Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Апоптоз мононуклеаров периферической крови у больных сахарным диабетом 1-го типа

На правах рукописи

ЛУГОВАЯ

Анна Владимировна

АПОПТОЗ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в ГОУ ДПО Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Минздрава России и Всероссийском центре экстренной и радиационной медицины МЧС России, Санкт-Петербург

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Козлов Антон Владимирович

доктор медицинских наук профессор Калинина Наталия Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доцент Антонов Виктор Георгиевич

доктор медицинских наук ведущий научный сотрудник Глазанова Татьяна Валентиновна

Ведущая организация - Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова

Защита диссертации состоится « о » июня 2004 г. в/о часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (194175, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова

9-

Автореферат разослан « ' » мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Пастушенков Владимир Леонидович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сахарный диабет 1 типа (СД-1) является органоспецифическим аутоиммунным заболеванием, которое развивается в результате селективного разрушения Р-клеток поджелудочной железы цитотоксическими лимфоцитами, Т-хелперами 1 типа и аутсантителами [Хаитов P.M., 2000; Фрейдлин И.С., Тотолян А.А., 2001]. В результате постепенной деструкции р-клеток наступает инсулиновая недостаточность, приводящая к расстройству гомеостаза глюкозы и возникновению СД-1. Клинически классические симптомы СД-1 -гипергликемия и кетоз, проявляются только при разрушении 80-90% островков Лангерганса [Балаболкин М.И., 2000; Зак К.П. и соавт., 2002].

Несмотря на активное изучение иммуно патогенеза СД-1 многие ключевые моменты в развитии и прогрессировании данного заболевания остаются не ясными. По-прежнему актуальными являются проблемы ранней диагностики СД-1, обеспечения стабильного течения заболевания и борьбы с его вторичными осложнениями [Карпищенко А.И., 2001; Зилов А.А., 2002]. В связи с тенденцией к «омоложению» возраста больных СД-1, приводящей к ранней инвалидизации, увеличению частоты заболеваемости, особую актуальность приобретают уточнение механизмов иммунопатогенеза и разработка новых методов своевременной диагностики СД-1.

В последнее время внимание многих исследователей привлечено к роли апоптоза в гибели р-клеток при развитии СД-1. В патогенезе СД-1 с апоптозом связаны 2 основных механизма: 1) нарушение процессов апоптоза в тимусе, приводящее к неэффективной селекции аутореактивных Т-лимфоцитов, накоплению их в циркуляции, и, как следствие, к утрате толерантности к клеткам поджелудочной железы; 2) роль апоптоза как завершающего механизма иммунообусловленной деструкции Р-клеток [Зак К.П. и соавт., 2002; Один В.И., 2003; Mauricio D., Mandrup-Poulsen Т., 1998].

Ключевым моментом в инициации СД-1 является резистентность аутореактивных Т-лимфоцитов к апоптозу [Мохорт Т.В. и соавт., 2000]. Ускользание аутореактивных клеток от иммунологического надзора приводит к активной деструкции р-клеток и последующей манифестации заболевания [Mauricio D., Mandrup-Poulsen Т., 1998]. Установлено, что у мышей линии NOD (nonobese diabetic), являющихся моделью спонтанного аутоиммунного диабета, близкого к СД-1 человека, CD4+- и СD8+-лимфоциты при блокировании влияния на них ИЛ-2 проявляют повышенную устойчивость к апоптозу. При этом Т-хелперы оказываются более резистентны к апоптозу, чем СD8+-клетки, что нарушает нормальный баланс хелперы/цитотоксические Т-лимфоциты и способствует поддержанию аутоиммунной агрессии. Резистентность Т-лимфошггов NOD-мышей к апоптозу объясняется повышенной экспрессией Т-. клетками ингибитора апоптоза белка В П ^ I al.,

1998] РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА С-Птрб; OS К»'

да

Аутореактивные лимфоциты, устойчивые к апоптозу, мигрируют из кровяного русла в орган-мишень - поджелудочную железу и образуют воспалительные инфильтраты - инсулиты [Зак К.П. и соавт., 2002; Eizirik D.L. et al., 2001]. Иммунокомпетентные клетки, инфильтрирующие островковую ткань, продуцируют провоспалительньзе цитокины (ФНОа, ИЛ-lfï, ИФНу), оксид азота, цитотоксические ферменты (перфорин и гранзим В), избыточное количество свободных радикалов и другие соединения, вызывающие гибель Р-клеток по механизму апоптоза [Колесник Ю.М., Орловский M А, 2004; Yoon J.W. et al., 1998]. ИЛ- ip самостоятельно или в комбинации с ИФНу и ФНОа

усиливает экспрессию Fas-рецептора на Р-клетках, что приводит к их апоптозу в результате взаимодействия с аутореактивными лимфоцитами, экспрессирующими Fas-лиганд [Колесник Ю.М., Орловский М.А., 2004; Benoist С. et al., 1997]. В настоящее время Fas-опосредованный апоптоз рассматривается как ведущий механизм деструкции Р-клеток [Chemovsky A.V. et al., 1997; Kreuwel Ы.Т. et al., 2001; Nakayama M. et al., 2002].

В патогенезе СД-1 важное значение имеют, нарушения Fas-опосредованного апоптоза лимфоцитов, играющего главную роль в поддержании периферической аутотолерантности [Lejon К. et al., 1996; Kim S. et al., 2000, 2002]. В то же время большинство результатов по изучению Fas-опосредованного апоптоза при СД-1 получено в экспериментах in vitro с использованием изолированных островков поджелудочной железы человека и NOD-мышей. Не вызывает сомнений тот факт, что аутоиммунные изменения in vivo носят более глубокий характер, и экстраполяция эффектов, выявленных в системе in vitro, на организм не всегда правомочна. Установлено, что особенности индукции и регуляции апоптоза у экспериментальных животных существенно отличаются при СД-1 у людей [Horens A., Pipcleers D., 1999]. В связи с этим представляется актуальным изучение особенностей Fas-опосредованного апоптоза лимфоцитов у больных СД-1 и лиц с высоким риском развития аутоиммунного диабета, а также уточнение механизмов развития апоптоза мононуклеаров периферической крови в зависимости от состояния компенсации углеводного обмена и длительности течения СД-1.

ТТель исследования- охарактеризовать особенности процессов апоптоза мононуклеаров периферической крови больных СД-1 в зависимости от фазы компенсации и длительности течения заболевания, а также у лиц с высоким риском развития СД-1, и сопоставить полученные результаты с состоянием jî-клеток по уровню С-пептида в крови.

1. Оценить функциональное состояние р-клеток по уровню С-пептида в сыворотке периферической крови больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1.

2. Определить титр антител к островкам поджелудочной железы (1СА) у больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1 для оценки активности процесса деструкции Р-клеток.

3. Охарактеризовать готовность к апоптозу Т-лимфоцитов больных СД-1 и лиц группы риска путём определения количества CD3+CD95 + -, CD4+CD95 + -и СD8+СD95+-лимфоцитов.

4. Провести количественное определение растворимых форм Fas-рецептора и Fas-лиганда и исследовать корреляционные связи между этими показателями и количеством СD95+-клеток с целью оценки эффективности Fas-опосредованного апо птоза лимфоцитов больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1.

5. Определить чувствительность мононуклеаров периферической крови больных СД-1 к активационному апоптозу в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином и инсулином методом проточной ДНК-цитометрии через 144 часа культивирования и сопоставить с уровнем глюкозы и С-пептида.

6. Изучить пролиферативную активность лимфоцитов больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1 в ответ на стимуляцию митогенами и антигеном (инсулином).

7. Выявить зависимость между показателями апоптоза и пролиферации Т-лимфоцитов у больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных СД-1 выраженность спонтанного и активационного апоптоза мононуклеаров периферической крови находится в прямой зависимости от содержания глюкозы в крови и в обратной - от содержания С-пептида.

2. У больных СД-1 выявлена повышенная чувствительность мононуклеаров к активационному апоптозу в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином, более выраженная в фазе декомпенсации заболевания.

3. В периферической крови больных СД-1 отмечается увеличение количества аутореактивных СD95+-клеток и Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, более значимое при декомпенсации заболевания.

4. У больных в фазе декомпенсации СД-1 и у лиц с высоким риском развития СД-1 происходит ингибирование Fas-опосредованного апоптоза аутореактивных лимфоцитов за счёт растворимой формы Fas-рецептора. В фазе компенсации СД-1 Fas-опосредованный апоптоз аутореактивных СЕ)95+-клеток реализуется с помощью растворимой формы Fas-лиганда и СD16+-клеток, экспрессирующих мембранный Fas-лиганд.

Научная новизна

Выявлены особенности Fas-опосредованного апоптоза мононуклеаров периферической крови у больных СД-1 в разных фазах компенсации заболевания и у лиц с высоким риском развития СД-1.

Установлена выраженная корреляционная связь между содержанием сывороточного Fas-лиганда и высоким титром аутоантител к островковым клеткам поджелудочной железы, уровнем С-пептида и глюкозы крови у лиц с высоким риском развития СД-1.

Установлено, что уровень спонтанного и индуцированного апоптоза мононуклеаров больных СД-1 коррелирует с декомпенсацией заболевания и содержанием С-пептида крови.

Выявлена повышенная чувствительность мононуклеаров больных СД-1 к активационному апоптозу в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином. Более выраженная чувствительность клеток к индукции апоптоза при декомпенсации заболевания объясняется влиянием гипергликемии, являющейся дополнительным индуктором активационного апоптоза.

Установлена прямая корреляционная связь между интенсивностью пролиферативного ответа лимфоцитов на инсулин и повышенным титром аутоантител к островковым клеткам поджелудочной железы, уровнем С-пептида крови у лиц с высоким риском развития СД-1.

Практическая значимость

Определение сывороточного Баз-лиганда может быть использовано для прогноза развития СД-1 у пациентов с нарушением толерантности к глюкозе.

Реакцию бластной трансформации лимфоцитов с инсулином можно рассматривать в качестве дополнительного критерия оценки риска развития СД-1 у лиц первой степени родства больных диабетом 1 типа.

Определение индуцированного апоптоза в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином и инсулином позволяет оценить фазу компенсации заболевания и контролировать эффективность проводимой терапии у больных СД-1.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования были доложены и обсуждены на Межгородской научной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2002, 2003), II Всероссийской конференции по нейроиммунопатологии (Москва, 2002), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2002), научных конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2002,2003).

Реализация результатов исследования. Результаты работы внедрены в учебный процесс на цикле «Клиническая лабораторная диагностика», «Гематологические и общеклинические методы исследований» на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ ДПО Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Минздрава России, используются в работе научно-исследовательской лаборатории клеточного и гуморального иммунитета Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины МЧС России, Санкт-Петербург.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 14 рисунками. Список литературы содержит 268 источников, из которых 103 отечественных и 165 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Характеристика обследованных групп больных

Было обследовано 63 больных (32 мужчины и 31 женщина) с достоверно установленным диагнозом СД-1 в возрасте от 17 до 60 лет и 15 человек с высоким риском развития данного заболевания. Средний возраст больных сахарным диабетом составил 33,6±4,8 года. Диагноз СД-1 основывался на результатах клинического обследования и подтверждался данными лабораторных исследований. Распределение больных по группам было осуществлено в зависимости от фазы компенсации заболевания.

В качестве контрольной группы (I группа) были обследованы 30 здоровых лиц, по полу и возрасту сравнимых с больными СД-1.

II группу составили 36 больных (21 мужчина и 15 женщин) в состоянии декомпенсации СД-1. В зависимости от длительности заболевания данная группа была разделена на две подгруппы. В подгруппу На вошли 17 больных (10 мужчин и 7 женщин) с впервые выявленным СД-1 в возрасте от 17 до 29 лет (в среднем 22,8±3,9 года) с острым дебютом заболевания. На момент постановки диагноза СД-1 уровень глюкозы в крови у пациентов Па подгруппы составил в среднем 16,3±2,2 ммоль/л, у всех больных был выявлен кетоацидоз. Симптомы СД-1 у этих больных развивались остро, в течение короткого периода времени - до 1 месяца, длительность заболевания составила в среднем 0,8±0,1 месяца. Все пациенты Па подгруппы были обследованы не позднее 2 дней после подтверждения диагноза СД-1 и находились в состоянии декомпенсации заболевания. Подгруппу 11б составили 19 больных (11 мужчин и 8 женщин) с длительностью СД-1 от 1 года до 30 лет (в среднем 15,3±5,1 года), у которых на момент исследования определялась гипергликемия (в среднем 17,1 ±1,5 ммоль/л) и глюкозурия. У 12 из 19 больных был выявлен кетоацидоз. В данную подгруппу вошли пациенты в возрасте от 17 до 60 лет (средний возраст 44,6±5,4 года).

III группу составили 27 больных (11 мужчин и 16 женщин) в состоянии компенсации СД-1, у которых на момент исследования определялась нормогликемия (в среднем 5,2±1,9 ммоль/л), аглюкозурия и нормальные показатели HbAic (в среднем 6,4±1,2% при норме 4,5-7,0%), который является интегральным показателем уровня гликемии за последние 60-90 дней. В зависимости от длительности заболевания данная группа была разделена на две подгруппы. В подгруппу Ша вошли 13 больных (5 мужчин и 8 женщин) с длительностью заболевания до 1 года (в среднем 0,6±0,2 года) в возрасте от 17 до 32 лет (средний возраст 24,1 ±4,2 года). Подгруппу Шб составили 14 больных (6 мужчин и 8 женщин) с длительностью заболевания от 1 года до 30 лет (в среднем 15,1±5,4 года) в возрасте от 17 до 60 лет (средний возраст 42,9±4,5 года).

IV группу составили лица с повышенным риском развития СД-1. В неё были включены 15 человек (6 мужчин и 9 женщин) в возрасте от 17 до 29 лет (в среднем 22,1±3,6 года), являющиеся лицами первой степени родства больных СД-1. У всех пациентов IV группы было зарегистрировано повышение титрз

аутоантител к цитоплазматическим антигенам островковых клеток - ICA (Islet Cell Autoantibodies) в сыворотке (>1/20) и нарушение толерантности к глюкозе в анамнезе. На момент исследования у лиц данной группы определялась нормогликемия (в среднем 4,9±1,8 ммоль/л) и нормальные показатели НЬА|( (в среднем 5,8± 1,4% при норме 4,5-7,0%).

2. Методы исследований

Объектом изучения явились периферическая кровь и моча пациентов.

Для количественного определения глюкозы в крови глюкозооксидазным методом использовали реактивы фирмы «Эко-Сервис» (Россия). Применяли фотометрический метод с использованием реакции Триндера. Фотометрию проводили при длине волны 500 нм с использованием полуавтоматического анализатора ФП-901 фирмы «Labsystems» (Финляндия).

Определение гликозилированного гемоглобина проводили с помощью набора реактивов фирмы «Human» (Германия). Применяли метод мини-колоночной ионообменной хроматографии. Искомое содержание НЬА^ рассчитывали в процентах от содержания общего гемоглобина.

Выявление кетоновых тел в моче проводили полуколичественным методом с помощью диагностических полосок фирмы «Биоскан» (Россия).

Фенотипирование мононуклеаров периферической крови осуществляли с применением проточной цитометрии с использованием следующих моноклональных антител производства «Immunotech» (Coulter Corporation, USA): anti-CD3, конъюгированные с FITC (флюоресцеинизотиоционат) (mouse IgGl isotype), anti-CD4-FITC (mouse IgGl), anti-CD8-FITC (mouse IgGl), anti-CD16-FITC (mouse IgGl), anti-CD20-FITC (mouse IgGl), anti-CD25-FITC (mouse IgGl), anti-HLA-DR-FITC (mouse IgGl), anti-CD95-FITC (mouse IgGl) и их изотопических контролей.

Для определения количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, использовали двойную флуоресцентную метку - FITC и РЕ (фикоэритрин). Исследование проводили с применением следующих сочетаний антител: anti-CD3-FITC/anti-CD95-PE, anti-CD4-FITC/anti-CD95-PE, anti-CD8-FITC/anti-CD95-PE и их изотипических контролей (mouse IgGl, конъюгированный с FITC, и mouse IgGl, конъюгированный с РЕ). Для каждой пробы использовали выделенные мононуклеары периферической крови в концентрации 2хЮ6 клеток/мл. Цитометрический анализ лимфоцитов проводили на проточном цитофлуориметре EPICS XL (Coulter Corporation, USA). Накопление производили до 5000 событий в лимфоцитарной или моноцитарной области, которые определяли с использованием антител anti-CD45-FITC/anti-CD14-PE (Coulter Corporation, USA). Данные анализировали с помощью программы Coulter System II.

Оценку пролиферативной активности лимфоцитов цельной крови после стимуляции митогенами (в 3 суточной культуре) и антигеном (в 7 суточной культуре) проводили методом ДНК-цитометрии (Manual of Flow Cytometry, 1999). В качестве митогенов использовали фитогемагглютинин (ФГА) и

митоген лаконоса, в качестве антигена был использован человеческий рекомбинантный инсулин. Цитометрический анализ ДНК-проб проводили с использованием FL3 фильтра в ДНК - протоколе программы Coulter System II. Для анализа полученных результатов была привлечена программа MultiCycle AV ver. 3 (Beckrnan-Coulter). Уровень пролиферативной активности (индекс пролиферации) вычисляли как сумму клеточных ядер в синтетической, постсинтетической фазах и и митозе. Бласттрансформацию лимфоцитов в отсутствии митогена оценивали как спонтанную. Индексы стимуляции рассчитывали как отношения показателей митоген - или антиген — стимулированной бласттрансформации лимфоцитов к спонтанной [Фримель Г., 1987].

Активационный апоптоз мононуклеаров периферической крови в ответ на стимуляцию митогеном и антигеном оценивали методом проточной ДНК-цитометрии. Для активации мононуклегров использовали ФГА в конечной концентрации 10 мкг/мл и инсулин в трёх различных концентрациях: 1,75 мкг/мл, 3,5 мкг/мл и 7,0 мкг/мл. Для контроля использовали неактнвированные клетки. Определяли процент клеток, содержащихся в гиподиплоидной зоне гистограммы (она выявляется з виде фракции, расположенной левее основного пика, соответствующего диплоидным клеткам), в которой сосредоточиваются клетки, подвергшиеся алоптозу [МсС^кеу T.W. et аЬ, 1994]. Анализ ДНК-гистограмм проводили в программе Multigraph (Beckman-Coulter), с помощью которой осуществляли подсчёт процента гиподиплоидных клеток.

Определение растворимых форм Fas-рецептора (sFas) и Fas-лиганда (sFasL) в сыворотке крови проводили методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем «Human sFas Ligand ELISA» фирмы Bender McdSystems (Австрия) и «Human Fas ELISA» фирмы BD Biosciences (США). Количественную оценку результатов выполняли методом автоматического построения калибровочной кривой, отражающей зависимость оптической плотности от концентраций стандартов.

Определение С-пептида в сыворотке крови проводили методом одноэтапного «сэндвич» - ИФА с использованием тест-системы, производимой фирмой Diagnostic System Laboratories (США). Количественную оценку результатов выполняли методом автоматического построения калибровочной кривой.

Полуколичественное определение аутоантител к клеткам островков Лангерганса (ICA) проводили по методу Н.Л. Вартанян [Вартанян Н.Л. и соавт., 2000]. В его основу положено выявление 1СА на криосрезах человеческой поджелудочной железы методом непрямой иммунофлуоресценции. Из аутопсийного материала поджелудочной железы готовили криостатные срезы ткани толщиной 4-5 мкм, которые инкубировали с сывороткой больных, содержащей ICA, а затем — с FITC-конъюгированными антителами, специфичными к Fc-фрагменту IgG человека. FITC-меченные антитела фиксируются на аутоантителах к островковым клеткам, образуя иммунные комплексы. Флуоресцентная метка даёт при люминесцентной микроскопии ярко-зеленое свечение, соответствующее

локализации образовавшихся в островках иммунных комплексов. Оценку результатов производили по специфическому свечению фиксированных в р-клетках иммунных комплексов с помощью люминесцентного микроскопа (ЛЮМАМ-РП011) при увеличении х 200.

Для статистической обработки полученных данных использовали непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни для сравнения средних, корреляционный анализ по Спирману [Гельман В.Я., 2002]. Обработка материала выполнялась на ПЭВМ с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v.5.0). Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии значимых различий) принимали равным 0,05.

3. Результаты работы и их обсуждение

3.1. Содержание С-пептида в крови больных СД-1

Результаты определения содержания С-пептида в сыворотке крови больных СД-1 и лиц группы риска представлены в табл. 3.1.

Как следует из представленных в таблице данных, во всех группах обследуемых пациентов уровень С-пептида был снижен по сравнению с контрольной группой (I группа).

Таблица 3.1.

Содержание С-пептида в крови больных СД-1 и лиц группы риска

С*пепгид Частота выявления

Группы (нг/мл) С-пслтнда (*/•)

1 труппа 2.0 100

Its группа 0.24** 100

Мб группе 0.05"* 15.9

lili группа 0,49** 100

П1б групп« 0.0*"* 28.6

IV групп! I.I 100

** - р<0,01, *** - р<0,001 - достоверные отличия по сравнению с контрольной группой

В группе лиц с повышенным риском развития СД-1 (IV группа) наблюдалась выраженная тенденция к снижению концентрации С-пептида в сыворотке крови, что свидетельствовало о нарушении функционального состояния -клеток поджелудочной железы.

Достоверное снижение уровня С-пептида по сравнению с контрольной группой (р<0,01) наблюдалось уже на ранних сроках заболевания (группы На и IIIa). При длительности СД-1 более 15 лет (группы Пб и Шб) содержание С-пептида в сыворотке периферической крови приближалось к нулю. Частота выявления изучаемого показателя в группах Нб и Шб составила 15,9% (3 человека из 19) и 28,6% (4 человека из 14), соответственно. Полученные результаты согласуются с данными, опубликованными исследовательской группой по изучению СД-1 и его осложнении [The Diabetes Control and

Copmplications Trial Research Group, 1998], в которых показано, что даже при длительно текущем СД-1 у некоторых больных остаточная функция {$■-клеток может частично сохраняться.

При сопоставлении концентрации С-пептида в группах больных в разных фазах компенсации с одинаковой продолжительностью заболевания (11а и 111а, 116 и III6) более высокие значения были отмечены при компенсации СД-1 на ранних сроках заболевания.

Результаты проведённого исследования подтверждают имеющиеся в литературе данные о том, что содержание С-пептида и частота его выявления зависят как от длительности течения СД-1, так и от состояния компенсации углеводного обмена [Балоболкин М.И., 2000; Зак К.П. и соавт., 2002].

3.2. Аутоантитела к клеткам островков Лангерганса в сыворотке крови больных СД-1

Данные по определению аутоантител к цитоплазматическим антигенам островковых клеток (ICA) представлены в табл. 3.2.

Таблица 3.2

_Титр 1СА в сыворотке больных СД-1 и лиц группы риска_

Группы обследоинных Число обследованных Уровень К,'А (шф)» Частота ■мппенмя 1СЛ (%}

I группа 30 <1« 0

1U группа 17 то aiAo-тщ 76,5

Шгрупп» 19 1/30 (1/30-1/40) 10.S

Illa группа 13 I/1S ПЛО-1ЛО) 76,»

1116 группа H I/IS (1/10-1/20) 14.9

IV групп» и 1/60 (1/40.1/1ЯО) 100

Примечание: • - указан средний титр, в скобках - диапазон колебаний титра

Как следует, из приведённых в таблице данных, в группе контроля (I группа) ICA не были обнаружены.

Выявляемость аутоантител в группах На и Пб составляла 76,5% и 10,5% соответственно, в группах Ша и Шб - 76,9% и 14,9% - соответственно, в группе IV - 100%. Полученные результаты согласуются с данными литературы о наличии корреляции между частотой выявления ICA и продолжительностью заболевания [Балаболкин М.И., 2000; Севергина Э.С., 2002; Botazzo G.F. et al., 1971]. Показано, что ICA определяются у 60-85% больных с впервые выявленным СД-1 [Вартанян Н.Л. и соавт., 2000], у 20-30% больных с длительностью СД-1 более 3 лет и у 5-10% пациентов через 15-20 лет от начала заболевания [Балаболкин М.И., 2000].

Титр ICA в сыворотке крови больных СД-1 изменялся в зависимости от состояния компенсации и длительности заболевания. При сопоставлении уровня 1СА в группах больных с одинаковой продолжительностью заболевания (Па и Ша, Пб и Шб) было отмечено его повышение при декомпенсации СД-1,

более выраженное на ранних сроках заболевания (На группа). С увеличением длительности СД-1 наблюдалось снижение титра 1СА более чем в 2 раза независимо от состояния компенсации заболевания. Максимальное повышение титра ICA наблюдалось у больных с впервые выявленным СД-1 (Па группа) и у лиц с высоким риском развития сахарного диабета (IV группа).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у больных СД-1 частота выявления ICA чётко ассоциирована с продолжительностью заболевания, а титр - с продолжительностью и остротой процесса.

3.3. Экспрессия pas-рецептора лимфоцитами периферической крови больных СД-1

Результаты определения количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, и содержания СБ95+-клеток в периферической крови больных СД-1 и лиц с высоким риском развития данного заболевания представлены в табл. 3.3.

Таблица 3.3.

Содержание С095+-клеток и Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, в периферической крови больных СД-1 и лиц группы риска

Группы Ct»J+ CD3*CE№H | CD4*CWS* | CD8+CD9J+

относительное содержание. % абсолютом содержание. мы1 относительное содержа»*, %

1 4.2 И зл 2.3 0.9

11а 11,«" 260** 10.»** . №* 6,0"*

1№ 1ЭД" 221** 11.1" М"

111а «А* III* U* Î.I* 3,4"

Il IS и* 1«* 6,9*

IV 4.« ТО 3.Î ЭЛ 1.1*

*- р<0,05, **- р<0,01, ***- р<0,001 - достоверные отличия по сравнению с контрольной группой.

Как следует из представленных в табл. 3.3. данных, у больных СД-1 было выявлено значительное повышение относительного и абсолютного количества лимфоцитов с маркером апоптоза СБ95, наиболее выраженное в группе больных с декомпенсацией и длительностью заболевания более 15 лет (11б группа). Особый интерес вызывает неравномерность увеличения числа клеток, несущих Бав-рецептор, среди субпопуляций Т-лимфоцитов. Так, у больных в группе Иб количество СБ3+СБ95+-клеток увеличивалось в 3,7 раза по сравнению с контрольной группой (I группа), количество СБ4+СБ95+-лимфоцитов - в 3,5 раза, в то время как число СБ8+СБ95+ клеток возрастало в 7,4 раза (табл. 3.3.). Увеличение количества клеток СБ3+СБ95+ только в 3,7 раза позволяет высказать предположение о наличии в популяции зрелых Т-лимфоцитов, экспрессирующих Бав-рецептор, клеток СБ4+СБ8+ (около 4%), которые, согласно данным литературы, являются аутоагрессивными клонами и подтверждают аутоиммунный характер заболевания [Кетлинский С. А., Калинина Н.М., 1998].

Во всех обследуемых группах отмечалось увеличение процента CD8+CD95+ клеток от общего количества цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с контрольной группой, более выраженное при декомпенсации заболевания (рис.1). Увеличение количества СD8+-лимфоцитов, несущих рецептор CD95, является компенсаторным механизмом, направленным на элиминацию аутореактивных цитотоксических Т- лимфоцитов [Bach J-F., 1998; Roep О. et al., 2002], принимающих активное участие в деструкции (J-клеток поджелудочной железы [Kukreja A. et al., 1999; Su X. et al., 2000].

Полученные нами данные об увеличении количества СD95+-клеток у больных СД-1 согласуются с результатами исследований ряда других авторов [Глазанова Т.В., 2002; Мазуров В.И. и соавт., 2002; Tchorzewski H. et. al., 2001] и свидетельствуют о повышенной готовности иммунокомпетентных клеток к апоптозу [Мазуров В.И. и соавт., 2002].

Группы

ШШШШ

*- р<0,05, **- р<0, 01, ***- р<0,001 - достоверные отличия по сравнению с контрольной группой

Рис.1. Процент CD8+CD95+клеток от общего числа цитотоксических Т-лимфоцитов.

Максимальное увеличение относительного и абсолютного содержания СВ95+-клеток и количества Т-лимфоцитов, экспрессируюoих Fas-рецептор, было выявлено при декомпенсации СД-1 независимо от продолжительности заболевания (Па и Пб группы). У больных в фазе компенсации СД-1 (Ша и Шб группы) также было отмечено достоверное повышение количества CD95+-клеток и Т-лимфоцитов с рецептором CD95 по сравнению с контрольной группой (р<0,05), но менее выраженное, чем в фазе декомпенсации заболевания (р<0,01). Полученные данные указывают на то, что при СД-1 повышение готовности иммунокомпетентных клеток к апоптозу не зависит от

длительности течения заболевания, а чётко ассоциировано с обострением процесса, уровнем гликемии.

В группе лиц с высоким риском развития СД-1 было отмечено достоверное повышение количества СБ8+СБ95+-клеток по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Таким образом, уже в латентной стадии СД-1 наблюдалось увеличение количестза аутореактивных цитотоксических Т-лимфоцитов в периферической крови, что, согласно данным литературы, свидетельствует о прогрессировании аутоиммунного процесса и является неблагоприятным прогностическим фактором [Cheng J. et al., 1999; NicoJetti F. etal.,2001].

3 4. Продукция растворимой формы Fas-рецептора и Fas-лиганда иммунокомпетентными клетками больных СД-1

Содержание растворимой формы Fas-рецептора (sFas) и Fas-лиганда (sFasL) в сыворотке крови больных СД-1 не зависело от длительности течения заболевания, а изменялось в зависимости от фазы компенсации сахарного диабета. Полученные данные представлены в табл. 3.4.

Таблица 3.4.

Содержание растворимой формы Fas-рецептора и Fas-лиганда

в сыворотке крови больных СД-1 и лиц группы риска

Показатель Контрольная группа tn-S) Больные СД-1 Группа риска СД-1 (п-14)

фаза деком пехсашш заболевания (п»26) фаза компенсации заболевания in-24)

1 11 III IV

sFas (пт/мл) 778 1501* 789 864

sFasL (иг/мл) 0.102 0.1)8 0.243* 0.403«

*-р<0,05, **-р<0,01-достовсрные отличия по сравнению с контрольной группой

Как видно из представленных в табл. 3.4. данных, у больных СД-1 в фазе декомпенсации заболевания (II группа) наблюдалось достоверное увеличение содержания sFas по сравнению с контрольной группой (I группа) и остальными обследуемыми группами пациентов (р<0,05).

В группе больных СД-1 в фазе компенсации углеводного обмена (Ш группа) уровень sFas был сопоставим с контрольной группой. В группе риска (IV группа) была отмечена тенденция к повышению sFas по сравнению с контрольной группой и группой больных СД-1 в фазе компенсации заболевания. Полученные результаты о повышении sFas при декомпенсации СД-1 согласуются с данными литературы [СшИЫ Я. е! в1., 2001 I.

Как видно из таблицы 3.4., содержание sFasL в контрольной группе было на границе чувствительности метода (0,1 нг/мл) [АЬе Я. е! в1., 2003].

В группе больных СД-1 в фазе декомпенсации наблюдалась тенденция к повышению sFasL по сравнению с контрольной группой.

I При компенсации СД-1 содержание sFasL в сыворотке крови больных

' было достоверно выше, чем в группе декомпенсированных больных (р<0,05) и

i достоверно ниже, чем в группе риска развития СД-1 (р<0,05).

Обращает внимание значительное увеличение содержания sFasL в группе • риска, что согласуется с данными литературы [Tchorzewski H. et al., 2001]. По

мнению авторов, повышение sFasL в сыворотке крови лиц с высоким риском развития СД-1 является защитным механизмом, направленным на элиминацию аутоагрессивных клонов лимфоцитов.

Полученные результаты свидетельствуют о выраженной дисрегуляции в системе Fas/FasL, которая наблюдается на всех этапах развития СД-1. ^ 3.5» Оценка эффективности Fas-опосредованного апоптоза лимфоцитов

J периферической крови больных СЯ-1 и лиц с повышенным риском развития

| СД-1

Программированная клеточная гибель Fas-«положительных» клеток ^ происходит при связывании Fas-рецептора на их поверхности с мембранной

I или растворимой формой Fas-лиганда (А.Ю. Барышников, Ю.В.Шишкин,

2002). В то же время, не все клетки, несущие активационный маркер - Fas-антиген подвергаются апоптозу (Klass С. et al., 1993). Нельзя не учитывать роль растворимой формы Fas-антигена в ингибировании развития апоптоза по Fas-пути (Cheng J. et al., 1994; Nagata S., 1999]. Показано, что повышение sFas в сочетании с уменьшением в периферической крови количества клеток, экспрессирующих мембранный Fas-лиганд (CD8+- лимфоциты, СD16+-клетки) | является свидетельством ингибирования Fas-опосредованного апоптоза

[Барышников АЛО., Шишкин Ю.В., 2002; Comi М. et al., 2000; Mouawad R. et ; al., 2000; Miret C. et al., 2001 ].

! С целью оценки эффективности Fas-опосредованного апоптоза

лимфоцитов периферической крови в группах обследуемых пациентов и уточнения роли физиологических антагонистов sFas и sFasL в этом процессе, была изучена корреляционная зависимость между количеством С1)95+-клеток и ' уровнем sFas, sFasL, содержанием CD8+- и СD16+-клеток.

Во II группе была выявлена сильная прямая корреляционная зависимость между количеством CD95+-клеток и уровнем sFas в сыворотке (г=0,77; р<0,05) и обратная корреляционная связь между уровнем sFas и количеством CD16+-клеток в периферической крови (r=-0,69; p<0,05). Таким образом, увеличение содержания СD95+-клеток сопровождалось повышением уровня sFas. Это означает, что при декомпенсации СД-1 имеет место выраженная конкуренция между мембранной и растворимой формами Fas-рецептора за связывание лиганда. Наблюдаемая при этом отрицательная корреляционная связь между количеством СD16+-клеток и содержанием sFas свидетельствовала о том, что Fas-лиганд на натуральных киллерах блокировался растворимым Fas-рецептором, что делало невозможным реализацию апоптоза СD95+-клеток по Fas-пути. Это подтверждалось отсутствием какой-либо корреляционной связи между количеством СD95+-клеток и содержанием sFasL, CD8+^ CD16+-клеток.

В Ш группе была выявлена обратная корреляционная зависимость между количеством СВ95+-клеток и уровнем sFasL (г=-0,64; р<0,05), между количеством СВ95+-клеток и СВ16+-клеток периферической крови (г=-0,69; р<0,05). Таким образом, повышение концентрации sFasL и количества CD16+-клеток, экспрессирующих FasL, сопровождалось снижением числа CD95+- .

клеток. Это означает, что в фазе компенсации СД-1 происходит элиминация аутореакгивных CD95+-лимфоцитов при участии sFasL. Принимая во внимание .

данные экспериментальных исследований, показавших роль sFasL в I

предупреждении развития СД-1 у NOD-мышей [Kim S. et al., 2000, 2002; Chernovsky A. et al., 2003], можно предположить, что повышение sFasL при СД- (

1 имеет протективное значение. J

В IV группе наблюдалась сильная прямая корреляционная зависимость |

между количеством СD95+-клеток и уровнем sFas (r=0,75; р<0,05), между i

количеством СD95+-клеток и уровнем sFasL (r=0,68; р<0,05). Так как эти !

показатели возрастали параллельно, вероятно, элиминация по Fas-пути *

оказывалась неэффективной, либо недостаточной, что, в конечном итоге, способствовало дальнейшей деструкции Р-клеток и прогрессированию '

заболевания. Учитывая данные литературы о понижении в периферической (

крови больных СД-1 содержания клеток, несущих костимуляторные молекулы CD28 и CD152 [Глазанова Т.В., 2002; Мазуров В.И. и соавт., 2002], а также 1

низкую плотность Fas-рецептора на Т-лимфоцитах у лиц с высоким риском 1

развития СД-1 [Барышников А.Ю., 2002; Giordano С, et al., 1995], можно |

предположить, что связывания Fas и FasL не происходило. Дополнительным фактором, препятствующим развитию Fas-опосредованного апоптоза, являлось ^

блокирование FasL на СD16+-клетках растворимым Fas-рецептором, о чём [

свидетельствовала выраженная отрицательная корреляционная связь между sFas и количеством CD16+-KtfETOK (r=-0,7l; p<0,05). J

Полученные результаты указывают на то, что ингибирование Fas-опосредованного апоптоза лимфоцитов при участии sFas имеет место как в субклинической стадии СД-1, так и на этапе развёрнутых клинических проявлений при декомпенсации заболевания.

В фазе компенсации СД-1 наблюдается реализация Fas-опосредованного |

апоптоза, о чём свидетельствуют процессы элиминации аутоагрессивных ,

СD95+-лимфоцитов при участии sFasL и СD16+-клеток, экспрессирующих \

FasL, что согласуется с данными литературы [Hofmann M.A. et al., 1997].

Повышение sFasL у больных СД-1 имеет протективное значение и способствует достижению компенсации заболевания, поскольку sFasL принимает участие в удалении аутореактивных СD95+-клеток периферической |

крови больных СД-1.

У лиц с высоким риском развития СД-1 выявлена прямая корреляционная связь между повышенным содержанием sFasL и высоким титром аутоантител к островковым клеткам поджелудочной железы (г=0,71; р<0,05), уровнем гликемии (г=0,69; р<0,05) и обратная зависимость между содержанием sFasL и уровнем С-пептида в крови (г=-0,76; р<0.05). Это позволяет рассматривать .

sFasL в качестве одного из показателей активности процесса деструкции р* клеток поджелудочной железы.

Полученные нами результаты указывают на то, что определение содержания sFasL следует использовать для прогнозирования развития СД-1 у пациентов с нарушением толерантности к глюкозе, а также у лиц первой степени родства больных СД-1.

3 6. Оценка индукции апоптоза мононуклеаров периферической крови больных СД-1

Результаты оценки спонтанного и индуцированного апоптоза в культуре мононуклеаров периферической крови in vitro представлены в табл. 3.6.

Как видно из представленных в таблице данных, во всех группах обследованных больных СД-1 апоптотический ответ на стимуляцию ФГА был достоверно выше, чем в контрольной группе, и достигал максимальных значений у больных в состоянии декомпенсации СД-1 с длительностью заболевания более 15 лет (Нб группа).

Полученные данные свидетельствует о повышенной чувствительности мононуклеаров больных СД-1 к активационному апоптозу, более выраженной при декомпенсации заболевания. Принимая во внимание, что в ответ на стимуляцию ФГА апоптозу подвергаются преимущественно Т-клетки [Ярилин А.А. и соавт., 2000], можно говорить о высокой чувствительности активированных Т-лимфоцитов больных СД-1 к индукции апоптоза.

Таблица 3.6.

Спонтанный и индуцированный апоптоз мононуклеаров периферической крови больных СД-1 и лиц группы риска

% гмкшкшюидньи клеток

Очко* 24 час* 714Kt 144 чм*

1 в £ 1 » I ИкАуииромнмиП «(■enrol ИпяушфманниП 1ГЮПТ01 if Ичщуцнроваиный 1ГКМТГСП

ц ФГА 10 utrftu HHC икг/tu и г ФГА 10 нкг/ма мне XJ МЕГ/НЛ ФГА 10 мхг/нл ИНС JJ млДса

1 3,9 12 У2 4.7 12.1 « b.i НА t.0

tit 5.1" 9.4* 20.1* if) Щ" И,** 10.7 »,1** i W

116 14,1* 22.«" 2W" 46.Г' S.4 JJ.S* tW 16.1*

III» 1.9 S.I 16J" "i* 4.1 14.9* li.l* 10.« Ш' зоа"

ШБ lv6 i.t 17.0* 12.1* W 24,1* 16.4* 9.1 3«* w

*-р<0,05, **-р<0,01-достоверные отличия по сравнению с контрольной группой

Уровень спонтанного апоптоза при СД-1 изменялся в зависимости от фазы компенсации заболевания. У больных с гипергликемией (11а и 11б группы) достоверное повышение процента гиподиплоидных клеток по сравнению с больными в фазе компенсации СД-1 (Ша и Шб группы) и контрольной группой (р<0,05) наблюдалось сразу после выделения клеток (0 часов инкубации), что

позволяет предположить наличие зависимости между уровнем гликемии и активностью спонтанного апоптоза у больных СД-1.

Максимальный апоптотический ответ на инсулин был отмечен при компенсации СД-1 (Ша и Шб группы). Согласно данным литературы, у больных в фазе компенсации СД-1 культивирование лимфоцитов с инсулином in vitro значительно повышало их чувствительность к апоптозу, индуцированному моноклональными антителами к Fas-рецептору [Tchorzewski H.etal.,2001].

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что при СД-1 адекватно подобранная доза инсулина способствует не только достижению нормогликемии in vivo, но и элиминации аутореактнвных лимфоцитов путём апоптоза.

У больных СД-1 была выявлена сильная прямая корреляционная :

зависимость между уровнем спонтанного и индуцированного апоптоза мононуклеаров и содержанием глюкозы в периферической крови (r=0,72; j

р<0,05 и r=0,78; р<0,01 - соответственно) и обратная зависимость между |

уровнем спонтанного и индуцированного апоптоза и концентрацией С-пептида |

в сыворотке крови (r=-0,62; р<0,05 и r=-0,65; р<0,01 - соответственно). Таким образом, выраженность спонтанного и индуцированного апоптоза мононуклеаров больных СД-1 коррелирует с декомпенсацией заболевания и 1

степенью деструкции -клеток.

Полученные результаты указывают на то, что определение процента гиподиплоидных клеток в культуре мононуклеаров in vitro позволяет оценить состояние компенсации заболевания и контролировать эффективность проводимой терапии у больных СД-1.

3.7. Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови |

больных СД-1 и лиц с повышенным риском развития СД-1 1

Результаты определения спонтанной и индуцированной in vitro I

пролиферации лимфоцитов больных СД-1 и лиц с повышенным риском I

развития диабета 1 типа представлены табл. 3.7.

Таблица 3.7.

Пролиферативная активность лимфоцитов периферической крови

больных СД-1 и лиц группы риска in vitro

Спонтанны Ф#юпийгтях*тнннн Мктоген НиcvjtHri

1 Е лролмфершх* (%) (W uit/iu) (if ыкг/мл) мммюса (1 мкг/мл) (I.W тсгЛм) (« UKT/tM) MkWMJl)

НН0СКС cTMUv^auNM fe ответ m MKTortHU m «нтигтн

1 и 5T 47.Î 59 0Ï 01 07

til U 4ТД SJ U* 3.0* 1.9*

ti» 14 114" 469 6Î 11 11 12

lili 1 9 1-1 Г 511* «0 и 1.5 14

1116 :i »s* 5 Я 10 14 U

IV )1» м* 304* ЬЛ 1 9* i M îft*

*- р<0,05, • *- р<0,01 -достоверные отличия по сравнению контрольной группой

I

I.

Как следует из представленных в табл. 3.7. данных, у больных в состоянии декомпенсации СД-3 (11а и II6 группы) был отмечен аномально ' высокий пролиферативный ответ лимфоцитов на ФГА в концентрации 2,5 мкг/мл, что свидетельствует о предсушествуюшей активации Т-лимфоцитов в острой фазе заболевания.

У больных в состоянии компенсации СД-1 с длительностью заболевания менее 1 года (111а группа) наблюдалось значительное повышение пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на ФГА в концентрациях 2,5 мкг/мл и 15 мкг/мл, что указывает на повышенную реактивность лимфоцитов и i напряжение Т-клеточного звена иммунитета.

В группе больных в состоянии компенсации СД-1 с длительностью I заболевания более 15 лет (111б группа) и у лиц группы риска СД-1 отмечалось

достоверное снижение пролиферативного ответа на ФГА по сравнению с f . контрольной группой (р<0,05).

Г Изучение пролнферативного ответа лимфоцитов периферической крови

i in vitro на инсулин в трёх различных концентрациях выявило его достоверное

' увеличение у больных с впервые выявленным СД-1 (1а) и в группе лиц с

'.i высоким риском развития СД-1 (III) по сравнению с контрольной группой

I (р<0,05), что согласуется с результатами исследований ряда других авторов

J [Naquet Ph. et al., 1988; Keller P.J., 1990; Bach J-F., 1994].

1 У больных СД-1 независимо от фазы компенсации и длительности

течения заболевания была выявлена достоверная прямая корреляционная связь между пролиферативным ответом на инсулин и повышенными титрами ' аутоантител к цитоплазматическим антигенам островковых клеток (ICA),

' имеющих высокую прогностическую и диагностическую значимость.

1 Полученные результаты согласуются с данными литературы о наличии у

( больных СД-1 чётко выраженной взаимосвязи между сенсибилизацией

лимфоцитов к инсулину, характеризующейся повышением их f пролиферативного ответа на инсулин, и уровнем 1СА [Асфандиярова Н.С. и

соавт., 1998]. Наиболее сильная корреляционная связь между этими • показателями наблюдалась у больных с впервые выявленным СД-1 (R=0,64;

I р<0,05) и у лиц группы риска (к=0,73; р<0,05). Кроме того, у лиц с высоким

! риском развития СД-1 была установлена выраженная обратная зависимость

между интенсивностью пролиферативного ответа лимфоцитов на инсулин и ' содержанием С-пептида в крови (г=-О,68; р<0,05).

Полученные результаты указывают на то, оценку пролиферативного ответа лимфоцитов in vitro на инсулин можно использовать в качестве одного I из дополнительных критериев определения риска развития СД-1 у лиц первой

степени родства больных сахарным диабетом.

3.8. Сравнительная оценка процессов апоптоза и пролиферации Т-лимфоцитов периферической крови больных СД-1

С целью сопоставления процессов апоптоза и пролиферации во всех обследуемых группах был проведён корреляционный анализ между

количеством CD3+CD95+-лимфоцитов периферической крови и уровнем спонтанной, а также индуцированной в культуре in vitro пролиферации.

В группе контроля была выявлена достоверная обратная корреляционная связь (р<0,05, r=-0,61) между содержанием CD3+CD95+ лимфоцитов в периферической крови и уровнем их индуцированной пролиферации в культуре цельной крови in vitro. To есть, чем меньше лимфоцитов, готовых к апоптозу, тем интенсивнее происходит пролиферативный ответ на дополнительный стимул. Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что процессы пролиферации и апоптоза являются альтернативными вариантами путей развития клетки [Никонова М.Ф. и соавт., 1999].

У больных СД-1 и лиц группы риска была выявлена обратная корреляционная связь между количеством CD3+CD95+ лимфоцитов in vivo и интенсивностью спонтанной пролиферации мононуклеаров в культуре цельной крови (р<0,05, r=-0,69), что, вероятно, свидетельствует о включении механизмов, ограничивающих пролиферацию. Но в случае дополнительной антигенной стимуляции (смоделированной в культуре на примере стимуляции лимфоцитов ФГА) появлялась прямая корреляционная зависимость между интенсивностью пролиферативных процессов и числом готовых к апоптозу Т-лимфоцитов (р<0,05, г=О,65), количество которых возрастало в зависимости от длительности и степени тяжести заболевания. Это означает, что у больных СД-1 аутореактивные СDЗ+СD95+-лимфоциты, подлежащие элиминации, не подвергаются апоптозу, а активно пролиферируют (рис.2).

I споит»««« пролмфарацт I нмдуциромнм»* пропнфарамия (ФГА 2Дмкт(мл) I ичвуиироааииая пролиферация (ФГА IS мкггмп) ' npottawT С03*С09£»<лнмфоцитов

W03+CD9S*

11

IV группы

Рис.2. Сравнительная оценка пролиферативного ответа Т-лимфоцитов и содержания аутореактивных Т-клеток ( СБ3+СБ95 +) в периферической крови больных СД-1 и лиц с высоким риском развития сахарного диабета.

Полученные результаты свидетельств) ют о повышенной устойчивости к апоптозу и высоком пролиферативном потенциале аутореактивных Т-клеток при СД-1, что указывает на перспективность изучения апоптоза как механизма, ограничивающего пролиферацию аутореактивных лимфоцитов.

Выводы

1. У больных СД-1 выявлена достоверная корреляция между обострением процесса и активностью спонтанного и индуцированного апоптоза мононуклеаров периферической крови, которая выражается в наличии прямой связи между содержанием глюкозы в крови и количеством гиподиплоидных клеток и обратной зависимости между содержанием С-пептида в крови и количеством гиподиплоидных клеток.

2. При СД-1 наблюдается повышенная чувствительность мононуклеаров периферической крови к активационному апоптозу в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином, более выраженная в фазе декомпенсации заболевания.

3. В периферической крови больных СД-1 выявлено увеличение количества СD95+-клеток и Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, что свидетельствует о повышенной готовности иммунокомпетентных клеток к апоптозу. Максимальное повышение количества СD95+-клеток и Т-лимфоцитов, несущих рецептор CD95, наблюдается при декомпенсации заболевания, что указывает на связь между повышенной готовностью клеток к апоптозу и обострением процесса.

4. У лиц с высоким риском развития СД-1 отмечается увеличение количества СD8+-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, что свидетельствует о накоплении в циркуляции аутореактивных цитотоксических Т-лимфоцитов, участвующих в деструкции -клеток поджелудочной железы. Повышение количества СD8+CD95+-лимфоцитов в периферической крови лиц группы риска способствует прогрессированию аутоиммунного процесса и является неблагоприятным прогностическим фактором.

5. У больных СД-1 наблюдается повышение растворимой формы Fas-лиганда, более выраженное в фазе компенсации заболевания. Увеличение содержания растворимой формы Fas-лиганда имеет протективное значение и способствует достижению компенсации заболевания, поскольку растворимый Fas-лиганд принимает участие в удалении аутореактивных СD95+-клеток периферической крови больных СД-1.

6. У больных в фазе декомпенсации СД-1 и у лиц с высоким риском развития диабета 1 типа происходит ингибирование Fas-опосредованного апоптоза аутореактивных СD95+-клеток при участии растворимой формы Fas-рецептора. В фазе компенсации заболевания наблюдается реализация апоптоза СD95+-клеток по Fas-пути с помощью растворимого Fas-лиганда и CD16+-клеток, экспрессирующих мембранный Fas-лиганд.

Практические рекомендации _!

1. Определение сывороточного Fas-лиганда необходимо осуществлять с целью 1 прогноза развития СД-1 у пациентов с нарушением толерантности к глюкозе.

2. В качестве дополнительного критерия оценки риска развития СД-1 у лиц

первой степени родства больных СД-1 необходимо рассматривать j

повышение пролиферативного ответа на инсулин в реакции властной трансформации лимфоцитов.

3. Данные по определению количества гиподиплоидных клеток в ответ на | стимуляцию фитогемагглютинином и инсулином целесообразно применять

для оценки фазы компенсации заболевания - и контроля эффективности ;<

проводимой терапии у больных СД-1. ]

Публикации по теме диссертации

1. Луговая А.В. Особенности иммунограммы у больных инсулинзависимым *f сахарным диабетом // Межгородская конференция молодых учёных ^ «Актуальные проблемы патофизиологии»» (29-30 января 2002 г.).- СПб:, Изд- ч во СПбТМУ.- 2002.- С.67-68. '

2. Луговая А.В. Изменения иммунологических показателей у больных инсулинзависимым сахарным диабетом, осложнённым полинейропатией // Нейроиммунопатология: Материалы Второй Российской конференции (21-23 [ мая 2002 г.у Москва: Изд-во РАМН.- 2002.- С.46-47.

3. Луговая А.В. Изменения иммунологических показателей и содержания эндотелиоцитов в крови при инсулинзависимом сахарном диабете // «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» /• Материалы I Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию РосНИИ гематологии и трансфузиологии (18-20 июня 2002 года).- СПб.- 2002.-С.254-255.

4. Луговая А.В. Особенности иммунологической реактивности у больных инсулинзависимым сахарным диабетом // Медицинская иммунология .- 2002.-Т.4, №2.-С.201-202.

5. Луговая А.В. Анализ фрагментов деградации ДНК в апоптотических ; лимфоцитах у больных инсулинзависимым сахарным диабетом // Новые медицинские технологии на Дальнем Востоке. / Материалы V Региональной j научно-практической конференции, г. Хабаровск, 30 января - 1 февраля 2002г. -Владивосток: Дальнаука, - 2002.-С. 100. I

6. Луговая А.В., Бычкова Н.В., Калинина Н.М. Изменение показателей клеточного иммунитета у больных сахарным диабетом I типа // Медицинская иммунология.- 2003.- Т.5, №.3-4.- С. 258-259.

7. Луговая А.В. Нарушение экспрессии Fas-рецептора на Т-лимфоцитах 1 периферической крови у больных сахарным диабетом 1 типа // Межгородская конференция молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии»» (1-2 , февраля 2003 г.).- СПб:, Изд-во СПбГМУ.- 2003.- С.59-60. '

I i )

i t

I f

i'

Подписано в печать (.DSM. Формат 60x84 lfw Объем 17 п.л._Т и р а ж э к з ._Заказ №_

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

1-9 3 2 Z

Актуальность проблемы

Сахарный диабет 1 типа (СД-1) является органоспецифическим аутоиммунным заболеванием, которое развивается в результате селективного разрушения р-клеток поджелудочной железы цитотоксическими лимфоцитами, Т-хелперами 1 типа и аутоантителами [Хаитов P.M. и соавт., 2000; Фрейдлин И.С., Тотолян А.А., 2001]. В результате постепенной деструкции Р-клеток наступает инсулиновая недостаточность, приводящая к расстройству гомеостаза глюкозы и возникновению СД-1. Клинически классические симптомы СД-1 -гипергликемия и кетоз, проявляются только при разрушении 80-90% островков Лангерганса [Балаболкин М.И., 2000; Зак К.П. и соавт., 2002].

Несмотря на активное изучение иммунопатогенеза СД-1 многие ключевые моменты в развитии и прогрессировании данного заболевания остаются не ясными. По-прежнему актуальными являются проблемы ранней диагностики СД-1, обеспечения стабильного течения заболевания и борьбы с его вторичными осложнениями [Карпищенко А.И., 2001; Зилов А.А., 2002]. В связи с тенденцией к «омоложению» возраста больных СД-1, приводящей к ранней инвалидизации, увеличению частоты заболеваемости, особую актуальность приобретают уточнение механизмов иммунопатогенеза и разработка новых методов своевременной диагностики СД-1.

В последнее время внимание многих исследователей привлечено к роли апоптоза в гибели р-клеток при развитии СД-1. В патогенезе СД-1 с апоптозом связаны 2 основных механизма: 1) нарушение процессов апоптоза в тимусе, приводящее к неэффективной селекции аутореактивных Т-лимфоцитов, накоплению их в циркуляции, и, как следствие, к утрате толерантности к р-клеткам поджелудочной железы;

2) роль апоптоза как завершающего механизма иммунообусловленной деструкции Р-клеток [Зак К.П. и соавт., 2002; Один В.И., 2003; Mauricio D., Mandrup-Poulsen Т., 1998].

Ключевым моментом в инициации СД-1 является резистентность аутореактивных Т-лимфоцитов к апоптозу [Мохорт Т.В. и соавт., 2000]. Ускользание аутореактивных клеток от иммунологического надзора приводит к активной деструкции Р-клеток и последующей манифестации заболевания [Mauricio D., Mandrup-Poulsen Т., 1998]. Установлено, что у мышей линии NOD (nonobese diabetic), являющихся моделью спонтанного аутоиммунного диабета, близкого к СД-1 человека, CD4+- и С08+-лимфоциты при блокировании влияния на них ИЛ-2 проявляют повышенную устойчивость к апоптозу. При этом Т-хелперы оказываются более резистентны к апоптозу, чем С08+-клетки, что нарушает нормальный баланс хелперы/цитотоксические Т-лимфоциты и способствует поддержанию аутоиммунной агрессии. Резистентность Т-лимфоцитов NOD-мышей к апоптозу объясняется повышенной экспрессией Т-клетками ингибитора апоптоза белка Bcl-xL [Lamhamedi-Cherradi S.E etal., 1998].

Аутореактивные лимфоциты, устойчивые к апоптозу, мигрируют из кровяного русла в орган-мишень - поджелудочную железу - и образуют воспалительные инфильтраты - инсулиты [Зак К.П. и соавт., 2002; Eizirik D.L. et al., 2001]. Иммунокомпетентные клетки, инфильтрирующие островковую ткань, продуцируют провоспалительные цитокины (ФНОа, ИЛ-ip, ИФНу), оксид азота, цитотоксические ферменты (перфорин и гранзим В), избыточное количество свободных радикалов и другие соединения, вызывающие гибель Р-клеток по механизму апоптоза [Колесник Ю.М., Орловский М.А., 2004; Yoon J.W. et al., 1998]. ИЛ-ip самостоятельно или в s комбинации с ИФНу и ФНОа усиливает экспрессию Fas-рецептора на р-клетках, что приводит к их апоптозу в результате взаимодействия с аутореактивными лимфоцитами, экспрессирующими Fas-лиганд [Колесник Ю.М., Орловский М.А., 2004; Benoist С. et al., 1997]. В настоящее время Fas-опосредованный апоптоз рассматривается как ведущий механизм деструкции р-клеток [Chernovsky A.V. et al., 1997; Kreuwel H.T. et al., 2001; Nakayama M. et al., 2002].

В патогенезе СД-1 важное значение имеют нарушения Fas-опосредованного апоптоза лимфоцитов, играющего главную роль в поддержании периферической аутотолерантности [Lejon К. et al., 1996; Kim S. et al., 2000, 2002]. В то же время большинство результатов по изучению Fas-опосредованного апоптоза при СД-1 получено в экспериментах in vitro с использованием изолированных островков поджелудочной железы человека и NOD-мышей. Не вызывает сомнений тот факт, что аутоиммунные изменения in vivo носят более глубокий характер, и экстраполяция эффектов, выявленных в системе in vitro, на организм не всегда правомочна. Установлено, что особенности индукции и регуляции апоптоза у экспериментальных животных существенно отличаются при СД-1 у людей [Horens A., Pipeleers D., 1999]. В связи с этим представляется актуальным изучение особенностей Fas-опосредованного апоптоза лимфоцитов у больных СД-1 и лиц с высоким риском развития аутоиммунного диабета, а также уточнение механизмов развития апоптоза мононуклеаров периферической крови в зависимости от состояния компенсации углеводного обмена и длительности течения СД-1.

Цель исследования

Охарактеризовать особенности процессов апоптоза мононуклеаров периферической крови больных СД-1 в зависимости от фазы компенсации и длительности течения заболевания, а также у лиц с высоким риском развития СД-1 и сопоставить полученные результаты с состоянием Р-клеток по уровню С-пептида в крови.

Задачи исследования

1. Оценить функциональное состояние Р-клеток по уровню С-пептида в сыворотке периферической крови больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1.

2. Определить титр антител к островкам поджелудочной железы (1СА) у больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1 для оценки активности процесса деструкции Р-клеток.

3. Охарактеризовать готовность к апоптозу Т-лимфоцитов больных СД-1 и лиц группы риска путём определения количества CD3+CD95+-, CD4+CD95+- и С08+СЭ95+-лимфоцитов.

4. Провести количественное определение растворимых форм Fas-рецептора и Fas-лиганда и исследовать корреляционные связи между этими показателями и количеством С095+-клеток для оценки эффективности Fas-опосредованного апоптоза лимфоцитов больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1.

5. Определить чувствительность мононуклеаров периферической крови больных СД-1 к активационному апоптозу в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином и инсулином методом проточной ДНК-цитометрии через 144 часа культивирования и сопоставить с уровнем глюкозы и С-пептида.

6. Изучить пролиферативную активность лимфоцитов больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1 в ответ на стимуляцию митогенами и антигеном (инсулином).

7. Выявить зависимость между показателями апоптоза и пролиферации Т-лимфоцитов у больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных СД-1 выраженность спонтанного и активационного апоптоза мононуклеаров периферической крови находится в прямой зависимости от содержания глюкозы в крови и в обратной - от содержания С-пептида.

2. У больных СД-1 выявлена повышенная чувствительность мононуклеаров к активационному апоптозу в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином, более выраженная в фазе декомпенсации заболевания.

3. В периферической крови больных СД-1 отмечается увеличение количества аутореактивных С095+-клеток и Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, более значимое при декомпенсации заболевания.

4. У больных в фазе декомпенсации СД-1 и у лиц с высоким риском развития СД-1 происходит ингибирование Fas-опосредованного апоптоза аутореактивных лимфоцитов за счёт растворимой формы Fas-рецептора. В фазе компенсации СД-1 Fas-опосредованный апоптоз аутореактивных СЭ95+-клеток реализуется с помощью растворимой формы Fas-лиганда и С016+-клеток, экспрессирующих мембранный Fas-лиганд.

Научная новизна

Выявлены особенности Fas-опосредованного апоптоза мононуклеаров периферической крови у больных СД-1 в разных фазах компенсации заболевания и у лиц с высоким риском развития СД-1.

Установлена выраженная корреляционная связь между содержанием сывороточного Fas-лиганда и высоким титром аутоантител к островковым клеткам поджелудочной железы и уровнем С-пептида в крови у лиц с высоким риском развития СД-1.

Установлено, что уровень спонтанного и индуцированного апоптоза мононуклеаров больных СД-1 коррелирует с декомпенсацией заболевания и содержанием С-пептида в крови.

Выявлена повышенная чувствительность мононуклеаров больных СД-1 к активационному апоптозу в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином. Более выраженная чувствительность клеток к индукции апоптоза при декомпенсации заболевания объясняется влиянием гипергликемии, являющейся дополнительным индуктором активационного апоптоза.

Установлена прямая корреляционная связь между интенсивностью пролиферативного ответа лимфоцитов на инсулин и повышенным титром аутоантител к островковым клеткам поджелудочной железы, уровнем С-пептида крови у лиц с высоким риском развития СД-1.

Практическая значимость

Определение сывороточного Fas-лиганда может быть использовано для прогноза развития СД-1 у пациентов с нарушением толерантности к глюкозе.

Реакцию бластной трансформации лимфоцитов с инсулином можно рассматривать в качестве дополнительного критерия оценки риска развития СД-1 у лиц первой степени родства больных диабетом 1 типа.

Определение индуцированного апоптоза в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином и инсулином позволяет оценить фазу компенсации заболевания и контролировать эффективность проводимой терапии у больных СД-1.

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования были доложены и обсуждены на Межгородской научной конференции «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2002,

2003), II Всероссийской конференции по нейроиммунопатологии (Москва, 2002), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2002), научных конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2002, 2003). По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Реализация результатов исследования

Результаты работы внедрены в учебный процесс на цикле «Клиническая лабораторная диагностика», «Гематологические и общеклинические методы исследований» на кафедре клинической лабораторной диагностики ГОУ ДПО Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Минздрава России, используются в работе научно-исследовательской лаборатории клеточного и гуморального иммунитета Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины МЧС России, Санкт-Петербург.

ВЫВОДЫ

1. У больных СД-1 выявлена достоверная корреляция между обострением процесса и активностью спонтанного и индуцированного апоптоза мононуклеаров периферической крови, которая выражается в наличии прямой связи между содержанием глюкозы в крови и количеством гиподиплоидных клеток и обратной зависимости между содержанием С-пептида в крови и количеством гиподиплоидных клеток.

2. При СД-1 наблюдается повышенная чувствительность мононуклеаров периферической крови к активационному апоптозу в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином, более выраженная в фазе декомпенсации заболевания.

3. В периферической крови больных СД-1 выявлено увеличение количества С095+-клеток и Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, что свидетельствует о повышенной готовности иммунокомпетентных клеток к апоптозу. Максимальное повышение количества С095+-клеток и Т-лимфоцитов, несущих рецептор CD95, наблюдается при декомпенсации заболевания, что указывает на связь между повышенной готовностью клеток к апоптозу и обострением процесса.

4. У лиц с высоким риском развития СД-1 отмечается увеличение количества С08+-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, что свидетельствует о накоплении в циркуляции аутореактивных цитотоксических Т-лимфоцитов, участвующих в деструкции р-клеток поджелудочной железы. Повышение количества CD8+CD95+-лимфоцитов в периферической крови лиц группы риска способствует прогрессированию аутоиммунного процесса и является неблагоприятным прогностическим фактором.

5. У больных СД-1 наблюдается повышение растворимой формы Fas-лиганда, более выраженное в фазе компенсации заболевания.

Увеличение содержания растворимой формы Fas-лиганда имеет протективное значение и способствует достижению компенсации заболевания, поскольку растворимый Fas-лиганд принимает участие в удалении аутореактивных С095+-клеток периферической крови больных СД-1.

6. У больных в фазе декомпенсации СД-1 и у лиц с высоким риском развития диабета 1 типа происходит ингибирование Fas-опосредованного апоптоза аутореактивных СВ95+-клеток при участии растворимой формы Fas-рецептора. В фазе компенсации заболевания наблюдается реализация апоптоза СР95+-клеток по Fas-пути с помощью растворимого Fas-лиганда и С016+-клеток, экспрессирующих мембранный Fas-лиганд.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение сывороточного Fas-лиганда необходимо осуществлять с целью прогноза развития СД-1 у пациентов с нарушением толерантности к глюкозе.

2. В качестве дополнительного критерия оценки риска развития СД-1 у лиц первой степени родства больных СД-1 необходимо рассматривать повышение пролиферативного ответа на инсулин в реакции бластной трансформации лимфоцитов.

3. Данные по определению количества гиподиплоидных клеток в ответ на стимуляцию фитогемагглютинином и инсулином целесообразно применять для оценки фазы компенсации заболевания и контроля эффективности проводимой терапии у больных СД-1.