Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение механизма генерации кислородных радикалов фагоцитами крови и их значение при воспалительных и опухолевых заболеваниях пищеварительного тракта

А й1 19«

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ КАЗАХСКОЙ ССР НАУЧНО-1ЮСЛВДОВАТЕЛЬСК!'-1 КНСШУГ ЭПВДЕШШОГИИ, МИКРОБИОЛОГИИ И ИН2ЖЩЮНННХ БОЛЕЗНЕЙ

На правах рукописи МУХАМБЕГЬЯРОВА Ллйля Рухулловна

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ГЕНЕРАЦИИ КЕШРОДШХ РАДЖАЛОВ ФАГОЦИТАМИ КРОВИ И ИХ ЗНАЧЕНИЕ ЕРИ ЕОСШШИГЕЛШХ И ОПУХОЛЕВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ШЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

А в т о р э ф диссертации на соискание биологических

врат

ученой степени кандидата наук

Алма-Ата - 1991

Работа выполнена в лаборатории иммунологии НЦ РШ ЛШ СССР и в лаборатории физиологии пищеварения НШ фазаологпя АН КазССР

Научныа руководители : доктор медицинских наук

Е.С.ЮТШШОВА,

доктор медицинских наук А.Г.ШАРЩЮВ.

Официальные оппоненты : доктор медицинских наук, профессор

Б.В.КАРАЛЬНЖ,

доктор медицинских наук С.Х.БШЕВА.

Ведущая организация — 2-й Московский ордена Ленина Государственный Медицинский Институт им.Н.И.Пирогова

Зацита диссертации состоятся "_" _________ 1591 г.

в _ часов на заседании специализированного совета

Д 079.05.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии, микробиологии в инфекционных болззкей МЗ КазССР ( 480002, г. Алма-Ата, ул. Ыакатазво, 34 ).

С диссертацией исгно ознакомиться в библиотеке НШШиБ НЗ КазССР.

Автореферат разослан " " __________ 1991 г.

Ученый секретарь спеццалшированного сойота кандидат кедкцлнеких наук

Н.М.Нуркина

" ■ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' -та Актуальность проблемы. По данным отечественных и зарубежных : ' "исследователей в последнее время наблюдается рост заболеваний органов пищеварения,, по некоторым данным более 50% взрослого трудоспособного населения развитых стран страдают хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Среди населения нашей страны доля болезней органов пищеварения в структуре общей смертности составляет 15$.

Многие хронические заболевания верхнего отдела пищеварительного тракта в последнее время рассматривают как предопухолевые, вследствие высокого риска последующей трансформации в рак ( А. Camarón » 1335 ). В Казахстане рак пищевода остается важной медико-социальной проблемой: удельный вес лиц» страдающих этим заболеванием, составляет 25,6 среди мужчин и 14,4 среди женщин на 100 тыс. населения.

Не вызывает сомнений наличие четкой взаимосвязи меаду развитием опухоли и нарушениями функций иммунной системы. Однако, выработка эффективного противоопухолевого иммунитета возможна при достаточно точной идентификации опухолевых поверхностных антигенов, что крайне затруднено вследствие высокой мобильности и способности опухолевых клеток к изменению антигенов.

Весьма важным представляется изучение функций клеток фагоцитарного ряда, обладающих неспецифической цитотокснчностью, одним из проявлений которой является выброс кислородных радикалов, получивший название "респираторный взрыв" ( РВ >.

Вопрос обеспеченности больных хроническими я онкологическими заболеваниями пищеварительного тракта кислородной раднкало-зависн--мой цитотокоичностыо на сегодняшний день остается практически неизученным, а работы, посвященные исследовании роля кислородного игл-

тоякза в онкогенезе, единичны и противоречивы ( А. мигало, 1968; Fukuzumi Kazuo , 1988; JB. Rotstain , 1937; R.Zimmerman , 1988 ). Остаются недостаточно изученными многие молекулярные механизмы генерации активных форм кислорода.

Целью работы явилось выяснение нолекулярно-клеточиых механизмов генерация активных форм кислорода, их роли в реализации противоопухолевой цитотоксичности фагоцитов крови человека, а также изучение количественно-функциональных параметров фагоцитов у больных с патологией верхнего отдела пищеварительного тракта.

Основные задачи исследования.

1. Изучить кинетику и дать сравнительную оценку кинетических параметров генерации активных форм кислорода полиморфноядерными

( ПМЯ ) клетками, стимулированными кальциевым ионофороы A-23I87, форболмиристагацетагом ( ТМА ), опсонизированньм зимозаном ( 0Z ), тафтцином - веществами, различными путями стимулирующими активацию фагоцитов и образование кислородных радикалов.'

2. Оценить эффективность блокирования респираторного взрыва ШЯ-клеток ловушками кислорода и другими агентами ( SOD, азид натрия, цитохалаэин В, оуабаин ) при дифференцированном использовании указанных стимуляторов люминол-зависимой хемилюминесценции ( ЛЗХ1 ) для выяснения роли отдельных кислородных радикалов в формировании кинетики ЛЗХЛ, а также роли молекулярных, химических структур клетки в осуществлении функции респираторного взрыва.

3. Оценить.цитотоксичнорть ШЯ-клеток, стимулированных опухолевыми клетками К-562. Изучить возможность модификации цитоток-сичности с использование« указанных стимуляторов респираторного взрыва ( A-23I87, РЫА, Oz, тафтцин ), изучить возможность блокирования цитотоксичности с помощью ловушек кислорода и ингибиторов PB ( sod, азид натрия, цитохалаэин В ) для выяснения роли кисло-

родных радикалов в реализации цптотоксического действия фагоцитов.

4. Выявить характер изменений распределения сдпь, СД14 антигенов на поверхности клеток, фагоцитарной активности и окислительного метаболизма ГШ-к леток у больных с хроническими воспалительными заболеваниями желудочно-кишечного тракта и раком пищевода.

Ь. Оценить прогностическое значение исследования количественно-функциональных параметров фагоцитарной системы при воспалительной и опухолевой патологии указанной локализации.

Научная новизна работы.

Впервые проведено комплексное изучение механизмов проявления функции окислительного метаболизма фагоцитами крови с использованием различных стимулирующих я блокирующих клетку агентов.

Впервые исследовано модифицирующее действие стимулирующих окислительный метаболизм агентов на проявление цитолиткческого эффекта ПМЯ-клегок по отношении к модельной опухолевой линии К-562^ Исследована кислородная раднкаяо-завнсииая природа цитолиза. Показано, что внутриклеточный стимулятор - РИА - трижды увеличивал цитотоксичность ШЯ-клетоя, ¿несение в систему ЗОП полностьв отменяло литический эффект.

Впервые комплексно изучена картина количественно-функционального состояния фагоцитарной иммунной системы при воспалительных я онкологической патологиях пищеварительного тракта человека. Установлено, что -у больных раяом пищевода отмечается угнетение окислительного метаболизма фагоцитов крови, сниаенив количества моноцитов, экопрессирувщчх СД14 поверхностный антиген, что приводит к истощеняп защитных механизмов гомеостаза.

Практическая ценность работы.

Анализ особенностей различных заболеваний верхнего отдела п»-

щеварителыюго тракта, основанный на комплексной иммунологической оценке фагоцитарного звена, позволил определить ряд информативных параметров, которые ыогут иметь значение для дифференциальной оценки опухолевой и хронической воспалительной патологии верхнего отдела пищеварительного тракта..В качестве такого можно выделить угнетение окислительного метаболизма фагоцитов крови вне зависимости от видов стимуляции у больных раком пищевода.

Результаты проведенных исследований, свидетельствующие о прямом цитотоксическом действии фагоцитов на опухолевые клетки при воздействии форболмиристатацетатом ( стимулятор фермента протеин- ■ киназы С ), позволяют рекомендовать пременеьие лекарственных препаратов, активирующих данный фермент, после соответствующей апробации на экспериментальных моделях.

Основные положения, выносимые на защиту.

Общая способность ПМЯ-клеток к генерированию кислородных метаболитов зависит от целого ряда внутриклеточных и мембранных элементов фагоцитов. Быстрый, но непродолжительный во времени кислородный метаболизм амеет место а случае активации цитоплазматичес-еих структур, Екяэчогаю мсмбрашо-рсцептордах структур 'приводит и замедленному, но максимальному уровню продукции кислородных радикалов, ,1 •

Пояучзно доказательство пряного цятолитического действия кислородных радикалов на опухолевые клетки К-562 при стимулировании ШШ-кяеток форбрлмирйстатедотатом.

Во всех псследовшвшх, группах больных с хро»шчсскими воспалительными заболеваниями, п раком пищевода отмечается сииаснле параметров окислительного метаболизма фагоцитов по пути их роцзптор-ной активации. йиеяородизй метаболизм в ответ на внутриклеточный

активатор форболмиристатацета? снижен лишь у больных с онкологической патологией, что позволяя? говорить о вникеник потенциальных защитных сил организма, о чем свидетельствует также снижение абсолютного количества моноцитов периферической крови, выявленное цитофлюориметрическим анализом.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Материалы доложены на конференции молодых ученых по важным вопроса современной науки о питании ( Алма-Ата, 1990 ), на конференции аллергологов и иммунологов "Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии в аридной зоне" ( Ашхабад, 1991 ), на совместном заседании отделов иммунологии и пищевой аллергии Щ РПП АМН СССР и инфекционной иммунологии и аллергология НИИЭМиБ ИЗ КазССР ( Алма-Ата, 1991 ).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, йовчавдего 20 отечественных и 158 иностранных источников. Текст иллюстрирован 14 таблицами и I рисунком.

МАТЕРИАЛЕ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунокомпетентные нейтрофильные гранулоцитн и мононуклеарныв клетки, необходимые для исследований, выделяли на двойном градиенте фиколл-верографина плотностью 1,077 и 1,114.

Исследования по стимулировании окислительного ивтабояязма , ПШ-алеток были проведены с использованием еяедугарх агентов: опсонизяроганиыЯ зимозан - 40 исследований, гвфтцин - 21 псслздо~ вание, форбоямпристатацэтаг - 42 исследования, ааяьцяввый ясяофор ~ А-23187 - 25 исследований, кокпявко К-662-аШ; 1^-562 -^исследований.

- б -

В качестве ингибиторов•окислительного метаболизма применяли: супероксидцисыутазу - 17 исследований, азид натрия - 4 исследования, цитохалазин В - 9 исследований, оуабаин - 9 исследований.

Во второй серии исследований изучали цитотоксическое действие нейтрофилов периферической крови доноров по отношению к клет-. кам опухолевой линии К-562 после модифицирующего влияния на эту функцию перечисленных стимуляторов и ингибиторов окислительного метаболизма. Количество определений в каждом случае равнялось 15. Всего 205 исследований.

В серии клинико-иммунологических исследований для анализа иммунологического состояния фагоцитарной системы было проведено обследование периферической крови здоровых доноров Í 56 человек ) и 56 больных, распределенных по следующим группам: хронический гастрит - 13 человек» язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки -27 человек, ран пищевода - 16 человек.

В работе были использована следующие методы:- определение кинетических параметров лдаидалзависимой хемилюминесценции нейтрофилов периферической ярови человека { Вах^ег , 1983; v.L.Tjiomaa , 1968 >,'отражающих картину образования кислородных радикалов.

- спектрофотсыетрйчоский метод 'определения цитотоксического эффекта ГШ-клотон по выходу лактатдегидрогеназы их лизированкых опухолевых клеток К-Е?62 ( C.Korreaiewsfci , 1933 ).

- субпопулащиорый анализ моноцитов ( СДИ Ь , СД14' ) человека с использованием моноквоная^ных антител, моченных РИС: Мо-I, Мо-2, методом лазерной проточной .цдтофлвориастрии.

- оценка фагоцитарной активности нвДтрофвиов крови методом лазерной проточной цптофлзоргае грип с использованием флюоролатексо

стандартного ( EPICS Coultrontca , Франция ) ( M.Hasui , 1989; A.M.Saad, I935;R.M.ffil3on , 1985 ).

Измерения проводили на лгоминометре LKB - VYallao 1250 ( Финляндия ), флюоресцентном спектрофотометре Multi-Reader ( ®РГ ), лазерном проточном цигофлюориметре EPICs Coultronics ( Франция ). Полученные результаты были обработаны методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента. Статистические расчеты проводили на ЭШ IBM ( США ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСЩЕНИЕ

Нами было выявлено, что респираторный взрыв ПМЯ-клеток запускается уже на первых секундах после воздействия кальциевого ионо-фора A-23I87. Время для генерации максимального количества кислородных метаболитов составляло для А-23187 3 мин. ( табл.1 ). A-23I87 является заменителем инозиток-1,4,5-трифосфата - одного из производных биохимического каскада постройки НДЦШ-оксвдазного комплекса - и вместо него вызывает быстрый выход Са2+ из эндоплаэ-матического ретикулука. Са2+ усиливает активирующую способность протеин-киназы С, а также приводит к уменьшении "лаг"-периода для действия вторичных сигналов С M.R.SbBlaby , 1985 ). Полученное нами быстрое стимулирование респираторного взрыва ионсфором A-23I87 при невысоком уровне максимального выхода кислородных метаболитов, оцениваемого по амплитуде ЛЗХЯ ( табл.1), малой общей концентрация радикалов, оцениваемой по интегрированному ответу ( табл.1 ), а также быстром снижении JEXJI после прохождения пикового значения, говорит в пользу того4 что A-23I87 является лишь ранним и кратковременным активиру'эщчм агентом. Тем не менее, действие А-23187 не ограничивается яишь стеснением Са2+ из эндопяаэматетческого трь-бвкулярного аппарата, накопление Со2+ внутри клетка облепав? я

способствует выходу лизосомшх ферментов ( А.А.Герасимов, 1989 ) и может происходить эа счет повышения экзогенной проницаемости клеточных мембран под действием яонофора A-23I87. Интересно отметить, что способность ШШ-клеток к стимулированию респираторного ьэрыва в ответ на А-23187 не снижается у доноров в зависимости от их возраста ( I. Fulop , 1988 ).

Столь же быстрое стимулирование респираторного взрыва отмечалось нами в ответ на форболмиристатацетат - РМА < табл.1 ). Быстрое стимулирование люминесценции РИА ( J .Undena t 1988; nuto Sa_ toehi , 1988 ), как и в случае A-23I87, можно объяснить игнорированием целого ряда биохимических реакций гидролиза инозитольных фосфолипидов мембраны. РИА, являясь структурным аналогом дкацил-гяицерола, может напрямую связываться и активировать протеин-кина-зу С ( J'E. líiedel, 1983 ), которая может включаться в процесс де-грануляции ПШ-кяеток ( E.Melloni , 1986 ) и, главное, в процесс формирования КАДШ-оксццазного комплекса и последнего респираторного взрыва ( A.I.Taubar , 1967 ). фикция по неспецифическому стимулированию респираторного взрыва ПМЯ-клеток в ответ на РИА не меняется у людей различного возраста ( I. Pulop, 1988 ): Однако, на основании невысоких значений амплитуды ЛЗХЛ и интегрированного ответа ( табл.1 ) в случае использования РМА мы можем предположить, что активирование протеин-киназы С не затрагивает глубоких метаболических процессов клетки для проявления реакций респираторного взрыва. 4 _ ,

Окислительный метаболизм фагоцитоз запускается также агентами» способными рэагироЕать со специфическими рецепторами мембраны. На использовали опсонлзированный зимозан и тафтцин, которые запускают реакции FB поело взаимодействия a С3 и ?с рецепторами {<J£. я bt-t in f IB85;S.DagoH , 1937 ). Взаимодействие этих двух агентов со специфическими рецепторами вызывает каскад рэагцай гидролиза

Кинетические параметры люминолзавнсимой хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови доноров, стимулированных различными агентами

Группы стимуляторов

Параметры лшинодэавиеиыой хемилюминесценции

Амплитуда )

Интегрированный ответ

Время

достижения пика{ йя )

Ионофор А-23187 п=25

РМА

п=42

360,64^53,31 225,07+22,13

1114,92+185,14 834,14+63,27

Опсошзаро-взнный п=40 зимозан

1513,92+143,57 10475,15+1115,77

Тафтции п=21 431,00+34,10 1569,09+266,60

3,0 1,9

6,7

7,2

р2,3< 0 001 рЗ,4<0)001 р2,4<0,05

р1,3с и,ТОГ

рг,з<о,оо1

рЗ,4<0,001 рВ,4<0 01

фогфолипедоэ, на определенном этапе которого начинают действовать Са2+ и протеин-киназо-С-зависимыэ пути активации НАД® -оксвдазного комплекса. Поскольку опсогатроватшй зиыоган а тафтцин являются объектами фагоцитозз, то события актавацип 1Ш~клетск тробуют оп~ ределенного интервала времени. Этим можно объяснить растянутый во времена выход кислородной продукции на максимальная уровень, оце-*. ииваемый показателем амплитуда ( табл.1 ). Достаточно полной картиной метаболических процессов, имеющий место з фагоците, н слнер-гическим действием фагоцитоза на окислительный метаболизм иокно. объяснить высокие уровни продукция общего количества кислородных радикалов, оцеяиваемь'з по показателям интегрированного ответа я амплитуды ( табл.1 ) в случае опсоияэироваякого зкноэакя п тафтци-

Амплитуда люминолзависимой хемияюминесценцик ) нейтро-филов крови доноров, стимулированных опухолевыми клетками К-5 62

Клетки -мишени I 10 Интервал времени ( 15 20 30 мин ) 60 75 Клетки -эффекторы (неитрофилы)

К-562- 31 57 .43 ■ш 100 тыс.

antl-К-562- 15 7Z 65 45 - - - 200 тыс.

IgG 21 65 75 367 391 240 156 400 тыс.

К-562 + аутолог. сыворотка 3 6 S 25 47 33 61 75 63 46 67 120 115 - 100 тыс. 200 тыс. 4С0 тыс.

Феномен стимуляции окислительного метаболизма нейтрофильиых гранулоцитов опухолевыми клетками К-562, преинкубированными с anti-K-562-IeG антителами ( 50 ыкл/Ю тыс. кл. ), характеризовался резким возрастанием ЛЗХЛ уже на первой минуте реакции ( табл.2 ). Начальный уровень ответа ЛЗХЛ при стимуляции комплексом К-562-anti -К-56?. IgG был в 10 pas выше ( 31 ®v ), чем при стимуляции К-562, оп-сонизированных аутологичной сывороткой ( 3 ®v ) при концентрации эффекторов 100 тка. Аналогичная закономерность имела место при использовании более высоких концентраций эффекторов'. В последующие 10» 15 минут инкубации различия между двумя видами стимуляции выравнивались, и рестфдторный взрыв Характеризовался картиной плато, которая сохранялась по меньшей'мере Í час 15 мин. { табл.2 ). Нам представляется веяным, что диЙ0ренцированная стимуляция Fc и Сд рецепторов ыояег тлеть значение как в реализации антителозависимой, так и несцзцифической цитотоксичности. Интересен факт, что хемилю-нинесценция запускается К-562 и в отсутствии антител { К.P. Van Kessel , 1989 ).

Следует отметить, что в процессах циготоксического действия гранулоцитов ведущую роль могут играть активные формы кислорода, высвобовдение которых является не "кратковременной" вспышкой, а динамичным, растянутым во времени процессом ( 75 мин. ), целесообразность которого, вероятно, связана с осуществлением цитолитичес-кого действия.

В экспериментах по ингибированию респираторного взрыва отдельными агентами было выявлено неравнозначное их влияние на проявление реакций окислительного метаболизма. Максимальное угнетение ЛЗХЛ э точке внесения по коэффициенту ингибирования выявил азид натрия ( 0,1 мМ ) ( табл.3 ). Высокий супрессирующий ЛЗХЛ эффект проявил в точке внесения цитохалазлн В ( В мкг/мл ). эф ( 300 ед.) и оуабаин ( 2 мкМ ) в точке внесения выявили незначительный эффект подавления ЛЗХЛ, оцениваемый по коэффициенту ингибирования.

Таблица 3

Ингибирование лшпшолзавискмой хемилюминесценции ней-трофилов доноров ловугшами кислородных радикалов и другими агентами

Агенты Критерий ингибирования

ингибирования Коэффициент Скорость падения ,

ингибирования люминесценции ( тЧ /мин)

1. зО Л п»17 1,44 £0,09 8,55 + 1,17

2. Азид п=4 22,27 + 2,46 4,09 + 0,05 натрия

3. Цитоха- п=9 4,64 + 0,80 41,44 + 9,41 лазин В

4. Оуабаин п=9 1,40 + 0,01 13,33 + 2,93

-р1,И*и,Ш; р1,3<и,ииТ;-р1,к<и,и1} р!,Ь^и,иГ

р2,3<0,001? р2,4<0,001: р2,3<0,01 р2,4<0,01 рЗ,4<0 001 рЗ,4<0 02

Азид натрия является ингибитором гомовых ферментов. Мгновенная етабили&ация гзм-содер®ащих цитохромоа класса В, входящих в состав ккслород-продуцируицей НАД$Н системы, приводит к ее инактивации и резкому снижению ЛЗХЛ, низкие кинетические параметры которой в дальнейшем остаются практически неизменными, что мк видим по показателю скорости падения люминесценции ( табл.3 ). Цитохалазик В стабилизирует ыикротубудярный аппарат клетки, который в факсирован-• ном состоянии уяе не ыокет быть ответственным за проявление пластических, инвазионных свойств плазматической мембраны, в результата которых идет постройка ШДШ-оксидазного комплекса, что и находит свое отражение в резком снижении профиля ЛЗХЛ, выявленном по скорости падания люминесценции ( табл.3 ). Полный разрыв микротубул нейтрофилов приводит к полному угнетению хемилюминесценции ( йена , 1938 ). Незначительный ингибирующий эффект в 0 рв точке внесения возможен вследствие того, что супрзоксид-аиион - субстрат фермента 3 0 и - способен быстро дискутировать с образованием других кислородных радикалов, ингибировать вклад которых в окислительный метаболизмэО в не в состоянии. Однако, инактивация супероксид-аниона в последующем формирует снижение остаточного профиля 13X31, оцениваемого по скорости падения люминесценции ( табл.З ). Оуьбаин, являясь блокаторомNа+-К+-АТФ-азных каналов клетки, вызывает нарушение ионных потоков, тормозит процесс поляризации и деполяризации мембраны, что приводит к невозможности полноценной ответной картины ЛЗХЛ, что хорошо видно по показателю скорости падегая лю-шшесцеицки ( табл.3 ).

В экспериментах по цитотоксическому действию гранулоцитов к опухолевой линии К-562 фоновый ивдакс цитотоксичности в системе: НФ - опухолевые: клетки составил 19,(5%, Цитолитический афг^хэкт кислородных редяяайов был оценен о использованием стимуляторов и ин-

гибиторов РВ. Тривды повысил фоновый индекс цитотоксичности акти-Еатор протеин-киназы С - фолболмиристатацетат ( 57,6% ), что говорит в пользу того, что последняя играет определенную роль в лизисе опухолевых клеток ( K.aavioli , 1990 ). Кальциевый ионофор A-23I87, опсонизированный зимозан и тафтцин не выявили усиливающего цитоток-сичность эффекта ( 23,61$, 22,55$, 22,08$ - индекс цитотоксичности соответственно для этих агентов ). Невыявленный в этих условиях эффект стимулирования цитотоксичности мы предположительно объясняем кратковременным активирующим действием A-23I87 на продукции кислорода, высокой активностью антиоксидантных ферментов опухолевой линии К-562 ( Е.В.Борунов, 1989 ), позволяющей анактивировать малое количество кислородных метаболитов при стимуляции A-23I97. Состав мембраны и контур e'S рецепторов могут быть причиной ослаб. леиия и полного отсутствия цитолитического эффекта ( 1,1и1од1988 ). Опухоль кокет быть источником супрессируощих иммунсциты агентов, модифицирующих и инантивируощих рецептора мембраны последних ( М. Ашаг, 1990 ), что приводит к невозможности контакта опсонизирован-кого зимоэана и тафтцина с фагоцитами, что отражается в невозможности проявления мощного стимулирующего действия на РВ этих, агентов. SOD в полной мере ингибировала РМА-зависимую цитотоксичность, что является доказательством активного участия кислородных радикалов в цитолизе опухолевых клеток.

Анализ иммунологических параметров фагоцитарной системы периферической крови доноров а больных показал достоверное снижение уровня максимального выброса кислородных радикалов, оцениваемого по амплитуде ЛЗлД, у больных язвенной бояезньо двенадцатиперстной кишки по сравнения с донорами ( табл.4 ) при стимуляции ПМЯ-клз-ток опсониэировагашм зимозаноч. Скорость достижения люминесценции; пика, то есть амплитудного значения, при всех патологиях ста-

Кинетические параметры лгаминолзавиеимой хемилюминесценцик фагоцитов крови доноров и больных с заболеваниями пищеварительного тракта

Кинетические параметры хемилюминесценцик

' Группы Амплитуда Интегрированным скорость дости-

(тУ ) ответ (шУ .мин) жения пика(мин)

Хронический

гастрит

п=13

Опсонизированкый зимозан

1087,00+174,62 6745,47+1128,75 рМ-Ю.бб

ЯэВбНН&Я

болезнь 1004,36+112.15 5389,81+561,89 12-перстной ' р274<0,01 р274<0,001

кишки п=22

Рак

:пи^еьода

Доноры п=40

1303,81+174,05 6730,89+879,51 р374 <6,05

1513,92+143,57 10475,15+1115,77 • ¡¡горбоямиристатацетат

246,09+35,09 . 882,27+130,43

Хронический гастрит п=И

Язвенная болезнь 12-перстной 338,20+57,67 кишки п=20

Рак пищевода п=14

Доноры п=42

181,01+28,96 225,07+22,13

1186,85+199,63 р273 <0,05

657,08+86,15 834,14+63,27

129,50+22,35 р174 <0,001

154,32+16,87 р274-<0,001

194,00+23,89 р374< 0,001

410,20+40,63

65,87+12,08

86,70+16,17

51,27+10,73 54,83+4,53

тистически достоверно снижалась ( Р< 0,001 ) при использовании этого стимулятора ( табл.4 ). Медленнее всего накопление кислородных радикалов проходило у больных с хроническим гастритом ( 129,50 + 22,35 и\' /мин ), во всех других группах она боа выше, но нигде не приближалась к таковой в контрольной группе' здоровых лиц ( 410,20+ 40,63тт/лган ). Однако, овмым интересным, с иппгей точги зрения,

представляется показатель интегрированного ответа, который дает общую информацию о скорости наработки кислородных производных, о кинетике и количестве их выброса за определенный период времени. Несмотря на запаздывающую во времени картину выхода на пик продукции радикалов в группе больных с хроническим гастритом, общий выход кислородных токсических производных в этой группе не отличался от эюго показателя в других группах больных ( табл.4 ), но все больные с патологиями имели сниженный показатель интегрированного ответа в сравнении с контролем - донорами ( ?<0,05 )(табл.4). То есть, общая способность к генерированию кислородных радикалов, сопряженная с фагоцитозом зимозана, снижена во всех исследованных группах больных. Отмечается позитивная корреляция между процессом фагоцитоза и продукцией перекиси водорода нейтрофилами ( Н.шазаГи-в1 , 1989 ). Все фагоцитарные клетки вносят свой вклад в развитие люминесценции, есть данные об увеличенной продукции активных форм кислорода моноцитами онкологических больных ( 1.Тги1воп , 1989; И.Е.Шепеткин, 1991 ). Нами обнаружено снижение количества истинных моноцитов, что хорошо видно по уменьшении процента Мо-2 клеток, меченных СД14-антятелами ( табл.5 } во зсех группах с воспалительными заболеваниями й раком пищевода, что само по себе может быть одной из причин снижения окислительного метаболизма. Другой причиной может быть действие блокирующих факторов» а их источником при злокачественном росте, з первую очередь, может быть сама опухоль ( К.М.Бережная, 1983; Т.М^аЫаа, 1931; А.КогапЫвт1са , 1983; Тешндаак! , КЗб;З.А. Мзгег.й1ло ( 1933 ). Опухолевые экстракты могут модифицировать рецепторннй контур ЕКЯ-клетои, что и находят свое отражение в снижении ЛЗХЛ в ответ на опсонизированкый зимо-озн. Это предположение находит подтверждение з том, что прп стимулировании респираторного взрыва форболмиристптацетатом нами на было

йамунофеноитирование ыоконуклеарнкх клеток, крови пз СДИь и СД14 с помощью моноклональных антител йо-1-Р1ТС и Мо-2-Р1ТС методом лазерной проточной цитофлюоримотрии у доноров и больных с заболеваниями пищеварительного тракта

Группы___СДПЪ_СД14 _

меап % меап %

п = 12 п = 9

71,29+13,13 18,38+3,23 64,14+6,70 4,27+1,08 т р1Т4<0,05 " р!74<0,001

п = 27 п = 18

68,45+6,48. 15,42+1,93 65,90+2,63 5,76+1,15

- " р274<0,001

п = 15 п « 8

77,82+7,55 17,42+2,98 . 78,64+3,83 5,66+2,36 . " ~ ~ р374<0,05

п в 56 п = 56

66,09+4,60 11,54+1,08 66,09+4,60 11,54+1,08

Хронический , гастрит

Язвенная болезнь 12-перстной кишки

. Рак пищевода

Доноры

обнаружено резкого и достоверного снижения продукции кислородных метаболитов в исследованных группах больных ( табл.4 ). Группа больных с яззенной болезньо характеризовалась дахе повышенным показателем количества генерируемых кислородных радикалов. Тенденция угнетения окислительного метаболизма проявилась лишь в группе больных раком пищевода, оцениваемая по параметрам амплитуды и интегрированного ответа ( табл.4 ). Остающийся в пределах нормы кислородный метаболизм Нф' в ответ на РИА мокет быть показателем все еще высокой внутренней потенциальной способности фагоцитов больных с хроническими воспалительными и онкологическими заболеваниями к • проявлению кисдйродо-аависимой цитотоксичностя. Проявление этих

резервных способностей связано в данном случае с прямым воздействием форболовых эфиров на мембранную протеин-хиназу С, действие которой имеет место в лизисе опухолевых линий (И.0ау1о11 , 1990 ).

Таблица б

йагоцитарная активность нейтрофялов крови доноров и больных с заболеваниями пищеварительного тракта. Анализ гистограмм лазерной проточной цитофлюориметрии

Количество

флюоролатексар^^гри-

Х'руппы

Язвенная со- гак доноры

п=5 леэнь 12-пер. пищеводе п=12

кишки п=10 п=9

Зон

Латекс 5 мкл

Латекс 10 мкл

Латекс 20 мкл

Процент фагоцитировавших нейтрофияов

4,71+0.71 1,54+0,26 3,17+0,62 3,80+1,08 р1,2-е 0,01 р2^3<0,05 ~

13,42+0,43 6,32+1,15 13,79+4,24 7,51+0,98 р1)4<0,001 р1 >0,001 -

22,67+3,42 9,22+1,33 25,72+5,73 12,25+1,33 2< 0,01 р2,3<0,05 ~

38,31+5,49 21,46+1,05 33,88+5,10 31,55+3,87 " р1 2<0,0| р2 3«0,С5 "

р2,4<0,05

Средний канал флюоресце;щии - интенсивность фагоцитоза

!5сн

Латекс 5 мкл

Латекс 10 мкл

Латекс 20 мкл

87,98+8,49 87,92+2,41 88,35+3,48 97,11+1,63 52,4* 0,01

94,84+5,33 90.02+2,01 100,82+2,43 98,46+1,12 рЙ,3;2;4-<0,01

99,18+5,96 52.55+3,59 103,24+2,13 101,31+1,55 р2,3;2,4<0,05

107,76+18,27 101,06+4,49 112,65+3,66 111,01+1,99 р2,4«0,05

При анализе двухмерных гистограмм, полученных лазерной проточной .цитофлсорияетрией, мы выявили снижение количества активных фагоцитирующих нейтрофилов и снижение интенсивности фагоцитоза в группе больных с язвенной болезнью ( табл.6 ). У больных хроническим гастритом наблюдалось достоверное повышение процента фагоцитировавших нейтрофилов { табл.6 ) при малых объемах латекса ( р<0,001 ) Остающийся в пределах нормы фагоцитоз у больных раком пищевода можно объяснить эффектом мобилизационных, резервных возможностей организма ( Н.УиЗапотПэ , 1983; ¿.огон , 1981; Н.М.Бережная, 1988 ) ■' с резкий снижением фагоцитарной активности на глубокой стадии злокачественного процесса ( Ю ,11 .Гусаров, 1981 ). Возможно, что снижение числа активных фагоцитов, снижение интенсивности фагоцитоза и пониженный уровень генерации кислородных метаболитов в группе больных с язвенной болезнью может служить показателем угнетенного состояния фагоцитарной иммунной системы.

Функция окислительного метаболизма является реактивной, быстро формируется во времени, поскольку не затрагивает синтетических, анаболических процессов. Интерес к цитолитическому действия фагоцитов через реакции респираторного взрыва на опухолевые клетки оправдан при учете его во время медикаментозного лечения. Выбор фармакологических доз цитотоксических лекарств, проявляющих яити-чеекое действие по отношению к опухолевым клеткам и толерантное к нормальным тканям организма хозяина, затруднен вследствие присущей опухояегьм клеткам резистентности, с одной стороны, и вгоричнопри-обретениой резистентности после циклических курсов лечения, с другой стороны ( Р. V Лоо11еу, 1988 ). Опухоли желудочно-кшпечной и легочной локализации являются наиболее трудноизлечимыми, все чаще внимание исследователей привлекает вопрос генерации кислородных радикалов при помощи ионизирующего излучения и химических систем,

вклада и посреднических функций кислородных радикалов в метаболизм и цитотоксическое действие противоопухолевых препаратов ( J.W. bovra , 1988 ). Одним из механизмов цитотоксического действия, например, антрациклинов является их способность к генерированию кислородных радикалов ( H.Eliot, 1984; J.L.Zwaln , 1984 ), гашение кислородных радикалов может быть причиной резистентности к действии антрациклинов ( С.Batist , 1988 ). Необходимо учитывать, что лекарственные препараты могут как стимулировать, так и угнетать функции респираторного взрыва фагоцитов ( P. W.Gudswiez,1938 ).

ВЫВОДЫ

1. Прямое стимулирование фагоцитов крови к проявлению респираторного взрыва через активации внутриклеточных систем посредством A-23I87 и РМА приводило к ускоренной, но менее выраженной реакции окислительного метаболизма. Стимуляция рецепторов фагоцитов 0Z и тафтцином вызывала замедленное образование кислородных производных с одновременным увеличением интенсивности их выброса.

2. Применение блокаторов респираторного взрыва выявило, что для осуществления функции окислительного метаболизма необходимо: нормальное функционирование цитохромов В НАДШ-оксидазной цепи переноса электронов, активный актомиозиновый аппарат клетки, оптимальный ионный баланс, сопряженный с процессом поляризации и деполяризации плазматической мембраны.

3. Сохранение в течение длительного времени высокого уровня окислительного метаболизма при стимуляции ПМЯ-клеток комплексом K-562-IgG имеет важное значение в осуществлении лизиса опухолевых клеток. Стимулятор респираторного взрыва - форболмиристатацетат -3-х кратно увеличивал цитотоксичность полиморфноядерных клеток по отношению к опухолевой линии К-562. Применение супероксцвдисмута-зы существенно снижало интенсивность цитолиза и являлось доказательством его кислородо-радикальной природы.

4, Анализ фагоцитарной системы крови выявил снижение коли--чества моноцитов, экспрессирующих СД14 (Мо-2) антигенный кластер, у всех исследованных больных. Отсутствие существенных изменений способности нейтрофилов к фагоцитозу флюоролатекса отмечалось у больных хроническим гастритом и раком пищевода.

5. Окислительный метаболизм фагоцитов крови во всех исследованных группах больных с заболеваниями пищеварительного тракта был существенно угнетен в ответ на опсонизированный эимозан, воздействующий на рецепторы клетки, и не изменялся при внутриклеточной стимуляции форболмиривдатацетагом. Последнее свидетельствует о сохранении потенциальной способности фагоцитов больных к проявлению кислородозависимой циготоксичности.

С1ИХ)К РАБОТ, ОПУБЖСОВ/ШШ ГЮ ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Шарманов А.Т., Ыухаыбетьярова 1.Р. Лгаминолзависимая хеми-лиминесценция .яолиыорфноядерных клеток человека, стимулированных опсонизированным зимозаном, форболмиристатацетатом и опухолевыми клетками К-562 / Дшунопатология и аллергия.- Алма-Ата, 1991.-С.191-195,

.2. Шарманов А.Т., Мухамбетьярова Л.Р.. Иммунопатология хронических и опухолевых заболеваний пищеварительного тракта I Экологические аспекты иммунопатологических состояний: Пат. Всес. конф,-Алма-Ата, 1990.- т.1,- С.74.

3. Шарманов А.Т., Кайшибеков Е.Б., Асылбекова Д.Т., Мухам-бетьярова Л.Р. Клеточные иммунные механизмы и белки крови при заболеваниях верхнего отдола пищеварительного тракта / Тез. мат.

15 Всес. конф. "Физиология пищеварения и всасывания".- Краснодар, 1990— С .34.

4, КаЧшибекоз Е.Б., Мухамбетьярова Д.Р. Оценка иммунного ста-

туса у больных с заболеваниями верхнего отдела пищеварительного тракта / Тез. докл. конф. аллергологов и иммунологов "Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии в аридной зоне".- Ашхабад, 1991,- С,91-92.

5. Кайиибеков Е.Б., Ташенов Е.Г., Мухамбетьярова Л.Р., Пар-манов А.Т. Значение иммунных белков крови у больных с предопухолевой и опухолевой патологией пищеварительного тракта / Тез. Зсес. симп. "Прогресс в лечении злокачественных новообразований".- Чимкент, 1991.- С.196.

6. Sharmanov A.T.,Saparov A.S,., Mukb-ambetjarcrra L.tl. Iramuno-lcgio function and natabolie disorders la patients with patholo-. sy of aliiaentary -tract / 10-th. Meeting of Europe an Federation of Iaraunologieal Societieo: Abatract3.~ Edinburgh, 1990« '

7. IMchaisbstJarova L.R., SharzsanoT Л.Т. A ccnparativo analjr-aio of respiratory burat of polyEOrphonualsar от Us, stimulated by several agents j Conference of young oolentiata on important isoueo of modern nutrition science.- Alma-Ata, 1990,- p.29.

Подписано к печати 30.09.91 г. зак. # 1471. тир. 100 энэ.

Отпечатано на ратопрннте Казинфори ГАПК.

г.Алма-Ата, пр. Лоиина, 23.