Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение нейрохимических и молекулярно-биологических механизмов противопаркинсонического действия препарата гимантан

На правах рукописи

Абаимов Денис Александрович

ИЗУЧЕНИЕ НЕЙРОХИМИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА

ГИМАНТАН

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2007

003065568

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии имени В В Закусова РАМН

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор

Ковалев Георгий Иванович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Воронина Татьяна Александровна

доктор биологических наук, профессор Каменский Андрей Александрович

Ведущая организация

ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

Защита состоится « » 2007 г в » часов на заседании

диссертационного совета Д 001 024 01 при ГУ НИИ фармакологии имени В В Закусова РАМН по адресу 125315, г Москва, ул Балтийская, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН по адресу 125315, г Москва, ул Балтийская, д 8

Автореферат разослан 09 _ 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Вальдман Е А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Болезнь Паркинсона (БП) относится к числу наиболее распространенных неврологических заболеваний в современном обществе Как показывают результаты многочисленных эпидемиологических исследований, с возрастом частота болезни Паркинсона в популяции неуклонно увеличивается Так, в возрастной группе до 65 лет она составляет около 1%, от 65 до 75 лет - 2%, у лиц старше 75 лет болезнь Паркинсона встречается с частотой 3-4% Можно заключить, что в связи с общемировой тенденцией к постепенному постарению населения актуальность данной проблемы в будущем будет постоянно возрастать (Иллариошкин, 2006, Marion, 2001)

БП является хроническим неуклонно прогрессирующим заболеванием ЦНС с дегенерацией нигростриарных нейронов и нарушением функции базальных ганглиев Патогенез БП окончательно не изучен, однако на сегодняшний день определен ряд молекулярных и нейрохимических изменений лежащих в его основе Так, в настоящее время известно, что дегенерация нигростриарных нейронов вызывается различными нарушениями внутриклеточного метаболизма окислительным стрессом, эксайтотоксичностью глутамата и аспартата, избыточным поступлением внутрь клеток ионов кальция, возрастанием активности внутриклеточных протеаз, нарушением митохондриального дыхания и энергетическим дефицитом нейрона, нарушением метаболизма железа (Федорова, 2001, Przedborski, 2005) Также существенный вклад вносят аутоиммунные и воспалительные процессы в компактной части черной субстанции (Orr, 2002, Haid, 2005) Основным нейротрансмииттерным нарушением при БП является изменение баланса нейромедиаторов ЦНС, проявляющееся в усилении активирующих влияний глутамата и ацетилхолина, при ослаблении ингибирующих влияний дофамина (Ещенко, 2004)

В настоящее время существует большое количество противопаркинсонических препаратов, однако большинство из них относятся к симптоматическим средствам В этой связи остается высокой актуальность создания новых средств патогенетической терапии Ввиду наличия большого числа патогенетических звеньев БП, наиболее перспективными представляются препараты с комплексным механизмом действия, обладающие как дофаминопозитивными, так и нейропротекторными свойствами Таким препаратом является препарат гимантан (>1-адамант-2-ил гексаметиленимина гидрохлорид), разработанный в ГУ НИИ фармакологии РАМН Гимантан оказывает дозозависимое модулирующее влияние на активность дофамин- и серотонинергической нейромедиаторных систем в стриатуме (Андяржанова, 2001), обладает свойствами низкоаффинного блокатора ионных каналов глутаматных рецепторов NMDA-подтипа, избирательно ингибирует фермент МАО типа В, имеет слабовыраженную антирадикальную активность и иммуномодупирующее действие (Вальдман, 2001) В экспериментах определен спектр противоларкинсонической активности гимантана, доказаны его преимущества перед амантадином (мидантаном), показана перспективность применения гимантана для лечения ригидных и дрожательных форм паркинсонизма (Неробкова, 2000, Вальдман, 2004) В настоящее

время препарат изучается в клинике Тем не менее, изучение нейрохимических и молекулярно-биологических механизмов действия гимантана не завершено Проведение рецепторологических исследований фармакодинамики препарата, изучение механизмов дофамишгозитивного эффекта, а также характера взаимодействия глутамат- и дофаминергической систем в процессе реализации эффектов препарата позволяет углубить представления о фармакологических мишенях гимантана и открывает перспективы создания на его основе новых, более эффективных препаратов

Цель исследования. Целью данного исследования явилось изучение нейрохимических и молекулярно-биологических механизмов действия и поиск новых фармакологических мишеней оригинального отечественного противопаркинсонического препарата гимантана Основные задачи исследования

1 Изучить с помощью метода радиолигандного связывания влияние гимантана на основные группы рецепторов участвующих в этиопатогенезе болезни Паркинсона -дофаминовые (DI, D2 и D3) и глутаматные (NMDA) рецепторы

2 Оценить участие системы обратного захвата дофамина в механизме модуляции гимантаном дофаминовой нейропередачи в стриатуме мозга крыс in vitro

3 Проанализировать влияние гимантана на пресинаптический транспорт ДА в стриатумах крыс в условиях эксперимента ex vivo

4 Изучить с использованием стандартных рецепторных анализаторов взаимосвязь глутаматных рецепторов с системой транспорта дофамина

5 Исследовать эффекты гимантана на содержание белка дофаминового транспортера DAT в стриатуме крыс и культуре клеток феохромоцитомы PC-12

6 Изучить влияние гимантана на ферментативную активность Na/K-АТФазы синаптосом стриатума крыс

7 Исследовать влияние гимантана на синтез нейромедиаторов и уровни основных биогенных аминов вовлеченных в патогенез паркинсонизма в различных структурах мозга Научная новизна работы.

На основе статистически репрезентативной серии экспериментов методом радиолигандного связывания in vitro была обнаружена тропность препаратов адамантановго ряда к D3-рецепторам дофамина. Впервые показано модулирующее воздействие нового противопаркинсонического препарата гимантана на подсистемы дофаминовых рецепторов стриатума D1 и D3, проявляющееся в изменении плотности рецепторов Втах, без изменения их аффинности к селективным лигандам (K<i) в указанной структуре Продемонстрирована способность гимантана модулировать обратный захват дофамина в экспериментах in vitro и ех vivo Методом иммуноблотгинга изучено влияние однократного и субхронического введения гимантана на содержание белка дофаминового транспортера DAT в стриатуме крыс линии Wistar Впервые обнаружено, что при однократном системном введении гимантан вызывает достоверное уменьшение содержания белка DAT в гомогенатах стриатума крыс Продемонстрировано активирующее влияние гимантана на ферментативную активность Na/K-АТФазы Выявлено, что гимантан в дозе 20 мг/кг оказывает мягкое ингибирующее влияние на

синтез ДА в стриатуме Обнаружено достоверное снижение концентрации серотонина и его метаболита 5-ГИУК в стриатуме на фоне дейсгвия препарата Научно-практическая значимость.

Полученные результаты существенно расширяют имеющиеся представления о нейрохимических и молекулярно-биологических механизмах противопаркинсонического действия препаратов адамантанового ряда. Обнаруженные эффекты антагонистов NMDA-рецепторов глутамата на дофаминергическую нейропередачу свидетельствуют о перспективности поиска среди антагонистов NMDA-рецепторов и, возможно, агонистов метаботропных рецепторов глутамата новых веществ с протевопаркинсонической активностью В целом, полученные результаты определяют показания к применению гимантана при болезни Паркинсона как при монотерапии, так и при комбинированном применении Апробация диссертации Материалы диссертации были представлены на конференции Российского Нейрохимического общества «Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты» (март, 2005), IV международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (март, 2006), на XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», межлабораторной конференции ГУНИИ фармакологии им В В Закусова РАМН (июнь, 2007) и на III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» Санкт-Петербург (сентябрь, 2007) Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 4 статьи в центральных журналах и 3 тезисов

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 6 глав результатов собственных исследований и их обсуждений, заключение, выводы, список литературы, включающий 31 отечественных и 195 зарубежных источника Работа иллюстрирована 7 таблицами и 20 рисунками

Материалы и методы. 1. Животные

В большинстве исследований использовали половозрелых крыс-самцов линии Wistar массой 200-250 г Для изучения синтеза моноаминов использовались мыши-самцы линии С57В1аск/6

2. Радиолигандное связывание:

2 1 Изучение радиолигандного связывания с Dl-, D2- и D3-рецепторами дофамина

Изучение радиорецепторного связывания с рецепторами дофамина проводили по методу Sun et al (2003) с модификациями Животных декапитировали, извлекали стриатумы, из которых получали фракцию мембран Мембраны инкубировали, в течение 30 мин при температуре 37°С с сечективными [С-3Н]-лигандами, в инкубационном буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl (рН 7,4

при 37°С) с добавлением солей (120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ СаС12-2Н20, 1 мМ MgCl2-6H20) (Sun,2003)

2 2 Изучение радиолигандного связывания с NMDA-peifenmopaMU глутамата Изучение связывания на NMDA-подтипах рецепторов производили согласно методу (Nowak et al, 1993) с модификациями Использовали меченный тритием МК-801 (дизоцилпин) с удельной активностью 210 Кюри/моль Мембранную фракцию инкубировали при комнатной температуре в буфере, содержащем 5 мМ HEPES и 4 5 мМ Трис, в присутствии меченого лиганда (50 нМ р р ) в течение 2 часов

По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman) Фильтры высушивали, переносили в сцинтилляционные флаконы, заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости Брея и определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике Wallac 1411, с эффективностью счета около 45%

3. Синаптосомальный захват [3Н]-ДА

Процедуру захвата проводили по протоколу (Page et al, 2001) Для проведения реакции захвата использовали среду инкубации, содержащую 125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 2 мМ MgSO.i, 1 2 мМ СаС12 10 мМ HEPES, 10 мМ D-глюкозы, 200 цМ раствора паргилина (ингибитор МАО-В) (pH инкубационной среды = 7 4)

Реакцию останавливали быстрой ультрафильтрацией через стекловолокнистые фильтры Whatman GF/C, которые переносили в сцинтилляционные флаконы со сцинтилляционной жидкость Брея, после чего измеряли уровень их радиоактивности с помощью сцинтилляционного счетчика Wallac 1411, с эффективностью счета около 45%

4. Определение активности №,К-АТФазы путем измерения концентрации продукта реакции Ф„ методом Ратбуна и Бертлах

Общую АТФазную активность опредетяли по методу Ратбуна и Бертлах, измеряя концентрацию продукта реакции - неорганического фосфата после инкубации проб в присутствии 3 мМ MgATO в среде содержащей 130 мМ NaCl и 20 мМ KCl (Rathbun and Bethlach, 1969)

5 Изучение влияния гимантана на содержание белка дофаминового транспортера DAT в гомогенатах стриатума крыс и культуре клеток РС-12.

Содержание белка-дофаминового транспортера (DAT) определяли в цитоплазматической фракции клеток линии РС-12 феохромоцитомы коры надпочечников крысы и цитоплазматической фракции гомогенатов стриатумов крыс с использованием методов электрофореза в ПААГ и последующего иммуноблотгинга.

б. Определение содержания моноаминов и их метаболитов в ткани мозга мышей.

Состояние биосинтеза дофамина и серотонина в структурах мозга мышей линии С57В1аск/6 оценивали по накоплению L-3,4-диоксифенилаланина (L-ДОФА) и 5-гидрокситриптофана (5-ГТП) соответственно, в условиях ингибирования ДААК селективным блокатором NSD1015 Структуры мозга выделяли по методу (Glowinski, Iversen, 1966) и гомогенизировали в среде выделения содержащей 0,1 н НСЮ4 с добавлением 100 нг/мл внутреннего стандарта диоксибензиламина (ДОБА) Пробы центрифугировали, супернатант использовали для

определения моноаминов и их метаболитов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Работа была выполнена при техническом и консультационном содействии с н с, к б н Воронина Михаила Владимировича, зав лабораторией нейрохимической фармакологии к б н Владимира Сергеевича Кудрина, зав лабораторией фармакологии нейропротекции кбн Зениной-Антиповой Татьяны Алексеевны, а также рук иссл группы проф , д б н Лопиной Ольги Дмитриевны (МГУ им М В Ломоносова)

I. Изучение влияния гимантана на основные группы рецепторов вовлеченных в этиопатогенез болезни Паркинсона

II. Изучение эффектов гимантана на радиолигандное связывание in vitro

Результаты экспериментов т vitro оценивали с помощью рассчитанной величины 1С5о, представляющей собой концентрацию, в которой препарат ингибирует специфическое связывание лиганда с соответствующим рецептором на 50% Нами было изучено влияние 1- и 2-аминопроизводных аминоадамантана на связывание селективного канального лиганда фенциклидинового сайта [G-3H] (+)МК-801 (дизоцилпина) с глутаматными рецепторами NMDA-подтипа мембран гиппокампа крыс Исследуемые аминоадамантаны обнаружили однородный характер влияния на этот подтип глутаматных рецепторов Как амантадин, так и гимантан наиболее эффективно смещали меченый лиганд в области 4-6 мкМ величины концентраций полуингибирования IC50 соответствовали 5,5 мкМ у гимантана и 4,0 мкМ у амантадина (см рис 1)

селективных Лигандов с NMDA-peцeптopaми гиппокампа и ОЗ-рецепторами стриатума (т+вЕМ).

Примечание * - статистически значимое отличие, р<0 05, п=6, парный 1>тест Стъюдента

В то же время, как гимантан, так и препарат сравнения, не оказывали значимого влияния на дофаминовые 01 и Р2 рецепторы стриатума в диапазоне концентраций от Ю-" до 10"3 М (на рисунках не представлено) Однако, в экспериментах по связыванию селективного

лиганда D3-подтипа рецепторов [G-3H] 7-OH-DPAT в стриатуме, было обнаружено, что как гимантан, так и амантадин в концентрациях, превышающих 10 мкМ, подавляют связывание радиолиганда Из графика видно, что влияние стандартного агониста этого типа рецептора (+)-7-OH-DPAT описывается классической кривой (пунктир) и характеризуется величиной 1С5о=1,3 мкмоль/л Внесение в среду инкубации как гимантана, так и амантадина демонстрирует значимый эффект конкуренции за рецепторные места связывания В области микромолярных концентраций гимантан оказался более эффективным, чем амантадин величина IC50 у гимантана (39 мкМ) почти на порядок меньше таковой у амантадина (360 мкМ) (рис 1) Известно, что дофаминовые рецепторы подгруппы D3 локализованы преимущественно на пресинаптических окончаниях нервных клеток, где исполняют функции ауторецепторов ДА, регулирующих концентрацию свободного дофамина в синаптической щели, оказывая влияние одновременно на синтез медиатора и его высвобождение (Aretha, 1995, Koeltzow, 1998) Исходя из этого можно предположить, что связывание гимантана и амантадина с Ш-рецеторами может приводить к формированию ДА-позитивного профиля действия препаратов адамантанового ряда

12. Изучение влияния субхронического введения гимантана на характеристики связывания селективных лигандов с дофаминовыми рецепторами стриатума крыс ex vivo.

Результаты экспериментов ex vivo оценивали с помощью рассчитанных величин Kd и Втах, отражающих степень сродства рецептора к лиганду (нМ) и количество мест связывания лиганда (фмоль/мг белка), соответственно Величины, полученные для контрольной (физраствор) и опытной (гимантан, 20 мг/кг, 7 суток, 1 раз в день, в/б) групп, были обработаны статистически и протестированы на достоверность различий с помощью программ Statistica 6 0 и GraphPad 4 0 Prism DI-дофаминовые рецепторы

Графики насыщения рецепторов данного типа в контрольной (пунктир) и опытной (сплошная линия) группах крыс, а также рассчитанные величины Kd и Втах, представлены на Рйс 2 Обнаружено, что величины Kj в мембранах стриатума обеих групп крыс не различаются статистически значимо, тогда как Втах в результате 7-дневного введения препарата увеличивается до 279 1 ± 7 7 фмоль/мг белка против 2184±168 фмоль/мг белка в контроле при р = 0 0076 (<0 01) (F-критерий Фишера)

График Скеиарда для [G 3Н] SCH 23390

i Гимантан

■ Контроль

о so loo i» а» 2» а»

Контроль Bmax = 218.4 ±16 8 фмоль/мг Kd = 2 97 ± 0 68 нМ

Гимантан

0.0 2.5 5.0 75 10.0 12.5 15.0 17.5 20 0 225

Втех = 2791 ± 7 7 фмоль/мг* Kd = 2 52 ± 019 нМ

Концентрация [G-3H] SCH 23390 (нМ)

Рис. 2. Влияние субхронического введения гимантаиа (7x20 мг/кг/день, в/б) на характеристики радиорецепторного связывания [G-3H] SCH 23390 с DI-рецепторами дофамина стриатума крыс ex vivo

Примечание * - статистически достоверное отличие от контроля, р<0 01, п=12, F-критерий Фишера

Таким образом, в результате субхронического введения гимантана крысам аффинитет (Kd) данного типа рецептора к радиоактивному лиганду не изменяется, тогда как число мест связывания лиганда (Вмах) достоверно увеличивается (более чем на 20%) На основании полученных данных можно выдвинуть предположение, что обнаруженная способность гимантана увеличивать плотность постсинаптических D1 рецепторов может вносить определенный вклад в улучшение эффективности дофаминергической нейропередачи под действием препарата Известно, что дофаминергическая денервация неостриатума при болезни Паркинсона ведет к повышению активности структур, находящихся под контролем D2 рецепторов и снижению регулируемых D1 рецепторами (Miller, 1987, Gerfen, 1992), в результате чего происходит серия функциональных изменений в базальных ганглиях (Albm, 1992) Обнаруженные в эксперименте эффекты гимантана, по всей вероятности, могут предотвращать подобные патологические изменения в балансе подгрупп дофаминовых рецепторов дофамина при паркинсонизме

РЗ-дофаминовые рецепторы Графики насыщения рецепторов данного типа в контрольной (пунктир) и опытной (сплошная линия) групп крыс, а также рассчитанные величины Kd и Bmax представлены на Рис 3

Рис. 3. Влияние субхронического введения гимантана (7x20 мг/кг/день, в/б) на характеристики связывания [G-3H] (+) 7-ОН DPAT с ИЗ-рсцспторами дофамина стриатума крыс ex vivo

Примечание * - статистически значимое отличие, р = 0 0045 (<0 01), п=10, F-критерий Фишера

Обнаружено, что величины Kd для селективного лиганда ОЗ-ренепторов [G-3H] (+)7-ОН DPAT в мембранах стриатума обеих групп крыс не различаются статистически значимо Вместе с тем, число мест связывания Вмах (количество активных рецепторов) после 7-дневного введения гимантана достоверно снижается до 86,7+9,8 фмоль/мг белка против 125,2±4,5 фмоль/мг белка в контроле (р<0,01) Таким образом, субхроническое введение препарата крысам не оказывает влияния на аффинитет (К<0 данного типа рецептора к радиоактивному лиганду, тогда как число активных рецепторов (Вмах) уменьшается достоверно на 30% по сравнению с контролем

Можно предположить, что прямое взаимодействие гимантана с ОЗ-рецепторами дофамина, обнаруженное нами в эксперименте in vitro, может вызывать функциональную инактивацию указанных рецепторов, и тем самым снижать их плотность в стриатуме Поскольку известно, что Ш-рецснторы имеют преимущественно пресинаптическую локализацию и оказывают регулирующее влияние на уровень экстраклеточного дофамина, можно допусгить, что изменение их содержания под действием гимантана положительно влияет на внеклеточную концентрацию нейромедиатора, тем самым, повышая эффективность дофаминергической передачи

2. Изучение влияния гимантана на обратный захват дофамина.

2.1. Изучение влияния гимантана и других производных адамантана на синаптосомальный захват [3Н]-ДА в стриатуме крыс in vitro.

2.1.1. ".Эффекты различных концентраций ги манта на на захват [ЛН]-ДА.

Для изучения эффектов гимаптана на обратный захват дофамина в стриатуме, был» проведены эксперименты in vitro на синагпосомах стрнтума мозга крыс с использованием меченого Plll-ДЛ. Результаты экспериментов приведены на рис.4.

Рис,4. В.пшннс Гнмактана на захват |3Н|-ДА сипа) но Симами Стрнатума крыс.

Примечание: * - статистически достоверное отличие от контроля при р<0.05 (И-тест Манна-Уитни).

И.) представленных данных следует, что гимантам статистически достоверно (р<0.05, п-6-9.1_1-тсст Маина-Уитни) йншбнрует сшантосомальный захват меченого дофамина, начиная с концентрации 10 мкМ (-22%). 50%-ное торможение процесса наблюдается при концентрации около 200 мкМ. Изучение кинетики ингибнронания захвата дофамина гимантапом и концентрации 100 мкМ с помощью метода АйзентальЖорйнш-Боудена, показало, что это В нгиб нрованкс происходит по неконкурентному типу. Обнаружено, что гнмантан в экспериментах т баиее чем «а 50% снижал величину Ушах, без изменения кажущейся величины (см. рис.5)

2.1.2. Сравнение ннгибнруюшей лклашосги имактаднни и гимантанд»

Амантадин (1-амнноадвмантана гидрохлорид) является наиболее изученным на сегодняшни]! день производным адамантана. По химическому строению амантадин и гимантан представляют собой дна различпых производных адамантана; 1- и 2-замещенные адамантаны, соответственно. Таким образом, представляло интерес сравнить эти два препарата в Одной серии экспериментов по их способности угнетать сииаптоеомальный захват [ Н]-ДА в диапазоне концентраций от 1 до 500 мкМ.

Результаты сравнительного эксперимента приведены на рис,5:

□ ГИМАНТАН 0МИДАНТАН

1 10 100 SOO

Концентрация препаратов, мкМ

Рис, 5. Сравнительная харакчериегика гимаитапа и »Мантадина по ил способности ингнйнровать обратный захват |^Н(-дофамнна

Примечание: * -статистически значимое отличие от контроля, р<0.05. п=6-9. U-теет Манна-Уитни.

Из предаавленною рис.б. следует. что тогда как гимантан в концентрации 10 мкМ достоверно ннгибируст- захиат [JIí]-/],A на 21% (р<0.05, U-критерий Манна-Унтни), для амащадина да концентрация оказывается практически недействующей 94-7 (р>11()5). При концентрации МОмкМ захват |"![Ц-ДЛ составляет 64±6% для гвШлтава н 73±9% для амантадина, что свидетельствует о сближении ■эффектов обоих препаратов. Наконец, и концентрации 500 мкМ величины захвата для гнмантана и амантадина практически эквивалентны. 2.2, Изучение влияния гимадтаяа па обратный синаптоеам a льн ый tax ват дофамина ех vivo.

При остром введении гимантан вводили животным впутрибртошинно в дозе 40 мг/кг. Животные контрольной j-руппы получали физиологический раствор (0.9% NaCl, в/б). Измеряли захват возрастатощих концентраций [^Н]-дофамина и синагггосомах етриапумов. выделенных у контрольной И ОПЫТНОЙ ТруШЫ животных.

Обнаружено, что гимантан существенно ннпгоирует обратный захват [3Н]-дофа\;ииа по сравнению с контролем. Кинетика ингибирования захвата дофамина гаман таном, представленная на графике двойных обратных координат Лайнуивера-Ьзрка (рис.6). свидетельствует, что это влияние носит неконкурентный характер: острое введение гнмантана животным в дозе 40 мг/кг изменяет кажущуюся величину Утах до 32.44 пмоль/мнп/мг бедка.

что достоверно (р<0 05, Б-критерий Фишера, п=6) отличается от аналогичной величины в контроле (51 26 пмоль/мин/мг белка)

Рис.6. Влияние острого ведения гимантана (40 мг/кг, в/б) на кинетические характеристики обратного захвата [3Н]-дофамина синаптосомами стриатума крыс (А-контроль, Б-гимантан).

Примечание * - достоверное отличие от контроля, р<0 05, п=6, парный 1-тест Стьюдента

В то же время, значения кажущейся аффинности Кт для обеих групп не различаются 0 49 мкМ для препарата против 0 50 мкМ в контроле (р>0 05, К-тест, п=б), что характерно для неконкурентного типа ингибирования (Табл 1)

Способность гимантана подавлять обратный синаптосомный захват [3Н]-дофамина в стриатуме крыс после острого введения препарата отличает его от эффекта амантадина, который ингибирует захват в дозах, на порядок превосходящих значения терапевтической (Морозов, 2001)

В случае субхронического введения (см рис 7) гимантан, напротив, увеличивал скорость обратного захвата [3Н]-дофамина на 17% величина Умах в контрольной группе животных составляет 51 49 пмоль/мин/мг, в то время, как в опыте соответствует 61 76 пмоль/мин/мг (статистически значимое отличие, р=0 0011, Р-критерий Фишера) Величина аффинности Кт контрольной группы (0 32±0 02 мкМ) статистически не отличается от таковой в опытной группе (0 33±0 03 мкМ) (Табл 1)

Концентрация [3Н]-ДА, нМ

Рис Влияние хронического введения гимантана (20 мг/кг, 7 дней, 1 раз в сутки, в/б) на кинетические характеристики обратного синаитосомальиого захвата {3Н}-дофамина.

Примечание * - достоверное отличие от контроля, р<0 05, п=6, парный t-тест Стьюдента

Можно предположить, что увеличение обратного захвата дофамина, наблюдаемое в ответ на введение гимантана, является следствием непрямой компенсаторной модуляции активности DAT со стороны пресинаптических рецепторов дофамина 02-подгруппы в ответ на увеличение экстраклеточной концентрации дофамина под действием препарата (Page, 2000)

Таблица 1 Кинетические параметры обратного захвата [3Н]-дофамина в синаптосомах стриатума крыс после острого и субхронического введения гимантана

Измеряемая характеристика Vmax (имоль/мг белка/мин) Кт (мкМ)

Группа животных • Контроль Гимантан Контроль Гимантан

Острое введение 51 26 ±2 89 32 44±2 93* 0 50 ± 0 06 0 49 ± 0 09

Субхроническое введение 51 49±1 60 61 76±2 36* 0 32 ± 0 02 0 33 ± 0 03

Величины Ушах и Кт были определены на основании кривых насыщения обратного захвата [3Н]-ДА изображенных на рисунках 6и ?,с помощью нелинейной регрессии Величины ¥тах и Кт представлены в виде т ± в Е М, * - статистически значимое отличие, р<0 05, Р-критерий Фишера

Таким образом, полученные в нашем исследовании результаты в целом свидетельствуют о важном участии дофаминового транспортера DAT в дофаминпозитивном механизме реализации противопаркинсонического действия препаратов адамантанового ряда, в частности, гимантана Результаты острого эксперимента ex vivo также указывают на большую по сравнению с мидантаном (амантадином) эффективность воздействия гимантана на процесс обратного захвата дофамина 3. Влияние веществ-анализаторов на захват [ЭН]-ДА синаптосомами стриатума крыс 3.1. Влияние антагонистов NMDA-рецепторов глутамата на обратный захват [3Щ-ДА синаптосомами стриатума крыс.

Установлено, что гимантан, являясь канальным блокатором NMDA-рецепторов с ICsc=5 5 мкМ, оказывает тормозящее воздействие в отношении ДА-транспортера, в связи с чем возникает необходимость уточнения характера функциональной связи между глутаматными рецепторами и системой обратного захвата ДА Для этого было исследовано влияние различных агонистов и антагонистов глутаматных рецепторов на систему захвата [3Н]-ДА синаптосомами стриатума крыс

В качестве первого вещества-анализатора, которое с высоким сродством блокирует ионный канал NMDA-рецептора, было использовано производное арилциклогексиламина МК-801 Вторым препаратом выбранным в качестве анализатора стало вещество (t-/-)CPP, которое является селективным конкурентным антагонистом глутаматных рецепторов NMDA-подтипа (Lehmann, et al, 1987) Было осуществлено сравнительное исследование влияния конкурентных и неконкурентных антагонистов обратного захвата дофамина на обратный захват [3Н]-дофамина Для оценки воздействия МК-801 на захват [3Н]-ДА и сравнения ингибирующей активности его и (+/-)СРР была проведена серия экспериментов, результаты которой представлены на рис 8

Установлено, что высокоаффинный неконкурентный канальный антагонист NMDA-рецепгора МК-801 (дизоцилпин) достоверно ингибирует обратный захват [3Н]-ДА уже в концентрации 1 мкМ При концентрации 10 мкМ значение захвата (в процентах от контроля) [3Н]-ДА составляет 68±9% Присутствие 100 мкМ МК-801 подавляет захват [3Н]-ДА на 88% Использование конкурентного антагониста NMDA-рецептора (+/-)-СРР показало, что в концентрациях 01 и 1 0 мкМ он неэффективен в отношении захвата дофамина, но при 10 и 100 мкМ величина захвата [3Н]-ДА составляет уже 24±2 и 10±2% от контроля (100±7) При сравнении динамики ингибирования захвата [3Н]-ДА веществами (+/-)-СРР и МК-801 (см рис 9) заметна скачкообразная зависимость ингибирующей активности от концентрации для СРР и более «пропорциональное» ингибирование для МК-801

120 5 юо

о"-

<

S 80

О

0

0,1 1 10 100 Концентрации веществ, мкМ

Рис.8. Влияние антагоннсюв 1ЧМОА-рецепторов глутамати на обратный laxnai | 'Н|-ДЛ синаптосомами стрнагуми крыс

Примечание: * - до сто вер нос огаичие от контроля, р<0.05, п—6-9, U-критериЙ Маина-Уитни.

3.2. Влияние агоннсюв глутаматиы* рецепторов на захьа t [ Н ¡-ДА синантосомалш стрнатума крыс.

Ввиду того, что блокирование немного канала, сопряженного с NM DA-рецептором, приводит к подавлению активности DAT. вполне оправданно было бы предположить, что активация NMDA-рецеггтора (де блокирование канала) будет, напротив, стимулировать обратный захват ДА. Для проверки этого предположения реакцию чах ват а fHJ-ДА целесообразно было дровсстн в присутствии aroнистоr глутаматных рецепторов. 13 качестве веществ-анализаторов использовали агонмсты глутаматных рецепторов NMPA-подтипа - N-метил-О-аетрТат и смешанный агонист рецепторов AM Г'А-подтип а, а также метаботропных глутамаггных (mGluR) — квисквалат. Результаты экспериментов приведены па рис.9.

■ MK-8Q1

ШКвисквалэт SNMDA

1 10 100 Концентрация препаратов, mkW!

í'tre.9, Bjihhhhc агонистов глутаматных рецепторов на захват [3111-ДА сннаптвеомами стрнатума крыс.

Примечание: * - мрстовфнэе отлитие от контроля. р<0.05. U-критерий Манна-Уитни.

Как можно видеть, NMDA во всех трех концентрациях не влияет ни захват [ Н]-ДА еинаптоеомами. Квисквалат достоверно ипгабирует захват [511]-ДЛ лишь в концентрации ¡00 мкМ: величина захвата составляет 63±8% от контроля. Таким образом, результаты экспериментов со специфическими аптагонистами и aro:тегами глутаматных рецепторов Подтверждают тесную функциональную взаимосвязь между глутамач ер! и ческой и ДА'Э системами с i риатума.

4. Изучение влияния гимашана на активность Nç/K-АТФазЫ сннаптосом стрматума крыс.

Известно, что источником энергии для активного трап спора дофамина является трйнсмембранный концентрационный электрохимический граниев i ионов Na За формирование и поддержание градиента ионов натрия отвечает мембранный фермент ■ Na/K-АТФазп. Показано, что ингнбирование этого фермента селективным бяокагором уабаином способно существенно угнетать обратный ¿и налтосомал ькый захват катехоламинов (Sanios. 19%). И этой связи, было предположено, что угнетение обратного транспорта дофамина может осуществляться через ингибирование ферментативной активности Na'K-ЛТФазы.

Вшо исследовано влияние различных концентраций гимантана (в диапазоне от 100 мкМ до 1 мМ) на активность, ИаЛС-АТФазы а Синаптосомах сл-риатуиа Однако, препарат не

вызывал угнетения активности фермента. Было обнаружено, что гнмантап оказывает стимулирующее влияние на активность Na/K-АТФазы, с экстремумом в узком концентрационном диапазоне (рис. 10.), Показано^ что гимантан вызывает достоверное увеличение активности Na/K-АТФазы в концентрации 300 мкМ (р<$.05, t-критсрий С'тт.юдсlirai на 40% относительно базалытой активности фермента. Остальные концентраций гимантана достоверных изменений активности фермента ме вызывали, однако при концентрации 250 нкМ

и 400 мкМ наблюдалась тенденция к увеличению активности фермента Таким образом установлен куполообразный эффект препарата

Рис. 10. Зависимость активности Ка,К-АТФазы от концентрации гимантана.

Примечание * - статистически значимое отличие, р<0 05, п=6-9, U-тест Манна-Уитни

Можно предположить, что гимантан, блокируя NMDA рецепторы и оказывая антиоксидантное действие, снижает уровень свободнорадикального окисления Na/K- АТФазы, чем и вызывается активация фермента (Болдырев, 2004)

5 Изучение эффектов гимантана на уровень белка - дофаминового транспортера DAT в стриатуме крыс и культуре клеток

Покольку гимантан оказывает выраженное влияние на обратный транспорт дофамина как in vitro, так и ex vivo, представлялось интересным изучить молекулярные механизмы лежащие в основе подобных эффектов

В этой связи с помощью метода иммуноблоттинга было изучено влияние острого (24 ч ) и субхронического (7 дней) введения гимантана на концентрацию молекул белка -дофаминового транспортера в стриатуме крыс линии Вистар, а также влияние острого и субхронического режимов внесения гимантана, в диапазоне конечных концентраций от 10~7 до 10"5 М, на содержание белка DAT в культуре дофаминпозитивных клеток феохромоцитомы РС-12 (Kadota, 1996) В результате проведенного исследования было обнаружено, что гимантан через 24 часа после однократного введения в дозе 20 мг/кг (в/б), вызывает достоверное уменьшение концентрации белка DAT в гомогенатах стриатума крыс на 59% по сравнению с контролем (р<0 05, парный t-тест) При субхроническом введении, концентрация DAT также оказывается сниженной по сравнению с контролем (на 35%) Однако наблюдалось статистически достоверное увеличение относительно аналогичного значения при однократном

введении (более чем на 60%. p^Q.05, l-тест Сльюдента), что, по всей видимости, свидетельствует о тенденции к восстановлению первоначальной концентрации DAT, снизившейся под воздействием препарата (см. рис, 11).

А.

Контроль Гнмантан Контроль Гнмантан

ВАТ

24 часа

7 дней

Ь.

□ Контроль (0,9 % NaCl. 2 мл/кг, в/б)

□ Гнмантан, 20 мг/ki , в/б

3

120

[00

2 £ S а

£

X с.

I

О

SO ■ 60

40 —| 20

О

И

Ш:

щ

.У-

жй* Ш

- <V-VV

Ш-

Í

24 часа

7 дней

Рис. II. Влияние однократного и суйхроническшо введении ш.мангана на содержание йелка дофаминового транспортера ПАТ в гомогенатах стрнзтума крыс линии Wíslar.

A. - оригинальные блоты, результат трех независимых жепери ментов.

B. - графическое изображение результатов денситометра и ориг инальных Слотов

11римечание: *- статистически значимое отличие от дачакткого контроля. # -

статистически достоверное отличие от значения, отмеченного спустя 24 часа после введения i

[ имашапа, р<0.ТЬ. п~6, (-критерий Стьюде1?гф

При исследованиях на ^ульгуре клеток феохромоцитомы РС-12 было обнаружено, что гнмантан обладал активностью в узком микромолярном концепт рационном диапазоне (см. рис. 12). Наиболее выраженные изменения содержания белка DAT и культуре клеток РС-12 были обнаружены при внесении гимантана в концентрации Ю-51 М. Спустя 24 часа после внесения пшйнтан в концентрации Ю-4 М вызывал достоверное уменьшение содержания DAT на 51% но сравнению с контролем (р<0.05). При недельном субхроническом варианте внесения гнмантана (10_tT М) концентрация DAT также оставалась сниженной относительно контроля на 43% (р<0.05. (-критерий Стьюдента). Однако обнаружилась тенденция к увеличению уровня DAI на 20-22 % относительно концентрации бедка, обнаруженной через 24 часа после первого внесения гнмзнтана (р=0.07. т-критерий С ■ ыодента).

А.

Контроль \

Гимантан

DAT

24 часа

Контроль |

ПАТ

Ю^М 7 дней

Гимантан

10" М

Б.

□ Контроль

□ Гимантан, 10-5 М

□ Гимантан. iU-6 М 0 Гимантан, 10-7 М

Фг

24 часа

7 дней

Риг. 12. Влияние различных концентраций i ымаитана па содержание белка дофаминового транспортера Г>ЛТ в культуре дофамннпозитивш.тх клеток НС-12, m ± S. Е. М

А. - ориг инальные б.тоты. результат iptN независимых экспериментов.

Ь. - графическое изображение результатов денситометр ли оригинальны* блотв

Примечание: * - статистически значимое отличие , р<0,05, н=6, t-критерии Стьюдента.

Результата полученные in vitro на культуре клеток, при концентрации гимантан а Iff4 М, обнаруживают выраженную положительную корреляцию с такоьыми, полученными па препаратах стриатумов крыс линии Внстар с коэффициентом Спирмана, равным 0,92 (р=0,0005). В конечных концентрациях IÜ"7 М и 10 s М гимантан не вызывал значимых изменений к Задержании DAT, что свчдегсяьотвует об активности препарата в узком микромтдарном Концентрационном диапазоне.

Обнаруженною данные хорошо согласуются с результатами Ю. Вахтовой, относительно влияния I и мангала на экспрессию DAT, и позволяют сделать вывод о важном вкладе процессов

экспрессии белка DAT в реализации дофаминпозитивного действия противопаркинсонического препарата гимантана (Vakhitova, 2003) 6. Изучение влияния гимантана на синтез ДА.

Изучали влияние гимантана на синтез моноаминов и уровни основных нейромедиаторов в коре, стриатуме и гиппокампе мышей линии С57 Black/6 Наиболее выраженные эффекты препарата были обнаружены в стриатуме Эффекты в других структурах были незначительны (на рисунках не приводятся) Обнаружено, что гимантан при введении препарата интактным животным (не получавшим NSD1015) в дозе 20 мг/кг вызывал снижение количества ДОФА в стриатуме на 18 % от контрольного значения Также было продемонстрировано статистически значимое уменьшение СТ (на 13 %) и его метаболита 5-ГИУК (на 17 %) и СТ на 13 % соответственно (см Табл2, рис 13) Однако изменения в соотношении 5-ГИУК/СТ обнаружено не было Полученные результаты свидетельствуют о важности серотонинергического компонента в биохимических механизмах противопаркинсонического действия гимантана, поскольку известно, что серотонин усиливает активность ключевых нейрохимических и нейропатофизиологических механизмов расстройства движения при паркинсонизме Снижение сертонинергической передачи в системе базальных ганглиев ■оказывает выраженный противопаркинсонический эффект (Крыжановский, 1993) Следовательно, установленное влияние гимантана на серотонинергическую иннервацию может вносить определенный вклад в устранение проявлений паркинсонизма, включая дрожательную симптоматику

При введении гимантана на фоне NSD1015 наблюдалась тенденция к снижению ДОФА (р=0 0781 по U-тесту Манна-Уитни) (см рис 14) в ткани стриатума Обнаруженная тенденция хорошо согласуется с результатами, полученными нами на интактных животных (Таблица 2), согласно которым гимантан статистически значимо уменьшал концентрацию ДОФА в стриатуме Полученные результаты свидетельствуют о том, что гимантан в дозе 20 мг/кг оказывает умеренное ингибирующее действие на синтез ДА

Таблица 2. Влияние гимантана на содержание биогенных аминов в стриатуме мышей С57В1аск/6 (нмоль/г ткани, М± S.E.M)

ДОФА НА ДОФУК 5- гтп ДА 5-ГИУК гвк СТ ГВК/ДА

Контроль 0,74* ± 3,00± 3,22± 0,00± 57,64± 2,08*± 5,54± 5,15*± 0,10±

|шз р-р. в/б) 0,15 0,10 0,33 0,00 7,37 0,20 0,65 0,23 0,00

Гимантан 0,61* ± 2,82± 3,08± 0,00± 59,00± 1,72*± 6,08± 4,54*± 0,10±

20 мг/кг в/б 0,02 0,10 0,15 0,00 2,51 0,08 0,28 0,17 0,00

*-статистически значимое отличие, р<0 05, п=6, U-критерий Манна-Уитни

5 ОЧ Й %

й I

к я

* §

о г'

§ ..

я

I'

I I

£ £

1

9 £

л

$ л > °

53! й

^ 5 Й

5 I ч

и =

^ в я

* 2 _

2 ге к

£ 2 •

а 2 й

п С?

* « а

а Й Е 3 £ 9 ~ ^ ^ *

¡5 3 ^

с - ч

II

3

I

&

е-

с

« я Й

=> £

Й а

я 5

а в

■О 2

5 3

*

« О

Я

■а о

8 -6-

Т. в

I I

I ё

? :

{Й я

а |

VI ■ я к

% по отношению к контрольному значению

5

пип'миин пев-*

*

1[|МИ1|р11111111111111И1111|111!11Л1111

ШНН

ап

3 § I ?

а» к а "о

1 з 1 г* Й

пресинаптических ауторецепторов, которые оказывают влияние одновременно на синтез ДА и его высвобождение (Aretha, 1995, Gobert, 1995, Koeltzow, 1998)

ВЫВОДЫ.

1 Гимантан оказывает прямое in vitro влияние на рецепторы нейромедиаторов мозга крыс глутаматные рецепторы NMDA-подтипа в гиппокампе (1С50=5,5 мкМ) и дофаминовые ауторецепторы ОЗ-подтипа в стриатуме (lCso=39 мкМ) Обнаружено модулирующее воздействие субхронического введения гимантана (7x20 мг/кг/день, в/б) на подсистемы дофаминовых рецепторов D1 и D3, проявляющееся в изменении плотности рецепторов Втах без изменения их аффинности к селективным лигандам (Ка)

2 Гимантан в диапазоне концентраций от 10 мкМ до 500 мкМ достоверно ингибирует систему активного транспорта [3Н]-дофамина в синаптосомах стриатума мозга крыс in vitro Ингибирование захвата [3Н]-дофамина происходит по неконкурентному типу о чем свидетельствует двукратное снижение величины Vmax по сравнению с контролем при неизменной величине Км

3 Системное введение гимантана (20 мг/кг, 40 мг/кг, в/б) существенно изменяет активность обратного захвата [3Н]-дофамина в синаптосомах стриатума крыс через изменения величины Vmax однократное введение снижает плотность пресинаптических транспортеров дофамина, а субхроническое, напротив, приводит к их увеличению

4 Стандартные антагонисты NMDA-рецепторов и агонисты метаботропных глутаматных рецепторов mGluR оказывают ингибирующее влияние на обратный захват дофамина

5 Гимантан при однократном системном введении (20 мг/кг, в/б) вызывает значительное уменьшение содержания бежа DAT в стриатуме крыс При субхроническом введении (7x20 мг/кг/день, в/б) в стриатуме отмечается постепенное восстановление содержания белка DAT Аналогичные результаты были получены в эксперименте на культуре клеток PC-12 при внесении 1имантана в микромолярной конечной концентрации

6 Гимантан in vitro в узком концентрационном диапазоне (250-400 мкМ) обнаруживает куполообразный стимулирующий эффект на ферментативную активность синаптосомальной Na/K-АТФазы с экстремумом в области 300 мкМ

7 Гимантан при однократном системном введении (20 мг/кг, в/б) вызывает уменьшение уровня серотонина и его метаболита 5-ГИУК в стриагуме мышей

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 ДА Абаимов, Ю Ю Фирстова, Г И Ковалев Действие нового противопаркинсонического препарата гимантана на захват [3Н] -Дофамина синаптосомами стриатума крыс // Сборник тезисов докладов и стендовых сообщений конф НХО «Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты», 14-16 марта 2005, Москва, с 75

2. ДА Абаимов, Ю Ю Фирстова, М В Воронин, О В Долотов, Г И Ковалев Изучение влияний 1-й 2-аминопроизводных адамантана на связывание с дофаминовыми и глутаматными рецепторами // Мат 4-ой Международной конф «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» 13-16 марта 2006, Москва, с 3

3 Г И Ковалев, Д А Абаимов, М В Воронин, Ю Ю Фирстова Изучение ауто- и гетерорецепторных путей модуляции пресинаптического транспорта дофамина в механизме действия нового противопаркинсонического препарата гимантана m vitro // Нейрохимия, 2007, т 24, №2, с 150-156

4 ДА Абаимов, Т А Зенина-Антипова, Г И Ковалев, С Б Середенин Изучение эффектов противопаркинсонического препарата гимантана на уровень белка - дофаминового транспортера DAT в стриатуме крыс и культуре клеток // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, в печати

5. ДА Абаимов, Г И Ковалев Изучение эффектов острого и хронического введения гимантана на обратный захват [3Н]-дофамина синаптосомами стриатума крыс ex vivo // Экспериментальная и клиническая фармакология, в печати

6. ДА Абаимов, Г И Ковалев, Т А Зенина-Антипова Изучение нейрохимических и молекулярных механизмов дофаминопозитивного действия противопаркинсонического препарата гимантана ex vivo // Мат III съезда фармакологов России «Фармакология -практическому здравоохранению» 23-27 сентября 2007 года, Санкт-Петербург, в печати

7 Gl Kovalev, D A Abaimov, М V Voronin, J Yu Firstova, and О V Dolotov Study of auto-and heteroreceptor components of the presynaptic dopamine reuptake modulation m the mechanism of the in vitro action of the novel antiparkinsonian drug Hemantane // Neurochemical Journal, 2007, Vol 1, No 3, pp 253-259

Подписано в печать 04 09 2007 г Исполнено 05 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 674 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Актуальность проблемы. Болезнь Паркинсона относится к числу наиболее распространенных заболеваний в современном обществе. Как показывают результаты многочисленных эпидемиологических исследований, с возрастом частота болезни Паркинсона в популяции неуклонно увеличивается. Так, в возрастной группе до 65 лет она составляет около 1%, от 65 до 75 лет - 2% и, наконец, у лиц старше 75 лет болезнь Паркинсона встречается с частотой 3-4% (Иллариошкин, 2006; Marion, 2001). Можно заключить, что в связи с общемировой тенденцией к постепенному постарению населения актуальность данной проблемы в будущем будет постоянно возрастать.

Паркинсонизм характеризуется брадикинезией, мышечной ригидностью, амимией, а также аффективными расстройствами (депрессией) и прогрессирующей деменцией (Ilamani and Lozano, 2003). Доказано, что болезнь Паркинсона вызывается дефицитом до-фаминергической передачи в стриатуме, который, в свою очередь, обуславливается дегенерацией нейронов компактной части черной субстанции (Piccirilli, 1984; Ilamani and Lozano, 2003). Дефицит дофаминергических влияний в свою очередь неизбежно влечет за собой нарушение баланса нейромедиаторов. Наиболее серьезный вклад в развитие пар-кинсонического симптомокомплекса вносит усиление активирующих влияний глутамата и ацетилхолина, при ослаблении ингибирующих влияний дофамина. При активации глута-матергической системы реализуются токсические эффекты глутамата (Lipton, 2004), что в еще большей степени способствует дегенерации нейронов (Beal, 1992; Blandini, 1996). Данное нарушение баланса нейромедиаторных систем стриатума вызывают существенные изменения в рецепторной архитектонике (Loschmann, 1997; Stoessl and de la Fuente-Fernandez, 2003). Таким образом, наиболее эффективным подходом к терапии паркинсонизма представляется одновременная стимуляция нарушенной дофаминергической передачи с ингибированием глутамат- и холинергических проекций.

В настоящее время существует большое количество противопаркинсонических препаратов, однако большинство из них относятся к симптоматическим средствам. В этой связи остается высокой актуальность создания новых средств патогенетической терапии. Ввиду наличия большого числа патогенетических звеньев БП, наиболее перспективными представляются лекарства с комплексным механизмом действия, обладающие как дофаминопозитивными, так и нейропротекторными свойствами. Такими препаратами являются » производные адамантана (мидантан, глудантан) (Schwab, 1972; Вайншток, 1978), которые воздействуют сразу на несколько нейрохимических систем и обладают выраженными нейропротективными свойствами (Ebadi, 1996; Danysz, 1997).

В НИИ Фармакологии РАМН был синтезирован новый потенциальный иротивопар-кинсонический препарат гимантан (Ы-адамант-2-ил гексаметиленимина гидрохлорид), который превосходит амантадин по противопаркинсонической эффективности. В экспериментах in vitro показано, что гимантан в концентрации 10"5 М оказывает ингибирующее влияние на активность фермента МАО-В (Вальдман, 2003). Установлено, что гимантан в микромолярпом концентрационном диапазоне обладает свойствами неконкурентного блокатора ионного канала глутаматных рецепторов NMDA-подтипа с IC50 = 11,8 ± 0,6 мкМ. (Вальдман, 2003). В экспериментах определен спектр противопаркинсонической активности гимантана, доказаны его преимущества перед амантадином (мидантаном), показана перспективность применения гимантана для лечения ригидных и дрожательных форм паркинсонизма (Неробкова, 2000; Вальдман, 2003). В микродиализных исследованиях на крысах показано что системное введение гимантана повышает уровень экстраклеточного дофамина и вызывает дозозависимое снижение содержания метаболитов дофамина и серотонина в стриатуме крыс (Андяржанова, 2001). Таким образом, гимантан оказывает комплексное воздействие на дофаминергическую передачу, улучшая ее эффективность. В настоящее время препарат изучается в клинике. Тем не менее, изучение нейрохимических и молекулярно-биологических механизмов действия гимантана не завершено. Проведение радиорецепторных исследований фармакодинамики препарата, изучение механизмов дофаминпозитивного эффекта, а также характера взаимодействия глутамат- и дофаминергической систем в процессе реализации противопаркинсониче-ского действия препарата позволяет углубить представления о фармакологических мишенях гимантана и открывает перспективы создания на его основе новых, более эффективных препаратов.

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение нейрохимических и молекулярно-биологических механизмов действия и поиск новых фармакологических мишеней оригинального отечественного противопаркинсонического препарата гимантана. Для достижения указанной цели были сформулированы и поставлены следующие задачи:

1. Изучить с помощью метода радиолигандного связывания влияние гимантана на основные группы рецепторов участвующих в эгиопатогенезе болезни Парки неона - дофаминовые (Dl, D2 и D3) и глутаматные (NMDA) рецепторы.

2. Оценить участие системы обратного захвата дофамина в механизме модуляции ги-мантаном дофаминовой нейропередачи в стриатуме мозга крыс in vitro

3. Проанализировать влияние гимантана на пресинаптический транспорт ДА в стриа-тумах крыс в условиях эксперимента ex vivo.

4. Изучить с использованием стандартных рецепторных анализаторов взаимосвязь глутаматных рецепторов с системой транспорта дофамина.

5. Исследовать эффекты гимантана на содержание белка дофаминового транспортера DAT в стриатуме крыс и культуре клеток феохромоцитомы РС-12.

6. Изучить влияние гимантана на ферментативную активность Ыа/К-АТФазы синап-тосом стриатума крыс.

7. Исследовать влияние гимантана на синтез нейромедиаторов и уровни основных биогенных аминов вовлеченных в патогенез паркинсонизма в различных структурах мозга.

Научная новизна. На основе статистически репрезентативной серии экспериментов методом радиолигандного связывания in vitro была обнаружена тропность препаратов ада-мантановго ряда к ОЗ-рецепторам дофамина. Впервые показано модулирующее воздействие 1< нового противопаркинсонического препарата гимантана на подсистемы дофаминовых рецепторов стриатума D1 и D3, проявляющееся в изменении плотности рецепторов Втах, без изменения их аффинности к селективным лигандам (Kj) в указанной структуре. Продемонстрирована способность гимантана модулировать обратный захват дофамина в экспериментах in vitro и ex vivo. Методом иммуноблоттинга изучено влияние однократного и субхронического введения гимантана на содержание белка дофаминового транспортера DAT в стриатуме крыс линии Wistar. Впервые обнаружено, что при однократном системном введении гимантан вызывает достоверное уменьшение содержания белка DAT в гомогенатах стриатума крыс. Продемонстрировано активирующее влияние гимантана на ферментативную активность Na/K-АТФазы. Выявлено, что гимантан в дозе 20 мг/кг оказывает мягкое ингибирующее влияние на синтез ДА в стриатуме. Обнаружено достоверное снижение 1 концентрации серотонина и его метаболита 5-ГИУК в стриатуме на фоне действия препарата.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют имеющиеся представления о нейрохимических и молекулярно-биологических механизмах противопаркинсонического действия препаратов адамантанового ряда. Обнаруженные эффекты антагонистов NMDA-рецепторов глутамата на дофаминергическую нейропередачу свидетельствуют о перспективности поиска среди антагонистов NMDA-реценторов и, возможно, агонистов метаботропных рецепторов глутамата новых веществ с противонаркип-сонической активностью. В целом, полученные результаты определяют показания к применению гимантана при болезни Паркинеона как при монотерапии, так и при комбинированном применении.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

6. выводы.

1. Гимантан оказывает прямое in vitro влияние на рецепторы нейромедиаторов мозга крыс: глутаматные рецепторы NMDA-подтипа в гиппокампе (IC50—5,5 мкМ) и дофаминовые ауторецепторы ОЗ-подтипа в стриатуме (1С5о=39 мкМ). Обнаружено модулирующее воздействие субхронического введения гимантана (7x20 мг/кг/день, в/б) на подсистемы дофаt миновых рецепторов D1 и D3, проявляющееся в изменении плотности рецепторов Втах без изменения их аффинности к селективным лигандам (Kj).

2. Гимантан в диапазоне концентраций от 10 мкМ до 500 мкМ достоверно ингибирует систему активного транспорта [3Н]-дофамина в синаптосомах стриатума мозга крыс in vitro. 1

Ингибирование захвата [ Н]-дофамина происходит по неконкурентному типу, о чем свидетельствует двукратное снижение величины Vmax по сравнению с контролем при неизменной величине Км

3. Системное введение гимантана (20 мг/кг, 40 мг/кг, в/б) существенно изменяет активность обратного захвата [3Н]-дофамина в синаптосомах стриатума крыс через изменения величины Vmax: однократное введение снижает плотность пресинаптических транспортеров дофамина, а субхроническое, напротив, приводит к их увеличению. 4. Гимантан при однократном системном введении (20 мг/кг, в/б) вызывает значительное уменьшение содержания белка DAT в стриатуме крыс. При субхроническом введении (7x20 мг/кг/день, в/б) в стриатуме отмечается постепенное восстановление содержания белка DAT. Аналогичные результаты были получены в эксперименте на культуре клеток РС-12 при внесении гимантана в микромолярной конечной концентрации.

5. Стандартные антагонисты NMDA-рецепторов и агонисты метаботропных глута-матных рецепторов mGluR оказывают ингибирующее влияние на обратный захват дофамина.

6. Гимантан in vitro в узком концентрационном диапазоне (250-400 мкМ) обнаруживает куполообразный стимулирующий эффект на ферментативную активность синаптосомальпой Na/K-АТФазы с экстремумом в области 300 мкМ. к 7. Гимантан при однократном системном введении (20 мг/кг, в/б) вызывает уменьшение уровня серотонина и его метаболита 5-ГИУК в стриатуме мышей.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью настоящего исследования стало изучение нейрохимических и молекулярно-биологических аспектов фармакодинамики противопаркинсонического препарата гимантан.

Болезнь Паркинсона является одним из наиболее распространенных нейродегенера-тивных заболеваний. Общая распространенность паркинсонизма в Европе среди людей старше 65 лет составляет 1,6-1,8 случая на 100 человек. Из-за старения населения Земли ожидается, что значение паркинсонизма как проблемы здравоохранения будет возрастать. (Федорова, 2001; Tanner and Aston, 2000; de Lau and Breteler, 2006).

Одним из перспективных направлений противопаркинсонической фармакотерапии являются производные адамантана, поскольку они воздействуют сразу на несколько нейрохимических систем и обладают выраженными нейропротективными свойствами (Ebadi, 1996). Из сказанного следует, что поиск и разработка новых, более эффективных III 1С в ряду производных адамантана представляет большой практический интерес.

В ГУ НИИ Фармакологии РАМН был синтезирован новый потенциальный III 1С гимантан (И-адамант-2-ил гексаметиленимина гидрохлорид), превосходящий мидантан (амантадина гидрохлорид) по противопаркинсонической эффективности и фармакологическому спектру действия. Антикаталептогенная эффективность гимантана превосходит таковую амантадина и L-DOPA. Кроме того, гимантан обладает выраженной аптитремор-ной активностью, что выгодно отличает его от амантадина, не проявляющего антагонизма по отношению к ареколину и оксотреморину (Вальдман, 1999). Гимантан способен устранять проявления паркинсонического синдрома, вызванного МФТИ - снижает тремор, ригидность и олигокинезию у крыс и у мышей. Препарат нормализует электрическую активность хвостатого ядра, сенсомоторной коры и гиппокампа, нарушаемую МФТИ: устраняет патологически медленную активность, пароксизмальные разряды и пачки высокочастотной активности. Гимантан превосходит по эффективности леводопу, усиливающую тремор, и циклодол, который не устраняет медленную активность (Неробкова, 2000).

Однако, относительно нейрохимических механизмов, лежащих в основе иротивопар-кинсонических эффектов гимантана известно сравнительно немного. Так, продемонстрировано ингибирующее влияние гимантана на активность МАО-В (Kj = 470 ± 70 мкМ) (Вальдман, 2003). Показано, что гимантан неконкурентно блокирует канал NMDA-рецептора по типу «trapping block» (IC5o= 11.8 ± 0.6 мкМ) (Елшанская, Соболевский, Вальдман, 2000). В микродиализных исследованиях на крысах показано увеличение внеклеточного содержания ДА в стриатуме (Андяржанова, 2001). Таким образом, гимантан оказывает комплексное воздействие на ДАЭ передачу, улучшая ее эффективность. Вместе с тем обнаруженные нейрохимические механизмы не позволяют в полной мере объяснить отдельные нротивопаркинсоничеекие эффекты препарата, например его антагонизм с нейролептиками галоперидолом и трифтазином (Вальдман, 1999), который предполагает влияние препарата на рецепторы дофамина. Невыясненным остается механизм, посредством которого препарат вызывает увеличение экстраклеточной концентрации дофамина, т. е. неизвестно, связан ли этот эффект с усиленным высвобождением медиатора, угнетением обратного захвата дофамина, либо это связано с увеличением синтеза ДА под действием гимантана.

В этой связи представляло существенный интерес исследовать возможные эффекты гимантана на различные пре- и постсинаптические нейрохимические звенья дофаминер-гического синапса - изучить влияние препарата на синтез, обратный захват и основные группы рецепторов дофамина.

Одной из важных задач данного исследования стало изучение влияния гимантана на основные группы ДА-рецепторов стриатума крыс. Также представлялось важным провести сравнительное исследование гимантана и амантадина по выраженности эффектов на гиппокампальные NMDA-рецепторы глутамата.

На первом этапе исследования нами было изучено влияние 1- и 2-аминопроизводных аминоадамантана на связывание селективного канального лиганда фен цикл идинового сайта

G-3H] (+)МК-801 (дизоцилпина) с глутаматными рецепторами NMDA-подтипа мембран гиппокампа крыс. Как амантадин, так и гимантан наиболее эффективно смещали меченый Лиганд в концентрационном диапазоне от 4 до 6 мкМ: величины констант полу-иигибирования IC50 соответствовали 5,5 мкМ у гимантана и 4,0 мкМ у амантадина. Поскольку именно с воздействием на NMDA-рецепторы связывают нейропротекторные свойства адамантанов, можно предположить, что благодаря этим характеристикам гимантан не будет уступать амантадину по способности подавлять глутаматную эксайтотоксич-ность (Lustig, 1992).

Следующим этаном стало изучение влияния гимантана на основные группы рецепторов дофамина стриатума крыс. В исследованиях по связыванию селективных меченых ли-гандов in vitro было обнаружено, что гимантан не оказывает прямого стимулирующего действия на ДА рецепторы подгрупп D1 и D2, поскольку значимого сродства к местам связывания стандартных лигандов данных рецепторов у препарата обнаружено не было. На этом основании хотелось бы подчеркнуть, что в механизмах облегчения ДА-ергической передачи, по всей видимости, наиболее важен пресииаптический компонент.

Однако, нами показано, что препарат обладает способностью смещать с рецепторных мест связывания селективный лиганд ОЗ-рецепторов [G3-H] 7-ОН DPAT с величиной IC50 = 39 мкМ, что свидетельствует о тропности препарата по отношению к ОЗ-рецепторам дофамина. По аффинности к D3 рецепторам гимантан значительно превосходил препарат сравнения амантадин, величина 1С5о которого равнялась 360 мкМ.

Полученные данные представляет особый интерес, поскольку пресинаптические дофаминовые ауторецепторы D3 играют важную роль в процессах регуляции синтеза и высвобождения дофамина из пресинаптических окончаний (Aretha, 1995; Gobert, 1995; Koeltzow, 1998), а, следовательно, оказывают модулирующее влияние на уровень синап-тически активного ДА. Кроме того, появились сведения о тесной взаимосвязи пресинаптических рецепторов D3 с системой обратного транспорта ДА (Joyce, 2004). Исходя из этого можно предположить, что связывание гимантана и амантадина с ОЗ-рецегпорами вносит определенный вклад в формирование ДА-позитивного профиля действия препаратов этого ряда.

В исследованиях на самцах крыс ex vivo было показано, что при субхроническом (7 дней) введении гимантан существенно изменял характеристики радолигандного связывания D1 и D3 рецепторов дофамина в стриатуме. Препарат вызывал увеличение количества мест связывания Втах для селективного антагониста D1 рецепторов [G-3H] SCII 23390 более чем на 20% по сравнению с контролем без изменения Kj Известно, что дофаминерги-ческая денервация неостриатума при болезни Паркинсона ведет к повышению активности структур, находящихся под контролем D2 рецепторов и снижению регулируемых D1 рецепторами (Miller, 1987; Gerfen, 1992). В результате происходит серия функциональных изменений в базальных ганглиях (Albin, 1992). Обнаруженные в эксперименте эффекты гимантана, по всей вероятности, могут предотвращать подобные патологические изменения в балансе подгрупп дофаминовых рецепторов дофамина.

Величина Bmax для селективного лиганда D3 рецепторов [G-3H] (+) 7-ОН DPAT в стриатуме, напротив, достоверно снижалась на 30% по сравнению с аналогичным значением в контроле. Величина K<j характеризующая аффинитет лиганда по отношению к рецептору, как и в первом случае, не претерпевала изменений под действием препарата. Подобное снижение количества активных рецепторов D3 в стриатуме может быть связано с прямыми эффектами гимантана на данную подгруппу рецепторов, что может вызывать их функциональную инактивацию. Поскольку известно, что ОЗ-рецеиторы имеют преимущественно пресинаптическую локализацию и оказывают регулирующее влияние на уровень экстраклеточного дофамина, можно предположить, что изменения их содержания иод действием гимантана положительно влиять на внеклеточную концентрацию нейромедиа-тора, тем самым повышая эффективность дофаминергической передачи. v

Считается, что патогенетической основой повреждения нигростриатных нейронов при паркинсонизме является окислительный стресс (Cohen, 1983). Эта гипотеза легла в основу формирования новых подходов к лечению паркинсонизма, направленных на устранение последствий окислительного стресса за счет блокады NMDA-рецепторов, индукции синтеза нейротрофинов, а также за счет ингибирования МАОВ и обратного захвата ДА (Крыжановский, 2002; Ebadi, 1996). Вместе с тем, действие гимантана на обратный захват в стриатуме до сих пор не изучено. В этой связи следующим этапом нашей работы стало изучение влияния гимантана на систему обратного захвата дофамина. Для решения данной проблемы представлялось важным оценить участие системы обратного захвата дофамина в механизме модуляции гимантаном дофаминовой нейропередачи в стриатуме мозга крыс in vitro, изучить кинетику ингибирования гимантаном обратного захвата in vitro и ex vivo, провести сравнительные исследования эффектов гимантана и других производных адамантана на процесс захвата ДА, а также изучить с использованием стандартных рецепторных анализаторов взаимосвязь глутаматных рецепторов с системой транспорта дофамина.

В результате проведенных исследований in vitro удалось установить, что гимантан ингибирует захват [3Н]-ДА в диапазоне 10-500 мкМ, причем 50%-ное ингибирование осуществляется в концентрации 200 мкМ.

Поскольку препаратом сравнения для гимантана является амантадин, нами было ! проведено сравнительное изучение влияния его и гимантана на захват [3Н]-ДА синапто-сомами стриатума. Этот интерес усиливался уже имеющимися сведениями о сопоставимости их эффектов по способности блокировать канал NMDA-рецептора (Елшанская, Соболевский, Вальдман, 2000; Sobolevsky and Yelshansky, 2000), а также новыми данными, полученными в результате экспериментов по радиорецепторному связыванию [G-3H| (+)МК-801, которые также свидетельствовали об эквивалентном влиянии обоих препаратов на NMDA-рецепторы. Сопоставление показало, что гимантан превосходит амантадин по способности ингибировать захват [ Н]-ДА синаптосомами - ингибирующий эффект гимантана обнаруживался уже в концентрации 10 мкМ, неактивной для амантадина. В концентрации ЮОмкМ захват [3Н]-ДА для гимантана и амантадина составлял 64±6% и \ 73±9%, соответственно.

При кинетическом анализе гимантан (100 мкМ) проявил неконкурентный характер ингибирования. Показатели кажущейся Vmax (пмоль/мин/мг белка) составляли 9.00 и 5.08 для контроля и гимантана, соответственно, что предполагает уменьшение вдвое числа активных переносчиков дофамина. Изменение величины Км не было статистически достоверным. Полученные данные согласуются с результатами Ю. Вахитовой и соавторов, которые продемонстрировали, что 67%-ное ингибирование экспрессии гена переносчика дофамина, оцененной методом RT-PCR, гимантаном (10 мг/кг, в/б) наступает на 2-м часу после введения, когда его уровень в ткани стриатума достигает максимума (Vakhitova, 2003).

Исходя из обоснованной на разных уровнях взаимосвязи ДАЭ и глутаматергиче-ской систем стриатума, представлялось целесообразным изучить действие антагонистов и агонистов глутаматных рецепторов на систему обратного захвата ДА стриатных сииаито-сом.

В экспериментах с веществами-анализаторами in vitro было обнаружено, что неконкурентный высокоаффинный канальный блокатор NMDA-рецепторов МК-801 достоверно ингибировал обратный захват 3Н-ДА уже в концентрации 1мкМ. При концентрации 10 мкМ значение захвата Н-ДА составляло 68±9% от контроля. В свою очередь, ЮОмкМ МК-801 иугибировали захват [3Н]-ДА на 88%.

Далее представлялось важным выяснить влияние конкурентных антагонистов NMDA-рецепторов на захват 3Н-ДА синаптосомами стриатума крыс. Конкурентные антагонисты NMDA-рецепторов взаимодействуют с глутамат-связывающим участком NMDA-рецептора и не позволяют нейромедиатору (L-глутамат) активировать ионный канал. Для оценки действия конкурентных антагонистов NMDA-рецепторов на захват 3Н-ДА синаптосомами стриатума крыс были проведены эксперименты с (+/-)-СРР - селективным конкурентным антагонистом глутаматных рецепторов NMDA-подтипа (Lehmann, 1987). В наших экспериментах концентрации (+/-)-СРР 0.1 и 1мкМ являлись неэффективными и практически не влияли на захват 3Н-ДА. Однако при концентрациях 10 и 100 мкМ величина захвата П-ДА составляла 24±2 и 10±2% от контроля (100±7), соответственно.

При сравнении характера ингибирования захвата [ Н]-ДА веществами (+/-)-СРР и МК-801 характерна скачкообразная зависимость ингибирующей активности от концентрации для СРР и более «пропорциональное» ингибирование для МК-801.

Важно подчеркнуть, что все соединения, которым свойствен антагонизм по отношению к рецепторам ВАК, в частности, к эффектам NMDA-рецепторов, оказывали инги-бирующее влияние на захват [3Н]-ДА синаптосомами стриатума крыс. Указанный факт подтверждает гипотезу о модулирующем значении глутаматных рецепторов NMDA-подтипа в регуляции активности DAT и ДА-нейропередачи в целом.

Учитывая, что по всей видимости, именно взаимодействие с NMDA-рецептором, было фактором, вызвавшим угнетение активности DAT, было предположено, что активация NMDA-рецептора будет, напротив, стимулировать обратный захват ДА. Для проверки этого предположения нами использовались агонист глутаматных рецепторов NMDA-подтипа - ^метил-О-аспартат и агонист рецепторов АМРА-подтипа, а также метабо-тропных глутаматных (mGluR) -квисквалат. Как оказалось, NMDA во всех концентрал циях не влиял на захват [ Н]-ДА синаптосомами. Квисквалат в концентрации ЮОмкМ достоверно ингибировал захват [3Н]-ДА: величина захвата составляла 63±8% от контроля. Выше уже отмечалось, что квисквалат является агонистом метаботропных глутаматных

95 рецепторов (mGluRs). Поэтому можно согласиться с предположением Page и соавторов о том, что указанный тип рецепторов осуществляет модуляцию активности DAT в стриату-» ме через механизм фосфорилирования участков молекулы DAT (Page, 2001).

В научной литературе широко представлено мнение относительно неспособности препаратов адамантанового ряда в физиологических концентрациях оказывать значимое влияние на дофаминергическую нейропередачу и на такое ее важное звено, как обратный захват медиатора в экспериментах in- и ex vivo. В частности считается, что амантадин может вызывать увеличение внеклеточной концентрации дофамина только при введении препарата в дозе, десятикратно превосходящей терапевтическую (Kornhuber, 1995; Danizs, 1997). В этой связи, полученные нами данные относительно влияния гимантана на обратный захват дофамина in vitro потребовали дальнейшего изучения и подтверждения на моделях ex vivo.

В результате серии экспериментов, проведенных на крысах-самцах линии Wistar, было обнаружено, что гимантан в дозе 40 мг/кг при остром введении достоверно снижает скорость обратного захвата [3Н]-ДА в синаптосомах стриатума крыс: величина Vmaxiia фоне действия препарата уменьшилась более чем на 30% - с 51,26 пмоль/мин/мг белка в контроле до 32,44 пмоль/мин/мг белка в опыте (статистически значимое отличие, р<0,05). Величина аффиности Кт оставалась неизменной (0,5 мкМ), что свидетельствует о неконкурентном характере ингибирования. При субхроническом введении в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней гимантан, напротив, увеличивал кажущуюся величину Vmilx обратного захвата [3П]-ДА на 17%: с 51,49 пмоль/мин/мг в контрольной группе до 61,76 пмоль/мин/мг в опыте.

Полученные результаты могут быть связаны с компенсаторным механизмом, направ-\ ленным на поддержание гомеостаза дофамина в синаптической щели: известно, во-первых, что ауторецепторы дофамина подгруппы D2 в ответ на увеличение экстраклеточной концентрации дофамина могут вызывать увеличение обратного захвата нейромедиа-тора. Во-вторых, активация систем обратного захвата дофамина может быть индуцирована агонистами 02-рецепторов, например, квинпиролом (Ruiu and Pignatelli, 1988). Можно предположить, что увеличение обратного захвата дофамина, наблюдаемое в ответ на введение гимантана, является следствием непрямой модуляции активности DAT со стороны пресинаптических рецепторов дофамина 02-подгруппы в ответ на увеличение внеклеточной концентрации дофамина под действием препарата.

Таким образом, полученные в нашем исследовании результаты в целом свидетельствуют о важном участии дофаминового транспортера DAT в дофаминпозитивном механизме реализации противопаркиисонического действия препаратов адамантанового ряда, в частности, гимантана. Результаты острого эксперимента ex vivo также указывают на большую по сравнению с мидантаном (амантаднном) степень воздействия гимантана на процесс обратного захвата дофамина.

Следующей важной задачей настоящего исследования стало изучение клеточных и молекулярно-биологических механизмов, лежащих в основе ингибирующего действия гимантана на обратный захват дофамина.

Известно, что источником энергии для активного транспорта дофамина является трансмембранный концентрационный электрохимический градиент ионов Na. За формирование и поддержание градиента ионов натрия отвечает мембранный фермент - Na/K-АТФаза (натрий-калиевый насос). Показано, что ингибирование этого фермента селективным блокатором уабаином способно существенно угнетать обратный синаптосомальный захват катехоламинов (Santos, 1996). В этой связи, мы предположили, что угнетение обратного транспорта дофамина может осуществляться через ингибирование ферментативной активности Na/K-АТФазы. Однако, нами было обнаружено, что гимантан не ингиби-рует Ыа/К-АТФазу, а в концентрации 200 мкМ даже вызывает увеличение активности данного фермента на 40% относительно базальной активности. Полученные результаты можно объяснить с точки зрения обнаруженных у гимантана антиоксидантных свойств и свойств неконкурентного блокатора NMDA-рецепторов. Так, А.А. Болдыревым и соавторами показано, что агонисты глутаматных рецепторов, прежде всего М-метил-П-аспартат, способны вызывать ингибирование активности Na/K-АТФазы, которое легко купируется с помощью дизоцилпина (Болдырев, 2006). Авторы связывают подобные изменения со сво-боднорадикальными процессами, которые активизируются при входе Са2+-ионов внутрь клетки после открытия каналов NMDA-рецепторов. Можно предположить, что гимантан, блокируя NMDA рецепторы и оказывая антиоксидантное действие, снижает уровень сво-боднорадикального окисления Na/K- АТФазы, чем и вызывается активация фермента.

На следующем этапе исследования было изучено влияние острого и субхронического введения гимантана непосредственно на содержание молекул дофаминового транспортера DAT в стриатуме крыс. В результате проведенного исследования было обнаружено, что гимантан через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения в дозе 20 мг/кг, вызывал существенное уменьшение содержания белка DAT в гомогенатах стриатума крыс на 59% по сравнению с контролем (р<0.05, парный t-тест). При субхроническом введении содержание DAT также было сниженным по сравнению с контролем (на 35%). Однако наблюдалось статистически достоверное увеличение относительно аналогичного значения при однократном введении (более чем на 60%, р<0.05, t-тест Стьюдента), что но всей видимости, свидетельствует о тенденции к восстановлению первоначальной концентрации DAT, снизившейся под воздействием препарата.

Аналогичные результаты были получены в исследованиях на культуре дофаминпози-тивных клеток феохромоцитомы PC-12. Данные, полученные in vitro на культуре клеток при концентрации гимантана 10"6 М обнаруживают выраженную положительную корреляцию с таковыми, полученными на крысах линии Вистар с коэффициентом Спирмана равным 0,92 (р=0,0005). Обнаруженные данные хорошо согласуются с результатами относительно влияния гимантана на экспрессию DAT (Vakhitova, 2003) и позволяют сделать вывод о важном вкладе процессов экспрессии белка DAT в реализации дофаминпозитив-ного действия противопаркинсонического препарата гимантана. Известно, что элиминация гена DAT у мышей может приводить к увеличению уровня экстраклеточного дофамина в мозге животных. Можно предположить, что гимантан вызывает угнетение экспрессии гена белка дофаминового транспортера, последствием чего может являться многократное увеличение концентации медиатора в синаптическом пространстве, аналогично тому, как это имеет место у животных, нокаутных по гену DAT (Jones, 1998).

Завершающим этапом наших исследований стало изучение влияния гимантана на синтез ДА и содержание основных биогенных аминов в гомогенатах стриатума мышей линии С57В1аск/6 с помощью метода ВЭЖХ/ЭД, в результате которого было показано, что препарат в дозе 20 мг/кг оказывает умеренное ингибирующее действие на синтез ДА в стриатуме (при введении гимантана на фоне NSD1015 наблюдалась тенденция к снижению ДОФА (р=0.0781 по U-тесту Манна-Уитни). Кроме того, было обнаружено влияние гимантана на серотонинергические системы стриатума, которое выражалось в уменьшении тканевого уровня СТ и его метаболита 5-ГИУК. Полученные данные хорошо согласуются с результатами микродиализных исследований (Андяржанова, 2001), в которых было продемонстрировано уменьшение внеклеточного содержания 5-ГИУК. На основании этого авторы выдвинули предположение о влиянии гимантана на серотонинергическую систему стриатума в целом. Полученные нами результаты подтверждают это предположение и свидетельствуют о важности серотонинергического компонента в биохимических механизмах противопаркинсонического действия гимантана. Так, известно, что серотонин усиливает активность ключевых нейрохимических и нейропатофизиологических механизмов расстройства движения при паркинсонизме. Снижение сертонинергической передачи в системе базальных ганглиев оказывает выраженный противопаркинсонический эффект (Крыжановский, 1993). Следовательно, установленное влияние гимантана на серотонинергическую иннервацию может вносить определенный вклад в устранение проявлений паркинсонизма, включая дрожательную симптоматику.

Таким образом, результаты исследования подтверждают участие дофамин-, глутамат-и серотонинергической нейромедиаторных систем в реализации противопаркинсониче-ских эффектов гимантана, причем, наиболее важную роль в механизме регуляции пейропередачи играют, по-видимому, прееинаптичеекие компоненты дофаминергической и глутаматергической систем, такие как ДА-ауторецепторы группы D3, глутаматные гете-рорецепторы группы NMDA и дофаминовый транспортер DAT. Внутриклеточные механизмы данного ингибирующего воздействия могут быть опосредованы каскадом вторич

2 f ных посредников, таких как цАМФ, Са , ДАГ и системой протеинкиназ, что требует специальных исследований.