Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное изучение фармакокинетики оригинального противопаркинсонического препарата гимантана

Петренко Евгения Сергеевна

На правах рукописи

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ОРИГИНАЛЬНОГО ПРОТИВОПАРКИНСОНИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

ГИМАНТАНА

! 14.00.25-фармакология, клиническая фармакология

I !

АВТОРЕФЕРАТ

I I

диссертации на соискание ученой степени

I

кандидата биологических наук

I

I

Москва - 2003

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте фармакологии им. В.В.Закусова Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Г.И. Ковалев

кандидат химических наук

А.П. Родионов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор P.C. Мирзоян

доктор медицинских наук И.И. Мирошниченко

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

/

Защита состоится « 17 » декабря 2003 года в.........ч

на заседании диссертационного совета Д 001.024.01 в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (125315 Москва, ул. Балтийская, 8).

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.

Автореферат разослан «........»........................... 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фармакокинетические исследования проводятся на разных этапах создания лекарственных средств: на стадии доклинического экспериментального изучения на животных, при первичных и расширенных клинических испытаниях, а также после внедрения лекарства в практическую медицину.

Предметом экспериментальной фармакокинетики является изучение процессов всасывания, распределения, биопревращения и выделения препарата. Знание фармакокинетических свойств фармакологического средства позволяет обосновать выбор путей и методов его введения, выявить ткани, в которые оно проникает наиболее интенсивно и/или в которых удерживается наиболее длительно, установить основные пути элиминации фармакологического средства. По результатам экспериментального изучения фармакокинетики фармакологического средства возможна выработка ориентировочной схемы его дозирования и .применения, обеспечивающей поддержание эффективной концентрации препарата в пределах терапевтического диапазона, которая может быть затем уточнена в ходе клинических испытаний. Важной задачей изучения фармакокинетики оригинального фармакологического средства является оптимизация выбора его лекарственной формы (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000). Кроме того, фармакокинетические данные позволяют объяснить различия в реакции организма на лекарственное вещество, предупредить возникновение нежелательных эффектов препарата (Вальдман А.В., Жердев В.П., 1988; Жердев В.П. и др., 2003; Мирошниченко И.И., 2001).

Настоящая работа посвящена изучению фармакокинетических свойств нового потенциального противопаркинсонического средства - гимантана в эксперименте на животных. Работа проводилась в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000).

Интерес к данному веществу - потенциальному лекарственному средству для лечения болезни Паркинсона обусловлен тем, что среди хронических заболеваний ЦНС паркинсонизм занимает одно из центральных мест, являясь наиболее часто встречающимся неврологическим заболеванием (Ортель В.Х., Коршунов A.M., 1997; Lewis et al., 2003). Паркинсонизм, независимо от этиологии и возраста, в котором он начался, значительно сокращает продолжительность жизни (Martin, 1999; Gutman et al., 2003).

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПетсрФ

С.Петербург IjI. о 09 УОфитГУ-З

Применяющиеся в настоящее время лекарственные препараты для лечения данного заболевания имеют целый ряд существенных недостатков, что требует продолжения поиска и создания новых антипаркинсонических средств (Lewis et al., 2003; Gutman et al., 2003).

В комплексной терапии паркинсонизма значительный удельный вес занимают препараты аминоадамантанового ряда, используемые в виде разных солей 1- и 2-аминоадамантана - гидрохлорида (мидантан), сульфата (симметрел, вирегит), глюкоронида (глудантан).

В ГУ НИИ Фармакологии им. В.В.Закусова РАМН были синтезированы и изучены такие производные адамантана, как мемантин, бемантан, димантан, кемантан, бромантан и другие. В развитие данного направления был синтезирован целый ряд оригинальных соединений, из числа которых в ходе первичного скрининга было выделено соединение с наиболее ярко выраженной противопаркинсонической активностью - гидрохлорид Ы-(адамант-2-ил)гексаметиленимина (А-7 или гимантан). Доклинически данное соединение было изучено д.м.н. Е.А.Вальдман в лаборатории психофармакологии под руководством проф. ТАВорониной.

Противопаркинсонические свойства А-7 были изучены на моделях акинетико-ригидных и дрожательных проявлений паркинсонического синдрома (Вальдман Е.А. и др., 1999). Результаты исследований показали, что изучаемое соединение обладает способностью устранять акинетико-ригидные проявления паркинсонического синдрома, имея преимущества перед имеющимися в медицинской практике препаратами (Вальдман Е.А. и др., 1999; Неробкова Л.Н. и др., 2000). Одним из основных преимуществ гимантана перед другими лекарственными препаратами является отсутствие привыкания и синдрома отмены после длительного применения. Также было установлено, что гимантан обладает высокой иммунотропной активностью в терапевтической дозе 10 мг/кг (Нежинская Г.И. и др., 2001), что может вносить вклад в реализацию симптоматического и нейропротекторного эффекта препарата.

Таким образом, была показана перспективность дальнейшей разработки гимантана в качестве потенциального средства для лечения паркинсонизма и, в частности, доклинического изучения фармакокинетики и путей его биотрансформации, что является необходимым этапом в процессе внедрения этого оригинального препарата в клиническую практику.

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось доклиническое изучение фармакокинетики гимантана и путей его биотрансформации. Для достижения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать фармакокинетику и распределение радиоактивного эквивалента гимантана в крови, по органам крыс после однократного внутривенного введения и введения внутрь.

2. Провести проверку гипотезы линейности фармакокинетики гимантана при однократном внутривенном введении различных доз.

3. Изучить кинетику выведения радиоактивного эквивалента гимантана из организма крыс.

4. Изучить фармакокинетику гимантана у кроликов после однократного внутривенного введения субстанции и введения внутрь субстанции и таблетки.

5. Изучить фармакокинетику препарата у кроликов после многоразового введения.

6. Установить количественное содержание неизмененного гимантана в крови крыс и кроликов, в моче крыс.

7. Изучить выведение гимантана с мочой, пути биотрансформации и установить химические структуры возможных метаболитов.

Научная новизна. Разработан оригинальный, высокочувствительный и селективный метод определения гимантана в биологическом материале с использованием капиллярной газовой хроматографии.

Впервые изучены фармакокинетические свойства нового потенциального противопаркинсонического средства - гимантан. Выявлены абсорбционные свойства тканей организма; доказана линейность зависимости между уровнями содержания 3Н-Гимантана в крови и вводимой дозой; выявлены различия концентрации 3Н-Гимантана в крови и органах при различных способах введения у крыс. Показана особая тропность радиоактивного эквивалента препарата к органу-мишени - стриатуму. Найдено фармакокинетическое обоснование различий в динамике развития эффекта гимантана при разных способах введения. Установлено, что исследуемое соединение подвергается биотрансформации, особенно активной при пероральном способе введения. Установлено, что количество продуктов метаболизма гимантана в моче экспериментальных животных значительно превышает количество неизмененного вещества. Выявлены пути биотрансформации и качественный состав возможных метаболитов.

Научно-практическая значимость. Разработанный метод определения гимантана с использованием капиллярной газовой хроматографии предложен для широкого применения в практике при проведении фармакокинетических исследований соединений класса адамантана.

Найденные фармакокинетические закономерности позволяют дать некоторые практические рекомендации при создании лекарственной формы. Разработанная в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН таблетированная лекарственная форма гимантана обладает высокой относительной биодоступностью и может быть рекомендована для клинических исследований.

Полученные результаты вошли в материалы доклинического изучения гимантана, утвержденные Медико-биологической комиссией НИИ Фармакологии РАМН, для представления в Минздрав РФ и получения разрешения на проведение клинических испытаний в качестве средства лечения паркинсонизма.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на VIII и IX Российских Национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002), 3-ей Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам (Суздаль, 2001).

Связь с планами научных исследований. Исследование выполнено в рамках плановой тематики ГУ НИИ Фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, проекта «Фармакологическая регуляция рецепторных образований», ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», подпрограмма «Создание новых лекарственных средств методами химического и биологического синтеза».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на страницах и включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов, главу собственных исследований с обсуждением результатов, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована рисунками, таблицами. Список используемой литературы содержит 120 источников: из них 51 отечественных и 69 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на двух видах экспериментальных животных: крысах-самцах линии Вистар массой 230-250 грамм и кроликах-самцах. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Крысам препарат вводился в виде раствора субстанции внутривенно в дозе 10 мг/кг и внутрь в дозе 20 мг/кг. Кроликам препарат вводился внутривенно в виде раствора субстанции в дозе 10 мг/кг и внутрь в виде субстанции в капсуле и в виде таблетки в дозе 10 мг/кг.

После введения препарата крысам, их декапитировапи через фиксированные интервалы времени, по 6 животных на каждый интервал, отбирали кровь и исследуемые органы и ткани. Изучение распределения гимантана в организме проводилось на тканях внутренних органов крыс: печени, почек, селезенки, сальника, вилочковой железы, семен- ников, мозга, а также в тканях некоторых структур мозга, таких как, стриатум, мозжечок, гиппокамп.

Кровь центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин и плазму хранили при температуре -20 С до анализа. Ткани органов взвешивали, гомогенизировали в системе «тефлон-стекло» в физ.растворе и центрифугировали при 3000 об/мин. Гомогенаты переливали в герметизированные пробирки и хранили при -20 С до количественного определения.

Для взятия образцов крови у кроликов проводилась предварительная катетеризация животных путем имплантации полихлорвинилового катетера в крайнюю ушную вену. Отбор крови проводился в заданные временные интервалы. Кровь центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин и плазму хранили при температуре -20 С до анализа.

Для изучения метаболизма крыс содержали в метаболических клетках на стандартной диете вивария в условиях свободного доступа к воде и пище. Животные получали гимантан однократно внутрь в дозе 10 мг/кг. Для определения химической структуры метаболитов гимантана проводили экстракцию препарата из мочи по методике, описанной ниже.

Для количественного определения гимантана были использованы следующие методы:

- метод определения радиоактивного эквивалента гимантана с использованием радиоизотопной метки. Это метод, дающий сведения о содержании, так называемого, радиоактивного эквивалента гимантана, т.е. о суммарном содержании самого препарата и его метаболитов.

- метод определения неизмененного вещества с использованием. капиллярной газовой хроматографии.

Продукты биотрансформации гимантана в моче изучали хроматомасс-спектрометрическим методом (данный фрагмент исследования проводился в лаборатории органической физхимии химического факультета МГУ).

Метод определения гимантана с использованием радиоизотопной метки.

Для количественного определения гимантана с использованием радиоизотопной метки предварительно был осуществлен химический синтез по вводу трития в структуру гимантана. Синтез меченого препарата осуществлен д.х.н. Ю.А.Золотаревым (НИИ молекулярной генетики РАН). Для экспериментальных биологических исследований на животных готовили раствор гимантана в физ. растворе. Соотношение радиоактивного препарата к нерадиоактивному во вводимом растворе было в пропорции 1/5. Измерение радиоактивности проводили с помощью жидкостно-сцинтилляционного счетчика WALLAC-1409. Подготовленные биологические образцы в объеме 500 мкп вносили в сцинтилляционные флаконы, содержащие 20 мл сцинтилляцисннсго коктейля «OpíiPhase «HiSafe»3", выдерживали 2 часа в темноте после чего помещали в счетчик. Определение уровня радиоактивности (число распадов в минуту, DPM) и эффективности счета проводили с помощью программы MULTICALC.

Количественное определение гимантана в биопробах проводили методом абсолютной калибровки. Построенный калибровочный график описывается следующим линейным уравнением в диапазоне от 0,07 до 8,3 микрограмм:

у = 19886х -251,08,

коэффициент регрессии составляет 0,9971.

Метод определения гимантана с использованием капиллярной газовой хроматографии.

Метод заключается в использовании капиллярной газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием. Работа выполнена на газовом хроматографе Carlo Erba Strumentazione серии HRGC 5300 mega series, снабженном пламенно-ионизационным детектором серии FID-40 и подключенном к системе газоснабжения ВОДЕНЬ-1. В качестве газа-носителя использовался азот особой чистоты, расход которого составлял 5 л/мин. Расход водорода - 0,7 л/час.

Разделение компонентов проб осуществляли на капиллярной колонке с внутренним диаметром 0,23 мм. Объем проб, вводимых в инжектор хроматографа, составлял 5 мкл. Определение гимантана проводили при градуированном температурном режиме колонки, данные которого приведены в таблице 1.

Таблица 1.

N TR, С ТМ, мин R, С/мин

1 100 3 9

2 250 5 10

3 260 10 10

4 280 25 -

где TR - температура каждого этапа, С;

ТМ - продолжительность каждого этапа, мин;

R - скорость подъема температуры,

Идентификацию гимантана производили с помощью стандартного образца по параметрам удержания. Количественное определение гимантана в биопробах проводили методом абсолютной калибровки стандартных растворов. Построенный калибровочный график описывается следующим линейным уравнением в диапазоне от 0,08 до 10,8 мкг/мл:

у = 22,621х+ 1,0812,

коэффициент регрессии составляет 0,9985.

Подготовка биологических образцов

Подготовка образцов плазмы крови и мочи для хроматографирования заключалась в двойной экстракции органическим реагентом. Биологические пробы в объеме 1 мл подщелачивали 100 мкл 0,1 М NaOH (рН=9) и дважды экстрагировали 5 мл смеси эфир:гексан в объемном соотношении 15:85, органический слой отбирали, упаривали в токе азота при 40 С, сухой остаток растворяли в 50 мкл метанола и пробы в объеме 5 мкл вводили в хроматограф. Процент экстракции гимантана из плазмы крыс составляет 89,4 %.

Идентификация метаболитов гимантана в моче крыс

С целью изучения продуктов биотрансформации гимантана в моче использовали комплексный метод, включающий газовую хроматографию и масс-спектрометрию. На первом этапе использовался газовый хроматограф VARIAN 3300. Разделение проб осуществлялось на капиллярной колонке НР-1, L=25 m, о=0,25 mm, неподвижная фаза - диметилполисилоксан, толщина нанесения 25 мк, начальная температура 50 °С, подъем температуры до 280 °С со скоростью 8 °/мин, конечная температура 280 °С в течение 5 мин. Температура инжектора 270°С; в качестве газа-носителя использовался гелий, 20 см/сек. На втором - масс-спектрометр FINNIGAN SSQ 7000; э.у. 70 э/в.

Анализ хроматомасс-спектрограмм проводили с использованием программы NIST-98. Из хроматограммы экстракта мочи крыс опытной группы вычитали хроматограммы экстракта мочи контрольной группы животных (без препарата). Разностную хроматограмму анализировали на предмет идентификации метаболитов гимантана.

Подготовка биологических образцов

Проводилась по методике, описанной в методе определения гимантана с использованием капиллярной газовой хроматографии.

Интерпретация результатов. Анализ экспериментальных данных проводили с использованием пакета программ ASKID и COMSTAT. Статистический анализ производился пакетом программ EXCEL. Результаты проведенных исследований обработаны методом вариационной статистики. Для каждого вариационного ряда вычисляли: среднее арифметическое, стандартное отклонение, стандартная ошибка

среднего значения. Достоверность различий оценивали с помощью

параметрического t-критерия Стьюдента.

Отдельные этапы исследования выполнены при консультативном и техническом содействии к.х.н. Л.М. Косточки, М.Л. Косточки (отдел химии НИИФ им. В.В. Закусова РАМН), к.б.н. И.А. Кабановой (ГУ ЦНИКВИ МЗ России), сотрудников лаборатории фармакокинетики под руководством д.м.н., проф. В.П. Жердева (НИИФ им. В.В. Закусова РАМН), которым автор приносит искреннюю благодарность.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фармакокинетика гимантана в крови крыс .

На рисунке 1 представлены концентрационные кривые 3Н-гимантана после внутривенного введения и введения внутрь препарата крысам в дозах 10 и 20 мг\кг.

Изменение концентраций радиоактивного эквивалента гимантана после внутривенного введения описывается в рамках двухкамерной модели, после введения внутрь - в рамках двухкамерной модели с всасыванием первого порядка.

Гимантан длительное время циркулирует в организме, период полувыведения препарата на терминальном участке фармакокинетической кривой после внутривенного введения (таб. 2) характеризуется высоким значением Т^р =402 ч., после введения внутрь Тшр =365 ч, среднее время пребывания препарата в организме (MRT) составляет 580 и 526 часов соответственно.

Процесс распределения 3Н-гимантана по органам и тканям (a-фаза) протекает в 50 раз быстрее, чем выведение его из организма. На это указывают такие фармакокинетические параметры, как период полураспределения Т^и = 7,94 ч. и период полувыведения Т1/2р =402 ч. при внутривенном введении; и период полураспределения Т\аа = 7,04 ч. и период полувыведения Ti/2p =365 ч. при введении внутрь.

Величина кажущегося объема распределения (Vi) в 2,3 раза (после внутривенного введения) и в 2,7 раза (после перорального введения) ниже значений объема распределения в квазистационарном состоянии (Vss) - это свидетельствуют о том, что препарат интенсивно захватывается тканями. Значения кажущегося объема распределения (Vi) значительно превышают реальный объем крови, что также указывает на лабильность препарата, его метаболизм или интенсивный захват тканями организма.

Низкие значения клиренса CI дополнительно подтверждают факт низкого концентрационного освобождения организма от препарата.

а.

Рис. 1(а, б). Фармакокинетические кривые Н-гимантана после введения внутривенно в дозе 10 мг/кг и внутрь в дозе 20 мг/кг (п=6).

Таблица 2.

Фармакокинетические параметры 3Н-гимантана для плазмы крови крыс после в/в введения и введения внутрь в дозе 10 мг/кг и 20 мг/кг (п=6)

способ Т*1/2а Т1ЯЭ С1 V, Х/вв МЯТ АиСо-240

введения час час мл/мин л/кг л/кг час мкг*час/мл

В/в 7,94 402 0,192 7,11 16,37 580 217

Внутрь 7,04 365 0,197 9,82 26,70 526 422

При изучении неизмененного гимантана в крови крыс после двух способов введения было установлено, что после внутривенного введения количество неизмененного препарата составляет 32,36 % от уровня радиоактивного эквивалента, при введении внутрь количество неизмененного препарата составляет 7,24 % от количества радиоактивного эквивалента (рис. 2 а, б).

Крысы в/в

Т, час

а.

б.

Рис. 2 (а,б). Сопоставление уровней радиоактивного эквивалента и неизмененного Гимантана в крови крыс после внутривенного введения дозы 10 мг/кг (а) и введения внутрь дозы 20 мг/кг (б) (п=6).

Таким образом, препарат активно метаболизируется в организме крыс, причем, интенсивность образования метаболитов гиманата выше при пероральном пути введения.

Расчет величины абсолютной биодоступности неизмененного препарата показал, что она составляет 28,3 %.

Изучение распределения 3Н-гимантана в тканях органов крыс

Были проведены исследования по распределению радиоактивного эквивалента гимантана в органах и тканях крыс после однократных внутривенного введения в дозе 10 мг/кг и введения внутрь в дозе 20 мг/кг. В таблице 3 представлены фармакокинетические параметры для тканей органов крыс.

Наибольшие концентрации меченого гимантана после двух способов введения достигается в выводящих органах: печени и почках.

Также высокие значения концентрации 3Н-гимантана наблюдаются после внутривенного введения в тканях селезенки, сальника, мышц, после введения внутрь в тканях мышц, стриатума, сальника, селезенки.

Время достижения максимальной концентрации в тканях органов после двух способов введения отличается. После внутривенного введения достижение Смах меченого препарата приходится почти во всех органах на 1 час, после введения внутрь значительно позднее, так, например, в тканях мозга, стриатума, семенниках время достижения максимальной концентрации составляет 8 часов.

Таблица 3.

Основные фармакокинетические параметры 3Н-гимантана для тканей органов крысы (п=6).

Т|0НЬ, орган Внутривенное введение Введение внутрь

С мах м кг/мл Тмах час АиС0-1 (мкг*час /мл) МЯТ час С мах мкг/мл Т мах час А11С 0-1 (мкг*час /мл) мет час

Плазма - - 217 580 4,916 4 422 526 0,97

Мозг 1,969 1 169 2273 2,575 8 318 282 0,94

Стриатум 3,339 1 401 1328 7,321 8 1296 762 1,62

Печень 24,24 1 452 155 34,125 1 870 128 0,96

Почки 11,41 1 265 526 14,018 3 658 144 1.24

Сепезеню 9,349 1 227 430 6,215 2 490 391 1,08

Сальник 7,431 2 659 171 7,006 4 602 1464 0,46

Мышцы 5,128 0,25 225 242 7,891 4 395 308 0,88

Тимус 2,559 1 94 247 4,248 3 313 366 1,66

Семенники 2,252 4 219 303 5,183 8 412 265 0,94

Радиоактивный эквивалент препарата длительное время циркулирует в организме. О скорости освобождения тканей от 3Н-гимантана можно судить по такому параметру, как среднее время удержания препарата в организме (MRT), располагающемуся в следующем порядке (по возрастанию): после внутривенного введения - печень, сальник, мышцы, тимус, семенники, селезенка, почки, стриатум, мозг, после введении внутрь - печень, почки, семенники, мозг, мышцы, тимус, селезенка, стриатум, сальник.

Расчет тотального содержания 3Н-гимантана в пересчете на весь орган показал, что наибольшее количество радиоактивного эквивалента гимантана находится в мышцах и сальнике. На долю мышечной ткани приходится около 50 % препарата, в то время как его содержание в крови на порядок меньше.

Результаты, заслуживающие отдельного внимания, были получены при сравнении распределения 3Н-гимантана после внутривенного и перорального введения.

Если сравнивать площади под фармакокинетической кривой (таб. 3), то для стриатума при введении внутрь величина AUCo-t превышает величину AUCo-t при внутривенном введении (с учетом дозы) в 1,62 раза, для тимуса - в 1,66 раз, у сальника, в отличие от первых двух органов, при введении внутривенно AUCo-t больше, чем при введении внутрь в 2,19 раза.

Данные о разности во времени достижения максимальной концентрации, и данные о различном содержании 3Н-гимантана в тканях органов свидетельствуют о разной степени связывания радиоактивного эквивалента гимантана в зависимости от способа введения. По-видимому, происходит изменение структуры препарата благодаря метаболическим превращениям гимантана при прохождении через ЖКТ. Вероятно, структура образующегося метаболита (-ов) более интенсивно преодолевает ГЭБ и селективно связывается с тканями стриатума, а также тимуса. Различия в интенсивности прохождения процессов метаболизма были подтверждены при изучении неизмененного препарата (стр. 11).

Полученные результаты позволяют дать фармакокинетическое обоснование особенностей в динамике развития эффекта после двух способов введения гимантана: внутривенно и внутрь. Данные, полученные Е.А. Вальдман (2001), свидетельствуют о том, что эффект гимантана оказался наиболее выраженным при введении внутрь. Поскольку стриатум является структурой мозга, имеющей непосредственное отношение к патогенезу паркинсонизма, то, по-видимому, преобладание гимантана в тканях органа при перорапьном введении обуславливает его эффект.

стриатум

»

Рис. 3. Сравнительное содержание радиоактивного эквивалента гимантана в тканях органов крыс при двух способа введения

Изучение динамики изменения коэффициента распределения

Для выяснения сорбционных особенностей тканей органов и изучения динамики выведения и накопления препарата во времени был рассчитан коэффициент распределения (Кр), представляющий собой отношение концентрации препарата в тканях органа к концентрации препарата в крови.

Коэффициент распределения во всех органах, кроме тимуса и мозга имеет значение больше единицы, это свидетельствует о том, что препарат хорошо насыщает органы. Характер кривых зависимости Кр от времени (рис.4) указывает, что

- меченый препарат наиболее интенсивно проникает в ткани печени, селезенки, сальников;

- после внутривенного введения в тканях сальника наблюдается накопление препарата, в остальных органах скорость выведения радиоактивного препарата равна скорости его выведения из системного кровотока;

- через 24 часа после введения внутрь в тканях селезенки, сальника, мышц, семенников наблюдается кумуляция препарата на протяжении 3-х суток, а затем начинается его выведение из тканей органов; в печени и почках скорость выведения препарата приблизительно равна скорости выведения из кровеносного русла.

Отдельно была рассмотрена динамика изменений Кр в тканях органов-мишеней. Поскольку гимантан является потенциальным лекарственным средством для лечения болезни Паркинсона, а также обладает иммунотропной активностью, то, следовательно, органами-мишенями для него являются вилочковая железа или тимус, мозг и, в частности, стриатум. Для сравнения были взяты еще две структуры мозга -мозжечок и гиппокамп.

Полученные данные (рис. 4) свидетельствуют, что наибольшие концентрации 3Н-гимантана уже в ранний период после введения обнаруживаются в стриатуме. Причем, идет увеличение значения Кр со временем. К 10-м суткам после введения концентрация меченого препарата в стриатуме после внутривенного введения превышает концентрацию в крови более, чем в 2, а при введении внутрь более, чем в 3 раза, что говорит о накоплении препарата в данной структуре мозга. Эта тропность характеризизуется значительной селективностью именно к ткани стриатума, степень которой более, чем в 100 раз превосходит таковую к тканям мозжечка и гиппокампа на всем интервале наблюдения (Кр для мозжечка и гиппокампа на графике не представлены). В мозге и тимусе после двух способов введения скорость выведения препарата равна скорости выведения из системного кровотока.

Как обсуждалось выше (стр. 13), уровни концентраций в стриатуме и тимусе были

выше при введении внутрь, чем при внутривенном введении.

15

п/о

2,5-1 2 • / —Ф—селезенка -«—сальники —А—мышцы -•—семенник

1,5.

0.5' ¡У ^г

V

1 А В 24 Ж Т, час 240

в/в

12' ■ ♦ печень —■—почки

10.

£ в. /Лл

4. //ч \

2' I/

•

1 4 6 24 96 Т, чае 240

еГв

2,5-

1,5 ■ У» —■

.-У ♦ мозг —стриатум —А—тимус

0,5.

г

) 0,25 1 4 6 24 96 Т.час 240

Рис. 4.

Динамика изменений коэффициента распределения 3Н-гимантана в тканях органов крыс

Гипотеза линейности 3Н-гимантана

Было проведено исследование влияния введения различных доз гимантана на фармакокинетику у крыс.

На Рис. 5 представлены три концентрационных профиля 3Н-гимантана после внутривенного введения крысам в дозах 5,10 и 30 мг/кг.

Ю-«

9- ' 8- .

0 10 20 30 40 50

! Т,час

Рис.5. Концентрационные кривые 3Н-гимантана в крови крыс после внутривенного введения различных доз.

Анализ концентрационных кривых показывает, что с увеличением дозы пропорционально увеличивается концентрация радиоактивного эквивалента в плазме крови. Такой фармакокинетический параметр, как площадь под фармакокинетической кривой также с увеличением дозы увеличивается в соответствующее число раз. Так, если для дозы 5 мг/кг величина величина АЫС равняется 41,566 мкг*ч/мл, то увеличение дозы в 2 и 6 раз изменяет площадь под концентрационной кривой до 76,511 мкг*ч/мл и 225,668 мкг*ч/мл. Значения дозонезависимых параметров не изменялись с увеличением количества введенного препарата.

Концентрационные кривые и данные основного фармакокинетического параметра (площади под фармакокинетической кривой) доказывают линейность препарата в крови в зависимости от введенной дозы.

Кинетика выведения гимантана с мочой из организма крыс

Из полученных данных следует, что количество радиоактивного эквивалента гимантана в 22,7 раза превышает количество неизмененного препарата (рис. 6 а,б). Так за 10 суток выводится всего 39,71 % радиоактивного эквивалента гимантана от введенной дозы, причем наибольшая часть препарата выходит за первые сутки

17

наблюдения. Та же тенденция прослеживается в поведении неизмененного препарата. За 10 суток выводится 1,75 % неизмененного гимантана, из них за первые сутки выходит также большая часть вещества. Таким образом, препарат медленно выводится с мочой, в основном, в виде метаболитов.

радиоактивный эквивалент гимантана

Т, час

а.

неизмененный гимантан

0 50 100 150 200 250

Т, час

б.

Рис. 6 (а, б). Выведение радиоактивного эквивалента гимантана (а) и неизмененного препарата (б) с мочой после внутривенного введения в дозе 10 мг/кг.

Фармакокинетика 3Н-гимантана в крови кроликов

Было проведено изучение фармакокинетики 3Н-гимантана в крови кроликов после внутривенного введения в дозе 10 мг/кг и введения внутрь субстанции и таблетки в дозах 10 мг/кг. Также как и у крыс, было изучено содержание радиоактивного эквивалента Гимантана и неизмененного препарата.

20 18 16 14 12

к 10

s

о

0 10

20 30 Т, час

т~

40

т

50

Рис. 7. Концентрационные профили 3Н-гимантана после введения кроликам

Таблица 4.

Время Время Ттах MRT Общий Обьм AUCo-t С мах

Введение полурас полувыве (час) (час) клиренс распред (мкг*ч/м (мкг/мл)

пределе дения CI еления Л)

доза ния Тр1/2 (в/в) (мл/мин/кг) V

То.1/2 или (л/кг)

(час) Tl/2(nfe)

(час)

В/в 0,421 38,7 - 55,8 1,44 0,370 116 -

Юмг/кг ± ± + ± ± ±

0,063 4.6 5,7 0,07 0,011 6

Peros - 34,9 3,0 50,4 1.59 4,80 104 3,68

таблетки ± ± ± ± ± ± ±

10 мг/кг 17.9 1,1 25.3 0.47 0 81 37 0,43

Peros - 31,2 2,3 45,1 1,73 4,68 96,2" 3,18

субстанц. ± ± ± ± ± ± ±

10 мг/кг 9,7 0,9 13,5 0,32 0,65 19,0 0,18

Прим: " - различия статистически незначимы при р < 0,01, по сравнению с

введением таблетки.

0

На рисунке 7 представлены концентрационные кривые после двух способов введения кроликам. На кривой построенной по значениям концентрации, полученным после внутривенного введения наблюдается наличие а-фазы. Расчет

фармакокинетических параметров после внутривенного введения был осуществлен в рамках двухкамерной модели (таб 4). В связи с тем, что скорость распределения препарата по тканям органов, по-видимому, выше скорости всасывания препарата из желудка, на концентрационной кривой после введения внутрь не наблюдается а-фазы. Поэтому расчет фармакокинетических параметров был осуществлен в рамках однокамерной модели с всасыванием первого порядка (таб. 4).

Данные, представленные в таб. 4, убедительно подтверждают высокую скорость распределения (а-фаза) препарата при внутривенном введении, которая составляет "Пдрас =0,421 часа. В то же время, скорость выведения 3Н-Гимантана характеризуется изменением содержания препарата на терминальной фазе концентрационной кривой в 100 раз медленнее и, в среднем, равна Т1/гр=38,7 часа, среднее время удержания препарата в организме - 55,8 часа, что свидетельствует о продолжительном пребывании препарата в организме.

Значения объема распределения V = 0,370 л/кг соответствует 37,0 % от объема организма, что свидетельствует об объемном распределении препарата во внеклеточной жидкости.

При введении внутрь таблетки и субстанции значимых различий не обнаружено, что подтверждается статистической обработкой данных с использованием критерия Стъюдента, наблюдается лишь тенденция к различию.

Продолжительность пребывания препарата в организме после введения внутрь довольно высока, так период полувыведения для таблеток равен 39,4 ч, среднее время удержания препарата в организме - 50,4 ч. Для субстанции период полувыведения составляет - 31,2 ч, среднее время удержания препарата в организме -45,1 ч.

Относительная биодоступность при введении внутрь таблетки препарата составляет у кроликов 92,5 %, кроме того, такие параметры, как полнота и скорость всасывания радиоактивного эквивалента 3Н-гимантана из лекарственной формы «таблетки», оцениваемые по величинам А11С(м и Смах/ АиС«, соответственно, по своим значениям статистически незначимо отличаются от параметров всасывания субстанции при степени вероятности р < 0,05 (таб. 5), что позволяет рекомендовать таблетированную лекарственную форму для клинических исследований.

Таблица 5.

Фармакокинетические параметры 3Н-гимантана при двух способах введения

Параметр введение А1)С <м (мкг*ч/мл) Смах/АиС м (час1) Доза (мг/кг) Т

¡.V. субстанция (¡.у.с.) 116± 6 10 1,000

р.о. субстанция (р.о.с.) 104 ±37* 0,0306* 10 0,8966

р.о. таблетки (р.о.т.) 96,2 ± 19,0** 0,0383* 10 0,8293

Прим: Различия статистически незначимы * - при р < 0,05, ** - при р < 0,01; по сравнению с в/в введением субстанции

Изучение количественного содержания неизмененного гимантана в крови кроликов после внутривенного введения в дозе 10 мг/кг показало, что количество неизмененного препарата составляет 42,91% от соответствующего количества радиоактивного эквивалента гимантана (рис. 8). Это свидетельствует о том, что гимантан подвергается в организме кроликов, также как и в организме крыс, интенсивным метаболитическим изменениям. Если же сравнить данные о количестве неизмененного препарата у крыс и кроликов, мы увидим, что при внутривенном пути введения интенсивность образования метаболитов гимантана у крыс несколько выше, чем у кроликов.

-г-

10

15 Т, час

20

■-г—

25

-1

30

Рис. 8. Сопоставление уровней радиоактивного эквивалента и неизмененного гимантана в крови кроликов после в/в введения.

Многократное введение кроликам

Для возможности определения влияния многократного введения гимантана на фармакокинетические параметры проводилось изучение его фармакокинетики после шестикратного введения в дозе 10 мг/кг с интервалом в 24 часа. Эти данные позволяют выявить возможные изменения активности метаболизирующих систем после многоразового введения. На рисунке 9 представлена теоретически рассчитанная фармакокинетическая кривая и экспериментально полученные результаты в соответствующие временные точки.

Результаты исследования показали, что при многократном введении гимантана кроликам наблюдается кумуляция радиоактивного эквивалента в крови, однако экспериментально обнаруженные концентрации хорошо согласуются с их теоретически рассчитанными значениями.

Т, час

Рис.9. Многократное введение 3Н-гимантана кроликам в дозе 10 мг/кг, внутрь.

Метаболизм гимантана

В связи с тем, что гимантан активно метаболизирует в организме экспериментальных животных с образованием значительного количества метаболитов, было проведено исследование, направленное на изучение качественного состава метаболитов. Продукты биотрансформации гимантана в моче изучали хроматомасс-спектрометрическим методом.

Было установлено, что метаболизм Гимантана происходит по следующим направлениям (см. схему на рис. 10):

- моногидроксилирование адамантанового цикла (II);

- дигидроксилирование адамантанового цикла с последующим образованием Мокиси (1Y);

- метилирование гидроксильной группы дигидрокси-производного (Illa) или метилированию окси-группы с образованием N-окиси (Шб);

- раскрытие гексаметилениминового цикла и его карбоксилирование (Y);

- образование конъюгатов (YI).

f

I - неизмененный препарат;

II - Окси-производное Гимантана;

| III - а) Окси, метокси-производное Гимантана;

' б) Метокси, N-окись - производное Гимантана;

IV - Диокси, N-окись - производное Гимантана;

V - Карбокси - производное Гимантана;

' VI - Образование конъюгатов Гимантана.

I Рис. 10. Схема предполагаемых путей метаболизма Гимантана

выводы

1. Гимантан хорошо всасывается из ЖКТ крыс и кроликов, интенсивно распределяется по всем органам и тканям, активно метаболизируется в организме экспериментальных животных, особенно при введении внутрь.

2. В тканях стриатума и тимуса после введения гимантана внутрь содержание радиоактивного эквивалента препарата в два раза больше, чем после внутривенного введения, что связано с различиями в биотрансформации Гимантана при введении внутрь и внутривенно.

3. Доказана линейная зависимость между вводимой гимантана дозой и концентрацией вещества в плазме крови.

4. Установлено, что препарат выводится с мочой, в основном, в виде метаболитов, на протяжении 10 суток. Основная часть неизмененного препарата и его метаболитов выводится в течение первых суток.

5. Многократное введение Гимантана приводит к кумуляции препарата в крови кроликов.

6. Высокая степень относительной биодоступности таблетированной лекарственной формы Гимантана у кроликов позволяет рекомендовать ее для проведения клинических испытаний.

7. Масс-спекгрометрический анализ выделенных метаболитов гимантана позволил предложить схему его возможных превращений в организме, связанных с образованием окси-производного; окси.метокси- производного; метокси,Ы-окись-производного; диокси-М-окись-производного; карбокси - производного; конъюгатов Гимантана.

Список публикаций по теме диссертации

1. Петренко Е.С., Вальдман Е.А., Родионов А.П., Ковалев Г.И. Распределение Гимантана - нового производного адамантана с противопаркинсонической активностью по тканям органов в эксперименте. // Ж. Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств,-2001,-Т.З, N7, с. 101-103.

2. Петренко Е.С., Вальдман Е.А., Родионов А.П., Ковалев Г.И., Нечаева Е.Б. Особенности фармакокинетики нового потенциального противопаркинсонического средства Гимантан. // Тезисы докладов VIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва.- 2001.- 2-6 апреля, с. 480.

3. Родионов А.П., Ковалев Г.И., Петренко Е.С., Вальдман Е.А. Экспериментальная фармакокинетика нового производного адамантана с противопаркинсонической

24

j

активностью. II Тезисы докладов 3-ей Международной конференции «Биологические ' основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». - Суздаль,-

4 2001,- 15-18 мая, с. 75.

i

4. Петренко Е.С., Вальдман Е.А. , Родионов А.П., Ковалев Г.И., Нечаева Е.Б.

i

Фармакокинетика нового потенциального противопаркинсонического средства Гимантан. // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва,- 2002,- 8-12 апреля, с. 676.

5. Ковалев Г.И., Родионов А.П., Петренко Е.С., Золотарев Ю.А. Сравнительное

I

изучение распределения НЗ-Гимантана в структурах мозга и вилочковой железе крыс.

I

// Ж. Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003.- Т.66.- N 3, с. 50-52.

i I I i

1 i

í.

185^ »185 6 3

Отпечатано ЗАО «Оперативное тиражирование» ИНН - 7710243829

т. 100 экз., заказ № 111/6-2, от 6.11.2003

Актуальность проблемы. Фармакокинетические исследования проводятся на разных этапах создания лекарственных средств: на стадии доклинического экспериментального изучения на животных, при первичных и расширенных клинических испытаниях, а также после внедрения лекарства в практическую медицину.

Предметом экспериментальной фармакокинетики является изучение процессов всасывания, распределения, биопревращения и выделения препарата. Знание фармакокинетических свойств фармакологического средства позволяет обосновать выбор путей и методов его введения, выявить ткани, в которые оно проникает наиболее интенсивно и/или в которых удерживается наиболее длительно, установить основные пути элиминации фармакологического средства. По результатам экспериментального изучения фармакокинетики фармакологического средства возможна выработка ориентировочной схемы его дозирования и применения, обеспечивающей поддержание эффективной концентрации препарата в пределах терапевтического диапазона, которая может быть затем уточнена в ходе клинических испытаний. Важной задачей изучения фармакокинетики оригинального фармакологического средства является оптимизация выбора его лекарственной формы (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000). Кроме того, фармакокинетические данные позволяют объяснить различия в реакции организма на лекарственное вещество, предупредить возникновение нежелательных эффектов препарата (Вальдман А.В., Жердев В.П., 1988; Жердев В.П. и др., 2003; Мирошниченко И.И., 2001).

Данная работа посвящена изучению фармакокинетических свойств нового потенциального противопаркинсонического средства - Гимантан в эксперименте на животных. Работа проводилась в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000).

Интерес к данному веществу - потенциальному лекарственному средству для лечения болезни Паркинсона обусловлен тем, что среди хронических заболеваний центральной нервной системы паркинсонизм занимает одно из центральных мест, являясь наиболее часто встречающимся неврологическим заболеванием (Ортель В.Х., Коршунов A.M., 1997; Lewis et al., 2003). Паркинсонизм, независимо от этиологии и возраста, в котором он начался, значительно сокращает продолжительность жизни (Martin, 1999; Gutman et al., 2003).

В настоящее время комплексное лечение паркинсонизма использует препараты, относящиеся к разным классам фармакологических средств. Некоторые из них показаны практически при всех формах паркинсонизма, другие - имеют специальные показания. Основным способом лечения болезни Паркинсона является применение препаратов, содержащих предшественник дофамина, который, проникая через гематоэнцефалический барьер, в процессе биосинтеза катехоламинов при декарбоксилировании превращается в дофамин -леводопа (L-ДОФА). Однако, наряду с преимуществом перед антипаркинсоническими препаратами других фармакологических групп, ДОФА-содержащие препараты имеют ряд существенных недостатков: снижение эффективности в процессе лечения (Крыжановский Г.Н. и др., 1995) и развивающиеся клинически нежелательные явления (Карабань И.Н., 1996). Кроме того, в терапии паркинсонизма используются ингибиторы моноаминооксидаз и КОМТ, увеличивающие эффективность дофаминзамещающей терапии (Крыжановский Г.И. и др., 1995, Jorga, 1998), холиноблокаторы, агонисты дофаминовых рецепторов, антиоксиданты (Lewis et al., 2003; Gutman et al., 2003).

Многие используемые ныне подходы к лечению заболевания направлены на отдельные звенья его патогенеза и имеют целый ряд существенных недостатков, что требует продолжения поиска и создания новых антипаркинсонических средств, способных комплексно влиять на ряд составляющих патогенетического процесса заболевания.

В комплексной терапии паркинсонизма значительный удельный вес занимают препараты аминоадамантанового ряда, используемые в виде разных солей 1- и 2-аминоадамантана - гидрохлорида (адамантан, мидантан), сульфата (симметрел, вирегит), глюкоронида (глудантан) (Морозов И.С. и др., 2001).

Положительный эффект амантадина при паркинсонизме подтвержден многими исследователями (Schwab et al., 1966; Parkes et al., 1970; Fieschi et al., 1972; Кадыков A.C, 1976; Камянов И.М., 1976). Кроме того, многие производные адамантана имеют выраженную иммунотропную активность (Арцимович, 1990,

2000). Препараты данной группы обладают рядом преимуществ по сравнению с другими лекарственными средствами. Основным положительным моментом является сравнительно небольшое количество побочных эффектов, а также сохраняющаяся при длительном лечении эффективность.

В ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН были синтезированы и изучены такие производные адамантана, как мемантин, бемантан, димантан, кемантан, бромантан и другие. В ходе дальнейшего изучения веществ данной группы был синтезирован целый ряд соединений, из которого по итогам первичного скрининга было выделено соединение с наиболее ярко выраженной противопаркинсонической активностью - гидрохлорид М-(адамант-2-ил)гексаметиленимина (А-7 или Гимантан). Доклиническое исследование данного соединения было проведено д.м.н. Е.А. Вальдман в лаборатории психофармакологии НИИ Фармакологии РАМН под руководством проф. Т.А. Ворониной.

Противопаркинсонические свойства А-7 были изучены на моделях акинетико-ригидных и дрожательных проявлений паркинсонического синдрома (Вальдман Е.А. и др., 1999). Результаты исследований показали, что изучаемое соединение обладает способностью устранять акинетико-ригидные проявления паркинсонического синдрома, имея преимущества перед применяемыми в медицинской практике препаратами (Вальдман Е.А. и др., 1999; Неробкова Л.Н. и др., 2000). Одним из основных преимуществ Гимантана перед другими лекарственными препаратами является отсутствие привыкания и синдрома отмены после длительного применения. Установлено, что Гимантан обладает высокой иммунотропной активностью в терапевтической дозе 10 мг/кг (Нежинская Г.И. и др., 2001), что может вносить вклад в реализацию симптоматического и нейропротекторного эффекта препарата.

Таким образом, была показана перспективность дальнейшей разработки Гимантана в качестве потенциального средства для лечения паркинсонизма.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось доклиническое изучение фармакокинетики Гимантана и путей его биотрансформации. Для достижения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать фармакокинетику и распределение радиоактивного эквивалента Гимантана в крови, по органам крыс после однократного внутривенного введения и введения внутрь.

2. Провести проверку гипотезы линейности фармакокинетики Гимантана при однократном внутривенном введении различных доз.

3. Изучить кинетику выведения радиоактивного эквивалента Гимантана из организма крыс.

4. Изучить фармакокинетику Гимантана у кроликов после однократного внутривенного введения субстанции и введения внутрь субстанции и таблетки.

5. Изучить фармакокинетику препарата у кроликов после многоразового введения.

6. Установить количественное содержание неизмененного Гимантана в крови крыс и кроликов, в моче крыс.

7. Изучить выведение Гимантана с мочой, пути биотрансформации и установить химические структуры возможных метаболитов.

Научная новизна. Разработан оригинальный, высокочувствительный и селективный метод определения Гимантана в биологическом материале с использованием капиллярной газовой хроматографии.

Впервые изучены фармакокинетические свойства нового потенциального противопаркинсонического средства - Гимантан. Выявлены абсорбционные свойства тканей организма; доказана линейность зависимости между уровнями содержания 3Н-Гимантана в крови и вводимой дозой; выявлены различия концентрации 3Н-Гимантана в крови и органах при различных способах введения у крыс. Показана особая тропность радиоактивного эквивалента препарата к органу-мишени - стриатуму. Найдено фармакокинетическое обоснование различий в динамике развития эффекта Гимантана при разных способах введения. Установлено, что исследуемое соединение подвергается биотрансформации, особенно активной при пероральном способе введения. Установлено, что количество продуктов метаболизма Гимантана в моче экспериментальных животных значительно превышает количество неизмененного вещества. Выявлены пути биотрансформации и качественный состав возможных метаболитов.

Научно-практическая значимость. Разработанный метод определения Гимантана с использованием капиллярной газовой хроматографии предложен для широкого применения в практике при проведении фармакокинетических исследований соединений класса адамантана.

Найденные фармакокинетические закономерности позволяют дать некоторые практические рекомендации при создании лекарственной формы. Разработанная в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН таблетированная лекарственная форма Гимантана обладает высокой относительной биодоступностью и может быть рекомендована для клинических исследований.

Полученные результаты вошли в материалы доклинического изучения Гимантана, утвержденные Медико-биологической комиссией НИИ Фармакологии РАМН, для представления в Минздрав РФ и получения разрешения на проведение клинических испытаний в качестве средства лечения паркинсонизма.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. ПАРКИНСОНИЗМ

Паркинсонизм - хроническое заболевание нервной системы человека, которое проявляется нарушениями преимущественно двигательной сферы в виде симптомов гипокинезии, тремора и мышечной ригидности, к которым могут присоединяться вегетативные расстройства (гиперсаливация, гипергидроз), и нарушения психики (брадифрения, депрессия, деменция).

Среди хронических заболеваний центральной нервной системы паркинсонизм занимает одно из центральных мест, являясь одним из наиболее часто встречающихся неврологических заболеваний. Его частота составляет 100 - 200 больных на 100000 населения. Заболеваемость прогрессирует с возрастом: на 100000 населения в возрасте до 54 лет ежегодно приходится 5 новых случаев, в возрасте 55-64 года - 32, в возрасте 65-74 года - 113, 75 лет и более - 254 (Ортель В.Х., Коршунов A.M., 1997). Паркинсонизм, независимо от этиологии и возраста, в котором он начался, значительно сокращает продолжительность жизни. Смертность среди больных паркинсонизмом почти в 3 раза выше, чем в остальной популяции того же возраста, пола и расы (Вейн A.M. и др., 1981).

6. выводы

1. Гимантан хорошо всасывается из ЖКТ крыс и кроликов, интенсивно распределяется по всем органам и тканям, активно метаболизируется в организме экспериментальных животных, особенно при введении внутрь.

2. В тканях стриатума и тимуса после введения Гимантана внутрь содержание радиоактивного эквивалента препарата в два раза больше, чем после внутривенного введения, что связано с различиями в биотрансформации Гимантана при введении внутрь и внутривенно.

3. Доказана линейная зависимость между вводимой дозой Гимантана и концентрацией вещества в плазме крови.

4. Установлено, что препарат выводится с мочой, в основном, в виде метаболитов, на протяжении 10 суток. Основная часть неизмененного препарата и его метаболитов выводится в течение первых суток.

5. Многократное введение Гимантана приводит к кумуляции препарата в крови кроликов.

6. Высокая степень относительной биодоступности таблетированной лекарственной формы Гимантана у кроликов позволяет рекомендовать ее для проведения клинических испытаний.

7. Масс-спектрометрический анализ выделенных метаболитов Гимантана позволил предложить схему его возможных превращений в организме, связанных с образованием окси-производного; окси,метокси- производного; метокси,М-окись-производного; диокси-М-окись-производного; карбокси -производного; конъюгатов Гимантана.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди хронических заболеваний центральной нервной системы паркинсонизм занимает одно из центральных мест, являясь одним из наиболее часто встречающихся неврологических заболеваний, затрагивающим около 2% населения старше 65 лет (Ортель В.Х., Коршунов A.M., 1997; Martin, 1999). Паркинсонизм, независимо от этиологии и возраста, в котором он начался, значительно сокращает продолжительность жизни (Lewis et al., 2003; Gutman et al., 2003).

Применяющиеся в настоящее время лекарственные препараты для лечения паркинсонизма имеют целый ряд существенных недостатков, что требует продолжения поиска и создания новых антипаркинсонических средств (Lewis et al., 2003; Gutman et al., 2003).

В комплексной терапии паркинсонизма значительный удельный вес занимают препараты аминоадамантанового ряда, используемые в виде разных солей 1- и 2-аминоадамантана - гидрохлорида (мидантан), сульфата (симметрел, вирегит), глюкоронида (глудантан).

В ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН синтезированы и изучаются такие производные адамантана, как мемантин, бемантан, димантан, кемантан, бромантан и другие. В развитие данного направления был синтезирован целый ряд оригинальных соединений, из числа которых в ходе первичного скрининга было выделено соединение с наиболее ярко выраженной противопаркинсонической активностью - гидрохлорид Ы-(адамант-2-ил)гексаметиленимина (А-7 или Гимантан). Доклинически данное соединение было изучено д.м.н. Е.А. Вальдман в лаборатории психофармакологии под руководством проф. Т.А.Ворониной (Вальдман Е.А., 2001).

Противопаркинсонические свойства А-7 были изучены на моделях акинетико-ригидных и дрожательных проявлений паркинсонического синдрома (Вальдман Е.А. и др., 1999). Результаты исследований показали, что изучаемое соединение обладает способностью устранять акинетико-ригидные проявления паркинсонического синдрома, имея преимущества перед имеющимися в медицинской практике препаратами (Вальдман и др., 1999; Неробкова и др., 2000). Одним из основных преимуществ Гимантана перед другими лекарственными препаратами является отсутствие привыкания и синдрома отмены после длительного применения. Также было установлено, что Гимантан обладает высокой иммунотропной активностью в терапевтической дозе 10 мг/кг (Нежинская и др., 2001), что может вносить вклад в реализацию симптоматического и нейропротекторного эффекта препарата.

Таким образом, была показана перспективность дальнейшей разработки Гимантана в качестве потенциального средства для лечения паркинсонизма.

Одним их этапов создания лекарственных средств является проведение фармакокинетических исследований. Предметом экспериментальной фармакокинетики является изучение процессов всасывания, распределения, биопревращения и выделения препарата. Знание фармакокинетических свойств фармакологического средства позволяет обосновать выбор путей и методов его введения, выявить ткани, в которые оно проникает наиболее интенсивно и/или в которых удерживается наиболее длительно, установить основные пути элиминации фармакологического средства. По результатам экспериментального изучения фармакокинетики фармакологического средства возможна выработка ориентировочной схемы его дозирования и применения, обеспечивающей поддержание эффективной концентрации препарата в пределах терапевтического диапазона, которая может быть затем уточнена в ходе клинических испытаний. Важной задачей изучения фармакокинетики оригинального фармакологического средства является оптимизация выбора его лекарственной формы (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000). Кроме того, фармакокинетические данные позволяют объяснить различия в реакции организма на лекарственное вещество, предупредить возникновение нежелательных эффектов препарата (Вальдман А.В., Жердев В.П., 1988; Жердев В.П. и др., 2003; Мирошниченко И.И., 2001).

В связи с вышеизложенным, целью данной работы, явилось доклиническое изучение фармакокинетики Гимантана и путей его биотрансформации. Для достижения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи: а) исследование фармакокинетики и распределения радиоактивного эквивалента Гимантана в крови, по тканям органов крыс после однократного внутривенного введения и введения внутрь; б) проведение проверки гипотезы линейности фармакокинетики Гимантана при однократном внутривенном введении различных доз; в) изучение кинетики выведения радиоактивного эквивалента Гимантана из организма крыс; г) изучение фармакокинетики

Гимантана у кроликов после однократного внутривенного введения субстанции и введения внутрь субстанции и таблетки; д) изучение фармакокинетики препарата у кроликов после многоразового введения; е) установление количественного содержания неизмененного Гимантана в крови крыс и кроликов, в моче крыс; ж) изучение выведения Гимантана с мочой, путей биотрансформации и установление химических структуры возможных метаболитов.

Для их выполнения был использован комплекс методических подходов, включающий радиоизотопный метод, специально разработанную методику с использованием капиллярной газовой хроматографии и метод хроматомасс-спеюрометрии. Работа проводилась в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000).

Применяемый радиоизотопный метод дает сведения о содержании т.н. радиоактивного эквивалента Гимантана, т.е. суммарном содержании самого препарата и его возможных метаболитов. Использовали меченый по тритию Гимантан со специфической активностью 14 Ci/mmol. Минимально определяемая концентрация Гимантана соответствует 0,07 мкг/мл.

Для количественного определения неизмененного Гимантана применяли специально разработанный метод газовой хроматографии. Метод заключается в использовании капиллярной газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием. Минимально определяемая концентрация Гимантана составляла 0,08 мкг/мл.

Продукты биотрансформации Гимантана в моче изучали хроматомасс-спектрометрическим методом. С этой целью использовали комплексный метод, включающий газовую хроматографию и масс-спектрометрию.

Изучение фармакокинетики препарата в крови животных двух видов после внутривенного и перорального введений включало в себя изучение: (а) содержания радиоактивного эквивалента Гимантана (суммарное содержание самого препарата и его возможных метаболитов), и (б) концентрацию неизмененного Гимантана.

Характер поведения р.а.э. Гимантана в крови экспериментальных животных отличается длительной циркуляцией в организме и быстрым прохождением процесса распределения по органам и тканям, что является характерным для соединений данной группы (Морозов И.С.2001). Об этом свидетельствуют рассчитанные фармакокинетические параметры.

Фармакокинетические параметры 3Н-Гимантана для плазмы крови крыс были рассчитаны после внутривенного введения в рамках двухкамерной модели, после введения внутрь - в рамках двухкамерной модели с всасыванием первого порядка. Расчет фармакокинетических параметров после внутривенного введения препарата кроликам был осуществлен в рамках двухкамерной модели, после введения внутрь - в рамках однокамерной модели с всасыванием первого порядка. Фармакокинетические параметры для крыс представлены в таблице 7, для кроликов в таблице 24.

Как уже говорилось, 3Н-Гимантан длительное время циркулирует в организме, при этом процесс распределения 3Н-Гимантана по органам и тканям крыс (а-фаза) протекает в 50 раз быстрее, чем выведение его из организма, а процесс распределения 3Н-Гимантана по органам и тканям кроликов после внутривенного введения протекает в 100 раз быстрее, чем процесс выведения. На это указывают такие фармакокинетические параметры, как среднее время пребывания препарата в организме (MRT), период полураспределения (Т1/2а) и период полувыведения (Ti/гр).

В протекании процессов распределения и выведения р.а.э. Гимантана у двух видов экспериментальных животных обнаружены межвидовые различия. Так, у крыс процесс распределения проходит в 17,5 раз, а процесс выведения -в 10 раз медленнее, чем у кроликов. То же и со временем удержания препарата в организме: для двух способов введения значение MRT у крыс больше значения MRT у кроликов примерно в 10 раз.

Для р.а.э. Гимантана характерно интенсивное распределение по тканям органов. У крыс величина кажущегося объема распределения (Vi) в 2,3 раза (после внутривенного введения) и в 2,7 раза (после перорального введения) ниже значений объема распределения в квазистационарном состоянии (Vss) -это свидетельствуют о том, что препарат интенсивно захватывается тканями. И у крыс, и у кроликов (после введения внутрь) значения кажущегося объема распределения (Vi) значительно превышают реальный объем крови, что также указывает на лабильность препарата, его метаболизм или интенсивный захват тканями организма. У кроликов значение объема распределения после внутривенного введения V = 0,370 л/кг соответствует 37,0 % от объема организма, что свидетельствует об объемном распределении препарата во внеклеточной жидкости.

Низкие значения клиренса (С1) у крыс дополнительно подтверждают факт низкого концентрационного освобождения организма от препарата. У кроликов значения клиренса на порядок выше, чем у крыс, что говорит о более быстром выведении препарата из организма. Об этом же упоминалось при сравнении таких параметров как среднее время пребывания препарата в организме и период полувыведения.

При введении кроликам таблетки и субстанции внутрь значимых различий не обнаружено, что подтверждается статистической обработкой данных с использованием t-критерия Стъюдента.

Относительная биодоступность при введении внутрь таблетки препарата составляет у кроликов 92,5 %. Кроме того, такие параметры, как полнота и скорость всасывания радиоактивного эквивалента 3Н-Гимантана из лекарственной формы «таблетки», оцениваемые по величинам AUCo-t и Смах/AUCo-t, соответственно, по своим значениям статистически незначимо отличаются от параметров всасывания субстанции (р < 0,05), что позволяет рекомендовать таблетированную лекарственную форму для клинических исследований.

При изучении неизмененного Гимантана в крови крыс после двух способов введения (рис. 20, 21) было установлено, что после внутривенного введения количество неизмененного препарата составляет 32,36 % от уровня радиоактивного эквивалента, после введения внутрь количество неизмененного препарата составляет 7,24 % от количества радиоактивного эквивалента. Таким образом, препарат активно метаболизируется в организме крыс, причем, интенсивность образования метаболитов Гимантана выше при пероральном пути введения.

Расчет величины абсолютной биодоступности неизмененного препарата у крыс показал, что она составляет 28,3 %.

Изучение количественного содержания неизмененного Гимантана в крови кроликов после внутривенного введения (рис. 22) показало, что количество неизмененного препарата составляет 42,91% от соответствующего количества радиоактивного эквивалента Гимантана. Это свидетельствует о том, что Гимантан подвергается в организме кроликов, также как и в организме крыс, интенсивным метаболитическим изменениям. Сравнение данных о количестве неизмененного препарата у крыс и кроликов показывает, что при внутривенном пути введения интенсивность образования метаболитов Гимантана у крыс несколько выше, чем у кроликов.

Как уже говорилось, препарат интенсивно распределяется по тканям органов.

Экспериментальные данные, полученные после изучения распределения радиоактивного эквивалента Гимантана в органах и тканях крыс после однократных внутривенного введения в дозе 10 мг/кг и введения внутрь в дозе 20 мг/кг (таб. 9 и 10) свидетельствуют, что наибольшие концентрации меченого Гимантана после двух способов введения достигается в выводящих органах: печени и почках. Также высокие значения концентрации 3Н-Гимантана наблюдаются после внутривенного введения в тканях селезенки, сальника, мышц, после введения внутрь в тканях мышц, стриатума, сальника, селезенки.

Время достижения максимальной концентрации (таб. 11) в тканях органов после двух способов введения отличается: после внутривенного введения достижение Смах меченого препарата приходится почти во всех органах на 1 час, после введения внутрь значительно позднее, в тканях мозга, стриатума, семенниках время достижения максимальной концентрации составляет 8 часов.

Для выяснения сорбционных особенностей тканей органов и изучения динамики выведения и накопления препарата во времени был рассчитан коэффициент распределения (Кр), представляющий собой отношение концентрации препарата в тканях органа к концентрации препарата в крови (таб. 14 и 15, рис. 13 (а,б) и 14 (а,б).

Коэффициент распределения во всех органах, кроме тимуса и мозга имеет значение больше единицы, это свидетельствует о том, что препарат хорошо насыщает органы. Характер кривых зависимости Кр от времени указывает, что

- меченый препарат наиболее интенсивно проникает в ткани печени, селезенки, сальников;

- после внутривенного введения в тканях сальника наблюдается накопление препарата, в остальных органах скорость выведения радиоактивного препарата равна скорости его выведения из системного кровотока;

- через 24 часа после введения внутрь в тканях селезенки, сальника, мышц, семенников наблюдается кумуляция препарата на протяжении 3-х суток, а затем начинается его выведение из тканей органов; в печени и почках скорость выведения препарата приблизительно равна скорости выведения из кровеносного русла; значения Кр у сальника приблизительно в 2 раза больше при внутривенном введении, чем при введении внутрь во всем периоде наблюдения;

- после введения внутрь в стриатуме наблюдается более значительное накопление препарата со временем, чем после внутривенного.

Отдельно рассмотрена динамика изменений Кр в тканях органов-мишеней. Поскольку Гимантан является потенциальным лекарственным средством для лечения болезни Паркинсона, а также обладает иммунотропной активностью, следо-вательно, органами-мишенями для него являются вилочковая железа (тимус), мозг и, в частности, стриатум. Еще две структуры мозга - мозжечок и гиппокамп были использованы для сравнения.

Полученные данные свидетельствуют, что наибольшие концентрации 3Н-Гимантана уже в ранний период после введения обнаруживаются в стриатуме (таб. 16, 17, рис. 15 а,б). Причем, идет увеличение значения Кр со временем. К 10-м суткам после введения концентрация меченого препарата в стриатуме после внутривенного введения превышает концентрацию в крови более, чем в 2, а при введении внутрь более, чем в 3 раза, что говорит о накоплении препарата в данной структуре мозга. Эта тропность характеризизуется значительной селективностью именно к ткани стриатума, степень которой более, чем в 100 раз превосходит таковую к тканям мозжечка и гиппокампа на всем интервале наблюдения. В целом мозге и тимусе после двух способов введения скорость выведения препарата равна скорости выведения из системного кровотока (рис. 15 а,б).

О скорости освобождения тканей от 3Н-Гимантана можно судить по такому параметру, как среднее время удержания препарата в организме (MRT) (таб. 11), располагающемуся в следующем порядке (по возрастанию): после внутривенного введения - печень, сальник, мышцы, тимус, семенники, селезенка, почки, стриатум, мозг; после введении внутрь - печень, почки, семенники, мозг, мышцы, тимус, селезенка, стриатум, сальник,.

Расчет тотального содержания 3Н-Гимантана в пересчете на весь орган показал, что наибольшее количество радиоактивного эквивалента Гимантана находится в мышцах и сальнике. На долю мышечной ткани приходится около 50 % препарата, в то время как его содержание в крови на порядок меньше.

Результаты, заслуживающие отдельного внимания, были получены при сравнении распределения 3Н-Гимантана после внутривенного и перорального введения.

В стриатуме и тимусе после введения внутрь количество р.а.э. Гимантана превышает таковое (с учетом дозы) после внутривенного введения в 1,62 и 1,66 раза, соответственно; у сальника, в отличие от первых двух органов, при введении внутривенно количество р.а.э. Гимантана в 2,19 раза больше, чем при введении внутрь. Эти данные были получены при сравнении площадей под фармакокинетическими кривыми (таб. 11).

Данные о разности во времени достижения максимальной концентрации, и данные о различном содержании 3Н-Гимантана в тканях органов свидетельствуют о разной степени связывания радиоактивного эквивалента Гимантана в зависимости от способа введения. По-видимому, происходит изменение структуры препарата благодаря метаболическим превращениям Гимантана при прохождении через ЖКТ. Вероятно, структура образующегося метаболита (-ов) более интенсивно преодолевает ГЭБ и селективно связывается с тканями стриатума, а также тимуса. Различия в интенсивности прохождения процессов метаболизма были подтверждены при изучении неизмененного препарата.

Полученные результаты позволяют дать фармакокинетическое обоснование особенностей в динамике развития эффекта после двух способов введения Гимантана: внутривенно и внутрь. Данные, полученные Е.А. Вальдман (2001), свидетельствуют о том, что эффект Гимантана оказался наиболее выраженным при введении внутрь. Поскольку стриатум является структурой мозга, имеющей непосредственное отношение к патогенезу паркинсонизма, то преобладание Гимантана в тканях этой структуры-мишени после перорального введения несет ответственность за эффект.

При исследовании влияния различных доз Гимантана на фармакокинетику у крыс установлено, что с увеличением дозы пропорционально увеличивается концентрация радиоактивного эквивалента в плазме крови. Величина площади под фармакокинетической кривой также увеличивается с ростом дозы в соответствующее число раз. Для дозы 5 мг/кг величина AUCO-t равняется 41,566 мкг*ч/мл, увеличение дозы в 2 и 6 раз изменяет площадь под концентрационной кривой до 76,511 мкг*ч/мл и 225,668 мкг*ч/мл. Значения дозонезависимых параметров не зависили от количества введенного препарата (таб. 19).

Концентрационные кривые и данные основного фармакокинетического параметра (площади под фармакокинетической кривой) (таб. 19, рис. 16) доказывают линейность уровней препарата в крови в зависимости от введенной дозы.

При изучении кинетики выведения Гимантана с мочой из организма крыс было установлено, что количество радиоактивного эквивалента Гимантана в 22,7 раза превышает количество неизмененного препарата (рис.17, 23). Так, за 10 суток выводится всего 39,71 % радиоактивного эквивалента Гимантана от введенной дозы, причем наибольшая часть препарата выходит за первые сутки наблюдения. Та же тенденция прослеживается в поведении неизмененного препарата. За 10 суток выводится 1,75 % неизмененного Гимантана, из них за первые сутки выходит также большая часть вещества. Это говорит о том, что препарат медленно выводится с мочой, в основном, в виде метаболитов.

Для возможности определения влияния многократного введения Гимантана на фармакокинетические параметры проводилось изучение его фармакокинетики после шестикратного введения в дозе 10 мг/кг с интервалом в 24 часа. Эти данные позволяют выявить возможные изменения активности метаболизирующих систем после многоразового введения.