Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Изучение роли серотонинергического компонента в механизме действия противопаркинсонического препарата гимантана

На правах рукописи

Зимин Иван Алексеевич

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКОГО КОМПОНЕНТА В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ГИМАНТАНА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук " ОЕВ 2011

МОСКВА-2011

4854120

Работа выполнена в НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Ковалёв Георгий Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Жердев Владимир Павлович

доктор биологических наук, профессор Каменский Андрей Александрович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет имени Н. И. Пирогова Росздрава

Защита состоится «_» _ 20Иг. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 001.024.01 при НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в учёной части НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН по адресу: 125315,г.Москва,ул.Балтийская,д.8.

Автореферат разослан «_»_2011 года.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Паркинсона (БП) относится к числу распространённых заболеваний в современном обществе. Как показывают результаты многочисленных эпидемиологических исследований, частота БП неуклонно увеличивается с возрастом. Так, в группе до 65 лет она составляет около 1%, от 65 до 75 лет - 2% и у лиц старше 75 лет встречается с частотой 3-4% (Иллариошкин, 2006; Marion, 2001). Таким образом, в связи с тенденцией к постепенному старению населения актуальность данной проблемы будет постоянно возрастать.

Клинические проявления БП характеризуются тремором, брадикинезией, мышечной ригидностью, а также аффективными расстройствами (депрессией) и прогрессирующей деменцией (Hamani and Lozano, 2003). Изначально причиной заболевания считали нарушение исключительно дофаминергической передачи (Piccirilli, 1984). Однако в дальнейшем было установлено, что наряду с указанными нарушениями в дофаминергической передаче, на развитие патологии могут влиять и изменения в других медиаторных системах. Так, при двигательных нарушениях, связанных с нейродегенеративными процессами в стриатуме, патологическим изменениям подвергается и серотониновая система. У больных паркинсонизмом в большинстве исследований in vivo и post mortem были обнаружены серьёзные нарушения серотонинергической трансмиссии (Chen, 1998; Hornykiewicz, 1998). Исследования показывают, что при БП значительно снижается уровень серотошша (CT) в коре, гиппокампе (Agid and Bim, 1987; Shannak, 1994), уменьшение содержания CT также выявляют в гипоталамусе и стриатуме (Kish, 2008).

Нарушения в серотонинергической системе проявляются рядом паркинсонических симптомов, таких как: моторные нарушения; изменения настроения; когнитивные расстройства; нарушения гастроинтестинальных функций организма (Schmitt, 2000; Fox, 2009). Считается, что серотонинергическая система также вовлечена в развитие дискинезии, вызванной приёмом L-DOPA (Fox, 2009).

В связи с наличием нескольких патогенетических факторов БП, вовлечённости моноаминергической, глутаматергической, ацетилхолиновой и других систем, терапия данного заболевания подразумевает применение комбинаций противопаркинсонических средств (ППС) с различным механизмом действия (Морозов и др., 2001). Перспективными считаются препараты, способные воздействовать сразу на несколько нейрохимических систем. К таким веществам относится производное адамантана - гимантан (1-(2-адамантил)-азациклогептан гидрохлорид), разработанный в НИИ фармакологии РАМН. Гимантан оказывает дозозависимое модулирующее влияние на активность дофамин- и серотонинергической нейромедиаторных систем в стриатуме (Андяржанова, 2001; Абаимов, 2009), обладает свойствами низкоаффинного блокатора ионных каналов глутаматных рецепторов NMDA-подтипа, избирательно ингибируег фермент МАО типа В, имеет

слабовыраженную антирадикальную активность и иммуномодулирующее действие (Вальдман, 2001, 2003). Препарат оказывает комплексное воздействие на ДАЭ передачу, улучшая её эффективность (Абаимов, 2007, 2008, 2009; Ковалев, 2007). В экспериментах определен спектр противоларкинсонической активности гимантана, доказаны его преимущества перед амантадином (мидантаном), показана перспективность применения гимантана для лечения ригидных и дрожательных форм паркинсонизма (Неробкова, 2000; Вальдман, 2004). Положительные эффекты гимантана, выявленные на животных, были подтверждены в клинических исследованиях. Пилотные исследования гимантана на пациентах с БП показали, что препарат хорошо переносится больными, вызывает значительное уменьшение двигательных расстройств (тремора) и оказывает положительный эффект на эмоциональную сферу (Катунина, 2008).

С учётом признанной сегодня вовлечённости серотониновой системы в патогенез БП и недостатка сведений о способности препарата влиять на серотонинергическую передачу, в том числе на моделях патологии, оценка серотонинергического компонента в нейрохимическом спектре действия гимантана представляется целесообразной и необходимой.

Цель исследования. Изучение пре- и постсинаптических серотонинергических звеньев и их взаимодействия с дофаминергическими компонентами нейрохимического механизма действия препарата гимантана в норме и при моделировании паркинсонического синдрома.

Основные задачи исследования:

1. Произвести сравнительное изучение с помощью метода радиолигандного связывания влияния гимантана и других производных адамантана на группы рецепторов, участвующих в этиопатогенезе болезни Паркинсона, - глутаматные (NMDA) рецепторы, дофаминовые Г)з- и серотониновые 5-HTia- и 5-НТгА-рецепторы в условиях in vitro.

2. Исследовать влияния субхронического введения гимантана на характеристики связывания селективных лигандов с Di-, 5-HTia- и 5-НТ2А-рецепторами компетентных структур мозга крыс в условиях ex vivo.

3. Произвести сравнительный анализ участия системы обратного захвата серотонина и дофамина в механизме модуляции гимантаном и другими производными адамантана нейропередачи моноаминов в головном мозге крыс в условиях in vitro.

4. Изучить влияния гимантана на синаптосомальный захват [3Н]-СТ фронтальной коры крыс в условиях ex vivo.

5. Исследовать влияние гимантана и препарата сравнения - амантадина на содержания белков SERT и DAT в компетентных структурах мозга мышей линии С57В1/6.

6. Исследовать влияние гимантана и препарата сравнения - амантадина на основные пре-и постсинаптические звенья серотониновой и дофаминовой нейросистем в условиях МРР+ и МРТР-индуцированных моделях патологии.

Научная новизиа работы. Впервые методом радиолигандного связывания показано модулирующее воздействие нового противопаркинсонического препарата гимантана lia D|-рецепторы стриатума, 5-НТ1А-рецепторы гиппокампа и 5-нт2а-рецепторы фронтальной коры крыс, проявляющееся в изменении плотности рецепторов, без изменения их аффинности к селективным лигандам в указанных структурах как в норме, так и при МРР+-индуцированной патологии. Продемонстрирована способность гимантана и других производных адамантана модулировать обратный захват серотошша в экспериментах in vitro и ex vivo. Впервые методом иммуноблотгинга обнаружено, что при однократном системном введении гимантан вызывает увеличение содержания белка серотонинового транспортёра (SERT) как в исследовании на культуре гшшокамиальных клеток НТ-22, гак и в гомогенаш гиппокампа мышей линии С57В1/6 в норме и при МРТР-индуцированной патологии. Острое введение препарата уменьшает содержание белка дофаминового транспортёра (DAT) в гомогенатах стриатума мышей линии С57В1/6 в норме и при МРТР-индуцированной патологии, а субхроническое введение вызывает противоположный эффект.

Научно-практическая значимость. Исследования эффектов адамантанов на серотонинергическую систему расширили существующие представления о фармакологических мишенях препаратов адамантанового ряда, а также позволили углубить знания о нейрохимических механизмах их противопаркинсонического действия. Полученные результаты позволяют более рационально применять гимантан при болезни Паркинсона как для монотерапии, так и при комбинированном лечении. В частности, дают основания для применения в терапии пациентам с проявлениями аффективных и когнитивных расстройств. Обнаруженные эффекты спектра действия изученных производных адамантана на серотонинергическую нейропередачу свидетельствуют о перспективности поиска среди антагонистов глутаматных рецепторов новых веществ с противопаркинсоннческой активностью. Более детальное изучение серотонинергического компонента в нейрохимической фармакологии адамантанов открывает перспективу создания на их основе других противопаркинсонических препаратов с селективными эффектами на разные звенья серотонинергической системы.

Апробация диссертации. Материалы диссертация были представлены на заседании учёного совета НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (май, 2010), V международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (июнь, 2010), межлабораторной конференции НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (декабрь, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, из них 4 статьи в центральных журналах и 1 тезисы.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на/3$*страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 3 главы результатов собственных исследований и их обсуждений, заключение, выводы, список литературы, включающий отечественных иЗЙОзарубежных источников. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 26 рисунками.

Материалы и методы.

1. Животные

В исследованиях по радиолигандному связыванию использовали половозрелых беспородных крыс-самцов или крыс-самцов линии Wistar массой 200-250 г. Для изучение содержания белков-транспортёров DAT и SERT использовали мышей-самцов линии С57В1/6.

2. Раднолигандное связывание

2.1, Изучение радиолигандного связывания с серотониновыми рецепторами 5-НТи- и 5-НТы-подтипов и с D¡- и Ds-nodmunaим pei¡enmopoe дофамина

Изучение радиорецепторного связывания с 5-НТ1д-рецепторами серотонина проводили по методу Rydelek-Fitzgerald et al. (1990) с модификациями, с б-НТгд-рецепторами серотонина — по методу Leysen et al. (1982) с модификациями, с Di-рецепторами дофамина — по методу Sun et al. (2003) с модификациями, с Бз-рецепторами дофамина — по методу Hillefors and Euler (2001) с модификациями. Животных декапитировали, извлек&чи стриатумы, гиппокамп и фронтальную кору, из которых получали фракцию мембран. Мембраны инкубировали в течение 2-ух часов при температуре 25"С для связывания с 7-OH-[G-3H]-DPAT, в течение 1 часа при температуре 25°С для связывания с 8-OH-[G-3H]-DPAT и в течение 30 минут при температуре 37°С для связывания с [G-3H]-SCH23390 и [G-3H]-Ketanserin в инкубационном буфере. Инкубационный буфер для связывания с Оз-рецепторами содержал 50 mM Tris-base, 1 тМ EDTA, 5 mM MgCh и 0,01% аскорбиновой кислоты; для связывания с 5-НТ]А-рецепторами - 50 mM Tris-base; для связывания с D|- и 5-НТ2д-рецепторами - 50 mM Tris-base, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 x 2H20,1 mM MgCl2x 6H20.

2.2. Изучение радиолигандного связывания с NMDA-рецепторачи глутамата

Изучение связывания с NMDA-подтипом рецепторов производили согласно методу Nowak et al. (1993) с модификациями. Использовали [G-3H]-MK-801 (дизоцилпин). Мембранную фракцию инкубировали в течение 2-ух часов при температуре 25 "С в буфере, содержащем 5 мМ HEPES и 4,5 мМ Tris-base.

По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman). Фильтры высушивали, переносили в сцинтилляционные флаконы, заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости Брея. Радиоактивность проб определяли на сцинтилляционном счётчике Tri-Carb 2900 TR (Perkin Elmer) с эффективностью счёта около 45%.

3. Синаптосомальнып захват [3Н]-ДА и [3Н]-СТ

Процедуру захвата проводили по протоколу Peeters et al. (2002). Для проведения реакции захвата использовали среду инкубации, содержащую 125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1.2 мМ MgS04, 1.2 мМ СаСЬ, 10 мМ HEPES, 10 мМ D-глюкозы, 20 мкМ раствора паргилина (pH = 7,4 при 37°С). Для определения доли неспецифических процессов вместо среды инкубации использовали 0,32 M раствор сахарозы, содержащий 1 ОмМ Tris-HCl (pH = 7,4 при 4°С) и 50 мкМ номифензина (ингибитор обратного захвата дофамина) или 50 мкМ пароксетина (ингибитор обратного захвата серотонина), в которой синаптосомы инкубировали при 0-4°С.

Реакцию останавливали быстрой ультрафильтрацией через стекловолокнистые фильтры Whatman GF/B, которые переносили в сцинтилляционные флаконы со сцинтилляционной жидкостью Брея, после чего измеряли уровень их радиоактивности с помощью сцинтилляционного счётчика Tri-Carb 2900 TR (Perkin Elmer) с эффективностью счёта около 45%.

4. Изучение влияния адамантаиов на содержания белков серотонинового (SERT) и дофаминового (DAT) транспортёров в гомогснатах компетентных структур мозга мышей и культуре клеток НТ-22

Содержание SERT определяли в цитоплазматической фракции мышиных иммортализованных гиппокампальных клеток НТ-22 и цитоплазматической фракции гомогенатов гиппокампа и фронтальной коры мышей линии С57В1/6, содержание DAT определяли в цитоплазматической фракции гомогенатов стриатума и фронтальной коры мышей линии С57В1/6 с использованием методов электрофореза в ПААГ и последующего иммуноблоттинга. Методика Вестерн-блота проводилась по методу Malyshev et al. (1996).

5. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакета программ Statistika 6.0 и Graphpad Prism 5 Demo. При обработке полученных результатов использовали методы параметрической и непараметрической статистики согласно «Методическим рекомендациям по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Автор выражает глубокую благодарность за техническое и консультационное содействие зав. опытно-технологического отдела, д.х.н., профессору Пятину Б.М.; зав. лабораторией фармакологии нейропрогекции, к.б.н. Антиповой Т.А.; с.н.с. лаборатории психофармакологии, к.б.н. Капица И. Г.; д.х.н., профессору Золотарёву Ю.А. (ИМГ РАН); к.б.н. Абаимову Д.А.

1. Сравнительное изучение влияния адамантаиов на основные группы рецепторов, вовлечённых в этиопатогенез болезни Паркинсона

1.1. Сравнительное изучение влияния гимантана и других производных адамантана на гиппокампальные глутаматныс рецепторы NMDA-подтипа, Рз-подтип дофаминовых рецепторов стриатума, гиппокампальные 5-НТи-подтип серотониновых рецепторов и 5-НТ2л-подтнп серотониновых рецепторов фронтальной коры крыс (in vitro)

Результаты экспериментов in vitro оценивали с помощью рассчитанной величины IC50, представляющей собой концентрацию, в которой препарат ингибирует специфическое связывание лиганда с соответствующим рецептором на 50%.

NMDA-nodmun глуталштныхрецепторов

Нами было изучено влияние 1-аминопроизводных амиивадамантана (амантадин, мемантин, 1-(1-адамантил)-азациклогептан (1-ААЦГ)), 2-аминопроизводных »шпоадамантана (2-аминоадамантан, гимантан, ладасген), а также оксипроизводных амн«еадамантана (кемантан) на связывание селективного канального лиганда фенциклидинового сайта [G-3H]-МК-801 (дизоцилгшна) с глутаматными рецепторами NMDA-подтила мембран гиппокампа крыс (рис. 1). Наиболее выраженный эффект оказывал мемантин (ICso=l ,14мкМ). Известно, что данный препарат используется в терапии деменции, связанной с болезнью Альцгеймера. Считается, что его нейропротекторный эффект реализуется именно посредством неконкурентного антагонизма NMDA-рецепторов (Berger, 1994). Остальные 1- и 2-аминопроизводные адамантана обнаружили однородный характер влияния на этот подтип глутаматных рецепторов и ингибировали связывание [3Н]-МК-801 в диапазоне 1С5о=15-28 мкМ. В отличие от аминопроизводных адамантана, кемантан (оксипроизводное) не проявил влияния на NMDA-рецепторы гиппокампа крыс. Поскольку величина полуингибирования связывания [3Н]-МК-801 для гимантана (1С>о=20,03 мкМ) попадает в диапазон большинства изученных производных адамантана, можно предположить, что гимантан не уступает этим 1 -и 2-аминопроизводным адамантана по способности подавлять глутаматную эксайтотоксичностъ, так как именно с воздействием на NMDA-рецепторы связывают нейропротекторные свойства адамантанов (Lipton, 2004).

I

I «он * s

а

Щ, О 75Н I

50-

25-

0-

.......

--1 i\

rv

iV

кемантан

амантадин

1-ААЦГ гимантан ладастен

2-аминоадамантан ICS0= 20,03 ±7,02 мкМ

мемантин 1С50= 1,14 мкМ

-9 -8 -7-6-5-4 -3 Концентрация препаратов (LgM)

Рис. 1. Влияние производных адамантана на связывание (G-3H]-MK-801 с NMDA рецепторами гиппокампа крыс.

Di-nodmim дофаминовых рецепторов

Те же производные адамантана были изучены на связывание с Оз-рецепторами стрнатума крыс in vitro (рис. 2). Активными в отношении данного подтипа ДА рецепторов оказались

лишь гимантан (1С50=330,00мкМ) и новое производное 1-аминоадамантана - 1-ААЦГ (1С5о=155,10мкМ). Известно, что Оз-рецепторы локализованы преимущественно на пресинаптических окончаниях нервных клеток и являются ауторецепторами, регулирующими концентрацию свободного дофамина в синаптической щели (Aretha, 1995; Koeltzow, 1998). Также существуют данные о вовлеченности Из-рецепторов в развитие дискинезии, ассоциированной с приёмом L-DOPA, но потенциальная эффективность селективных лигандов к Рз-рецепторам пока остаётся не до конца подтверждённой (Sokoloff, 2006; Joyce and Millan, 2007). В связи с вышеизложенным, можно предположить, что хотя величины IC50 достаточно велики для данных препаратов, связывание гимантанаи 1-ААЦГ с Оз-рецепторами может вносить вклад в формирование дофаминпозитивного профиля действия данных веществ, а также снижать риск развития L-DOPA ассоциированной дискинезии.

к

S X

в 100-

Q

о п

-г о;

п и

9 о fc. о

¡Г"

JF 0

ас о о

7 S

■В

75-

50'

25-

0J

k^l.....'« . 1

-4— t

\ \'

■

амантадин

мемантин

2-аминоадамантан

ладастен

кемантан

гимантан IC50= 330,00 мкМ

1-ААЦГ

IC50= 155,10 мкМ

-9 -8 -7-6-5-4 -3 -2 Концентрация препаратов (LgM)

Рис. 2. Влияние производных адамантана на связывание [G- Н]-7-ОН DPAT с 1)з-рсцепторамн стриатума крыс.

5-НТи- и З-НТ^-подтипы серотониновых рецепторов

Однако те же производные адамантана не проявили значимого влияния на связывание селективных лигандов с гиппокампальными 5-НТ1А-рецепторами и 5-НТ2д-рецепторами фронтальной коры крыс (на рисунках не представлено).

Таким образом, из всех изученных основных групп рецепторов, вовлечённых в патогенез БП, основной точкой приложения в in vitro исследованиях 1- и 2-аминопроизводных адамантана являются глутаматиые рецепторы NMDA-подтипа. Стоит отметить, что оксипроизводное адамантана (кемантан) оказалось инертным в отношении всех исследуемых типов рецепторов.

1.2. Изучение влияния субхронического введения гимантана на характеристики связывания селективных лигандов с рецепторами компетентных структур мозга крыс в норме и при МРР+-11ндуц1|рованной модели патологии (ex vivo)

Результаты экспериментов ex vivo оценивали с помощью рассчитываемых величин Kd и

Втах, отражающих степень сродства рецептора к лиганду и количество мест связывания

лиганда соответственно.

D¡-подтип дофаминовых рецепторов

Ранее нами было показано, что субхроническое введение гимантана (20 мг/кг*7 дней, в/б) вызывает увеличение плотности Di-рецепторов в стриатуме крыс на 23% по сравнению с контролем (Абаимов, 2008) (таб. 1). Интранигральная инъекция МРР+ (Змкг/0,6мкл дистиллированной воды) спустя 7 дней приводила к снижению количества Di-рецепторов на 14%, а внутрибрюшинное введение гимантана в течение 7 дней в дозе 20мг/кг повышало плотность Di-рецепторов на 23% относительно значений в группе с МРР+ и возвращало его к контрольным величинам (таб. 2).

Таблица 1. Влияние субхронического введения гимантана (20мг/кг * 7 дней, в/б) на характеристики радиолигандного связывания с В]-, 5-НТ1Д-, 5-НТгА-рецепторами структур головного мозга крыс (т ± Б.Е.М.).

D, (стриатум) 5-НТ,д (гиппокамп) 5-НТ3а (фронтальная кора)

Втах (фмоль/мг) Kd (нМ) Втах (фмоль/мг) Kd (нМ) Вшах (фмоль/мг) Kd (нМ)

Контроль (физ. р-р, в/б) 218,4 ± 16,8 3,0 ±0,7 280,7*13,2 2,6±0,3 214,9±9,8 4,4±0,5

Гимантан (20мг/кг*7дней, в/б) 279,1*7,7* 2,5 ± 0,2 363,4±23,4* 3,0±0,5 159,5±15,0* 3,6±0,9

Примечание: * - достоверное отличие от контроля, р<0,05, п=10-12, F-критерий Фишера.

Таблица 2. Влияние субхронического введения гимантана (20мг/кг * 7 дней, в/б) на характеристики радиолигандного связывания с В]-, 5-НТ(а-, 5-НТ2д-рецепторами структур головного мозга крыс после введения МРР+ (Змкг/0,6мкл диет., интранигрально) (ш ± 8.Е.М.).

D, (стриатум) 5-HTía (гиппокамп) 5-НТ2А (фронтальная кора)

Вшах (фмоль/мг) Kd (нМ) Втах (фмоль/мг) Kd (нМ) Вшах (фмоль/мг) Kd (нМ)

Контроль (физ. р-р, в/б) 547,5±9,5 4,1±0,3 140,2±9,6 3,7±0,7 150,2±8,9 6,0±0,8

МРР+ (Змкг/0,6мкл, интранигрально) 471,2±12,3* 4,6±0,4 103,7±4,Í* 2,9±0,2 114,2±5,7* 6,2±0,7

Гимантан/МРР+ (20мг/кг*7дней, в/б) 581,5±15,8" 4,0±0,4 161,9±8,1* 3,6±0,5 80,7±5,4# 4,7±0,6

Примечание: * - достоверное отличие от контроля, р<0,05, п=10-12, р-критерий Фишера.

# - достоверное отличие от МРР+, р<0,05, п=10-12, р-критерий Фишера.

Способность гимантана увеличивать плотность постсиналтических Di-рецепторов не только в норме, но и при МРР+-индуцированной патологии позволяет предположить, что этот механизм может вносить определённый вклад в улучшение эффективности дофаминергической нейропередачи под действием препарата. Известно, что при БП происходит серия функциональных изменений в базальных ганглиях (Albin, et al., 1992), характеризующихся повышением активности структур, находящихся под контролем Dî-рецепторов, и к снижению функций, регулируемых D|-рецепторами (Gerfen, 1992). Выявленные в эксперименте эффекты гимантана могут предотвращать подобные патологические изменения в балансе подгрупп дофаминовых рецепторов дофамина при паркинсоннзме.

5-HTia- и 5-НТ2А-подтипы серотониновых рецепторов

Субхроническое введение гимантана (20мг/кг * 7 дней, в/б) приводило к увеличению плотности 5-нт1а-рецепторов (Втах) в гиппокампе крыс на 30% по сравнению с контролем и к сннжению величины Втах для 5-нтга-рецепторов во фронтальной коре крыс на 26% (таб.1). Введение мрр+ приводило к снижению количества как 5-htia- так и 5-НТ2д-рецепторов на 26% и 24% соответственно (таб. 2). Последующее введение гимантана (20мг/кг * 7 дней, в/б) повышало плотность 5-НТ|А-рецепторов на 57% относительно значений в группе мрр+-вызванной патологии, что даже немного превышало контрольные значения, и приводило к ещё большему снижению количества 5-НТ2А-рецепторов (на 29% относительно МРР+ значений и на 46% относительно группы, получавшей только физ. р-р) (таб. 2).

Данные перестройки в подтипах серотониновых рецепторов, возможно, связаны со способностью гимантана ингибировать обратный захват СТ. Возрастание конценграции синаптически активного ст может приводить к опосредованному увеличению плотности 5-htia-ауторецепторов и, соответственно, к снижению популяции 5-нтга-рецепторов, локализованных на постсиналтических мембранах (Fillion and Fillion, 1981). Подобная ситуация возникает при хроническом введении трициклических антндепрессантов (Snyder and Peroutka, 1982). Полученные данные позволяют предположить, что в спектре действия гимантана содержится и антидепрессивная составляющая, которая может считаться положительным моментом в терапии БП.

Способность гимантана воздействовать на профиль представленности серотониновых рецепторов также может играть положительную роль в комплексной терапии БП, поскольку известно, что парциальные 5-HTia,'b агонисты способны блокировать индуцированную леводопой (L-DOPA) дискинезию (Bibbiani, 2001), а 5-НТгд антагонисты обладают терапевтической эффективностью в снятии психозов, галлюцинаций, ассоциированных с длительным приёмом L-DOPA (Vanover, 2008). Известно также, что стимуляция 5-НТ]А-подтипа рецепторов при одновременном ингибировании 5-НТгрецепторов приводит к выраженному противопаркинсоническому эффекту (Scholtissen, 2006).

2. Сравнительное изучение влияния адамантанов на обратный захват серотопипа и дофамина

2.1. Сравнительное изучение влияния гпмантаиа и других производных адамантана на синаптосомальный захват [3Н]-ДА в стрнатуме и [3Н]-СТ фронтальной коры крыс (in vitro)

Изучение влияния спектра производных адамантанов на обратный захват дофамина и серотонина в условиях in vitro проводилось на синаптосомах стриатума и фронтальной коры мозга крыс с использованием меченого [3Н]-ДА и [3Н]-СТ соответственно. Результаты экспериментов приведены на рис. 3 и 4.

Было выявлено, что большинство аминопроизводных адамантана эффективны в отношении обоих видов захвата. 2-аминопроизводные (гимантан, 2-аминоадамантан) ингибировали как [3Н]-ДА, так и [3Н]-СТ в диапазоне 1С5о=130,00±28,30 мкМ. 1-аминопроизводные (амантадин, мемантин) проявили большую селективность по отношению к обратному захвату [3Н]-СТ: 1С5о для [3Н]-СТ была в 3 раза меньше, чем для [3Н]-ДА. Наиболее выраженное влияние на ингибирование обратного захвата [3Н]-ДА оказывал ладастен (1С5о=3,5бмкМ) (рис. 3). По-видимому, в частности этим объясняется активирующая составляющая психотропного эффекта данного препарата. Однако при этом у ладастена исчезала тропность по отношению к обратному захвату СТ (рис. 4). Промежуточное положение занимал 1-ААЦГ с IC50 около 30 мкМ как для [3Н]-ДА, так и [3Н]-СТ. В отличие от аминопроизводных адамантана, кемантан (оксипроизводное) оказался неэффективным в ингибировании как обратного захвата [3Н]-ДА, так и [3Н]-СТ.

-*- кемантан

ладастен 1С50= 3,56 мкМ

1-ААЦГ

Ю50= 27,22 мкМ

амантадин

мемантин

гимантан

2-аминоадамантан IC50= 130,00±28,30

мкМ

oJ

-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

Концентрация препаратов (LgM)

Рис. 3. Влияние адамантанов на характеристики обратного захвата [3Н]-ДА сииаптосомамп стриатума крыс.

Концентрация препаратов (LgM)

Рис. 4. Влияние адамантаиов на характеристики обратного захвата [3Н|-СТ сннаптосомами фронтальной коры крыс.

Таким образом, структ>'рные модификации молекулы адамантана приводят к изменению свойств веществ:

- перенесение азотосодержащего заместителя из 2-ого в 1-ое положение приводит к усилению эффектов на обратный захват СТ;

- структурные изменения, приводящие к значительному усилению ингибирования обратного захвата ДА, сопровождаются утратой влияния на обратный захват СТ;

- замена азотосодержащей группы на окси группу ведёт к потере эффектов по отношению к обоим исследуемым видам захватов нейромедиаторов.

2.2. Изучение влияния гнмантана на синаптосомальный захват [3Н]-СТ фронтальной коры крыс (ex vivo)

При остром введении гимантан вводили животным в дозе 20 мг/кг (в/б). При субхроническом введении животные получали препарат в дозе 20 мг/кг (в/б) в течение 7 дней. Животные контрольной группы получали физ. р-р. (0,9% NaCl, в/б). Измеряли захват возрастающих концентраций [3Н]-СТ в синаптосомах фронтальной коры крыс, выделенных у контрольной и опытной группы животных спустя 24 часа после последней инъекции препарата или физ. р-ра.

Обнаружено, что острое введение гимантана увеличивало кажущуюся величину Утах почти вдвое: с 505,20 фмоль/мин/мг белка в контроле до 815,40 фмоль/мин/мг белка в опыте (р<0,05, Р-критерий Фишера). В то же время значения кажущейся аффинности Кт для обеих групп не различались (0,15 мкМ для препарата против 0,10 мкМ в контроле), что характерно для неконкурентного типа ингибирования (таб. 3).

В случае субхронического введения гимантан, напротив, вдвое уменьшал скорость обратного захвата [3Н]-СТ: величина Утах в контрольной группе животных составляла 974,20 фмоль/мин/мг, в то время как в опыте соответствовала 404,10 фмоль/мин/мг (р<0,05, Р-критерий Фишера). Величина аффинности Кт контрольной группы (0,16 мкМ) статистически не отличалась от таковой в опытной группе (0,12 мкМ) (таб. 3).

Таблица. 3. Кинетические параметры обратного захвата [3Н]-СТ синаптосомами фронтальной коры крыс после острого (20мг/кг, в/б) и субхронического (20мг/кг * 7 дней, в/б) введения гимантана (т ± 8.Е.М.).

Утах (фмоль/мг белка/мин) Кт (мкМ)

Контроль Гимантан Контроль Гимантан

Острое введение (20мг/кг, в/б) 505,20 ±27,00 815,40 ± 24,04* 0,10 ±0,20 0,15 ±0,30

Субхроническое введение (20мг/кг*7 дней, в/б) 974,20 ± 75,97 404,10 ± 25,27* 0,16 ±0,40 0,12 ± 0,20

Примечание; * - достоверное отличие от контроля, р<0,05, п=10-12, F-критерий Фишера.

Полученные в нашем исследовании результаты свидетельствуют об участии серотонинового транспортёра в серотонинпозитивном механизме действия препаратов адамантанового ряда, который может вносить вклад в снятие депрессивной симптоматики у больных с БП.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что гимантан способен подавлять обратный синаптосомный захват [3Н]-ДА в стриатуме крыс после острого введения препарата и увеличивать его после субхронического введения (Абаимов, 2007). В нашем случае мы обнаружили, что на введение гимантана серотониновая система реагирует противоположным образом. Наши исследования согласуются с теорией, согласно которой серотонин является сильным стимулятором высвобождения дофамина, в частности посредством 5-НТ|А, 5-НТ[В, 5-НТ2А, 5-НТз, 5-НТ4-рецепторов (Benloucif, 1993; Alex, 2007). Снижение скорости обратного захвата серотонина приводит к увеличению его концентрации в синаптической щели. Свободный серотонин активирует высвобождение дофамина, повышается концентрация дофамина в межклеточном пространстве, что приводит к увеличению скорости обратного захвата дофамина (Maleki, 2008).

3. Изучение эффектов адамантанов на уровни белков серотонинового и дофаминового транспортёров, SERT и DAT, в компетентных структурах мозга мышей линии С57В1/6 и культуре клеток

Поскольку нами было обнаружено, что гимантан оказывает выраженное влияние на обратный транспорт серотонина как in vitro, так и ex vivo, представлялось актуальным изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе подобных эффектов.

3.1. Изучение эффектов гимантана и амантадина на уровень белка SERT в культуре клеток НТ-22 (in vitro)

На первом этапе было изучено влияние однократного внесения гимантана и амантадина на содержание SERT в культуре мышиных иммортализованных гиппокампальных клеток НТ-22. Амантадин в концентрации 10'7 M вызывал уменьшение уровня SERT (р<0,05), в концентрации 10"6М наблюдалась тенденция к снижению белка серотонинового транспортёра (р=0,07), а при концентрации препарата 10"5 M эффект исчезал (рис. 5).

контроль амантадин контроль гимантан

контроль 10-5M 10-6 M 10-7M контроль 10-5M 10-6М 10-7М

Рис. 5. Содержание SERT в культуре клеток линии НТ-22 после однократного внесения амантадина и гимантана.

Примечание: * - достоверное отличие от контроля, р<0,05, U-критерий Манна-Уитни # - тенденция отличия от контроля. р=0.07, U-критерий Манна-Уитни

В отличие от амантадина, гимантан увеличивал содержание SERT, При этом изменения носили куполообразную зависимость: отсутствие эффекта при концентрации 10~5 М, наибольшее увеличение при концентрации 10*6 M (р<0,05) и менее выраженное увеличение при концентрации 10"7 M (р<0,05) (рис. 5). Обнаруженная активность гимантана в концентрации КГ6 M на культуре клеток in vitro, согласуется с прочими результатами, свидетельствующими о высокой активности гимантана именно в микромолярном диапазоне.

Показано, что именно концентрация 10 M вызывала достоверное снижение содержания белка DAT в культуре клеток феохромоцитомы РС-12 (Абаимов, 2008), микромолярная концентрация гимантана образуется в стриатуме при введении препарата в дозе 20 мг/кг (Ковалев, 2003), в микромолярном диапазоне располагается Ki гимантана для канала NMDA-рецепторов (Елшанская, 2001).

3.2. Изучение влияние острого введения гимантана на содержание белка SERT в структурах мозга мышей линии С57В1/6 в норме и МРТР-индуцнрованной модели патологии (ex vivo)

При проведении острого эксперимента I группа получала физ.р-р (NaCl, 0.9%, в/б) в течение 2 дней, один раз в сутки; II группа — МРТР (ЗОмг/кг, в/б) в течение 2 дней, один раз в сутки; III группа — гимантан (20 мг/кг, в/б) в течение 2 дней, один раз в сутки; IV группа — токсин в той же дозе и за 30 минут до МРТР гимантан (20 мг/кг, в/б) в течение 2 дней, один раз в сутки. Спустя 24 часа после последней инъекции препарата, токсина или физ. р-ра животные забивались, выделялись структуры мозга (Glowinski and Iversen, 1966), которые использовались в дальнейшем в экспериментах по изучению влияния веществ на содержание белка SERT с помощью метода Вестерн-блота (Malyshev, 1996).

А) Б)

контроль МРТР гимантан МРТР/ контроль МРТР гимантан МРТР/

гимантан гимантан

контроль МРТР гимантан гимантан.МРТР контроль МРТР пшантан гимантан т МРТР

Рис. 6. Содержание SERT в А) гиппокампе и Б) фронтальной коре мышей линии С57В1/6 после острого введения МРТР и гимантана.

Примечание: * - достоверное отличие от контроля, р<0,05. U-критерий Манна-Уитни ** - достоверное отличие от МРТР, р<0,05, U-критерий Манна-Уитни

Гимантан при остром введении (rp.III) оказывал разнонаправленное действие на

содержание SERT в гиппокампе и фронтальной коре мышей. В гиппокампе мышей (как и в

гиппокампальных клетках НТ-22) препарат вызывал повышение содержания белка на 25%

относительно контроля, а во фронтальной коре, наоборот, снижение на 32% относительно контроля (рис. 6). Данные изменения могут быть связаны с функциональными структурами мозга. Как в гиппокампе, так и во фронтальной коре МРТР (гр.И) вызывал увеличение содержания SERT: в гиппокампе достоверное увеличение (р<0.05), а во фронтальной коре наблюдалась тенденция к увеличению (р=0.063). Совместное введение гимантана и МРТР вызывало снижение повышенное токсином содержание SERT во фронтальной коре на 43%. в гиппокампе была выявлена тенденция к снижению.

Отсутствие эффекта МРТР на уровень белка SERT в ткани коры в сочетании с ингибирующим эффектом гимантана как на фоне физ. р-ра. так и на фоне токсина в гр. IV, позволяет предположить, что ведущую роль в этих группах играет именно препарат. Данный эффект гимантана имел однонаправленное воздействие и на DAT при тех же условиях (см. гл. 3.3.). Полученные результаты указывают на способность гимантана нормализовать нейрохимические сдвиги, вызванные нейротоксином МРТР, что согласуется с полученными ранее результатами при оценке влияния препарата на двигательные и ЭЭГ нарушения, вызванные введением токсина МРТР (Неробкова, 2000; Вальдман, 2004).

3.3. Изучение эффектов острого и субхронического введения гимантана и амаитадина на уровень белка DAT в гомогснатах стриатума и фронтальной коры мозга мышей линии С57В1/6 в норме и при МРТР-индуцированной модели патологии (ex vivo)

При проведении острого эксперимента I группа получала физ. р-р (NaCl, 0.9%, в/б) в течение 2 дней, один раз в сутки; II группа — МРТР (30мг/кг, в/б) в течение 2 дней, один раз в сутки; III группа — препарат: гимантан (20 мг/кг, в/б) или амантадин (13,9 мг/кг (эквимолярная доза 20 мг/кг гимантана), в/б) в течение 2 дней, один раз в сутки; IV группа — токсин в той же дозе и за 30 минут до МРТР гимантан (20 мг/кг, в/б) или амантадин (13,9 мг/кг, в/б) в течение 2 дней, один раз в сутки. При проведении субхронического эксперимента I группа получала физ. р-р (NaCl, 0.9%, в/б) в течение 7 дней, один раз в сутки; II группа — токсин МРТР (ЗОмг/кг, в/б) в течение 2 дней, а затем спустя 24 часа физ.р-р (NaCl, 0.9%. в/б) в течение 7 дней, один раз в сутки; II! группа — препарат: гимантан (20 мг/кг, в/б) или амантадин (13,9 мг/кг, в/б) в течение 7 дней, один раз в сутки: IV группа — токсин в той же дозе и спустя 24 часа гимантан (20 мг/кг, в/б) или амантадин (13,9 мг/кг, в/б) в течение 7 дней, один раз в сутки. Спустя 24 часа после последней инъекции препарата, токсина или физ. р-ра животные забивались, выделялись структуры мозга (Glowinski and Iversen, 1966), которые использовались в дальнейшем в экспериментах по изучению влияния веществ на содержание белка DAT с помощью метода Вестерн-блота (Malyshev, 1996).

В первой серии экспериментов гимантан или амантадин вводили мышам за 30 минут до введения токсина, исследуя, таким образом, защитные, профилактические эффекты препаратов. В результате было обнаружено, что в стриатумах мозга мышей группы III острое введение гимантана не изменяло уровень белка DAT, „тогда как амантадин понижал

содержание белка-транспортёра на 45% по сравнению с контролем (гр.1; р<0,05). (рис. 7). Под воздействием МРТР (гр.Н) наблюдалась выраженная тенденция к уменьшению содержания белка DAT (р=0,063). предположительно, вследствие гибели части нигростриатных дофаминовых нейронов. У мышей rp.IV совместное введение гимантана и МРТР вело к дальнейшему снижению содержания белка-транспортёра ещё на 38% (р<0,05), а аналогичное введение амантадина и МРТР характеризовалось уменьшением уровня DAT на 50% относительно эффекта самого МРТР (р<0,05) (рис. 7).

А) Б)

контроль МРТР гимантан МРТРйнмактан контроль МРТР аиаетадин WPTP/ачатадин

Рис. 7. Содержание DAT в стриатуме мышей линии С57В1/6 после острого введения МРТР, А) гимантана и Б) амантадина.

Примечание: * - достоверное отличие от контроля, р<0,05, U-критерий Манна-Уитни # - тенденция отличия от контроля, р=0,063, U-критерий Манна-Уитни ** - достоверное отличие от МРТР, р<0,05, U-критерий Манна-Уитни

Во фронтальной коре мозга мышей вследствие однократного введения гимантана отмечалась тенденция к снижению содержания DAT (р=0,06), амантадин же был неэффективен. Более того, ни сам токсин, ни оба варианта сочетания МРТР с гимантаном и амантадином также не вызывали сдвигов в тканевых уровнях DAT (на рисунках не представлено).

Во второй серии экспериментов сравнивали фармакологическое действие обоих препаратов после их 7-кратного введения на фоне острого токсического эффекта МРТР. Субхроническое введение гимантана приводило к увеличению уровня DAT в стриатуме мышей С57В1/6 на 10% относительно контроля (р<0,05), амантадин в этих условиях действовал в том же направлении, но менее выражено (р=0,065) (рис. 8). Однако на фоне действия МРТР (rp.IV) амантадин индуцировал 2-кратное увеличение содержания белка DAT

относительно эффекта токсина (р<0,05), тогда как гимантан увеличивал уровень транспортёра на 58% (р<0,05) (рис. 8).

А) Б)

контроль MPTP гимантан МРТР/пшантан контроль МРТР амантвдин МРТР/амантадин

Рис. 8. Содержание DAT в стриатуме мышей линии С57В1/6 после острого введения МРТР и субхронического введения А) гимантана и Б) амантадина.

Примечание: * - достоверное отличие от контроля, р<0,05, U-критерий Манна-Уитни # - тенденция отличия от контроля, р=0,063, U-критерий Манна-Уитни ** - достоверное отличие от МРТР. р<0,05, U-критерий Манна-Уитни

После 7-кратного введения гимангана в ткани фронтальной коры мозга отмечалось 35%-ное увеличение количества DAT относительно контроля (р<0,05), инъекции токсина не изменяли содержания белка дофаминового транспортёра, а их совместное применение приводило к нарастанию концентрации белка-транспортёра на 20% относительно эффекта МРТР (р<0,05) (рис. 9). В аналогичных условиях ни амантадин, ни токсин МРТР, ни совместное применение не изменяли содержание белка DAT во фронтальной коре мышей С57В1/6 (на рисунках не представлено).

Суммируя полученные результаты, можно отметить, что наиболее выраженные изменения в содержании белка DAT под воздействием препаратов и токсина наблюдались в стриатуме, хотя и во фронтальной коре прослеживалась та же направленность изменений: (а) введение токсина приводило к незначительному снижению уровня DAT; (б) острое введение изученных производных адамантана снижает, а (в) субхроническое, напротив, увеличивает содержание DAT; (г) совместное применение препаратов и токсина усиливает оба этих эффекта.

В механизме нейротоксического действия МРТР выделяют следующие критические звенья: внутрь клетки перенос токсина в форме МРР+ осуществляет белок DAT. далее происходит вход его в митохондрии, а также захват в синалтические пузырьки (Przedborski. 2001). Внутри митохондрий токсин индуцирует нарушения функции дыхательной цепи, а

захват в пузырьки с помощью везикулярного транспортёра моноамииов (VMAT2) рассматривается как мера по защите дитозоля от МРР+ (Smeyne, 2005). Действительно, острое введение МРТР мышам С57В1/6 приводит к заметному уменьшению экспрессии генов DAT и VMAT2, а также белка и гена тирозингидроксилазы - ключевого фермента синтеза дофамина (Хи, 2005). Таким образом, МРТР осуществляет комплексное ослабление пресинаптической функции дофаминергических нейронов нигростриатной системы.

контроль МРТР гимантан МРТР/гимзнтан

Рис. 9. Содержание DAT во фронтальной коре мышей линии С57В1/6 после острого введения МРТР и субхронического введения гимантана.

Примечание: * - достоверное отличие от контроля, р<0,05, U-критерий Манна-Уитни ** - достоверное отличие от МРТР, р<0,05, U-критерий Манна-Уитни

Для производных адамантана к настоящему моменту выявлены следующие мишени фармакологического действия: NMDA-рецепторы (Magaii, 2002; Kovalev, 2007), ai-рецепторы (Kornhuber, ! 993), 0;,-рецепторы (Абаимов, 2008), воздействие на которые, предположительно, приводят к желательному увеличению внеклеточного дофамина (Андяржанова. 2001) через ускорение секреции и/или торможение обратного захвата нейромедиатора.

На основании имеющихся к настоящему моменту экспериментальных данных представляется затруднительным объяснить детальный механизм позитивного действия как гимантана, так и амантадина на фоне МРТР интоксикации, наблюдаемого в результате субхронического режима введения препаратов. Однако отсутствие эффекта МРТР на содержание белка DAT в ткани коры в сочетании со стимулирующим эффектом гимантана как на фоне физ. р-ра, так и на фоне токсина в гр. IV, позволяет предположить, что ведущую роль в этих группах играет именно препарат. Действительно, в ткани лобной коры содержится существенно меньше объектов воздействия для МРТР (белка DAT), чем в стриатуме, тогда как

для адамантанов специфических мишеней (скорее всего - NMDA-рецепторов) достаточно в обеих структурах мозга. Таким образом, можно сделать предположение, что токсин и производные адамантанов используют различные мишени первичного фармакологического действия, а не конкурируют за переносчик дофамина. Следовательно, увеличение уровня белка DAT в мозге мышей групп III и IV свидетельствует о модулирующем характере действия гимантана и амантадина на систему обратного захвата ДА.

3.4. Изучение влияния острого и субхронического введения гимантана на синаптосо.мальнын захват [3Н]-ДА в стриатуме мышеи линии С57В1/6 (ex vivo)

Результаты по влиянию острого и субхронического введения гимантана на содержание белка дофаминового транспортёра DAT в гомогенатах стриатума мышей линии С57В1/6 хорошо коррелируют с данными, полученными по эффектам данного препарата на обратный синаптосомальный захват [3Н]-ДА при таких же условиях введения вещества.

Обнаружено, что гимантан при остром введении (20мг/кг, в/б) не влияет на скорость обратного захвата [3Н]-ДА синаптосомами стриатума мышей линии С57В1/6 (табл. 4), так же как и на уровень белка DAT в стриатуме мышей той же линии (рис. 7). А при субхроническом введении (20мг/кг * 7 дней, в/б) увеличивает скорость обратного захвата [3Н]-ДА на 25% (табл. 4), что связано, по-видимому, с увеличением содержания белка DAT (рис. 8). Значения кажущейся аффинности Km для контрольной и опытной групп при 2-ух режимах введения препарата не различаются, что характерно для неконкурентного типа ингибирования (табл.4).

Таблица. 4. Кинетические параметры обратного захвата [3Н]-ДА синаптосомами стриатума мышей линии С57В1/6 после острого (20мг/кг, в/б) и субхронического (20мг/кг * 7 дней, в/б) введения гимантана (т ± Б.Е.М.).

Vm,Lí (пмоль/мг белка/мин) Кт (МКМ)

Контроль Гимантан Контроль Гимантан

Острое введение (20мг/кг, в/б) 47,56±1,85 50,81 ±1,22 0,20±0,02 0,23±0,02

Субхроническое введение (20мг/кг*7 дней, в/б) 39,11±0,21 50,29±0,28* 0,19±0,03 0,21 ±0,03

Примечание: * - достоверное отличие от контроля, р<0,05, п= 10-12, Р-критерий Фишера.

Результаты по субхроническому режиму введения согласуются с ранее полученными данными по недельному системному введению гимантана крысам в дозе 20 мг/кг, в результате которого произошло увеличение скорости обратного захвата [3Н]-ДА на 17% (Абаимов, 2007). Можно предположить, что увеличение обратного захвата дофамина связанно с

компенсаторным механизмом, направленным на поддержание гомеостаза дофамина в синаптической щели и является следствием непрямой модуляции активности DAT со стороны пресинаптических рецепторов дофамина Ог-подгруппы, так как известно, что активация систем обратного захвата дофамина может быть индуцирована агонистами 02-рецепторов, например, квинпиролом (Beyer, 2000).

Таким образом, полученные в наших исследованиях результаты свидетельствуют о способности гимантана в условиях in vitro и ex vivo воздействовать на системы обратного захвата серотонина и дофамина, как в норме, так и при МРТР-индуцированной модели патологии, а также о возможности нормализовать нейрохимические сдвиги, вызванные нейротоксином МРТР, что дополняет уже имеющиеся данные об участии моноаминергической системы в механизме реализации противопаркинсонического действия препарата гимантана (Андяржанова, 2001; Vakhitova, 2003; Абаимов, 2007, 2008, 2009; Ковалев, 2007).

ВЫВОДЫ

1. Методом радиолигандного анализа in vitro выявлено, что гимантан оказывает прямое влияние на глутаматные рецепторы NMDA-подтипа, имеет незначительную тропность к D3-рецепторам и не влияет на серотониновые рецепторы 5-НТ]д- и З-НТгд-подгрупп.

2. Радиолигандньш методом анализа in vitro показано, что 1-аминопроизводные адамантана обладают более высокой эффективностью в ингибировании обратного захвата чем I-аминопроизводные; при отсутствии влияния у окснпроизводных.

3. Интранигралыюе введение токсина МРР+ крысам вызывает снижение количества D|-рецелторов в стриатуме, 5-НТ]д-рецепторов в гиппокампе и 5-НТ2д-рецепторов во фронтальной коре.

4. Методом иммуноблоттинга установлено, что системное введение МРТР приводит к уменьшению содержания белка DAT в стриатуме, но не в лобной коре, и к незначительному повышению уровня белка SERT в гиппокампе и фронтальной коре мозга мышей С57В1/6.

5. Субхроническое введение гимантана крысам вызывает увеличение количества Di-рецепторов в стриатуме и 5-НТ|д-рецепторов в гиппокампе и одновременное снижение количества 5-НТгд-рецепторов во фронтальной коре, как в норме, так и при МРР+-вызванной патологии.

6. Однократное системное введение гимантана крысам увеличивает Vniax обратного захвата [3Н]-СТ в синаптосомах фронтальной коры, а субхроническое - уменьшает; неизменность Km свидетельствует о неконкурентном типе ингибирования.

7. При однократном системном введении гимантан вызывает увеличение содержания белка SERT в гомогенатах гиппокампа мышей линии С57В1/6 в норме и при МРТР-индуцированной патологии. Аналогичные результаты получены в экспериментах на культуре гиппокампальных клеток НТ-22.

8. Острое введение гимантапа не влияет на уровень белка DAT в стриатуме мышей линии С57В1/6, а также на скорость обратного захвата [3Н]-ДА; совместное введение препарата с МРТР вызывает значительное снижение содержания DAT. Субхроническое введение гимантана и гимантана на фоне токсина, напротив, приводит к увеличению уровня DAT в стриатуме и фронтальной коре, а также увеличивает скорость обратного захвата [3Н]-ДА в стриатуме.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Абаимов, Д. А. Влияние Гимантана на основные подсистемы дофаминовых рецепторов стриатума крыс ex vivo [Текст] / Д. А. Абаимов, И. А. Зимин, Г. И. Ковалёв // Экспер. и клин. Фармакол,- 2008,- Т.71, №1.-С. 18-21.

2. Зимин, И, А. Участие серотонин- и дофаминергических систем мозга в реализации психофармакологических эффектов ладастена и сиднокарба [Текст] I И. А. Зимин, Д. А. Абаимов, Е. А. Будыгин, Ю. А. Золотарёв, Г. И. Ковалёв // Экспер. и клин. Фармакол,- 2010,-Т.73, №2.-С. 2-5.

3. Зимин, И. А. Изучение влияния Гимантана на системы обратного захвата моноаминов в структурах головного мозга грызунов [Текст] / И. А. Зимин, Ю. В. Болотова, Т. А. Антипова, Г. И. Ковалёв Мат. 5-ой Международной конф. «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным веществам», 1-4 июня 2010, Подмосковье.- Экспер. и клин. Фармакол.- 2010,- Т.73, №5 (приложение).-С. 44.

4. Зимин, И. А. Изучение эффектов субхронического введения гимантана на дофаминовые и серотониновые рецепторы головного мозга крыс в норме и при МРР+-вызванной патологии ех vivo [Текст] / И, А. Зимин, И. Г. Капица, Т. А. Воронина, Г. И. Ковалёв // Экснер. и клин. Фармакол,- 2010,- Т.73, №11.-С. 2-5.

5. Зимин, И. А. Сопоставление эффектов гимантана и амантадина на содержание белка DAT в мозге мышей С5В1/6 в норме и при МРТР-интоксикации [Текст] / И. А. Зимин, И. О. Логвинов, Т. А. Антипова, Г. И. Ковалёв // Экспер. и клин. Фармакол.- 2011.- Т.74, №1 .-С. 11 -15.

Подписано в печать 20.01.2011 г.

Заказ № 138 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Актуальность. Болезнь Паркинсона (БП) относится к числу распространённых заболеваний в современном обществе. Как показывают результаты многочисленных эпидемиологических исследований, частота БП неуклонно увеличивается с возрастом. Так, в группе до 65 лет она составляет около 1%, от 65 до 75 лет - 2% и у лиц старше 75 лет встречается с частотой 3-4% (Иллариошкин, 2006; Marion, 2001). Таким образом, в связи с тенденцией к постепенному старению населения актуальность данной проблемы будет постоянно возрастать.

Клинические проявления БП характеризуются тремором, брадикинезией, мышечной ригидностью, а также аффективными расстройствами (депрессией) и прогрессирующей деменцией (Hamani and Lozano, 2003). Изначально причиной заболевания считали нарушение исключительно дофаминергической передачи (Piccirilli, 1984). Однако было установлено, что наряду с указанными нарушениями в дофаминергической передаче, на развитие патологии могут влиять и изменения в других медиаторных системах. Так, при двигательных нарушениях, связанных с нейродегенеративными процессами в стриатуме, патологическим изменениям подвергается и серотониновая система. У больных паркинсонизмом в большинстве исследований in vivo и post mortem были обнаружены серьёзные нарушения серотонинергической трансмиссии (Chen, 1998; Hornykiewicz, 1998). Исследования показывают, что при БП значительно снижается уровень серотонина (CT) в коре, гиппокампе (Agid and Blín, 1987; Shannak, 1994), уменьшение содержания CT также выявляют в гипоталамусе и стриатуме (Kish, 2008).

Нарушения в серотонинергической системе проявляются рядом паркинсонических симптомов, таких как: моторные нарушения, изменения настроения, когнитивные расстройства, нарушения гастроинтестинальных функций организма (Schmitt, 2000; Fox, 2009). Считается, что серотонинергическая система также вовлечена в развитие дискинезии, вызванной приёмом L-DOPA (Fox, 2009).

Имеются данные, что связывание агонистов дофаминовых рецепторов с серотониновыми рецепторами (5-НТ-Р) может участвовать как в повышении их эффективности, так и в увеличении развития побочных эффектов. Так, для производных эрготамина (перголид, бромокриптин, лизурид) показано связывание с подтипами 5-НТ2 и 5-НТь Тогда как неэрготаминовые (ропинпрол, прамипексол) имеют большую селективность к 5-HTia-P (Millan, 2002). Воздействие с 5-НТгв-Р связывают с развитием побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы (изменение клапанов сердца, фибробластный митогенез (Hofmann, 2006; Fitzgerald, 2000)) и лёгких (плевральный и ретропеританиальный фиброз (Bleumink, 2002; Kvernmo, 2006)). 6

Клинические наблюдения показывают, что эрготаминовые производные чаще вызывают психические нарушения, что также может быть обусловлено связыванием с 5-НТ-Р (Dodd, 2005; Grosset, 2006).

Существуют данные о вовлечённости серотонина в развитии тремора при БП. Показано, что у больных с тремором снижено связывание с 5-HTia-P в ядрах шва (Doder, 2003). Миртазапин, агонист 5-HTiA-P и антагонист 5-НТ2- и 5-НТз-Р, и клозапин. инверсированный агонист 5-НТ2л/2с-Р> снижали тремор у пациентов с БП (Gordon, 2002; Bonuccelli, 1997). Однако механизм действия, а также подтип 5-НТ-Р, отвечающий за «антитреморную» активность, на данный момент до конца не известны.

Некоторые серотониновые рецепторы вовлечены в механизм формирования левадопа-индуцированных дискинезий (ЛИД). Так, несективный агонист 5-HTia-P буспирон, а также антидепрессант миртазапин снижали ЛИД без ухудшения моторных функций (Bonifati, 1994; Pact, 1999). Однако саризотан оказался не эффективным в снятии дискинезии, а при повышении дозы даже вызывал ухудшения моторных функций (Goetz, 2007). В то же время клозапин и кутиапин, инверсированные агонисты 5-НТ2л/2с-1\ улучшали моторную симптоматику (Durif, 2004; Katzenschlager, 2004).

Стоит отметить, что низкий уровень серотонина часто ассоциирован с предрасположенностью к депрессии (van Praag and de Haan, 1979; Muck-Seler, 1983). Серотонинергическая гипотеза депрессии при БП основывается на представлениях об антагонистическом взаимоотношении между дофамином (ДА) и серотонином (CT) (Mayeux, 1990). Данная гипотеза предполагает, что снижение серотонина при болезни Паркинсона- это компенсаторный механизм в ответ на снижение уровня ДА в стриатуме. Снижение уровня CT, в свою очередь, провоцирует повышенный риск возникновения депрессии у больных паркинсонизмом (Scholtissen, 2006). Однако, по мнению некоторых авторов, использование селективных ингибиторов обратного захвата серотонина в качестве терапии тревожных расстройсв может ухудшать течение БП, усугублять моторные нарушения (Leo, 1996; Richard, 1999), хотя в эпидиомологических исследованиях по данному вопросу подтверждения получено не было (Arbouw, 2007).

Дегенеративные изменения в серотонинергической системе также влияют на формирование когнитивных нарушений, типичных для болезни Паркинсона, таких как ухудшение процессов консолидации памяти (Schmitt, 2000).

В связи с наличием нескольких патогенетических факторов БП, вовлечённости моноаминергической, глутаматергической, ацетилхолиновой и других систем, терапия данного заболевания подразумевает применение комбинаций противопаркинсонических средств (ППС) с различным механизмом действия (Морозов и др., 2001). Перспективными считаются препараты, способные воздействовать сразу на несколько нейрохимических систем, К таким веществам относятся производные адамантана (мидантан, глудантан) (Schwab, 1972; Вайншток, 1978), обладающие также нейропротективными свойствами (Ebadi, 1996; Danysz, 1997). Наиболее широкое применение в клинике получил 1-аминоадамантан — мидантан (Amantadine, Symmetrel) в виде гидрохлорида или сульфата. Считается, что данный препарат наиболее эффективен в отношении брадикинезии и ригидности, но менее полезен в лечении тремора и других гиперкинетических проявлений паркинсонизма (Кадыков, 1973; Щедеркин, 2005). Имеющиеся формы амантадина для внутривенных инфузий (амантадина сульфат) становятся незаменимыми для купирования и комплексного лечения акинетических кризов в клинической картине БП (Щедеркин, 2005). В качестве средства монотерапии мидантан используется при лёгких формах паркинсонического синдрома, чаще для коррекции экстрапирамидных расстройств, связанных с приёмом нейролептиков (Морозов, 2001; Садеков, 2001).

В НИИ фармакологии РАМН был синтезирован новый потенциальный противопаркинсонический препарат гимантан (1-(2-адамантил)-азациклогептан гидрохлорид), который превосходит мидантан по противопаркинсонической эффективности. В экспериментах in vitro и in vivo показано ингибирующее влияние гимантана на активность МАО-B (Вальдман, 2003). Подобно амантадину, гимантан неконкурентно блокирует канал NMDA-рецептора (Елшанская, 2001). Эффективность гимантана по способности устранять проявления паркинсонического синдрома, вызванного системным введением нейротоксина МРТР у мышей сопоставима с таковой мидантана и превосходит циклодол (Неробкова, 2000). В работе Абаимова Д. А. (2009) было продемонстрировано влияние гимантана на серотонинергические системы стриатума, которое выражалось в уменьшении уровня серотонина (CT) и его метаболита 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК). Данные результаты хорошо согласуются с таковыми, полученными для микродиализатов стриатума (Андяржанова, 2001), и позволяют предположить влияние препарата на систему ферментативной деградации биогенных аминов. Положительные эффекты гимантана, выявленные на животных, были подтверждены в клинических исследованиях. Пилотные исследования гимантана на пациентах с БП показали, что препарат, который давали в дозе 25 мг/кг ежедневно в течение 12-и недель, хорошо переносится больными, вызывает значительное уменьшение двигательных расстройств (тремора) и оказывает положительный эффект на эмоциональную сферу. Клинические изменения были подтверждены электронейро-миографическими данными и показателями ЭЭГ (Катунина, 2008).

С учётом признанной сегодня вовлечённости серотониновой системы в патогенез БП и недостатка сведений о способности препарата влиять на серотонинергическую передачу, в том числе на моделях патологии, оценка серотонинергического компонента в нейрохимическом спектре действия гимантана представляется целесообразной и необходимой.

Цель исследования. Изучение пре- и постсинаптических серотонинергических звеньев и их взаимодействия с дофаминергическими компонентами нейрохимического механизма действия препарата гимантана в норме и при моделировании паркинсонического синдрома.

Для достижения указанной цели были сформулированы и поставлены следующие задачи:

1. Произвести сравнительное изучение с помощью метода радиолигандного связывания влияния гимантана и других производных адамантана на группы рецепторов, участвующих в этиопатогенезе болезни Паркинсона, - глутаматные (NMDA) рецепторы, дофаминовые D3- и серотониновые 5-HTia- и 5-НТ2л-рецепторы в условиях in vitro.

2. Исследовать влияния субхронического введения гимантана на характеристики связывания селективных лигандов с Di-, 5-HTia- и 5-нт2а-рецепторами компетентных структур мозга крыс в условиях ex vivo.

3. Произвести сравнительный анализ участия системы обратного захвата серотонина и дофамина в механизме модуляции гимантаном и другими производными адамантана нейропередачи моноаминов в головном мозге крыс в условиях in vitro.

4. Изучить влияния гимантана на синаптосомальный захват [ Н]-СТ фронтальной коры крыс в условиях ex vivo.

5. Исследовать влияние гимантана и препарата сравнения - амантадина на содержания белков SERT и DAT в компетентных структурах мозга мышей линии С57В1/6.

6. Исследовать влияние гимантана и препарата сравнения — амантадина на основные пре- и постсинаптические звенья серотониновой и дофаминовой нейросистем в условиях МРР+ и МРТР-индуцированных моделях патологии.

Научная новизна. Впервые методом радиолигандного связывания показано модулирующее воздействие нового противопаркинсонического препарата гимантана на Di-рецепторы стриатума, 5-НТ i д-рецепторы гиппокампа и 5-НТ2л-рецепторы фронтальной коры крыс, проявляющееся в изменении плотности рецепторов, без изменения их аффинности к селективным лигандам в указанных структурах как в норме, так и при МРР+-индуцированной патологии. Продемонстрирована способность гимантана и других производных адамантана модулировать обратный захват серотонина в экспериментах in vitro и ex vivo. Впервые методом иммуноблоттинга обнаружено, что при однократном системном введении гимантан вызывает увеличение содержания белка серотонинового транспортёра (SERT) как в исследовании на культуре мышиных иммортализованных гиппокампальных клеток НТ-22, так и в гомогенатах гиппокампа мышей линии С57В1/6 в норме и при МРТР-индуцированной патологии. Острое введение препарата уменьшает содержание белка дофаминового транспортёра (DAT) в гомогенатах стриатума мышей линии С57В1/6 в норме и при МРТР-индуцированной патологии, а субхроническое введение вызывает противоположный эффект.

Научно-практическая значимость. Исследования эффектов адамантанов на серотонинергическую систему расширили существующие представления о фармакологических мишенях препаратов адамантанового ряда, а также позволили углубить знания о нейрохимических механизмах их противопаркинсонического действия. Полученные результаты позволяют более рационально применять гимантан при болезни Паркинсона как для монотерапии, так и при комбинированном лечении. В частности, дают основания для применения в терапии пациентам с проявлениями аффективных и когнитивных расстройств. Обнаруженные эффекты спектра действия изученных производных адамантана на серотонинергическую нейропередачу свидетельствуют о перспективности поиска среди антагонистов глутаматных рецепторов новых веществ с противонаркинсонической активностью. Более детальное изучение серотонинергического компонента в нейрохимической фармакологии адамантанов открывает перспективу создания на их основе других противопаркинсонических препаратов с селективными эффектами на разные звенья серотонинергичсской системы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

6. выводы

1. Методом радиолигандного анализа in vitro выявлено, что гимантан оказывает прямое влияние на глутаматные рецепторы NMDA-подтипа, имеет незначительную тропность к Оз-рецепторам и не влияет на серотониновые рецепторы 5-HTia- и 5-НТ2А-подгрупп.

2. Радиолигандным методом анализа in vitro показано, что 1-аминопроизводные адамантана обладают более высокой эффективностью в ингибировании обратного захвата о Н]-СТ, чем 2-аминопроизводные; при отсутствии влияния у оксипроизводных.

3. Интранигральное введение токсина МРР+ крысам вызывает снижение количества Di-рецепторов в стриатуме, 5-НТ1А-рецепторов в гиппокампе и 5-НТоЛ-рецепторон во фронтальной коре.

4. Методом иммуноблоттинга установлено, что системное введение МРТР приводит к уменьшению содержания белка DAT в стриатуме, но не в лобной коре, и к незначительному повышению уровня белка SERT в гиппокампе и фронтальной коре мозга мышей С57В1/6.

5. Субхроническое введение гимантана крысам вызывает увеличение количества Di-рецепторов в стриатуме и 5-НТ1л-рецепторов в гиппокампе и одновременное снижение количества 5-НТ2А-рецепторов во фронтальной коре, как в норме, так и при МРР+-вызванной патологии.

6. Однократное системное введение гимантана крысам увеличивает Vmax обратного о захвата [JH]-CT в синаптосомах фронтальной коры, а субхроническое — уменьшает; неизменность Km свидетельствует о неконкурентном типе ингибирования.

7. При однократном системном введении гимантан вызывает увеличение содержания белка SERT в гомогенатах гиппокампа мышей линии С57В1/6 в норме и при МРТР-индуцированной патологии. Аналогичные результаты получены в экспериментах на культуре гиппокампальных клеток НТ-22.

8. Острое введение гимантана не влияет на уровень белка DAT в стриатуме мышей линии С57В1/6, а также на скорость обратного захвата ["Т1]-ДА; совместное введение препарата с МРТР вызывает значительное снижение содержания DAT. Субхроническое введение гимантана и гимантана на фоне токсина, напротив, приводит к увеличению уровня DAT в стриатуме и фронтальной коре, а также увеличивает скорость обратного о захвата [ Н]-ДА в стриатуме.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Болезнь Паркинеона (БП) является распространённым нейродегенеративным заболеванием. Так, в Европе среди людей старше 65 лет оно составляет 1,6-1,8 случая на 100 человек (Tanner and Aston, 2000; de Lau and Breteler, 2006). Из-за старения населения Земли ожидается, что значение паркинсонизма как проблемы здравоохранения будет возрастать. В России число больных составляет не менее 300 тысяч. По статистике неврологических стационаров Москвы, болезнь стоит на 5-ом месте по частоте обращаемости и составляет около 3,5% от общего числа неврологических болезней (Федорова, 1996). Несмотря на успехи, достигнутые в области изучения течения заболевания, медицина до сих пор не имеет достаточно эффективных методов лечения БП.

Показано, что болезнь Паркинеона обусловлена дефицитом дофаминергической (ДАЭ) передачи в стриатуме (Carlsson, 1958; Hornykiewicz, 2006). В свою очередь дефицит ДАЭ передачи связан с дегенерацией нейронов компактной части чёрной субстанции (Отеллин, Арушанян, 1989). Выпадение ингибирующих влияний нигростриатных нейронов в стриатуме влечёт за собой гиперактивацию других нейромедиаторных систем полосатого тела: глутаматергической (Lange et al., 1997) и холинергической (Крыжановский и др., 1989). При активации глутаматергической системы реализуются токсические эффекты глутамата, что в ещё большей степени способствует дегенерации нейронов (Beal, 1992; Blandini et al., 1996). Также при нарушениях, связанных с нейродегенеративными процессами в стриатуме, патологическим изменениям подвергается и серотониновая система. У больных паркинсонизмом в большинстве исследований in vivo и post mortem были обнаружены серьёзные нарушения серотонинергической трансмиссии (Chen, 1998; Hornykiewicz, 1998). Показано, что при БП значительно снижается уровень серотонина в коре, гиппокампе (Agid and Blin, 1987; Shannak, 1994), уменьшение содержания CT также выявляют в гипоталамусе и стриатуме (Kish, 2008).

Роль серотонинергической системы в БП остаётся дискуссионной. Существует мнение, что CT оказывает ингибирующий эффект на дофаминергическую систему стриатума (Jacobs and Fornal, 1993; Di Matteo, 2002; De Deurwaerdere, 2004), тем самым усугубляя тяжесть течения заболевания. Сторонники альтернативной гипотезы представляют данные, свидетельствующие о том, что CT, напротив, существенно стимулирует высвобождение ДА (Benloucif and Galloway, 1991; Benloucif, 1993; Alex, 2007). Возникшее противоречие можно объяснить тем, что различные подтипы рецепторов серотонина оказывают противоположный эффект на дофаминергическую систему. Одни группы рецепторов (5-htia, 5-нтш, 5-нт2а, 5-нтз, 5-нт4) оказывают возбуждающее воздействие на высвобождение дофамина (Fink and Göthert, 2007; Alex and Pehek, 2007), другие же (5-НТгс), напротив, ингибирует его высвобождение (Pozzi, 2002; Alex and Pehek, 2007). Однако в мозге больных паркинсонизмом, а также у пациентов, длительно принимающих L-DOPA, эффекты CT на высвобождение ДА остаются не до конца изученными на данный момент, и решение данной проблемы представляет существенный научный интерес.

Клинические проявления БП характеризуются тремором, брадикинезией, мышечной ригидностью, а также аффективными расстройствами и прогрессирующей деменцией (Hamani and Lozano, 2003). В последнее время всё больше внимания уделяется изучению немоторных нарушений при БП: депрессии, когнитивным расстройствам. Известно, что депрессия - это наиболее распространённая форма тревожных расстройств у больных паркинсонизмом (Cummings, 1992). Распространённость депрессии при паркинсонизме достигает в среднем уровня 25 — 40% от общего числа больных (Leentjens, 2004). При этом доказано, что предрасположенность к депрессии часто ассоциирована с низким уровнем серотонина (van Praag and de Haan, 1979; Mück-Seler, 1983). Дегенеративные изменения в серотонинергической системе могут также вносить серьёзный вклад в формирование когнитивных нарушений, типичных для болезни Паркинсона, таких как ухудшение процессов консолидации памяти (Schmitt, 2000).

В связи с наличием нескольких патогенетических факторов БП, терапия данного заболевания подразумевает комплексный подход с применением комбинаций противо-паркинсонических средств (ППС) с различным механизмом действия (Морозов и др., 2001). Данная схема лечения обусловлена тем, что каждое ППС в отдельности имеет побочные эффекты, а комбинированное применение позволяет снизить дозу препарата и частично сгладить побочные действия используемых веществ. Такие схемы терапии включают назначение метаболического предшественника дофамина L-DOPA (Гусев, 2000; Бойко, 2004; Bertler, 1971), антихолинергические средства центрального действия (циклодол) (Садеков, 2001; Голубев, 2001; Dorshay and Constable, 1949), препаратов с дофаминопозитивными и нейропротекторными свойствами (Левин, 2003; Пилипович, 2003; Watts, 1997). Последние включают ингибиторы МАО-B (депренил) и КОМТ (Садеков, 2001; Федорова, 2001; Гольдштейн, 2002; Голубев, 2003; Birkmayer et al., 1975) и производные адамантана (мидантан, глудантан) (Садеков, 2001; Щедеркин, 2005; Schwab and England, 1969; Вайншток, 1978).

В настоящее время производные адамантана представляют перспективное направление в противопаркинсонической терапии, так как воздействуют сразу на несколько нейрохимических систем, а также обладают нейропротективными свойствами

Ebadi, 1996). Так, амантадин оказывает сложное многокомпонентное действие на нейромедиаторные системы стриатума. Показано, что в концентрации 1СГ1-10~5 M данный препарат ингибирует обратный захват дофамина (ДА) и норадреналина (НА) (Herblin, 1972), стимулирует синтез и высвобождение ДА в стриатуме (Toide 1990), проявляет центральные М-,Н-холиноблокирующие свойства (Buisson and Bertrand, 1998), а также прямо стимулирует адрено- и дофаминовые рецепторы мозга (Stone, 1976). Предполагается, что возможный нейропротективный эффект амантадина связан с неконкурентным антагонизмом NMDA-рецепторов (Kornhuber, 1994). Показана способность 1-аминопроизводных адамантана ингибировать обратный синаптосомальный захват серотонина, оказывать влияние на высвобождение нейромедиатора (Wesemann, 1978), а также потенцировать эффекты селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (Maleki, 2008; Rogóz, 2009). Таким образом, разработка новых, более эффективных ППС в ряду производных адамантана представляет перспективное направление в поиске веществ для лечении БП.

В НИИ фармакологии РАМН было синтезировано потенциальное ППС гимантан (1-(2-адамантил)-азациклогептан гидрохлорид), превосходящее мидантан по противо-паркинсонической активности. Эффективность гимантана по способности устранять проявления паркинсонического синдрома у мышей, вызванного системным введением нейротоксина МРТР, сопоставима с таковой мидантана и превосходит L-DOPA и циклодол (Неробкова и др., 2000). В экспериментах in vitro и in vivo показано ингибирующее влияние гимантана на активность МАО-B (Вальдман и др., 2003). Подобно мидантану, гимантан неконкурентно блокирует канал NMDA-рецептора по типу «trapping block» (Елшанская и др., 2000). В микродиализных исследованиях на крысах показано увеличение внеклеточного содержания ДА в стриатуме (Андяржанова и др., 2001). Данные об оценке экспрессионного статуса генов ДААК, DAT и МАО-B в клетках стриатума крыс в ответ на введение гимантана хорошо согласуются с эффектами гимантана на различные звенья ДАЭ трансмиссии (Vakhitova, 2003). Глубокое всестороннее изучение влияния гимантана на различные нейрохимические звенья дофаминергического синапса было проведено сотрудниками нашей лаборатории (Абаимов, 2007, 2008, 2009; Ковалев, 2007). Было выявлено, что гимантан оказывает комплексное воздействие на ДАЭ передачу, улучшая её эффективность. Однако вопрос о способности препарата воспроизводить положительные эффекты на ДАЭ передачу на моделях патологии оставался открытым.

В связи с признанной сегодня вовлечённости серотониновой системы в патогенез БП и недостатка сведений о способности гимантана влиять на серотонинергическую передачу, в том числе на моделях патологии, целью настоящего исследования стало:

Изучение нейрохимических и молекулярно-биологических механизмов серотонин- и дофаминопозитивного действия противопаркинсонического препарата гимантана, а также сравнение этих эффектов при исследовании на интактных животных и при моделировании паркинсонического синдрома.

Одной из задач данного исследования стало изучение влияния производных адамантана на основные группы рецепторов, вовлечённых в патогенез БП, — глутаматные NMDA-рецепторы, дофаминовые и серотониновые 5-HTia- и 5-нт2а-рецепторы.

На первом этапе исследования было изучено влияние 1-аминопроизводных адамантана (амантадин, мемантин, 1-(1-адамантил)-азациклогептан (1-ААЦГ)), 2-аминопроизводных адамантана (2-аминоадамантан, гимантан, ладастен), а также оксипроизводного адамантана (кемантан) на связывание селективного канального лиганда фенциклидинового сайта [G-'H] (+)МК-801 (дизоцилпина) с глутаматными рецепторами NMDA-подтипа мембран гиппокампа крыс. Величина полуингибирования IC50 для гимантана попадала в диапазон большинства 1- и 2-аминопроизводных адамантана и соответствовала 20,03 мкМ. Поскольку именно с воздействием на NMDA-рецепторы связывают нейропротекторные свойства адамантанов (Lipton, 2004). можно предположить, что гимантан не уступает большинству исследованным 1- и 2-аминопроизводным адамантана по способности подавлять глутаматпую эксайтотоксичность.

Вторым этапом стало изучение влияния того же спектра производных адамантана на связывание с Оз-рецепторами стриатума крыс. Пресинаптические дофаминовые ауторецепторы D3 играют важную роль в процессах регуляции синтеза и высвобождения дофамина из пресинаптических окончаний (Aretha, 1995; Gobert, 1995; Koeltzow, 1998) и, следовательно, оказывают модулирующее влияние на уровень синаптически активного ДА. Кроме того, появились сведения о тесной взаимосвязи пресинаптических рецепторов D3 с системой обратного транспорта ДА (Joyce, 2004). Также существуют данные о вовлечённости Бз-рецепторов в развитие дискинезии, ассоциированной с приёмом L-DOPA, но потенциальная эффективность селективных лигандов к Бз-рецепторам пока остаётся не до конца подтверждённой (Sokoloff, 2006; Joyce and Millan, 2007). В наших о исследованиях по связыванию селективного меченого лиганда [G- Н] 7-ОН DPAT in vitro было обнаружено, что активными в отношении Бз-рецепторов оказались лишь гимантан (1С5о=330,ООмкМ) и новое производное 1 -аминоадамантана 1-ААЦГ (1С5о=155,10мкМ). Хотя величины IC50 достаточно велики для данных препаратов, можно предположить, что связывание гимантана и 1-(1-адамантил)-азациклогептана с Dj-рецепторами может вносить вклад в формирование дофаминпозитивного профиля действия данных веществ, а также снижать риск развития L-DOPA ассоциированной дискинезии.

Следующим этапом стало изучение влияния тех же производных адамантана на гиппокампальные б-НТ^-рецепторы и 5-НТ2л-рецепторы фронтальной коры крыс. В исследованиях по связыванию селективных меченых лигандов in vitro было обнаружено, что спектры изученных производных адамантана не включают в себя прямого стимулирующего действия на серотониновые рецепторы 5-HTia и 5-НТ2а подгрупп, поскольку значимого сродства к местам связывания стандартных лигандов данных рецепторов у изученных веществ обнаружено не было.

В сериях экспериментов по изучению влияния препаратов на рецепторы в условиях ех vivo нами было обнаружено, что моделирование паркинсонического синдрома с помощью интранигрального введения токсина МРР+ (3мкг/0,бмкл дистиллированной воды) спустя 7 дней приводит к снижению количества Di рецепторов в стриатуме, 5-НТ1л-рецепторов в гиппокампе и З-НТгд-рецспторов во фронтальной коре мозга крыс. Данные изменения, предположительно, происходят вследствие гибели части дофаминовых и серотониновых нейронов. Субхроническое введение гимантана (20мг/кг * 7 дней, в/б) оказывает одинаковый эффект на плотность Di-, 5-HTia- и б-НТгл-рецепторов как в норме, так и при МРР+-вызванной патологии у крыс, характеризующийся в увеличении количества Di-рецепторов в стриатуме и 5-НТ1д-рецепторов в гиппокампе с одновременным снижением количества 5-НТ2д-рецепторов во фронтальной коре крыс.

Известно, что дофаминергическая денервация пеостриатума при болезни Паркинсона ведёт к повышению активности структур, находящихся под контролем Бг-рецепторов, и снижению структур, регулируемых Di-рецепторами (Gerfen, 1992). В результате происходит серия функциональных изменений в базальных ганглиях (Albin et al., 1992). Обнаруженные в экспериментах эффекты гимантана могут предотвращать подобные патологические изменения в балансе подгрупп дофаминовых рецепторов. Выявленная нами способность гимантана воздействовать на профиль представленности серотониновых рецепторов может играть положительную роль в комплексной терапии БП, поскольку известно, что парциальные 5-HTia/b агонисты способны блокировать индуцированную леводопой (L-DOPA) дискинезию (Bibbiani, 2001), а 5-НТгл антагонисты обладают терапевтической эффективностью в снятии психозов, галлюцинаций, ассоциированных с длительным приёмом L-DOPA (Vanover, 2008). Известно также, что стимуляция рецепторов подтипа б-НТ^при одновременном ингибировании рецепторов 5-НТг приводит к выраженному противопаркинсоническому эффекту (Scholtissen, 2006).

Вполне возможно, что выявленные нами перестройки в подтипах серотониновых рецепторов связаны со способностью гимантана ингибировать обратный захват медиатора, так как возрастание концентрации синаптически активного СТ способно привести к опосредованному увеличению плотности 5-НТ1Л-ауторецепторов и к снижению популяции 5-НТ2л-рецепторов, локализованных преимущественно на постсинаптических мембранах (Fillion and Fillion, 1981). Подобная ситуация возникает при хроническом введении трициклических антидепрессантов (Snyder and Peroutka, 1982). Таким образом, в спектре действия гимантана, вероятно, содержится и антидепрессивная составляющая, которая может считаться положительным моментом в терапии БП.

Для проверки этой гипотезы нами были проведены серии экспериментов, направленных на изучение влияния гимантана и других производных адамантана на обратный захват [ Н]-серотонина в условиях in vitro и ex vivo, а также сравнение полученных эффектов со способностью данных производных ингибировать обратный захват [3Н]-дофамина.

В результате проведённых исследований in vitro было установлено, что большинство аминопроизводных адамантана эффективны в отношении обеих систем захвата. Гимантан ингибировал как [ Н]-ДА, так и [ Н]-СТ в диапазоне ICso=130,0±28,3 мкМ. 1аминопроизводные (амантадин, мемантин) оказались в 3 раза эффективнее в i ингибировании захвата чем 2-аминопроизводные, с ICso=50,0±7,5 мкМ. В отличие от аминопроизводных адамантана, оксипроизводное (кемантан) оказалось о т неэффективным в ингибировании как обратного захвата [ Н]-ДА, так и [ Н]-СТ.

В литературе широко представлено мнение относительно неспособности препаратов адамантанового ряда оказывать в физиологических концентрациях значимое влияние на дофаминергическую нейропередачу, в том числе и на такое важное её звено, как обратный захват медиатора в экспериментах in vivo и ex vivo. В частности полагают, что амантадин может вызывать увеличение экстраклеточной концентрации дофамина только при введении препарата в дозе, десятикратно превосходящей терапевтическую (Kornhuber, 1995; Danizs, 1997). В этой связи, полученные нами данные относительно влияния гимантана на обратный захват серотонина in vitro потребовали дальнейшего изучения и подтверждения на моделях ex vivo.

В результате ряда экспериментов, проведённых на крысах-самцах линии Wistar, нами было обнаружено, что гимантан в дозе 20 мг/кг при остром введении увеличивает л скорость обратного захвата [ Н]-СТ в синаптосомах фронтальной коры крыс: величина Vmax на фоне действия препарата увеличилась почти вдвое — с 505,20 фмоль/мин/мг белка в контроле до 815,40 фмоль/мин/мг белка в опыте (р<0,05, F-кригерий). Величина аффинности Km оставалась неизменной (0,15 мкМ), что свидетельствует о неконкурентном характере ингибирования. При субхроническом введении в дозе 20 мг/кг в течение 7 дней, гимантан, напротив, вдвое уменьшал кажущуюся величину Vmax обратного захвата [3Н]-СТ: с 974,20 фмоль/мин/мг в контрольной группе до 404,10 фмоль/мин/мг в опыте (р<0,05, F-критерий). Величина аффинности Km также оставалась неизменной. Полученные в нашей работе результаты свидетельствуют об участии транспортёра SERT в серотонинпозитивном механизме действия гимантана. Данный механизм может обуславливать снятие депрессивной симптоматики у больных с БП.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что гимантан способен подавлять обратный синаптосомный захват [ Н]-дофамина в стриатуме крыс после острого введения препарата и увеличивать его после субхронического введения (Абаимов, 2007). В проведённом нами исследовании показано, что препарат действует на обратный синаптосомный захват [3Н]-серотонина противоположным образом. Наши исследования согласуются с теорией, согласно которой серотонин является сильным стимулятором высвобождения дофамина, в частности посредством 5-HTia, 5-НТш, 5-НТгл, 5-НТз, 5-НТ4-рецепторов (Benloucif, 1993; Alex, 2007). Снижение скорости обратного захвата серотонина приводит к увеличению его концентрации в синаптической щели. Свободный серотонин активирует высвобождение дофамина, повышается концентрация дофамина в межклеточном пространстве, что приводит к увеличению скорости обратного захвата дофамина (Maleki, 2008).

Следующей важной задачей нашего исследования стало изучение клеточных и молекулярно-биологических механизмов, лежащих в основе ингибируюгцего действия гимантана на обратный захват серотонина и дофамина.

На первом этапе было изучено влияние однократного введения гимантана и препарата сравнения - амантадина на содержание белка (SERT) в культуре мышиных иммортализованных гиппокампальных клеток НТ-22 (in vitro). В отличие от амантадина, который в концентрации

10"7 M вызывал уменьшение уровня белка SERT, гимантан увеличивал содержание SERT. При этом изменения носили куполообразную зависимость: отсутствие эффекта при концентрации 10"5 М, наибольшее увеличение при концентрации

Г ч

10" M (р<0,05) и менее выраженное увеличение при концентрации 10" M (р<0,05). Полученные нами результаты согласуются с мнениями, что концентрация 10"6М является фармакологически активной для гимантана. Так, именно эта концентрация вызывала достоверное снижение концентрации белка DAT в культуре клеток феохромоцитомы РС-12 (Абаимов, 2008), микромолярная концентрация гимантана образуется в стриатуме при введении препарата в дозе 20 мг/кг (Ковалев, 2003), в микромолярном диапазоне располагается Ki гимантана для канала NMDA-рецепторов (Елшанская, 2001).

На втором этапе, при изучении влияния острого введения гимантана (20мг/кг, 2 дня, 1 раз в сутки, в/б) на содержание белка SERT в структурах мозга мышей линии С57В1/6 в норме и МРТР-индуцированной патологии ex vivo, было выявлено, что в гиппокампе мышей, как и в гиппокампальных клетках НТ-22, препарат вызывал повышение содержания белка на 25% относительно контроля, а во фронтальной коре, наоборот, снижение на 32% относительно контроля. Данные изменения могут быть связаны с различиями в физиологических ролях данных структур мозга.

Введение токсина МРТР (30 мг/кг, 2 дня, 1 раз в сутки, в/б) приводило к незначительному увеличению содержания белка SERT в гиппокампе. Совместное же введение гимантана и МРТР вызывало снижение повышенного токсином содержания SERT во фронтальной коре и не изменяло его концентрацию относительно уровня МРТР в гиппокампе. Отсутствие эффекта МРТР на уровень белка SERT в ткани коры в сочетании с ингибирующим эффектом гимантана как на фоне физ. р-ра, так и на фоне токсина, позволяет предположить, что ведущую роль в этих группах играет именно препарат. Полученные результаты указывают на способность гимантана нормализовать нейрохимические сдвиги, вызванные нейротоксином МРТР, что согласуется с полученными ранее результатами при оценке влияния препарата на двигательные и ЭЭГ нарушения, вызванные введением токсина МРТР (Неробкова, 2000; Вальдман, 2004).

Следующим этапом стало изучение влияния гимантана и препарата сравнения — амантадина на содержание молекул дофаминового транспортёра (DAT) в структурах мозга мышей линии С57В1/6 в норме и МРТР-индуцированной патологии в условиях ех vivo. В результате проведенного исследования было обнаружено:

- моделирование паркинсонического синдрома с помощью внутрибрюшинного введения токсина МРТР (30 мг/кг, 2 дня, 1 раз в сутки) сопровождается незначительным уменьшением содержания белка DAT в стриатуме, но не в лобной коре мозга мышей С57В1/6.

- острое введение препаратов либо не влияет (гимантан, 20 мг/кг, в/б), либо уменьшает (амантадин, 13,9 мг/кг (эквимолярная доза 20 мг/кг гимантана), в/б) уровень белка DAT в стриатуме (-45%), тогда как совместное введение препарата (гимантана или амантадина) с МРТР вызывает значительное снижение уровня DAT (-38% и -50% соответственно).

- субхроническое введение гимантана (20мг/кг * 7 дней, в/б) и гимантана на фоне токсина приводит к увеличению уровня DAT в стриатуме (+10% и +58% соответственно) и фронтальной коре (+35% и +20% соответственно), тогда как амантадин (13,9мг/кг * 7 дней, в/б) индуцировал 2-кратное увеличение содержания белка DAT относительно эффекта токсина только в стриатуме.

Выявленные данные по острому введению гимантана хорошо согласуются с результатами Ю. В. Вахитовой (2003) и Д. А. Абаимова (2008) относительно влияния препарата на экспрессию DAT и позволяют сделать вывод о важном вкладе процессов экспрессии белка DAT в реализации дофаминопозитивного действия противо-паркинсонического препарата гимантана. Известно, что элиминация гена DAT у мышей может приводить к увеличению уровня экстраклеточного дофамина в мозге животных. Можно предположить, что гимантан вызывает угнетение экспрессии гена белка дофаминового транспортёра, последствием чего может являться многократное увеличение концентрации медиатора в синаптическом пространстве, аналогично тому, как это имеет место у животных, нокаутных по гену DAT (Jones, et al., 1998).

На основании полученных экспериментальных данных представляется затруднительным исчерпывающе объяснить механизм позитивного действия как гимантана, так и амантадина на фоне интоксикации, наблюдаемого в результате субхронического режима введения препаратов. Однако отсутствие эффекта МРТР на экспрессию белка DAT в ткани коры в сочетании со стимулирующим эффектом гимантана как на фоне плацебо, так и на фоне токсина, позволяет предположить, что ведущую роль в этих группах играет именно препарат. Действительно, в ткани лобной коры содержится существенно меньше объектов воздействия для МРТР (белка DAT), чем в стриатуме, тогда как для адамантанов специфических мишеней (скорее всего, NMDA-рецепторов) достаточно в обеих структурах мозга. Таким образом, можно сделать вывод, что токсин и производные адамантанов используют различные мишени первичного фармакологического действия, а не конкурируют за переносчик дофамина. Следовательно, увеличение уровня белка DAT в мозге мышей групп, получавших препарат и препарат + токсин, свидетельствует о модулирующем характере действия гимантана и амантадина на систему обратного захвата ДА.

Результаты по влиянию острого и субхронического введения гимантана на содержание белка дофаминового транспортёра DAT в гомогенатах головного мозга мышей линии С57В1/6 хорошо коррелируют с данными, полученными по эффектам л данного препарата на обратный синаптосомальный захват [ Н]-дофамина. Обнаружено, что гимантан при остром введении не влияет на скорость обратного захвата [3Н]-ДА синаптосомами стриатума мышей линии С57В1/6, так же как и на уровень белка DAT в стриатуме мышей той же линии. А при субхроническом введении увеличивает скорость обратного захвата [ Н]-ДА на 25%, которое, возможно, связано с выявленным нами ранее увеличением экспрессии белка DAT.

Обобщая полученные данные, можно предположить, что в процессе формирования противопаркинсонического эффекта гимантана задействованы, помимо дофамин-ергической и глутаматергической систем, ещё и серотонинергическая система, причём, важную роль в механизме регуляции нейропередачи играют, по-видимому, глутаматные гетерорецепторы группы NMDA, дофаминовый и серотониновый транспортёры, DAT и SERT. При этом эффект препарата на данные функциональные мишени обладает однонаправленным характером действия как на интактных животных, так и моделях патологии. Механизм данного воздействия может быть опосредован каскадом вторичных мессенджеров, таких как: цАМФ, Са2+, фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат и системой протеинкиназ, что требует дополнительных исследований. Вместе с тем, полученные данные и их интерпретация не исключает, но требует экспериментальной проверки следующих версий: возможным вариантом действия препарата является встраивание в мембрану и изменение белок-липидных взаимоотношений, изменение вязкости мембраны, изменение микроокружения рецептора и/или молекулы обратного транспортёра нейромедиатора. В пользу этого предположения свидетельствует: (а) липофильность структуры гимантана, (б) неконкурентное ингибирование ММВА-рецепторов и обратного захвата [3Н]-ДА и [3Н]-СТ.