигнал может не вызвать падение экспрессии обоих корецепторов и, следовательно, часть Т-клеток может дифференцироваться прямо из пула клеток DP [Gemain, R. N. et al., 2002]. Рядом авторов было показано, что часть клеток CD8 не проходит промежуточную стадию CD4hlCD8int, а просто уменьшает экспрессию молекулы CD4 [Coreia-Neves, М. et al. , 2001; Barthlott, Т. et al., 1997]. Таким образом, можно предположить, что потеря поверхностной экспрессии корецепторов в ходе перехода тимоцитов из стадии DP в стадию SP, происходит нелинейным образом. Из вышеизложенного видно, как можно по-разному интерпретировать одни и те же результаты, используя их для доказательства той или иной модели. Тем не менее, факт ре-экспрессии корецептора CD4 с задержкой синтеза молекулы CD8 считается доказанным. Такая асимметричная экспрессия создает временную популяцию Т-клеток CD4hlCD8int, которая дифференцируется либо в лимфоциты CD4^~, либо в лимфоциты CD8 + . Этот процесс зависит от рестрикции TCR.

На сегодняшний день наибольшее распространение получила одна из разновидностей инструктивной модели. Она получила собственное название: модель "силы сигнала" ("strength of signal" model). В основу данной модели легли результаты, которые были получены Itano с соавторами, а так же другими исследователями [Itano, А. et al., 1996; Seong, R. et al. , 1992; Itano, A. et al., 1994]. Данная гипотеза пытается объяснить, как Т клетки DP инструктируются для развития в Т лимфоциты SP. Эта модель предполагает, что развитие тимоцитов в клетки CD4 и CD8 зависит от интенсивности или длительности сигнала через Т-клеточный рецептор. Кратковременный сигнал ведет к дифференцировке Тклеток CD8, а более продолжительный к развитию Т клеток CD4. Эти авторы сконструировали химерные корецепторы, представляющие собой молекулы CD4 с цитоплазматическими доменами от молекул CD8, и, наоборот, молекулы CD8 с цитоплазматическими доменами от молекул CD4. Затем были созданы трансгенные мыши, Т-клетки которых экспрессировали такие рекомбинантные корецепторы. Результаты исследования показали, что судьба Т клеток DP зависит от цитоплазматического (сигнального) домена корецептора, а не от класса молекул МНС [Itano, A. et al., 1996]. Другая группа авторов показала наличие лимфоцитов CD8, рестриктированных по молекулам МНС класса II, у мышей, лишённых эндогенной экспрессии корецептора CD4 . Согласно вышеупомянутой гипотезе о том, что корецептор CD4 помогает TCR распознать молекулу МНС класса II, то в случае отсутствия CD4 будет генерироваться слабый сигнал, который и повлечет за собой дифферендировку клеток CD8 [Matechak, Е. О. et al., 1996]. Модель "силы сигнала" подтверждают и другие данные. Было показано, что пре-селектированные тимоциты DP дифференцируются в лимфоциты CD4 и CD8 под действием форболового эфира и иономицина (эти реагенты стимулируют развитие сигнала без вовлечения поверхностных молекул таких, как TCR и корецепторы). Кроме того, при высоких концентрациях этих реагентов преимущественно развиваются Т клетки CD4, в то время как при низких концентрациях CD8 [Ohoka, Y. et al., 1996]. На основании своих экспериментальных данных, к сходному выводу пришла и другая группа ученых [Sharp, L. L. et al., 1997]: Высокая активность МАР-киназ приводит к предпочтительному развитию Т-клеток CD4, а низкая активность - к CD8. Используя другую модель, Zamoyska с соавторами показала, что при культивировании фетальных органных культур тимуса с гибридными антителами, способными одновременно связываться с молекулами TCR и одним из корецепторов, развиваются клетки CD4 [Bommhardt, U. , 1997; Basson, M. A. et al., 1998; Basson, M. A. et al., 1998], в то время как при применении антител, связывающих ТСН, развиваются Т-клетки СЭ8. В свете инструктивной модели селекции, эти данные легко объяснить тем, что при вовлечении корецептора рекрутируется больше киназы Ьск, которая ассоциирована с молекулами корецепторов и участвует в активации Т-клеток. Такая точка зрения подтверждается и более ранними наблюдениями. Рядом исследователей установлено, что молекулы С04 на тимоцитах БР ассоциированы с большим количеством Ъск, нежели молекулы СР8 [Уед.11е^е, А. et а1., 1989; Э.

Ь. et а1., 1993]. Следовательно, при распознавании молекул МНС класса II, тимоциты будут активироваться сильнее, чем при распознавании молекул МНС класса I. Дальнейшие исследования дифференцировки лимфоцитов СС4 у мышей с мудантной молекулой МНС класса II, лишённой сайта связывания с корецептором, косвенно подтверждают такое предположение. Из этих экспериментов следует, что в отсутствие продуктивного связывания молекул МНС класса II с молекулами ТСК и Сй4 не происходит развития клеток С04, несмотря на наличие Т-клеток, рестриктированнных по молекулам МНС класса II, в преселектированном репертуаре тимоцитов БР [И1Ьегс!у, М. et а1., 1998].

Как уже отмечалось, на сегодняшний день нет единого мнения в вопросе регулирования экспрессии корецепторов и специфичности ТСИ во время дифференцировки тимоцитов. Тем не менее, многие ученые склоняются в пользу инструктивной модели, в основе которой лежит вышеописанная гипотеза "силы сигнала".

Роль пептидов, презентируемых молекулами МНС, в позитивной и негативной селекции:

Молекулярная природа взаимодействия ТСИ-МНС при позитивной селекции является предметом активного исследования. Как уже было отмечено, селекция тимоцитов зависит от молекул МНС, которые экспрессируются на тимусном эпителии (кортикальном и медуллярном). Однако, молекулы МНС презентируют довольно большой репертуар пептидов. Возник вопрос: Каким образом пептиды влияют на селекцию Т-клеток?

Первые эксперименты в этом направлении показали, что мутации в молекулах МНС класса I мышей существенно изменяют селектирующийся репертуар Т лимфоцитов CD8 [Nikolic-Zugic, J. et al., 1990; Sha,W. С. et al., 1990]. Эти эксперименты четко показали, что эндогенные пептиды (в отсутствие инфекции в контексте молекул МНС презентируются пептиды собственных белков, прошедших процессинг), которые связаны с молекулами МНС, распознаются тимоцитами и необходимы для позитивной селекции. Дальнейшие эксперименты существенно продвинули исследования в этом направлении. Несколько групп исследователей использовали систему in vitro - фетальные органные культуры тимуса (FTOC) мышей, дефицитных по экспрессии молекул МНС класса I. Отсутствие экспрессии гена Ргт или отсутствие экспрессии генов ТАР, кодирующих переносчик пептидов в эндоплазматический ретикулум (см. выше), приводит к катастрофическому снижению эффективности селекции популяции клеток CD8+ [Van Kaer, L. et al., 1993; Koller, В. H. et al., 1990]. Это происходит из-за отсутствия молекул МНС класса I на поверхности клеток тимусного эпителия. В первом случае отсутствие ß2m приводит к нарушению связывания пептида с молекулами МНС и транспорта всего комплекса на поверхность, однако, небольшое количество пустых тяжелых цепей все же мигрирует на поверхность клеток. Во втором случае отсутствие белков ТАР приводит к отсутствию презентируемых пептидов, что, в свою очередь, влечёт за собой нестабильность экспрессируемых молекул МНС класса I на поверхности клеток. В таких моделях поверхностная экспрессия молекул МНС класса I может быть восстановлена путём добавления одного или смеси нескольких пептидов в органную культуру (для клеток мышей, нокаутированных по гену рг^/ необходимо добавлять и экзогенный белок Ргт) [Ashton-Rickardt, P.G. et al., 1993;

Hogquist, К. A. et al. , 1993; Hogquist, K. A. et al. , 1994]. Необходимо отметить, что смесь пептидов восстанавливает селекцию Т-клеток CD8 лучше, чем один пептид, который так же связывает и стабилизирует молекулы МНС [Ashton-Rickardt, P.G. et al., 1993]. Таким образом, это означает, что большое разнообразие пептидов обеспечивает селекцию широкого репертуара клеток. Используя все ту же систему in vitxo (FTOC), другие ученые исследовали селекцию у мышей, трансгенных по TCR. Было установлено, что позитивная селекция Т-клеток CD8 с трансгенными TCR (с известной специфичностью) тоже нуждается в распознавании пептида тимоцитами [Hogquist, К. A. et al . , 1994; Ashton-Rickardt, P. G. et al., 1994; Sebzda, E. et al. , 1996]. Однако, зависимость позитивной селекции от разнообразия пептидного репертуара не является линейной. Эффективность двух пептидов, добавленных в культуру тимоцитов, в способности обеспечить селекцию Т-клеток не сильно отличается от эффективности смеси из 1000 пептидов [Ashton-Rickardt, P. G. et al. , 1993]. Это предполагает некоторую вырожденность распознавания лиганда в процессе позитивной селекции.

Как хорошо известно, пептиды презентируемые молекулами МНС, очень разнообразны. Из этого нетрудно сделать предположение, что разные пептиды могут по разному влиять на ход селекции. Основываясь на экспериментах по активации Т-клеток, пептиды были разделены по своему действию на агонисты и антагонисты [Sloan-Lancaster, J. et al., 1996]. Агонист, или антигенный пептид, вызывает полную активацию Т-клеток, обуславливая оптимальную аффинность взаимодействия всего комплекса МНС-пептид с TCR [Sloan-Lancaster, J. et al., 1996]. Пептид-антагонист имеет одну или несколько аминокислотных замен (в сравнении с агонистом), которые уменьшают (изменяют) аффинность взаимодействия комплекса МНС:пептид с Т-клеточным рецептором. Такие изменения ведут к частичной утрате способности активировать Т-клетку. Следуя этой логике, был сделан ряд попыток, выяснить "качество" пептидов, участвующих в селекции. С этой целью использовали мышей, трансгенных по TCR. Было показано, что низкие концентрации специфического пептида (агониста) ведут к позитивной селекции, однако дальнейшее увеличение концентрации индуцирует делецию в ходе негативной селекции. Такие наблюдения привели ряд исследователей к формулированию гипотезы о различиях в авидности (differential avidity hypothesis) [Ashton-Rickardt, P. G. et al., 1994 ; Ashton-Rickardt PG, Tonegawa S., 1994]. Авторы предположили, что увеличение суммарной авидности взаимодействия TCR-MHC-пептид за счет изменения плотности экспрессии определенного комплекса молекула МНС-пептид на поверхности клеток приводит к позитивной или негативной селекции. Однако, новые данные показали несостоятельность данной гипотезы, так как Т-клетки, позитивно селектированные в присутствии пептида-агониста, были не способны активироваться в ответе на него [Hogquist, К. A. et al., 1994 ; Jameson, S. С. et al., 1994]. Тем не менее, пептиды с характеристиками антагонистов селектировали функциональные Т-клетки, способные отвечать на пептид- агонист [Hogquist, К. A. et al., 1994; Jameson, S. С. et al., 1994; Girao, С. et al., 1997]. В подтверждение вышесказанному дополнительно было показано, что пептиды, связывание которых с молекулами МНС класса I приводит к формированию низкоаффинного лиганда для TCR, эффективнее участвуют в созревании функциональных лимфоцитов CD8 [Hogquist, К. A. et al., 1995] . Кроме того, недавно было показано, что в системе in vivo с использованием агониста часть Т-клеток действительно способна выживать, однако для последующей активации таких клеток требуется намного большая концентрация данного пептида [Stockinger, В., 1999]. Таким образом, исследования с использованием пептидов-агонистов и антагонистов показали, что активация Т-клеток через TCR в этих случаях различна [Racioppi,

L. et al., 1993; Sloan-Lancaster, J. et al., 1994]. Поэтому можно предположить, что сигналы для позитивной и негативной селекции также качественно различаются. Такую точку зрения подтверждает ряд работ, в которых показано, что во время позитивной и негативной селекции Т-клетки используют разные сигнальные пути [Alberola-Ila, J. et al., 1996; Swan, К. A. et al., 1995].

Тем не менее, вышеописанные исследования не ответили на важный вопрос, касающийся роли пептида в тимусной селекции: Может ли один эндогенный петид/ представленный в контексте молекулы МНС, обеспечить селекцию широкого репертуара тимоцитов или наоборотг каждый TCR проходит селекцию на широком спектре пептидов? Чтобы приблизиться к пониманию специфичности позитивной селекции в тимусе, были предприняты эксперименты по исследованию мышей, клетки которых экспрессируют лишь один комплекс МНС-пептид. Первый такой комплекс (АьЕр) представляет из себя молекулу МНС класса II (Аь) и пептид из ос-цепи молекулы 1-Е МНС класса II (рЕа52-68). Пептид рЕа52-68 связан с р цепью молекулы МНС класса II (Аь) при помощи линкера. Кристаллографические работы подтвердили, что укладка пептида в groove молекулы МНС является корректной и что линкер не может мешать взаимодействию с TCR [Ignatowicz, L. et al., 1996]. Этими авторами были созданы трансгенные мыши (АьЕр) на основе мышей, дефицитных в экспрессии эндогенных молекул МНС класса II и Ii. В тимусе и на периферии мышей АьЕр обнаружили клетки CD4+CD8~. Например, в лимфатических узлах клетки CD4+ составляли около 8% от общего количества лимфоцитов, тогда как у нетрансгенных мышей на той же генетической основе (без молекул МНС класса II и Ii) клетки CD4+CD8~ практически не обнаруживались.

Как оказалось, репертуар лимфоцитов CD4+ у таких трансгенных животных обладает рядом неожиданных особенностей. Во-первых, было обнаружено широкое разнообразие аир цепей TCR [Ignatowicz, L. et al., 1996; Fukui, Y. et al. , 1997; Ignatowicz, L. et al., 1997; Gapin, L. et al., 1998 ; Chmielowski, B. et al., 1999]. Таким образом, можно заключить, что для позитивной селекции разнообразного репертуара Т-клеток вполне достаточно всего лишь одного комплекса МНС-пептид (АьЕр). В дальнейшем это утверждение было подтверждено тем, что Т-клегки, выделенные из мышей АьЕр, способны реагировать с другими комплексами. В частности, было показано, что среди лимфоцитов CD4+ с высокой частотой встречаются аллореактивные клетки [Ignatowicz, L. et al., 1996]. Во-вторых, у мышей АьЕр авторы обнаружили огромное количество клеток CD4+ реактивных к молекуле Аь дикого типа [Ignatowicz, L. et al., 1996]. Это означает, что негативная селекция у таких животных устраняет аутореактивные клетки не полностью. Сходные результаты были получены при работе с мышами с направленной делецией гена DM (Н-2М) [Miyazaki, Т. et al., 1996; Martin, W. D. et al., 1996; Fung-Leung, W. P. et al., 1996]. Клетки таких мышей экспрессируют молекулы МНС класса II (Аь) с пептидом CLIP, который блокирует пептид-связывающий участок МНС (см. выше), являясь продуктом деградации Ii, и в норме замещается на экзогенный пептид молекулами Н-2М у мыши (или HLA-DM у человека). У этих мышей также образуется широкий репертуар TCR, содержащий большое количество клеток CD4+, реактивных к молекуле Ab [Miyazaki, Т. et al., 1996; Martin, W. D. et al., 1996; Fung-Leung, W. P. et al., 1996]. Из вышеописанных экспериментов можно сделать следующий вывод: для позитивной селекции широкого репертуара TCR достаточно вырожденного взаимодействия (единственный комплекс молекула МНС-пептид), в то время как негативная селекция более зависима от пептида.

Тем не менее, такой вывод имеет свои ограничения. Во-первых, у мышей, дефицитных по экспрессии молекулы Н-2М, было показано наличие других пептидов (кроме CLIP), ассоциированных с молекулами МНС класса II [Grubin, С. Е. et al., 1997] . Используя другую модель, Rudensky показал, что даже очень небольшая "примесь" дополнительных пептидов играет важную роль в позитивной селекции [Barton, G. М. et al. , 1999]. Чтобы создать систему, в которой количество посторонних пептидов будет сведено до минимума, автор использовал трансгенную конструкцию II, где вместо пептида CLIP был вставлен пептид рЕа52-68. Кроме того, такой трансген был переведен на генетическую основу мышей, дефицитных по экспрессии эндогенных молекул Н-2М и Ii. Таким образом, эти исследования показали, что далеко не все Т-клетки могут проходить позитивную селекцию на одном комплексе молекула МНС-пептид (АьЕр). В подтверждение этого говорит тот факт, что многие Т-клетки, трансгенные по TCR, не способны селектироваться у мышей дефицитных по экспрессии Н-2М [Grubin, С. Е. et al. , 1997; Surh, С. D. et al. , 1997] . Кроме того, у мышей, дефицитных по экспрессии Н-2М, и у трансгенных мышей АьЕр при наличии трансгенной р-цепи TCR исследователи обнаружили искажённый репертуар а-цепей TCR, а именно ограниченный набор последовательностей Va и изменение длины петель CDR3 [Fukui, Y. et al., 1998; Sant'Angelo, D. В. et al. , 1997]. Таким образом, дальнейшее ограничение системы (фиксирование (3-цепи TCR) не приводит к дальнейшему сокращению репертуара TCR, что свидетельствует о том, что требования Т-клеточных рецепторов к селектирующему пептиду одинаковы.

Негативная селекция и ауггоиммунитет:

Основная задача иммунной системы организма - это отличить чужеродные антигены от своих собственных. Изучение специфичности Т-клеточной селекции является центральной проблемой в понимании механизмов адаптивной иммунной системы и аутоиммунитета. Уже неоднократно отмечалось, что Т-клетки имеют врожденную способность реагировать на продукты МНС, включая собственные (см. выше) . Как это ни парадоксально, но это свойство одновременно используется позитивной и негативной селекцией. Клональная делеция высокоаффинных Т-клеток в тимусе (или негативная селекция) является центральным механизмом формирования толерантности к своему. Именно в тимусе индуцируется толерантность к повсеместно экспрессирующимся антигенам и антигенам костномозгового происхождения. Несмотря на то, что до недавнего времени превалировала точка зрения, что тканеспецифическая толерантность обусловлена в большей степени периферическими механизмами послетимусной селекции [Stockinger, В. et al., 1999], такое простое разделение на до- и послетимусную селекцию, видимо, во многом преждевременно. Несколькими группами исследователей показано, что экспрессия ряда тканеспецифических генов может иметь место и в тимусе [Derbinski, J. et al., 2001; Anderson, A. S. et al., 2002]. Установлено, что такая "неразборчивая экспрессия генов" играет прямую роль в установлении Т-клеточной толерантности, так как аллельные или специфические видовые вариации во внутритимусной экспрессии ряда тканевых антигенов коррелируют с чуствительностью к органо-специфичекому аутоиммунитету [Derbinski, J. et al., 2001; Anderson, A. S. et al., 2002]. Существует три основных механизма, с помощью которых предотвращается аутоиммунитет. Во-первых, негативная селекция. Во-вторых, механизм презентации собственных антигенов на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АРС) без экспрессии костимуляторных молекул. Такое распознавание ведет к индукции анергии или апоптоза. В-третьих, элиминация хронически активированных Т-клеток с помощью апоптоза, который вызывается посредством молекул, членов семейства рецепторов TNF. Тем не менее, аутореактивные Т-клетки в ряде случаев избегают индукции толерантности. Среди популяции людей более 5% страдает тем или иным аутоиммунным заболеванием [Wandstrat, A. et al.,

2001]. Каким же образом Т-клетки, которые призваны защищать организм от внешних интервентов, сами начинают разрушать его? Наиболее распространена точка зрения, что аутоиммунные реакции это побочный продукт иммунного ответа на микробную инфекцию [Regner, М. et al., 2001; Benoist, С. and Mathis, D. , 2001]. Механизмы, лежащие в основе этого явления, до сих пор остаются неизвестными [Regner, М. et al., 2001; Benoist, С. and Mathis,

D., 2001] . Однако, во многих случаях корреляция между аутоиммунитетом и микробными заболеваниями не столь очевидна.

Так как селекция Т-клеточного репертуара полностью зависит от МНС, то и структура молекул МНС будет оказывать самое прямое влияние на этот процесс. Пептиды, презентируемые молекулами МНС, являются частью всего комплекса МНС-пептид. Они также могут изменять свойства молекул МНС [Bluestone, J. А. et al. , 1992; Sherman, L. A. et al., 1992; Pullen, J. K. et al., 1994; Hogquist, K. A. et al., 1993; Peterson, M. et al., 1990; Mellins,

E. et al., 1990; Chervonsky, A. V. et al. , 1998; Boniface, J. J. et al., 1996; Runnels, H. A. et al., 1996; Fremont, D. H. et al., 1992; Stura, E. A. et al., 1992]. Это хорошо известно из экспериментов по связыванию моноклональных антител комплексами МНС-пептид как первого, так и второго класса, а также из способности формировать SDS-стабильные компактные комплексы у молекул МНС класса II [Chervonsky, А. V. et al., 1998]. Кроме того, кристаллизация молекул МНС классов I и II с разными пептидами выявила пептидзависимые конформационные изменения [Fremont, D. Н. et al., 1992; Stura, Е. А. et al. , 1992; Stern, L. J. et al., 1994 ; Ghosh, P. et al., 1995; Dessen, A. et al. , 1997 ; Latek, R. R. et al., 2000] . Используя мышиные модели с экспрессией одного комплекса молекула МНС-пептид, недавно было показано, что способность представлять эндогенный вирусный суперантиген зависит от пептидов, которые и определеяют конкретные конформации молекулы МНС класса II (Ab) [Golovkina,Т. et al., 2001].

Хорошо известно, что предрасположенность к аугоиммунитету коррелирует с определенными аллелями МНС. Например, молекулы МНС класса II, ассоциированные с диабетом первого типа у мыши и человека, имеют одинаковую аминокислотную замену (аспарагин на серин) в ß цепи. Установлено, что такая замена ведет к изменению свойств молекул [Carrasco-Marin, Е. et al., 1996]. Они начинают связывать другой пептидный репертуар. В частности, работы по кристаллизации молекулы МНС класса II (Ад7) мышей, спонтанно индуцирующих диабет, показали, что такие молекулы предпочтительно связывают пептиды, у которых остаток Р9 имеет кислотную природу [Latek, R. R. et al., 2000, Corper, A. L. et al., 2000]. В то же время молекулы МНС человека HLA-DR4 (DRA*0101 и DRB1*0401) ассоциированы с высокой частотой случаев ревматоидного артрита. Такие молекулы содержат аминокислоту лизин в положении 71 ß цепи МНС класса II, что ведет к предпочтительному связыванию пептидов с негативно заряженным аминокислотным остатком в позиции Р4 [Dessen, А. et al., 1997; Woulfe, S. L. et al., 1995]. При сравнении кристаллических структур, которые сформированы разными молекулами МНС и различными пептидами [Stern, L. J. et al., 1994; Dessen, A. et al., 1997], оказалось, что комплекс молекулы HLA-DR4 с пептидом из белка коллагена более компактный. Таким образом, репертуар комплексов МНС-пептид, который экспрессируется в тимусе, участвует в формировании Т-клеточного репертуара. При этом селекция на определенных комплексах может приводить к неэффективной делеции или даже к селекции аутоиммунных Т-клеток.

Формулировка гипотезы и постановка Задачи

В связи с тем, что репертуар презентируемых петидов в контексте молекул МНС влияет на позитивную и негативную селекцию, можно предположить, что ограничение репертуара пептидов до одного комплекса МНС-петид приведет к изменению позитивной селекции. Очевидно, что в таких условиях часть репертуара Т-клеток будет утрачена, так как разнообразие лигандов (комплекс МНС-пептид) для ТСИ. ограничено. Кроме того, предпочтение в селекции будет отдано таким Т-клеткам, которые в большей степени зависят от распознавания самой молекулы МНС, нежели пептида, представленного ею.

Однако, кроме вышеописанного изменения в позитивной селекции Т-клеток, ограничение репертуара пептидов приведет к почти полной отмене негативной селекции. Негативная селекция будет работать только в том случае, если конкретный ТСИ будет специфически распознавать единственный комплекс молекула МНС-пептид, в то время, как остальные Т-клетки смогут избежать делеции. Иными словами, возникнут условия для эффективной селекции аутоиммунных Т-клеток с ТСК, довольно неразборчивым в выборе лиганда. В нормальном организме такие Т-клетки тоже будут присутствовать, но из-за фиксированного объема клеточного пула и негативной селекции их процент будет ничтожен, т.к. преимущество при селекции получат Т лимфоциты наиболее эффективно распознающие свои пептиды в контексте своих молекул МНС.

В связи с выше изложенным были высказаны две взаимосвязанных гипотезы, которые предлагалось решить в данной работе:

1. Ограничение репертуара пептидов до одного комплекса МНС-пептид приводит к изменению позитивной селекции и почти полной утрате негативной селекции, что ведет к селекции аутореактивных Т-клеток.

2. Аутореактивные клетки обладают неразборчивым Т-клеточным рецептором.

Таким образом, изучение механизма селекции Т-клеток в условиях ограниченного репертуара пептидов приведет к большему пониманию свойств аутоиммунных Т-клеток и принципов их селекции в тимусе. В связи с этим было предложено взять в качестве модели мышей АьЕр, найти и выделить аутореактивные Т-клетки, клонировать ТСЯ из этих клеток и сделать трансгенную мышь с использованием полученного рецептора. Изучить принципы селекции Т-клеток ТСИ трансгенной мыши и свойства аутореактивных Т-клеток в распознавании антигена. По возможности показать наличие Т-клеток со сходными свойствами у мышей дикого типа.

CD4CD3" CD4+CD8+ Одно

Двойные негативные (DN) Двойные позитивные (DP) Г позитивные (SP)

1 лл

I TCR Н )

Реаранжиоовка ^""Реаранжировка ^Ч^ (

РаннийТ "рцепиТСЯ™* ""ацепиТСа" [TCRh4 клеточный / предшественник Позитивная селекция

Р-селекция 1Т

Негативная селекция

Рис I. Основные этапы развития тимоцитов. [Sebzda et al. 1999]

I & В

CDR2(i

CDR1 (J

V " v. . CDR3c(^. . . ' r'f CDR3P l CDR2(/.

Рис II. Взаимодействие ТС1* с лигандом пептид-МНС. А Поверхность молекулы ТСЯ, взаимодействующая с лигандом. Фиолетовым цветом показаны С0112, желтым - СБ113 и синим - СБЮ районы ГС11. Б Ориентация ТСЯ относительно молекулы МНС. Красным цветом показана а-цепь и синим - р-цепь ТСЛ. Такое диагональное расположение ТСК. относительно лиганда основано на результатах нескольких кристаллографических работ (на рисунке указаны названия исследованных комбинаций молекул МНС/пептид/ТСК). В Топология взаимодействия разных СБЯ-районов ТСЛ с определенными структурами комплекса молекула МНС-пептид. Красным цветом обозначена а-цепь, синим цепь ТСЯ и желтым - пептид. [ОоМгаШ А. & Веуап М. I 1999]

Рис 20. Внешний вид и гистологический анализ кожного покрова мышей, страдающих псориазоподобным дерматитом, в сравнении с контрольными животными. Внешний вид мышей двух независимых линий ММ14.4+Аьо/0П0/0АьЕр+/0, страдающих заболеванием (А, Ж), и контрольных нетрансгенных животных (Г). Окрашивание микротомных срезов кожи мышей (5 щп) фиксированной в фиксаторе Буэна. Окраска -гематоксилин-эозин. Контрольные образцы (Д, Е), образцы заболевших животных (Б, В, 3, И). Рисунки (Б, Д) и (В, Е) представляют собой малое и большое увеличение, соответственно. Увеличение ХЗОО Б и Д, Х600 В, Е, 3 и И.

Рис III. Принцип действия внутритимусной селекции.

Материалы и методы.

Лабораторные животные

В работе использованы мыши следующих инбредных линий: AbEp (Н-2b) , C57BL/б J (H-2b) , C57BL/6J-Н2Ьт3 /ER (H-2bm3), BALB/cJ (H-2d), C3H/HeJ (H-2k) , C57BL/10Sn J (Н-2Ь) , DBA/2 J (H-2d), CBA/CaJ (H-2k), FVB/NJ (H-24) , B6. С - H2bmI 2/KhEg (H-2bm12), B10.D2 (H-2d) , B10.RIII-H2r H2- Г2 8b (7 1N S) /Sn (H-2r), BIO .MBR-H2iqVSxEg (H-2bql), B10.Q (H-2q) , B10.AKM-H2m H2-T18a / SnJ (H-2m) , Bl 0 . M-H2f/nMob (H-2f) , B10.BR-H2k2 H2-T183/SqSnJ (H-2k2) , SJL/J (H-2S), В10.А-Я^5 H2-T18a (5R) /SgSnJ (H-2i5) , ЗТ (Н-2Ъ) , 6T (H-2b) , Вб, 129-RagltmlMom (H-2b) , C57BL/6J-B2mtmlUnc (H-2b) , C57BL/6-IitmJiiz (H-2b) , B6,129-H2-MatmiLuc (н2ь)а C57BL/6J- TcrbtmlMomTcrdtmlMom ( H-2b) , С57BL/6 J-TCRatmlMom (H-2b) , C57BL/10-TgN(TcrAND)53Hed (H-2b). В скобках указан гаплотип комплекса Н~2 линий мышей.

Смешанная культура лимфоцитов (MLR)

В качестве респондеров использовали клетки лимфатических узлов. В качестве стимуляторов использовали предварительно облученные (2000 Rad) спленоциты. В суспензии клеток селезёнки лизировали эритроциты, добавляя к осадку последовательно 360 мкл Н20, 4 0 мкл 10Х PBS (на 1 литр 10х: 2 г KCl, 2 г КН2Р04, 80 г NaCl, 11,45 г Na2HP04) и 5 мл IX PBS. Затем спленоциты осаждали центрифугированием (600 д, 5 мин) и ресуспендировали в полной среде (см. ниже). Клетки респондеров и стимуляторов смешивали в соотношении 3:5 (ЗхЮ5: 5x105/на лунку). Смесь лимфоцитов раскапывали в плоскодонный 96-луночный планшет и инкубировали в полной среде (37°С, 5% С02, абсолютная влажность): Click's (Irvine Scientific, USA), содержащей 5% FCS (Sigma, USA), 20мМ L-глутамина (Life Technologies, USA), 5xl0~5 M 2-меркаптоэтанола (Bio-Rad, USA) и 100 U/мл смеси пеницилина и стрептомицина (Life Technologies, USA) . На третий день культивирования вносили 3Нтимидин () на 8 часов (37°С, 5% С02, абсолютная влажность) . Затем меченные клетки снимали на стекловолоконные фильтры при помощи харвестора.

Для получения Т-клеточных бластов CD8+ (для гибридом) в качестве респондеров использовали клетки лимфатических узлов мышей C57BL/6J или мышей поколения Fi между C57BL/6J (Н-2Ь) и C57BL/6J-TCRatmmoU[ - нокаутов по а-цепи TCR (TCR0/0, H-2b) . В качестве стимуляторов использовали спленоциты мышей C57BL/6J-Н2Ьт3/ER (Н-2Ьт3) , предварительно обработанные митомицином С (2 5 мкг/мл/107 клеток, 30 мин, 37°С) . Клетки респондеров и стимуляторов смешивали в соотношении 1:1. Смесь лимфоцитов в количестве 6х106 на лунку раскапывали в 24 луночный планшет и инкубировали в полной среде: RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 4 ммоль L-глутамина (Flow), 20 ммоль HEPES (Sigma) и 5 х 1СГ5 М 2-меркаптоэтанола (Merk) (37°С, 5% С02, абсолютная влажность). На третий день культивирования собирали Т-клеточные бласты.

Для получения Т-клеточных бластов CD4+ (для гибридом) в качестве респондеров использовали клетки лимфатических узлов мышей поколения Fi между C57BL/6J (Н-2Ь) и C57BL/6J-TCRatmlMon - нокаутов по а-цепи TCR (TCRa0/0, H-2b) или мышей AbEpTCRa+/0. В качестве стимуляторов использовали предварительно облученные (2000 Rad) спленоциты мышей, Вб. С-Н2Ьт1г/KhEq (H-2bm12) и B10BL/10, соответственно.

Бласттрансформация

Для получения бластов использовали клетки лимфатических узлов мышей. Клетки культивировали в 15 мл полной среды, содержащей 5мкг/мл конканавалина А, в течении 4 8 часов в культуральном матрасе, поставленном вертикально (37°С, 5% СОг) . Затем клетки отмывали 3 раза PBS.

Получение Т-клечочных гибридом

В качестве партнера для слияния использовали клетки тимомы (BW5147, BWZ.36.CD8a или BW.CD4 (любезно предоставленные А.В.Червонским, Jackson Laboratory, Main, USA)). Клетки тимомы и Т клеточные бласты (третьего дня культивирования в MLR) смешивали в пропорции 1:1, центрифугировали 5 мин при 600 g и инкубировали 20 мин (37°С, 5% СОг) . После этого удаляли супернатант и добавляли полиэтиленгликоль (PEG-1500) (Boehringer Mannheim, USA) на 70 сек. Затем отмывали 3 раза по 2 мин при 300g средой без сыворотки, после чего добавляли 2 0 мл среды с сывороткой и инкубировали 4 5 мин (37°С, 5% СО2) . Полученные клетки помещали в плоскодонный 9 6-луночный планшет в количестве 1 х 104 клеток/на лунку и инкубировали в полной среде. Через двое суток добавляли селективную среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT, GibcoBRL, USA). Через 1-2 недели тестировали выросшие гибридомы.

Тестирование Т-клеточных гибридом

Ответы гибридом тестировали по продукции IL-2 в ответ на специфические стимуляторы. Клетки гибридом активировали в течение суток стимулирующими клетками в плоскодонном 96 луночном планшете и замораживали. Затем собранный супернатант добавляли к клеткам линии CTLL-2, зависимой от IL-2. Наличие живых клеток CTLL-2 измеряли спектрофотометрически через сутки культивирования в присутствии раствора AlamarBlue (Nalgene, USA), 15 мкл на лунку (11-Х2: 570-600) .

Антисгела

Для анализа клеток на проточном цитофлуориметре (FACScan, FACStar, FACSCalibur, Becton Dickinson, USA) использовали следующие моноклональные антитела: анти-С04 (клон GK1.5), меченные изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) и фикоэритрином (РЕ) и aHTM-CD8 (клон 53-6.7), меченные FITC, РЕ и аллофикоцианином (АРС) и анти~Уос2 (В20.1) меченные FITC и РЕ. Все антитела фирмы PharMingen, USA. Для блокирования межклеточных взаимодействий использовали супернатанты B-клеточных гибридом Y3jP (анти-Аь) , TIB-207 (анти-С04), TIB-105 (анти-СЭ8), 16.3.1 (анти- Kk) , Y3 (анти-Кь) , 10-2-16 (анти-Ак) и 14-4-4 (анти-Ек) . Кроме того, в работе использовали мАТ (полученные в лаб. С. Janeway), полученные из супернатантов гибридом Y3jР (анти-Аь) , TIB-207 (анти-С04), TIB-105 (анти-С08), 145-2С11 (анти-СОЗе).

Окрашивание антителами и анализ на проточном цитофлуориметре

Для определения мышей DM КО и трансгенных мышей АьЕр использовали неконьюгированные мАТ 25-9-17, специфически распознающие комплекс МНС II/CLIP, и мАТ Y-Ae, специфически распознающие комплекс АьЕр, с последующим окрашиванием mAb анти-Fc, конъюгированными с FITC (Sigma, USA) . Окрашивание проводили при 4°С в течение 20-30 мин. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре (Becton Dickinson, Mountain View, CA) с использованием программного обеспечения CellQuest.

Мечение спленоцитов CFSE (5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) (Molecular Probes, USA) проводили при 37°C в течение 10 мин в PBS в концентрации красителя 10 мкМ. Затем отмывали клетки один раз в PBS центрифугированием при 60 0 g 5мин и ресуспендировали в полной среде для культивирования (см. Приготовление клеточных суспензий). После инкубации меченных клеток в течение 4 дней in vitro их окрашивали различными антителами (см. гл. Результаты) и анализировали на проточном цитофлуориметре. CFSE флуоресцирует в зелёной области спектра (FL1). Поэтому для окрашивания клеток, меченных CFSE, использовали антитела, коньютированные с РЕ, который флуоресцирует в красной области спектра (FL2).

Получение хромосомных препаратов для кариотипирования.

Клетки (1х107) инкубировали в полной среде с колцемидом (Sigma, USA) в концентрации 0,02 мкг/мл в течении 1 часа. Затем клетки собирали и центрифугировали 60 0 д. Осадок ресуспендировали в 1 мл 0,56% р-ра KCl (Sigma, USA), после чего добавляли еще 6 мл 0,56% р-ра KCl и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. Обработанные клетки осаждали 300g 1 мин. Перед осаждением добавляли несколько капель метанола и аккуратно перемешивали. К осадку клеток приливали по каплям 6 мл охлажденного фиксатора (3 части метанола:1 часть ледяной уксусной кислоты), при постоянном взбалтывании пробирки с клетками. Суспензию клеток инкубировали при комнатной температуре 5 мин и центрифугировали на низких оборотах 300g 5 мин Процедуру фиксации повторяли три раза, затем осадок клеток ресуспендировали в 0,5-1 мл холодного фиксатора и с расстояния 50 см суспензию раскапывали (по каплям) на предварительно обезжиренные предметные стекла. Высушенные препараты окрашивали 4% раствором Гимза, через 6 мин краситель смывали водой и высушивали препарат.

Типирование мышей методом ПЦР

ДНК для ПЦР выделяли из хвостов по стандартному протоколу (Molecular Cloning, USA). Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью Taq-полимеразы (GIBCO/BRL, USA) в буфере (с МдС12) , прилагаемом фирмой-производителем, в присутствии 2 мМ dNTP и 10 мкМ каждого праймера в следующем режиме (для всех праймеров): денатурация 94 °С - 2 мин; далее следовало 35 циклов: 94 °С - 1 мин, 55 °С - 1 мин, 72°С - 1 мин; и, наконец, последний синтез 72

С - Юмин. Продукты ПЦР анализировали в 0,8% агарозном геле в буфере ТАЕ.

ОТ-ПЦР

Выделение РНК: осадок 5-10 х 106 клеток лизировали 0,75 мл реагента TRIZOL LS (GibcoBRL, USA) 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 0,2 мл хлороформа и хорошо перемешивали, инкубировали 2-15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали (12000д, 15 мин) на центрифуге с охлаждением. После центрифугирования в бесцветную часть раствора, содержащую РНК, добавляли 0,5 мл изопропилового спирта, инкубировали 10 мин при комнатной температуре и осаждали (12000д, 15 мин) на центрифуге с охлаждением. Осадок РНК промывали 70% раствором этанола и растворяли в воде.

Синтез кДНК: 10 мкг РНК ресуспедировали в 15,5 мкл Н20 (обработанной DEPC) , инкубировали при 65 °С 5 мин и затем охлаждали на льду 2 мин. Раствора обратной транскриптазы в количестве 14,5 мкл, который содержал 1 мкл (U/мкл) Superscript RT (Promega, USA), 1 мкл RNase inhibitor (40U/ мкл), б мкл 5х буфера, 3 мкл DTP (100 mM), 1,5 мкл dNPPs (10 mM каждого) и 2 мкл oligo dT (0,5 мг/мл), добавляли в приготовленный раствор РНК и инкубировали 45 мин при 42°С. На ПЦР использовали 2-3 мкл полученного раствора кДНК.

Праймеры, использованные в работе:

Назва ние Структура праймеров Размер Продукта kb

АЬ wt п.(АЬ) 5'- AGCGACGTGGGCGAGCAC-31 о.(INTR0N) 5'-GAGAACGAGGGAAATGACAG-3' 0 . 610

Abu/Ü п.( Ab) 5'-AGCGACGTGGGCGAGCAC-3' 0.600 о.( neo) 5'-AGGTGAGATGACAGGAGATC-3'

Ii wt п. ( Ii) о. ( Ii) 5'-GTGCAGCCGTGGAGCTCTGTA-3' 5'-CAAGGAGCATGTTATCCATG-3' 0.421

Iiu/Ü п.(neo 5 Fl 65 0) '-CGTGCTTTACGGTATCGCCGC-3' 0.503 о. (Ii) 5 ' - CAAGGAGCATGTTATCCATG-3'

Vb п.(Vbl) 5 -CCCAGTCGTTTTATACCTGAATGC-3' Vb2 ) 5 -TCACTGATACGGAGCTGAGGC-3'

Vb3) 5 ' -CCTTGCAGCCTAGAAATTCAGTCC-3'

Vb4) 5 -GCCTCAAGCCTAGAAATTCAGTCC-3'

Vb5.1) 5 ' -GTCCAACAGTTTGATGACTATCAC-3'

Vb5.2) 5 ' -AAGGTGGAGAGACAAAGGATTC-3'

Vb6) 5 ' -CrCTCACTGTGACATCTGCC-3' Vb7 ) 5 ' -TACAGGGTCTCACGGAAGAAGC-3'

Vb8.1) 5 ' -CATTCTGGAGTTGGCTTCCC-3'

Vb8.2) 5 ' -CCTCATTCTGGAGTTGGCTACCC-3'

Vb8.3) 5 ' -ACGCAAGAAGACTTCTTCCTCCTGC-3'

Vb9) 5 ' -TCrCTCTACATTGGCTCTGCAGGC-3'

VblO) 5 ' -ATCAAGTCTGTAGAGCCGGAGGAC-3'

Vbll) 5 ' -GCACTCAACTCTGAAGATCCAGAGC-3'

Vbl2) 5 ' -GAAGATGGTGGGGCTTTCAAGGATC-3'

Vbl3) 5' -AGGCCTAAAGGAACTAACTCCAC-3'

Vbl4) 5 ' -ACGACCAATTCATCCTAAGCAC-3'

Vbl5) 5' -CCCATCAGTCATCCCAACTTATCC-3'

Vbl6) 5 ' -CACTCTGAAAATCCAACCCAC-3'

Vbl8) 5' -CAGCCGGCCAAACCTAACATTCTC-3' o. (Cba) 5 ' -CCAGAAGGTAGCAGACCC-3' 0,400

Cbb) 5 ' -CTrGGGTGGAGTCACATTTCTC-3' 0, 600

Va n.(Val) 5' -GCACTGATGTCCATCTTCTC-3'

Va2) 5' -AAAGGGAGAAAAAGCTCTCC-3'

Va3) 5'-AAGTACTATTCCGGAGACCC-3' (Va4) 5'-CAGTATCCCGGAGAAGGTC-3' (Va5) 5'-CAAGAAAGACAAACGACTCTC-3' (Va6) 5'-ATGGCTTTCCTGGCTATTGCC-3' (Va7) 5'-TCTGTAGTCTTCCAGAAATC-3' (Va8) 5'-CAACAAGAGGACCGAGCACC-3' (Va9) 5'-TAGTGACTGTGGTGGATGTC-3' (ValO) 5'-AACGTCGCAGCTCTTTGCAC-3' (Vail) 5'-CCCTGCACATCAGGGATGCC-3' (Val2) 5'-TCTGTTTATCTCTGCTGACC-3' (Va13.1)5'-ACCTGGAGAGAATCCTAAGC-3' (Va34S-281)5'-TCCTGGTTGACСAAAAAGАС-3' (VaAlO) 5'-TGGTTTGAAGGACAGTGGGC-3' (VaBWB ) 5 ' -CAT'TCGCrCAAATGTGAACAG- 3 ' (VaBMB) 5'-GGAAAATGCAACAGTGGGTC-3' o.(Caa) 5'-TGGCGTTGGTCTCTTTGAAG-3' (Cab) 5'-ACACAGCAGGTTCTGGGTTC-3' п. - прямой, о. - обратный.

Клонирование в ТА вектор.

Для клонирования TCR использовали ТА Cloning Kit (Invitrogen, USA) . Фрагменты ДНК, амплифицированные с помощью ПЦР, без предварительной очистки клонировали в вектор pCR 2.1 по протоколу, предложенному фирмой производителем.

Трансфекция.

Для трансфекции брали 1x10' клеток линии 4G4 и отмывали от сыворотки в lx PBS с 10 mM МдС12. Осадок клеток ресуспендировали в 0, 8 мл 1 х PBS с 10 mM МдС1г- К суспензии клеток добавляли 20 мкл стерильного раствора ДНК (1 мг/мл) в том же буфере, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 9 мин. Смесь переносили в кювету для электропорации (0,4 см) и инкубировали 1 мин на льду. Электропорацию проводили с характеристиками 32Ov/0,4 см 960 (J.F. После электропорации кювету инкубировали на льду 10 мин. Суспензию клеток разбавляли полной средой без сыворотки в соотношении 1:5 и инкубировали 20 мин при комнатной температуре, после чего доводили полной средой с сывороткой до 2 4 мл и разливали по 1 мл в лунку 24-луночного планшета.

Анализ ранних тимусных эмигрантов (RTE).

Раствор FITC в PBS (10 мкг/мл) в объеме 20 мкл вводили внутритимусно мыши по 10 мкл в каждую долю. Через 18 часов животное забивали и выделяли клетки лимфатических узлов, которые окрашивали меченными мАТ и анализировали на проточном цитофлуориметре. В качестве положительного контроля использовали тимус того же животного.

Костномозговые химеры.

Клетки костного мозга получали из бедренных костей мышей. Суспензию клеток обрабатывали мАТ анти-IgM и анти-СОЗе. Затем с помощью магнитных бус (QIAGEN, USA) из суспензии удаляли клетки IgM+ и CD3e+. Таким образом, мы избавлялись от зрелых Т и В клеток. В качестве реципиентов использовали предварительно облученных мышей (900 Rad). Суспензию клеток (4х106 клеток костного мозга) вводили реципиентам внутривенно. Установление химеризма анализировали через 2 месяца по окрашиванию клеток, выделенных из крови реципиентов, мАТ (анти-Уа2) на проточном цитофлуориметре.

Цитотоксический тест (CTL).

Эффекторные клетки CD8+ получали на 4 день стимуляции клеток лимфатических узлов в MLR. В качестве мишеней брали СопА-бласты подробнее см. раздел "Бласттрансформация") , меченные 51Сг. Для этого клетки мишени осаждали и к осадку добавляли 2 МБк/мл Na251Cr04. Клетки инкубировали 1,5 час при 37° С и трижды отмывали средой без сыворотки. Клетки-мишени инкубировали 1 час при 37° С, центрифугировали и переводили в полную среду. Затем клетки разливали (6х104) в круглодонный 9 6 луночный планшет вместе с эффекторными клетками и осаждали 600 g 5 мин. Смесь клеток инкубировали 4 часа при 37° С, в атмосфере с 5% С02. Затем радиоактивность супернатанта анализировали на гамма спектрометре. Цитотоксический индекс определяли по формуле: (b-с/(а-с))х100%, где "а" и "Ь" - выход 51Сг при полном разрушении мишеней 1% додецилсульфатом Na и при добавлении эффекторных лимфоцитов соответственно, "с" - спонтанный выход 51Сг в среду.

Гистология.

Для окрашивания флуоресцентными антителами образцы ткани замораживали в полимере Tissue Тек (Sakura, USA) в парах жидкого азота или в холодном метил-бутане. Полученные блоки хранили при -70° С. Срезы толщиной от 3 до 5 микрон помещали на предметное стекло и фиксировали в охлажденном (-2 0° С) ацетоне 2 мин, после чего высушивали под тягой и окрашивали мАТ во влажной камере при 4° С 20 мин. Избыток антител отмывали 1 х PBS с добавлением 1% FBS. Анализ образцов проводили на флуоресцентном микроскопе (Leitz, Germain).

Результаты

Для доказательства данной гипотезы были выбраны трансгенные мыши АьЕр, клетки которых экспрессируют только один комплекс МНС класса II с пептидом (Аьо/0110/0АьЕр+/0) . Чтобы проанализировать закономерности селекции Т клеток в данных условиях, были получены мыши, трансгенные по ТСР. на соответствующей генетической основе.

Выводы

1. Ограничение репертуара пептидов, презентируемых молекулами МНС до одного МНС-пептидного комплекса приводит к изменению позитивной селекции в тимусе: предпочтение отдается Т клеткам, распознающим в большей степени молекулы МНС, а не специфический пептид.

2. Ограничение репертуара пептидов, презентируемых молекулами МНС до одного МНС-пептидного комплекса приводит к нарушению негативной селекции, что создает предпосылки для возникновения аутоиммунных заболеваний.

3. У мышей, экспрессирующих индивидуальный комплекс молекулы МНС класса II с пептидом, развивается псориазоподобный дерматит, обусловленный активацией аутореактивных периферических Т-клеток CD8+.

4. У мышей с ограниченным репертуаром пептидов обнаружено существование клеток с TCRs, способными распознавать как молекулы МНС класса I так и молекулы МНС класса II. Показано существование таких клеток в репертуаре периферических Т-лимфоцитов нормальных мышей.

5. Корецептор CD4+ может обеспечивать активацию Т-клеток, TCR которых специфичен к молекулам МНС класса I.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко благодарен своему научному руководителю Казанскому Д. Б. - за мудрое руководство, всестороннюю помощь, заботу и поддержку на всех этапах создания этой работы. Я очень признателен Червонскому А. В. за предоставленную возможность выполнить часть диссертации на базе его лаборатории и конструктивную критику данной работы в целом. Я выражаю свою благодарность Christove Viret, который клонировал гены ММ14.4, и Надежде Лугуновой за помощь в работе и предоставленные результаты.

Я также благодарю рецензентов - Палкину Т.Н. и Садовникову Е.Ю. - за обсуждение диссертации.

Заключение.

Главной задачей данной работы было изучение принципов селекции аутоиммунных Т-клеток, исходя из предсказанных особенных свойств аутореактивных TCRs (См. 4 Лит. Обзор"). В начале исследования предполагалось, что аутореактивные Т-клетки могут обладать довольно неразборчивым рецептором, что помогает им успешно проходить позитивную и негативную селекцию. Для этой цели использовали трансгенную модель - мышей АьЕр с рестриктированным репертуаром пептидов, презентируемых в контексте молекул МНС. Из Т-клеток CD4+ мышей АьЕр была получена Т-гибридома экспрессирующая TCR, аутореактивный к молекулам МНС класа II дикого типа. Гены TCR были клонированы и секвенированы, после чего переклонированы в специальные кассетные векторы, что позволило создать TCR-трансгенных мышей. Было установлено, что у таких мышей Т-клетки экспрессируют исследуемый TCR. Как и предполагалось, у мышей с трансгенным TCR на генетической основе АьЕр селекция Т-клеток CD4+ происходит успешно. Однако довольно неожиданно было обнаружено, что Т-клетки CD8+ с трансгенным TCR тоже присутствуют на периферии и в большом количестве (См. "'Результаты"). Изучая принципы селекции столь необычного рецептора, мы установили, что позитивная селекция клеток CD4+ зависит от наличия молекул МНС класса II, в то время как позитивная селекция клеток CD8+ зависит от МНС класса I. Присутствующие на периферии Т-клетки CD4+ и CD8+ являются функциональными. Кроме того, было установлено, что позитивная селекция клеток CD4+ не зависит от конкретного пептида т.к. позитивную селекцию трансгенных Т клеток CD4+ наблюдали на периферии у мышей и с другим гаплотипом МНС. Таким образом, мы подтвердили, что аутоиммуный рецептор действительно неразборчив в выборе лиганда при позитивной селекции, и в большей степени распознает саму молекулу МНС нежели связанный с нею пептид.

Изучение условий негативной селекции Т-клеток, экспрессирующих такой рецептор, показало, что в условия сужения репертуара презентируемых пептидов до одного происходит почти полная отмена негативной селекции, что приводит к появлению на периферии большого количества аутореактивных Т-клеток.

Изучая специфичность и рестрикцию трансгенного рецептора на трансфектантах линии 4G4, было обнаружено необычное свойство корецептора CD4. Оказалось, что трансфектанты с корецептором CD4 могут распознавать молекулу МНС класса I, а без нее - нет. Кроме того, это распознавание было ресгриктировано наличием корецептора CD4 на отвечающих клетках и экспрессией молекулы МНС класса II на стимуляторах. Обнаружить такие свойства корецептора CD4 (помощь в распознавании молекул МНС класса I) стало возможным только при использовании данного TCR, который настолько неразборчив, что способен распознавать МНС разных классов.

Вторая часть работы посвящена анализу аутоиммуных заболеваний у мышей, трансгенных по TCR. Было установлено, что трансгенные Т-клетки CD8+ вызывают псориазоподобнай дерматит. Данное заболевание рестриктировано молекулами МНС класса I и гистологически напоминает псориаз у человека. Кроме того, у полученных мышей наблюдали развитие лимфопролиферативных заболеваний двух типов: у мышей на больших сроках жизни часто возникали тимомы, у других мышей наблюдалась спленомегалия, обусловленная бесконтрольной пролиферацией В клеток. Однако причины пролиферации Т- и В-клеток остаются неизвестными. Эти результаты подтверждают, что тимусная селекция нарушается при ограничении репертуара пептидов, представляемых молекулами МНС. В третьей части работы мы определили частоту выявления Т-клеток, обладающих рецепторами со сходными свойствами, на периферии у мышей АьЕр. Как и ожидалось, такие Т-клетки были найдены (меньше 3%). Это свидетельствует о том, что исследуемый нами рецептор не уникален - подобные рецепторы регулярно образуются у мышей с ограниченным репертуаром пептидов.

В четвертой части работы мы предприняли попытку найти Т-клетки с неразборчивыми рецепторами у мышей дикого типа в пуле клеток CD4+ и CD8+. Такие Т-клетки были получены и рецепторы клеток CD4+ отклонированы и секвенированы. В популяции клеток CD84" найдены лимфоциты с аутореактивными TCR, распознающие сингенные молекулы МНС класса IT .

Таким образом в данной работе показан возможный принцип внутритимусной селекции аутоиммунных Т-клеток и их миграции на периферию.