Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуноцитокины: регуляция функций макрофагов, локальная иммунокоррекция

РГв 00

- >1 т т

министерство здравоохранения россии

российский государственный медицинский университет

На правах рукописи

ГАНКОВСКАЯ Людмила Викторовна

ИММУНОЦИТОКИНЫ: РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИЙ МАКРОФАГОВ, ЛОКАЛЬНАЯ ИММУНОКОРРЕКЦИЯ

14.00.36 — аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1993 г.

Работа выполнена на кафедре иммунологии и ПНИЛ иммунорегуляции и иммунокоррекщш Российского Государственного медицинского университета.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Ковальчук Л. В.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А. А. Михайлова доктор биологических наук, профессор В. Я. Арион доктор медицинских наук А. Д. Черноусое

Ведущее учреждение: НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи

Защита диссертации состоится « » 1993 г.

в 14 час. на заседании Специализированного совета Д 084.1406 Российского медицинского университета (117437, Москва, ул. Островитянова, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского медицинского университета (ул. Островитянова, 1)

Автореферат разослан « » 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат медицинских наук доцент

Кузнецова Т. Е.

ОШЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Современный этап развития иммунологии характеризуется интенсивными исследованиями, посвященными изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции иммунного ответа.

Одно из видных мест занимает проблема медиаторов иммунитета, играющих клачевуо роль в становлении и функционировании иммунной системы, в патогенезе многих заболеваний (Арион Б.Я., 1990; Михайлова A.A., 1988; Летров Р.В. и др., 1987; Mitchell M.S.et »11988; Rappelee D.A. et »1. , 1989; Spern U.S., 1986; Deoxter Т.О. , 1989).

Открытие высокого потенциала цитокинов в осуществлении проти-воинфекционной и противоопухолевой защиты, в регуляции регенераторных процессов определили уникальность перспективы применения их а качестве иммунофармакологических препаратов направленного действия ( Spora M.B. et »1.,1986; Turok O.W. et al.198?; Кузнецов В.П., 1989).

В последние годы получила широкое экспериментальное и клиническое подтверждение теория сети цитокиновых взаимодействий, согласно которой одни «игокины индуцирует выработку других, грансмодулирувг поверхностные рецепторы, действуют в комбинации друг с другом, обеспечивая тем самым каскадность вызываемых эффектов ( Baikwin ?.H.et alJ989$ Hisel S.B. ,1989; Sptrn li.B.et al.,1988).

Ыононуклеарные фагоциты в силу своей полифункциональности являются основными источниками цитокинов ( Rappelee D.A. et al.I988; Ковальчук 1.В., Чередеев А.Н., 1991). В то же время накоплен обширный материал по регуляции функций фагоцитов иммунопептидами (Суслов A.n., 1990; ciarle S.O. et al., 198?; Herrmann ï.et al.1989). Благодаря цитокиновой системе межклеточного взаимодействия с лимфоцитами, неитрофилами и клетками нелимфоидной природа, макрофаг пере-

ходят в активированное состояние и .выполняет свои эф^екторные функции.

Сетевая концепция открывает новые подходы в изучении регуляции макрофагов принципиально на другой уровне, с учетом действия комбинации имаунолеятидных молекул на клетку. Это имеет важное прикладное значение, т.к. позволяет глубже понять роль фагоцитов и цитоки-нов а патогенезе многих заболеваний инфекционной и вирусной природы, опухолях, воспалительных процессах разно.» этиологии, болезнях соединительной ткани, патологии регенераци;формирует новое направление ишунопептидной терапии, основанное на применении различных комбинации цитокинов, секретируеыых клетками иммунной системы в оптимальных соотношениях. Сбалансированность регуляторного и эффекторного действия иммунопептидов позволяет рассматривать их как высокоэффективные эндогенные иимуномодуляторы. Воздействие таких лекарств максимально приближено к физиологическому и безвредно для организма.

Все это определяет актуальность исследований, направленных на изучение механизмов регуляции макрофагов цитокинаыи и разрао'отку на основе этого новых методов цитокинотералии.

Однако, многие аспекты этой проблемы далеки от своего окончательного понимания. 11редставляатся мало изученными механизмы активации макрофагов рекоыбинантными цитокинаии, их сочетаниями и естественной комбинацией мыуиолелтвдов эндогенного происхождения. Имеются единичные работы по синергизму рекомбинантных цитокинов в индукции противоопухолевой ЦЙТОТОКСИЧНОСТИ макрофагов ( Спогак1 К. е! &1.ДУ85; Цогу К. et а!.,1989), секреции ими интерлейкина-1 (Ы-1) ( Негг-тапп Р. Д988). Практически не изучены особенности цитокин-завнсимо-го принирования фагоцитов как важной стадии их активации.

Несмотря на определенные успеха в исследовании роли иммунояел-тг.дов и (фагоцитов в процессах воспаления и регенерации, имеются лишь немногочисленные исследования по применений отдельных цитокинов с

лечебной целью ( Кузнецов В.П., 1987; НаНоп б. , 1988; ЗаиЛег о.я. et а1. , 1990; ВгагвеИ й.К. et а1.,19ЭЗ); отсутствуют работы но применению комбинации эндогенных цитокинов в лечении острых и хронических воспалительных заболеваний пародонта, кости, роговицы глаза.

Цель работы. Цель» настоящей работы явилась разработка методов локальной шмунокоррекции, основанной на цветном применении комплексов цитокинов эндогенного происхождения и анализе особенностей им-мунопептидной регуляции цакрофагов.

Задачи исследования. Для достижения «оставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

X. Разработать технологии получения комплексов эндогенных цитокинов, секрэтируемых ыонояунлварньши клетками периферической крови; исследовать физико-химические свойства, биологическую активность.

2. Проанализировать особенности регуляции различных функций цакрофагов . рекомбинангныии иммунолеятидами: ингерлэйкинаци-1,2, фактором некроза опухоли-оС , интерфероном-/ и комплексом эндогенных цитокинов.

3. Исследовать механизмы ваккого этана активации - цитокин-зави-сииого примирования двух типов фагоцитов: цакрофагов и нейтрофилов периферической крови.

Разработать основные принципы локальной иммунокоррекции -аутолимфокинотерапии на модели раневого процесса у кроликов.

5. Исследовать механизмы активации естественного заживления ра-вы лод действием комбинации эндогенных цитокинов.

6. Оценить возможности и эффективность применения метода аутолимфокинотерапии в лечении хронических воспалительных пародонта, кости и проникающих ранений роговицы.

7. Обосновать экспериментальные подходы цитокин-завиоимой адоптивной макрофаготерапии иеланоыы Б.16.

Основные положения, выносимые на защит.у.

. I. Разработана технология получения комплексов зндогениых им-мунопептидов (й- и Д-активинов) из культур мононуклеарных клеток периферической крови человека и животных, оказывающих стимулирующее действие на клетки фагоцитарной системы и фибробласты и

¿п т!лго.

2. Продемонстрирована эффективность естественной комбинации ци-токинов по сра¿нению с рекомбинантными иммунопептидами: ИД-1, ФНО-с^ ИЛ-2 в активации кислородного метаболизма макрофагов, секреции Ш-1, индукции противоопухолевой цитотоксичности, что служит дополнением

и подтверждением фундаментальной теории сэти цитокиновых взаимодействий.

3. Анализ экспериментальных данных позволил сформулировать гипотезу о двух типах ирииирования фагоцитов под действием М-комплэкса цитокиков:

а) длительного - для макрофагов, связанного с интенсификацией синтеза белка, характеризующегося необходимость» длительного контакта клеток с цигокинами и выраяенной степенью лримирования;

б) кратковременного для нейтрофияов, сопровождающегося невысокой степенью проявления эффекта, меньшим временем его развития, не зависящего от белкового синтеза.

4. В результате проведенных исследований предложен новый метод локальной иымунокоррекции - аутолимфокинотерапия, основанный на местном применении естественной комбинации эндогенных цитокинов, секре-тируеиых аутологичными мононуклеарныии клетками периферической крови. Проведена экспериментальная разработка метода на модели раневого процесса, исследованы механизмы активации естественного заживления раны под действием цитокинов.

5. продемонстрирована высокая эффективность метода аутолимфоки-когерэпии в группе больных с хроническими воспалительными заболева-

ниями челюстно-лацевой оо'ласти (хронический пародонтит, остеомиелит), заклачающуюся в снятии воспаления, ускорении сроков эпители-зации, продлении сроков ремиссии.

Научная новизна.

1. Разработан новый метод получения препаратов на основе естественного комплекса эндогенных цитокинов, секретируемых мононукле-арными клетками периферической крови. Данный подход является принципиально новым и позволяет создать лекарственные средства, обладающие действиец, максимально приближенным к физиологическому и совершенно безвредным для организма.

2. Получены новые данные о высокой эффективности регуляции различных функций макрофагов естественным комплексом цитокинов по сравнению с рекоабинантными иимунопептидами, что служит подтверждением теории сетевой регуляции и синергизма цитокинов.

В. Анализ экспериментальных данных по действию цитокинов на фагоциты позволил сформулировать гипотезу о двух типах примирования фагоцитарных клеток естественным комплексом цитокинов; установить последовательность активации кислородного взрыва, метаболизмаарахи-доновой кислоты, свкрецмм ФНО.

Впервые на экспериментальной модели раневого процесса разработаны новые принципы локальной ямиунохоррэкции (аутолиыфокинотерапии), основанные на местном применении комплекса эндогенных цитокинов, секрегируеиых аутологичными мононуклеарньши клетками периферической крови. Показана решающая роль естественной комбинации эндогенных цитокинов в снятии воспаления и активации процессов естественного заживления.

5. Разработаны конкретные схемы применения и доказана эффективность аутолимфокинотерапии в лечении пародонтита и остеомиелита.

6. Впервые представлены экспериментальные данные о применении комплекса имыуноаеитидов в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте и клинике.

- б -

Приоритетность разработок подтверждена 4 авторскими свидетельствами, 3 положительными решениями на изобретения:

Кг 1494274 "Способ получения факторов, ингибирувцих миграционной активность макрофагов и лейкоцитов" от 15.03.89 г.;

Ш 1498498 "Способ лечения гнойных рак* от 8.04.89 г.;

К? 1514377 "Способ лечения пародов тита" от 15.06.90 г.;

й 1519367 "Способ оценки активности иммуномодулкруюцих препаратов от 1.07.89 г.

Положительные решения на изобретения:

1. Способ моделирования пролифератквных изменений в стекловидном теле глаза (® 4950443/14 от 4.06.92 г.).

2. Способ предупреждения грубого рубцевания роговицы (1124950578/ 14 ох 30.07.92 г.).

3. Способ лечения пролиферативных изменений в стекловидной теле глаза (1й 4950441/14 от 6.07.92 г.).

Практическая ценность работы а внедрение результатов исследования. Естественные комплексы цитокинов могут быть рекомендованы а широкую практику в качестве диагностикумов макрофагов и полиморфноядер-ных лейкоцитов. Дри прохождении соответствующих испытаний они могут использоваться в клинической практике в качестве иммуномодулирувдих лечебных препаратов, обладаодих противовоспалительным и регенератор-, нам действием.

Разработанный подход к оценке биологической активности комплексов цитокинов по прширующей активности в тесте люминол-зависимой хе-милюминесценции отличается экономичность» и относительной простотой. Это делает возможный его широкое применение в экспериментальной работе при скрининге новых иимуномодулирущих препаратов и оценке индивидуальной чувствительности пациента к данному препарату.

Предлохеи новый метод аутолкыфокинотерапии, позволяющий снять воспалительные явления, ускорить сроки эпителизации ран, продлить

- ? -

сроки ремиссии. Согласно peuieuuD Президиума Ученого медицинского совета U3 РСФСР от 5.10.90 г. разрешены клинические испытания метода аутолимфокинотерапии ярм экзогенных поранениях тканей (ожоги, трофические язвы, лучевые некрозы), воспалительных заболеваниях кожи; кости, пародонга и др. В настоящее время метод аутолимфокинотерапии проходит апробацию в НИИ глазных болезней иы.Гельмгольца, на кафедре иммунологии Смоленского медицинского института.

Материалы диссертации доложены на: - научной конференции с международным участием "Современные методы иммунотерапии", Ташкент, 1984; - пленуме Правления Всесоюзного научного общества иммунологов. - Минск 1987; Всесоюзном семинаре "Им-муномодуляторы". - Москва, 1987; Всесоюзном симпозиуме с участием иностранных специалистов "Структура регуляторных пеятидов". - Москва, 1988; У и У1 Всероссийских школах иммунологов. - Ростов-на-Дону, 1988. - Смоленск, 1990; заседании секции "Клиническая иммунология" Всесоюзного научного общества иммунологов. - Москва, 1989; 1-м Всесоюзном иммунологическом съезде. - Сочи, 1989; на 7 Международном конгрессе иммуаологов (Западный Берлин, 1989)"; международном симпозиуме проблемы иимунофармакологии", Тбилиси, 1990; заседании Ученого медицинского совета МЗ РСФСР. - Лосква, 1990; 1-й Учредительном конгрессе Международного общества патофизиологов. - Москва, 1991 г.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 42 научные работы.

Обьем и структура диссертации. Работа изложена на 2.70 страницах машинописи, включая ¿7 таблиц, рисунков, состоит из введения, обзора литература, глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография содержит 294 источника литературы отечественных и зарубежных авторов.

Апробация диссертации состоялась на совместном заседании кафедры и отдела иммунологии Российского государственного медицинского университета.

СОДЬРЗАШ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Источником МШС, используемых для получения ци токин-содержащих фракций.служила периферическая кровь здоровых доноров. Группу здоровых доноров составили 46 человек обоего пола в возрасте от 18 до 50 лег.

В большой серии экспериментов использовали периферическую кровь свиней, полученную на Московском мясокомбинате им.А.К.Микояна.

Периферическая кровь здоровых доноров (?6 человек) использовалась для выделения клеточных суспензий (лейкоцитов, моноцитов, нейтрофидов).

Группа больных с заболеваниями пародонта включала 54 человека обоего пода в возрасте от 25 до 55 лет, проходивших курс лечения по поводу «ародонгига в стоматологической отделении Объединенной больницы издательства газеты "Правда" (зав.отделением Рудавин).

Другая группа больных с хроническим травматическим остеомиелитом челюстно-лицевой области включала 13 человек в возрасте от 3055 лет, лечившихся в условиях стационара (I городская больница, кафедра стоматологии РВД, зав.кафедрой профессор Зуев В.Н.).

Группа из 5 больных, которым проведена экстракция катаракты глаза с имплантацией заднекамерной линзы Т26, находилась на лечении НЛО "Микрохирургия глаза".

В опытах использованы инбредные мыши линий ОВД, С^вь/б^ваьв/с, полученные из питомника "Столбовая". Опыты по моделированию раневого процесса выполнены на 36 беспородных кроликах. Эксперименты яо моделированию проникающих ранений роговицы проводились в группе 30 кроликов породы Шиншилла.

Используемые препараты цитокинов. В работе использовали коммерческий препарат интзрферона-гаима (ИСН-У) / сатаГегоп, РпапкысМд, Болгария/: фактор некроза опухолк-вльфа (»НО-<л-),/лаооратория химки

генов Института биоорганической химии им.й.Н.Ыемякина/; рекомбинант-ный интерлейкин-I (M-I), производствам генетики РАН; рекоыбинант-ный интерлейкин-2 (ИЛ-2) - предоставлен Институтом органического синтеза АН Латвии. Рекомбинантные цитокшш использовали в дозах 10, 50, 100, 500 ед/мл.

Ыононуклеарные клетки (ИНК) выделяли в градиенте плотности фи-колл-верографина (воумош, 1968). Лимфокинсодеряащие супернатанты получали после осаждения центрифугированием суточных культур, стимулированных ФГА МНК периферической крови. Сконцентрированные лиофили-зацией или ультра фильтрацией бесое точные супернатанты фракционировали на хроматографической колонке, используя для разделения образцов сефадекс &-I00. Элоцию проводили раствором Хэнкса (рН*7,2). Запись хроматограмм проводили в автоматическом релиме с помощью системы "Иу1сега-111(ыазХКонцентраци)0 белка во фракциях определяли спектро-фотометрическим методом ( Kaloicor, 1947). Расчет молекулярных масс вещее?», присутствующих во фракциях после проведения гель-фильтрации проводили по результатам предварительно полученных данных элю-цни маркеров с известной молекулярной массой (Остермав Л.А., 1985). Стерилизация - через фильтры 0=0,22 икм "ццироге-сз" (США).

Изоалактрическое фокусирование комплексов иммуноцитокинов.полученных после гель-фильтрации иа сефадексе 6-100 к обессоленных проводили на пластинах с тонким слоем агарозы на приборе tiultipbor 2117 (LXB, Швеция) в лаборатории молекулярной иммунологии НИИ физико-химической медицины > sds -электрофорез в полиакриламидном геле проводили в стандартной системе ЬаешюИ (1970).

Аналитический вариант гель-хроматографии высокого давления комплексов иммуноцитокинов проводили с помощью системы uitrochroa OTi (iiKB, Швеция). В работе использовали коленки TSK-gel 2000 sw (7,5 х 300 мм) и TSK-gel эооо sw (8x300 мм) /ькв, Швеция/.

Для изучения действия цитокивов на фагоцитарные клетки исполь-

зовади непршой капиллярный тест ингибацил миграции (Петров Р.В., 1983).

В качестве клеток-мишеней в капиллярном тесте использовали клетки перитонеального экссудата мышей линии С57В1г/6 и лейкоциты периферической крови здоровых доноров.

Поглотительную способность нейтрофилов в реакции Pc-опосредованного фагоцитоза оценивали по показателям фагоцитарного числа (ФЧ-процент нейтрофилов с фагоцитированным материалом) и фагоцитарного индекса (ФИ-количвство поглощенных частиц, приходящихся ва I вейтрофил), определяемым при постановке микротеста (Чередеев А.Н. и др., 1981).

Способность фагоцитарных клеток продуцировать активные формы кислорода (АФК) оценивали методой лвминол-зависимой хемилюминесцен-ции (ЛХЛ). Регистрацио ЛЛ проводили на хемилшинометре XilB-1251 (Швеция) при 37°С.

В качестве стимулятора хемилюминесцентного ответа использовали опсонизированный зииозан ( sigma ) - 50 мкл (0,2 мг). Стимулятор добавляли к клеткам через 3 минуты после начала регистрации спонтанной Ш.

Степень срогивояаразитарной активности ИФ оценивали на 1-е, 8-и и 5-е сутки после заражения ЫФ L.doaovani подсчитывая число : внутриклеточных паразитов на 100 МФ в поле зрения.

Работу о L.donovanl проводили совместно с д.м.н., ведущим научным сотрудником Института тропической медицины и медицинской паразитологии Шуйкиной Э.Е.

Определение вдтотоксической активности макрофагов проводили по методу р.г.Коз (1989), основанному на степени включения радиоактивной метки 3Н-тимидина в клетки мипени. В качестве миаеней использовали аутологичные опухолевые клетки меланомы 3.16, адаптируемые в условиях m vitro (Ьыковскан C.i. и др., 1987).

Секреторную активность моноцитов периферической крови оценивали по уровни активности интврлвйкина-I и содержанию простагландинов s супернатантах культур моноцитов, проинкубированных в течение суток с исследуемыми цигокинаыи (опыт) или средой Ш1-1640 (контроль). Для определения активности ИЛ-I в полученных супернатантах культур Uo и выделенных фракций использовали предложенную в 1982 г. uizel S.B. модификацию классического "LAï-assay",основанную на способности ИД-I стимулировать пролиферацию тимоцигов в присутствии субми-тогенных доз ФГА.

Содержание простагландинов Р2<^ и E¿ а супернатантах моноцитов и ИФ определяли радиоюыунологическим методом с помощью специальных наборов:

1) диагностический набор института изотопов Венгерской академии наук (для простагландина ï^)»

2) диагностический набор ( ЭН) Р&Е2 PIA Kit ( Trarenol Gene-teoh Diagnostica, Caabridge Ii.iL ДЛЯ простагландина Eg).

Определение активности фактора некроза опухоли (ФНО) проводили в цитотоксическом tecte ( ïliclc D.et al., 1984). В качестве клеток-мшеней использовали трансформированные фибробласты линии ь-929. Активность ФНО в беоклегочных супернатантах и комплексах иммунопеп-тидов определяли в присутствии I мкг/мл актиноммцина-Д ( »serra" ). За условную единицу ФНО принимали разведение образца, вызывающее 50% лизис клеток-мишеней. ИЛ-6 тестировали по оценке пролиферации ИЛ-6-зевискмой гибридомь Д6С8 (Клшненкова E.H. и др., 1991). . Определение активности М-2 проводилось сотрудниками лаборатории клеточной иммунологии ИМЫ им.Н.Ф.Гамалеи в тесте пролиферации селезеночных клеток (Пронин 4.А. и др., 1988). Активность интерферона, оцениваемая по уровню противовирусной активности, определялась в лаборатории противовирусного иммунитета НИМ им.Н.Ф.Гамалеи (Кузнецов В.П., 1987).

Активность известных цитокинов в условных единицах рассчитывалась

С помощью пробит анализа (Kronhein S. et al., 19B5).

При изучении действия комплексов естественных иммуноцитокинов

на фибробласты кожи человека использовали первично установленные и

поддерживаемые лассированиеи культуры клеток. Определение пролифе-

з

рагивной активности фибробластов проводили по включению Н-тимиди-на (Хаймен Д. и др., 1976). Содеркавие секретируемого в среду коллагена в культуре фибробластов оценивали, используя модификацию радиоизотопных методов ( Peterhof slcy B.,I97I; Postlethwaite А., 1984), . разработанную в лаборатории соединительной ткани института медицинской и биологической химии Aüh СССР (зав.лаб. д.б.н. Дельвиг A.A.). Действие U и Л-актавинов in tíyo изучали а экспериментальных моделях. * иодель^инген^ой^еревиваеиой опухоли меланомы_ВЛ6. Штамм меланомы В.16 получен из Häh канцерогенеза ВОНЦ РАН. Полученную клеточную суспензию иеланоиы В.16 (2хЮб клеток/мл) вводили подкожно мышам линии C57BL/6 в 0,5 ил среда 199.

При разработке модели адоптивной макрофаготерапии меланомы В.16 в качестве клеток эффекторов использовали сингенные ИФ ДЭ интактных мышей и ыышей-опухоленосителей на 1-е, 3-й, 5-е сутки опухолевого роста. ■ /.■"•,.:'

Выделенные ИФ инкубировали в течение 6-хи часов при 37°С в полной культуральной среде, содержащей ¿i-активин в оптимальной концентрации (10 мкг/мл), после чего клетки трансплантировали в место локализации опухоли подкожно на 1-е, 3-й и 5-е сутки ее роста по ЗхЮ6 в объеме 0,5 мл среда.

На 15-е сутки опухолевого роста мышей забивали и определяли среднее значение массы опухолевого узла, -¡о тормокения роста опухоли (Ti-O) Дале дин B.fc., 1931/.

На модели раневого процесса у кроликов (Большаков И.Н.,1983) изучали влияние комплексов цитокинов эндогенного происхождения. Раны обрабатывали в течение ? суток Ы или Л-активинами. Для оценки заживления экспериментальных ран исиользовали планиметрические критерии (Попова Л.Н., 1942), определяли макроскопическое состояние раны, цитологический состав раневого экссудата (Фенчин К.41.,1976), срок полного заживления.

Проникающие ранения роговицы наносились кроликам после предварительной анестезии дикаином. Перед нанесением раны проводили суб-коныонктивальнуа инъекцию цитокинов в объеме 0,3 мл. Последующее лечение проводилось дроо'ной инсталляцией цитокинов по I капле 5 раз в день в течение первых двух недель и 3 раза в день в течение последующих 1,5 месяцев.

Оценивались следующие параметры: величина раны (т.е. ширина отека и толщина формирующегося рубца), наличие слизистого отделяемого и светобоязнь в течение первых двух суток после нанесения раны, сроки исчезновения отека, восстановления естественной кривизны и прозрачности роговицы«

Исследование эффективности применения комплексов цитокинов в клинической практике проводили, разработав метод аутолимфокинотера-> пии, основанный на локальном применении супернатантов культур ауто-логичных стимулированных ИНК. Применение аутолимфокинотерапин у больных о хроническим пародонтитои проводилось консервативно или в комплексе с хирургический лечениеи.

При консервативном лечении лимфоцигарный супернатант в количестве 1,0 мл (50 мяг/мл) наносился в виде аппликаций на ватном тампоне или на турунде в межзубной промежуток на 20-30 мин.

При проведении лоскутных операций Цещинского-Видмана-Иеймана перед наложением швов раневую поверхность орошали супернатантом из шприца. Кратность применения аутолимфокинотерапии при проведении лос-

кутных операций зависела от наступления эпителизации и положительного клинического эффекта.

Клиническая эффективность применения аутологичного супернаган-та культур ИНК оценивалась по следующий критериям: отсутствие кровоточивости, снятие болей, исчезновение признаков воспаления, начало эпителизации после операции, полная эпителизация, срок пребывания на больничной листе, продление сроков ремиссии.

Больным с остеомиелитом, лкмфоцитарныВ супернатант подводился к патологическому очагу через свищевой ход, 2 раза в день в течение 5-7 дней. Перед введением свищевой ход предварительно тщательно промывался раствором фурацилина.

Полученные результаты обрабатывались с использованием стандартных статистических методов (Ыалета Ю.С. и др., 1982).

Комплексы цитокинов эндогенного происхождения -

регуляторы клеток фагоцитарной системы

Предметом настоящего исследования явилась разработка и обоснование новых подходов к локальной иммунокоррекции на основе изучения тонких механизмов иммуноаептмдной регуляции фагоцитарных клеток.

С агой цельц был разработан способ выделения комплексов цито-кинов эндогенного происхождения. Предложенный нами подход основан на представлении о сети цитокиновых взаимодействий и заключается в вы- ■ делении естественной комбинации цитокинов, секретируемьх мононукле-арными клетками периферической крови при стимуляции. На рис.1 представлены основные этапы получения и исследования комплексов естественных цитокинов.

Учитывая наши результаты и данные литературы о закономерностях выработки цитокинов (Ганковская Л.В. и др., 1986; Войтенок H.H., 1988; Feldman 'Л. et al.I989; Gauchat J. et al.,I989; Anderson U., 1990) разработана определенная система стимуляции и культивирования

периферической крови человека и экспериментальных животных (авт. .догельство fe 1494274).

ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ КРОВЬ

| ВЫДЕЛЕНИЕ ЫНК

СТШЛЯЩА ¿¿«РАБОТКИ ЦЙТОШОВ ФГА

УДАЛЕНЬЕ СТКЫУЛЯТОРА

КУЛЬТИВИРОВАНА ЦНК Б БЕССИВО-РОТОЧШИ СРКДЕ 20-24 ч. (ПРИ 37°С)

ПОДУЧЕНЫ СУДЕРНАТАНГА

КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ (УЛЬТРАФЫЬТРАЩЯ (РИ-Ю)

ГЕДЬХРОМТОГРАФЙЯ НА СЕФАДЕКСЕ &-100. ПОЛУЧЕНИЕ ФРАКЦИЙ ЫКД и ЛКЦ

| ХРАНЕНИЕ -1 ОБЕССОЛИВАНИЕ |

Изучение биологической активности:

I) определение

активности ИЛ-1

2) ФНО

3) ИЛ-2

4) Ш

5) МИФ, ЛИФ

6) М-6

3) В Э I I

4} Ионообменная хроматография

Рис.1. Основные этапы получения и исследования комплексов цитокинов из культур ИпК периферической крови

Фракционирование культур на сефадексе 6-100 дозволило выделить из надосадочной нидкости культур ипК пять фракций: 1-е м.ы. более 80 кй, II - «.и. 60-80 га, Ш - и.и. 30-60 VI), 1У - н.м.Ю-30 И), У - м.м. ценее 10 ки. Профиль элюции, регистрируемый в ходе гель-фильтрации культур ИНК,представлен на рис.2. Тестирование биологической активности в модельных системах 1п -»^го выявило интересный спектр биологических эффектов П и 1У фракций в отношении клеток фагоцитарной системы (макрофагов, моноцитов, кейтрофилоа}

I

20 30 W 50 6070 80 Ме (мл)

Рис.2. Профиль элации суцернатантов культур стимулированных

ФГА (а) и интактных (б) ШШ, регистрируемый в ходе гель-фильтрации на сефадексе 6-100 и содеркание белка. По оси ординат слева - экстинция яри длине волны 280 им, справа - концентрация белка, «кг/мл, сверху выход маркеров. Но оси абсцисс - объем элюции, мл.

Таблица I

Действие М и Л-активинов на функциональную активное» фагоцитарных клеток

йсследуеиые комплексы цитокинов

¡Клетки мишени

Критерии оценки

Контроль

ииграция, ИМ

фегоцитар-

Фагоцитоз 809 чиоло^

фагоцитарный индекс

ЕА-РОН, %

Экспрессия Рс.сзА ЕАС-РОИ

М-1 (Ка^ Секреция ДГЕг (xIO U)

ИГР.

„ О.ШО.1* 0,94*0,8 1,0

лейкоциты ° .98*0.6 0,Ш0}+ J.o

75,1+2,8* 70,9+3,2* 26,4^5,4

нейтрофилы

г*>

Uo Mo Но

1,78+0,1* 1,63+0,1* 0,6+0,1

54,2*3,1 65,9+2,9

41,2+4,3 50,5+5,3

3,33+0,3* 3,11+0,3е 1,92+0,19

3,55+I,I* 11,1+8,6*- 0,83+0,6

3,10+1,6* 1,62+0,8 1,82+0,7

М*

Генерация АФК (иадекс предеэмуляции отн.ед)

Противоопухолевая цито- Мф токсичность (*Ц. %)

4,53^0,11 1,5^0,1 1+0,05

57,5±2,9+ - 4,0+3,2

(64 од/ил)

Оказалось, что 1У фракция существенным образом изменяет функциональный профиль ыононуклеарных фагоцитов (МНФ): стимулирует секреции Мф высокоактивных биологических иолекул интерлейкина-1, фактора некроза опухоли-оО (ФНО-оС), простагландинов Е2 и Р2о(,.кислородных радикалов активирует фагоцитоз нейтрофилов, противоопухолевую цито-Токсичность ИФ и яротивопаразитарную активность к ь-аопотащ.

Эта фракция впоследствии была названа нами М-активином.

П фракция обнаруживала стимулирующее действие преимущественно в отношении полиморфноядерных лейкоцитов: активировала фагоцитоз ЕА-комплекса, регулировала их миграцию;« была обозначена Д-активи-ном.

Для выявления истинной значимости секретируемых МС цитокинов после индукции ФГА в качестве контроля провели серию экспериментов, включающую фракционирование надосадочная жидкости культур насгимула-рованных МНК и оценку действия полученных фракций на миграционную и поглотительную активность фагоцитов. Профиль элюции«регистрируемый в ходе гель-фильтрации (рис.26),имеет ряд отличий от хромато-граммы, полученной при аналогичном разделении супернатанта МЫС стимулированных ФГА: неразрешенное» пиков в области м.м. свыше 60 кД, более низкий уровень поглощения УФ (280 нм) в диапазоне выхода веществ с м.м. 10-30 ко, как и содержание белка во фракциях. Показатели оптической плотности I и 5 зон практически не отличались. Своеобразно и проявление биологической активности Д и 1У фракций. Зафиксировано меньшее содержание Ш-активности (1,3+0,6 ед/мл против 318+63 ед/мл, р <0,05) и Ш«Ф-активности (1,6+0,4 ед/мл, против 80^ 8 ед/мл, р<0,05). Не наблюдалось и стимуляции фагоцитоза КА-комп-лекса нейтрофилами под действием П и 1У фракций, выделенных из су-пернатантов культур нестимулированных мНК.

С целью изучения степени гетерогенности и физико-химических свойств белков, входящих в М- и Л-активины, проводили изозлектрофо-кусирование в тонком слое агарозы, что позволило выявить в Ы-активи-не 8 компонентов в области рН от 3,5 до 10, причем основное их количество сосредоточено в области кислых значений (р1 3,7-6,7), хорошо прокрашивается белковым красителем Кумаси^р1 выделенных компонентов Ы-активина соответственно 6,7; 6,45; 6,0; 5,5^4,8; 4,?; 3,75. Л-актавин содержит три компонента с р! : 4,3; 4,7; 4,8.

Проведение аналитического варианта гель-хроматографии высокого давления и электрофореза в полиакриламидном геле подтвердило иного-компонентность исследуемых фракций и позволило уточнить ä.M. поли-яептидов. М-активин представлен в основном двумя пиками белков о U.U. 13leD и I? kD , S-активин - белками с U.m. 80, 60 и 45 мэ.

Учитывая результаты о гетерогенности исследуемых комплексов, а также данные литературы по кинетике выработки цитокинов в культуре ШК, стимулированных ФГА., были проведены эксперименты по выявлению активности известных цитокинов а М- и Л-активине.

Распределение активности цитокинов во фракциях, полученных после гель-фильтрации, представлено на рис.3.

С помощью биотестирования и пробит анализа было показано, что в 10 мкг Ы-активина. содержатся активности ИЛ-1 (32+5,3 усл.ед), ФНО-оО (2,20+4,3 усл.ед), дШФ (32+3,8 усл.ед), ИФН (2-4 ед) , ИЛ-2 (2 ед), ИЛ-6 (5-6 ед).

Так как активность М-активина обусловлена комбинацией молекул различных иммунопептидов, то встал вопрос о методе тестирования их биологической активности.

Как показали наши исследования, метод ЛХЛ оказался информативный, быстрым я удобным. Биологическая активность определялась с помощью пробит-анализа. Число единиц активности ШСЦ определялось как величина, обратная максимальному разведению препарата, дающего 50% от максимального увеличение хемилюминесцавтного ответа клеток-ииое-ней (ИФ или нейтрофилов) на опсокизированннй зимозан. Удельная активность составила 640 вд/ur белка. '. 1

Е гго

ГД БСА

I I

ДНФ 1

14"

Ктт. Кст.Бим.ат. • 3 Ъ - 200

2-2

/ ■ /

■Ю0

30

1*0

50

60

70 V», мл

Рис.3. Распределение активностей ИД-1 (- - -), ИЛ-2 ( ... ) и

МО ( -х-х-) во фракциях, полученных после гель-фильтрация на сефадексе &-100 сулернатанта стимулированных Ш ¡ШС.. По оси ординат, слева - экстинкция при длине волны 230 ни,' справа - коэффициент активации для М-1, коэффициент стимуляции - для определения активности и-2 и удельная биологическая.активность для ФИО (уд.ед./мг). По оси абсцисс - объем злюции, ид.

Изучение механизмов действия комплексов цитокинов (Ц и Л-активкков) к рекоыбинантных цитокинов на функциональную активность макрофагов

Полученные естественные комплексы цитокинов (м- и Л-акгивины) могут оыгь использованы при изучении функций длгоцитов пркнципи-

ально иа другом уровне с учетом действия комбинации иимунопептидных молекул на клетку. Это представляется тем более важным, что в организме на МФ действует не индивидуальный цитокин, а различные комбинации регуляторных белков.

В связи с этим особую задачу исследования представляло изучение особенностей регуляции функций ыЯФ М-активином в сравнении с реком-бинантными цитокинаии.

Примирование (или лредстимуляция) является важным этапом клеточной активации и межклеточной нооперации ( uhing R.J. , 1989). Цитокины часто выступают в качестве дримирующих агентов ( szefier s.J.et ai. ,1989). Однако,многие механизма и особенности цитокин-зависимой предстимуляции двух типов фагоцитов - иф и нейтрофилов, а также анализ взаимосвязи предстимуляции МФ с реализацией эффек-торных функций требует детального, изучения.

Моделью для изучения ранних процессов активации фагоцитов под влиянием цитокинов служила способность этих клеток продуцировать активные формы кислорода, которую оценивали методом люыинол-зависимой хеыилюминесценции. Обнаружили, что М-активин в отличив от других активаторов фагоцитарных клеток (латекс или опсонизированный зимо-зан) не оказывают непосредственного стимулирующего влияния на ЛХЛ как М, так и нейтрофилов. Однако, преинкубация фагоцитов с М-вктиви-ном резко меняла способность клеток генерировать АФК в сторону активации (рисЛ). Степень предстимуляции зависела от времени инкубации клеток с цитокинаии. Для W> это был длительный процесс, требующий часов и даже суток контакта клеток с комплексом цитокинов.

Оценивая влияние рзкомбинантиых цитокинов Ы-1, М-2, ФНО-оС на кислородный метаболизм МФ, можно сказать, что преинкубация М с цитокинами в течение 6-ти часов не вызывала увеличения продукции кислородных радикалов в ответ на стимуляцию опсонизировэнным зимо-заном. Однако,20-часовая инкубация клеток с рекомбинантными цитоки-

нами приводила к увеличению ЛХД-ответа. иримирую«ая активность исследуемых цитокинов была неодинаковой и возрастала в ряду: М-2,

/- контроль; 2 -ИЛ-2; З-ИЛ-fß ; U- ФНО-ы.; 5-ИЩ

Рис.4 Сравнение цримирующей активности цитокинов в теста лшинол-зависшой хемилшинесценции макрофагов, ilo оси ординат - индекс активации, отн.ед.

U-активин обладал большей эффективностью лриаирующего действия, что проявлялось в сокращении вреиени аредстиауляции до 3-б-ти часов и увеличении индекса предстиыуляции.

При анализе кинетики хеывдюшнесцентного ответа кф, примярован-ных рекомбинантньши цитокинаыи и иКЦ наблюдалось сокращение латентного периода, что считается признаком большей готовности ферментных систем ыецораны №.

Ккслородний взрыв «¿4>, как правило, сопряжен с арахидоновым нас-кадоu ( schade et al.J987). С целью более детального изученья механизма цктокин-заваашого прмкрования № было проведано исследование продукций иростаглавдинов (ИГ) дршидоаишии «Ф параллельно с »егистрашгеЛ ЛХл.

Сравнивая динамику генерации АФК и продукции ЯГ макрофагами, можно заключить, что снижение ЛХЛ ответа клеток на стимуляции совпадает по времени с повышением продукции ШЛ2. Это наблюдается как в случае стимуляции интактных ЫФ, так и клеток, прединкубированных с цитоки-нами.

Таким образом, синтез ЛК сопутствует пику ЛХЛ, но отсрочен по времени. Предобработка клеток комплексом цигокинов приводит как к увеличению продукции кислородных метаболитов, так и к усилению метаболизма АА и секреции ЯГ£. Кроме того, предобработка цитокинаии приводит к ускоренна наступления максимума продукции 11ГК (рис. 5 ).

—МФ+МКЦ+зинозан —НФ+эимозан

—НФ+НКЦ+зимозан —о——ИФ^зимозон

Рис.5 Хемилюминесцентшй ответ и продукция ЙГЕ2 макрофагами,

цримированньши ^-активином. По оси абсцисс: время регистрации Ш и продукции ОГВ (мин); по оси ординат: слега -Ш ИФ (вт ); справа - продукция 11ГК ( тМ)

Важный подтверждение)* взаимосвязи активации кислородного метаболизма шФ с каскадом арахидоновоЙ кислоты явились эксперименты с использованием ингибитора циклооксигеназной системы - иадоиегацином.

Преинкубация Мф с индометацином в течение 2-х часов активирует генерацию А<1К под действием аЫЦ. Можно предположить, что индометацин, блокируя циклоксиганазный путь метаболизма ДА, приводит к усилению лшюксигеказкого нуги. Образующиеся при атом лейкогриэны, особенно лейкотриен В4, является иющным пршшрующим агентом для фагоцитов ( Dubois U. et al., 1989).

М-активин в присутствии Д11С активирует не только систему КАДФН-оксидазы, но и индуцирует выработку ФН0-с£ МФ.

Интенсификация синтеза белка при активации является характерным признаком именно этапа премирования, 1ак как известно, что макрофаги, перешедшие из этапа премирования в этап полной активации, теряют способность к синтезу белка (Лященко В.А. и др», 1988). Для проверки данного предположения были проведены эксперименты с применением ингибитора синтеза белка - циклогексеыида (ЦГи). Обнаружили, что присутствие Щ'и в культуре i®, инкубированных с ¿¡-активином, отменяет эффект цитокин-зависииой предстимуляции мф.

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что этап цитоккн-зависиаого яримирования макрофагов - это длительный процесс, связанный с интенсификацией синтеза белка, необходимого для полного проявления активации клеток. Цитокин-опосредованное приниро- i вание представляет общебиологнческое явление, включает в себя акти- ; вацию многих функциональных систем клетки. Это и активация системы ' "кислородного взрыва", и увеличение цикла обращения арахидоновой кислоты, и интенсификация белкового синтеза, в частности, проявляющегося в повышении выработки ФНО-оС-.

Эффект длительной предстимуляции ИФ моасет оыть отчасти связан с каскадной активацией различных систем клетки, при которой продукты

одного этапа активации могут стимулировать запуск последующих.

Естественным является вопрос о взаимосвязи этапа цитокин-зависи-мого примирования с реализацией эффекторных функций ¡ДФ.

Способность уничтожать микробы, опухолевые клетки или паразиты является одной из ключевых эффекторных функций цф. Для оценки эффекторных функций приыированных йф было проведено комплексное исследование кислород-зависимого метаболизма и лротивопаразитарной активности ¡¿Ф» предстимулированных й-активином. Нами было показано, что .¿ф, предварительно примированные М-активинои или рекомбинантным иФН-^К наряду с активацией кислородного метаболизма,проявляют повышенную противопаразитарную активность. Это выражается в уменьшении числа паразитов внутри клеток (29+8 на 100 ЫФ, контроль 156+2? деШшаний на 5-е сутки заражения. МН-/ в данной системе оказался более сильным примирующим агентом для жвяшшга макрофагами ь-<1опотап1.

Малые дозы ыКЦ оказались.явно недостаточными для индукции противоопухолевой цитотоксичности ¿Ф «о отношению к клеткам ыеданоиы. Эффективными оказались высокие концентрации *КЦ 50 и 100 мкг/мл (что составило соответственно 32 ед/мл и 64 ед/мл). Индекс цитотоксичнос-ти равен 47,7+4,1 и 57,5+2,9.

Так как М-ективин представляет комбинацию эндогенных имиунопеп-тадоз? с зз^дазосты» М-1, йЛ-2, Ы-6, ФНО-сС » МИФ и КФН, можно предположить, что реализация противоопухолевой активности ¡ЛФ осуществляется в результате кооперации нескольких типов молекул цитокшов. Возможно,, одни из них действуют в качестве премирующего агента, другие - играют роль триггера.

Рекоибинактные цитокины «>Н0-о<. , 1111-1, ЙЛ-2 в отдзльнооти ие индуцировали противоопухолевой цитотоксичности ¿¡Ф. Однако, использование различных комбинаций цитокинов приводило к значительной активации .цитотоксичности по отнояени» к клеткам меланомы 3.16. аффемааность сочетаний цитокиноз в значительной степени зависела от применяемых

доз. Максимальный уровень цитогоксической активности был получен при использовании 500 ед/ил ОНО-«с. и 500 ед/ил lUi-I. Аналогичные закономерности были выязлеиы к при использовании комбинации ¡¿.'1-2 и ФНО-о^ Это слулит еще одним подтверждением теории сети и синергизма цкто-ккновой регуляции.

Разделение функций иекду полииорфноядерныии лейкоцитами и .¿Ф порождает различные способы реагирования у обоих типов клеток на различные стимуляторы, в roa числе и на цигоккны.

Обобщая полученные результаты по цитокин-залисимой предстиыуля-ции двух популяций фагоцитов - &Ф и нейтрофилов»можно выделить два вида премирования фагоцитов цитонинами: кратковременное (для нейтрофилов) и более длительное (для ь1Ф). Для проявления кратковременной предегкмуляцик достаточно инкубировать клетки с иКЦ от 30 мин до 3 часов, при этой индекс лродстиауляции находится в пределах от 0,5 до 2, т.е. эффективность этого прииирования относительно невысока. Длительная предсткыуляция на примере ¿№ имеет более выраженный эффект (индекс предстииуляции от 4 до 8) и проявляется посла более длительного времени инкубации, от 3-х часов до 40 часов (таблица 2).

Таблица 2

Два типа цитокиа-зааисиаой предстиыуляции фагоцитов

ilapaueTp | • Макрофаги J йейтрофилы

Время инкубации клеток с комплексом цктокинов.необходимое 3-48 часов 0,6-3 часа для проявления максимального эффекта предегимудяции

Максимальная степень проявления прэдетимуляции 2-5 раз 0,5-1,5 раза

Зависимость эффекта от ингибитора синтеза белка

есть нет

При сопоставлении влияния ЦГш на цитокин-опосредованнуа пред-епшуляциа кислородного метаболизма иф и нейтрофклов можно сделать вь^од.что иеханизмы иримирования гтих двух популяций фагоцитов цито-

кинами различны. В случае шф аредстимуляция цитокинаыи связана с интенсификацией синтеза белка de novo. Это длительный процесс, включающий этап регуляции генома для синтеза необходимых для функционирования клетки поверхностных и секретируеьшх белков. Что касается другого типа фагоцитов и нейтрофилов, то в этой случае,активация синтетических процессов в клетке, ло-зидиаоцу, не играет решающей роли для проявления эффекта цитокин-зависшой предстиыуляцик "кислородного взрыва" и фагоцитоза. Эти результаты могут быть полезны при разработке схем применения цитокинов в клинике.

Экспериментальное обоснование адоптивной терапии меланомы В.16, пркмирозаннкаи цктоккнаии in vitro

С учетом особенностей приаирования фагоцитоз тшуноаептидами рекоыбинантного и эндогенного происхождения в настоящей разделе работы были разработаны новые подходы локальной иммунотерапии, основанные на применении комплексов естественных цитокинов. Для этого была выбрана экспериментальная модель роста сингенной опухоли ыеланомы 2.16, Этот выбор не случаен. На сегодня соверленно очевидно, что противоопухолевый потенциал системы а!НФ исключительно велик. В связи с этим.новое направление терапии опухолей основано на активации ¿Ф опухолецидньши цитокинаии. Одним из важных подходов иммунотерапии опухоли является вкеорганизиенная активация клеток иммунной системы с последующей реинфузией их в организм опухоленосителей (Гркневич U.A., Каменец Л.Я., 1986; Билынский Б.Т. и др., 1939).

Подход, примененный Н8ыи в лечении меланоаы В.16, был основам на активации дф in vitro естественным комплексом цитокмноз - .'i-ак-тивином. Однако, без анализа функционально2 активности аЭ в динамике роста опухоли мокно получить непредсказуемые результаты, порой связанные с активацией опухолевого процесса.

В динамике рола иеланоыы 3.16 прослеживается определенная корреляция между цитотоксичеслой активностью -ti и секрециса t.v-J^-

торных молекул цктотоксичности: активных метаболитов кислорода и ФНО-гО (рис. б ).

Рис .6 Динамика роста иеланоыы В.16 (а) и изменение функциональной акгигности макрофагов у мышей С5?81/6

Ц- цитотоксический индекс

0- Ш

Щ - активность ФН0-«с

В течение 15 суток после трансплантации опухоли ¡¿Ф активированы. Гьперпродукция АФК и ФНО-об может свидетельствовать об-увеличении деструктивных потенций ИФ. После 20-х суток роста меланомы В.16 зф-фекторный потенциал М резко снижался. Это соответствовало увеличению массы опухолевого узла и спорой гибели животного. Проанализировав изменение гффекторных функций макрофагов в динамике роста меланомы В.16, мы пришли к выводу; что на 3-5-е сутки опухолевого роста ИФ характеризуются высоким цигатоксическим потенциалом, активно сек-

ротируют ФИО-об роакгогенные метаболиты кислорода. Поэтому для трансплантации в организм опухолейосителэм были использованы ;К>, полученные на 3-5-е сутки роста аеланони 3.16. . . Оказалось, что эффекта МКЦ (¿1-активина) на ¿Ф, полученные от мыией-опухоленосителей, существенный образом отличаются от его действия на МФ-рвзиденты. ШЩ деактивировал респираторный взрыв ¿55, полученных от мышей с растущей опухолью. Однако следует отметить, что эта деактивация необязательно связана с истощением функциональных возможностей клетки. Подтверждением этому являются эксперименты по влиянию ФСЦ на цитотоксическуо активность иФ и секрецию ими ФН0-о&.. МЦ в значительной степени (в 2 раза) стимулировал противоопухолевую активность ИФ опухоленосктэлей и индуцировал выработку ими ФИО-«; (таблица 3).

Таблица 3

Функциональная активность интактиых макрофагов и № прккированных МКЦ (

Имлёмеиыё~йф *"Т президенты ГИ$"на"3=й"сугяй"ояухо="

ииилс^омио и* | левого роста

"ШЩ £ТЖЦ | чалц | +ШГ

Уровень Л-хемилюиинес-цевтного ответа (индекс активации) х» ху

6 час 25,9+1,5 114+3,3 94,6+6,2 8?,4+3,0

24 час. 26,1+3,9 154,4+И,8х> 121+5,6 56,3+3,4Х>

-.¡.V 17,3+3,0х^ 524,0+62 1453+96*>

Цитотоксическая актив- г\

ность (индекс цитоток- 3,6+0,8 28,3+3,0х' 32,8+3,1 79,1+4,9х' сичности) ~ ~ ~

х) достоверность отличия между группами ДО, приаированными аКЦ (р ¿0,05)

Считывая данные литературы и отработанные нами условия пркаи-розания макрофагов ¿¡-комплексом цитокиноз, оыла осуществлена трансплантация иФ от интактных животных и аилотных-опухолвносителей в место локализации опухоли.

Трансплантация ингактных МФ, ае стимулированных МКЦ (М-активи-нои) вызывала активации роста меланомы. Животные этой группы погибали на 19-21 день после имплантации опухолевых клеток. Полученный эффект можно объяснить фидерным действием «¿Ф по отношении к клеткам опухоли, которое заключается в обеспечении опухоли ростовыми факторам (Громов С.А. и др., 1988). Подобный эффект может вызвать и неадекватная стимуляций макрофагальных клеток in vitro.

В случае трансплантации ингактных примированных m vitro (41-активином), набжодается резкое торможение роста опухоли (ТРО* 90,5%). Продолжительность жизни таких животных увеличилась вдвое и составляла 60-65 дней. Б контрольной группе мыши жили 30 суток (р<0,05).

Локальное введение в опухоль ДО, полученных от мышей-опухоле-носителей, предсгиыулированных ЛСЦ, приводит к существенному торможению ее роста и значительно превосходит по эффективности адоптивный перенос таких же клеток, непримированных комбинацией естественных цигокинов (р<0,05) /таблица 4/.

Таблица 4

Влияние адоптивного переноса макрофагов, примированных М-активином на продолжительность жизни и торможение роста опухоли у «¡шея с иеланомоЗ В.16

пп{ {»«. иг ! is сутки

1. Контроль 74б£32,2 - 28-30 4,5+0,б". 30

2. ДО интактн. 915+32, 2х' стимуляция 19-21*' 29,7+3,7*' 32

роста

3. Щ антакт. 62 + 4,1х' 90,5 60-65*' 9I,I+6,5x) 42

+М-активин -

4. ¡¿Ф опухол. 565+34,5*^ 24,2 26-30 23,1+2,33^ 30

5. d<i опухол. 124+8,5х' ¡33,3 51-53х^ 87,9+2,9х) 32 +й-активин -

х) достоверность отличия между группами с контролем (р < 0,05)

Вполне вероятно, что торможение роста опухоли происходит как за счет функции перенесенных клеток, так и за счет индукции клеток иммунной системы, способных проявлять цитотоксический аффект и получивших двухэташшй цикл активации.

В нашей системе макрофаги мышей всех опытных групп обладали ми-тотоксической активностью против клеток меланомы B.I6,

Таким образом, экстракорпоральная цитокин-зависииая ыакрофаго-терапия представляется весьма перспективным цетодои лечения опухолевого процесса. Важным направлением этого вида лечения является получение и использование природных комплексов цитокинов.

Лимфокиногерапия раневого процесса Анализ данных литературы о ведуцай роли фагоцйтарных клеток и цитокинов в процессах воспаления и регенерации открывает широкие возможности для разработки новых подходов в лечении раневого процесса. В настоящее вредя иыеягся лишь единичные работы ао использованию ре-комо'инантных цитокинов с лечебной целью (sauder d.ií. et al., 1990; Kaiton ,1990).

Основываясь на полученных данных о сишулирувдеа влиянии м-ак-тивинов на аФ и нейрофиды, нами были проведены эксперименты но влиянию цитокинов на процесс заживления ран у кроликов. Особенность настоящего исследования заключалась а том, что применялась естественная комбинация эндогенных иммунопептидов, секретируе-мых :*пК периферической крови.

Раневой процесс, яри котором воспаление тесно сопрялено с рега-нерацией, является оптимальной моделью для изучения in viro роли цитокинов в регуляции межклеточного взаимодействия лиа^оцит-^агоцит-фиоробласт.

Объективно в ранний период времени воспалительные явления затухали быстрее у кроликов, леченных и-активинои и л-актйвином. Раны а опиткых группах оыстро очиьались, раньлс; поклялась грьиулл-

ционная ткань, быстрее проходило струшобразование. Характерной чертой исхода раневого процесса у кроликов с веинфицировавшши ранами, леченными препаратами комплексов цитокинов, было отсутствие грубых коллагеновых рубцов после аамвления, в то время,как у контрольной группы раны заживали под грубым струпом. В 20^ случаев образовывались грубые рубцы.

йз данных планиметрического анализа следует, что применение комплексных препаратов цитокинов значительно сокращало срок полного заживления раны по сравнению с контрольной группой (рис.?').

ЛССЛЗЦУЗЙШ ГРУППЫ КК1ТЕРЛЯ ' зтсшвшш

10 ' 20 30 сутки

—I-н-»—г •

Супернатянт культур аутоюгичных МНК, 1 стлмуллроваяных ФГА

/

4

1

Среда 199 с антибиотик;

1ГПМЧ - '

1.1-активин

я-ективин

М-комплекс питокянов КУЛЬТТО стимуллповш-ных М.к, обработанных ГсА

О- темп зажиВления ран О- срок эажиВления ран

Гис.7 Сроки и темпы зежив.чония ран в группах.леченных нсталаксшя еитокзноб .

При лечении И- и Л-вкгивиками 80-90£ раневого дефекта сокращалось на 8-14-е сутки, в контроле лишь 40-50j». Скорость заживления ран у леченных животных токе значительно превышала таковую в контрольной группе.

Важный доказательством роли цитокинов в процессе заживления ран явились эксперименты с циклоспорином А, известный иммунодепрес-сантои, супрессирувщим выработку ряда цитокинов; WI-2, йФН, M-I ( Kay J.Е. 1987). О этой целью ьшК периферической крови свиньи после стимуляции ФГА, инкубировали в среде, содержащей-ЦсА» Затем проводили гель-фильтрацию полученного супернатанта на оефадексе 6-100.

ЦсА изменил уровень секреции растворимых белковых молекул в среду культивирования, оулрессирозал выработку Ы-I моноцитами и ШФ л!НК. 'И,что очень важно отметить, циклоспорин А отменял стимулирующий эффект фракций иымунопелгидоз на заживление ран у кроликов (рис.? ),

Для объяснения механизмов активации естественного заяивления раны под действием комбинаций цитокинов эндогенного происхождения . были проведены серии экспериментов в модельных системах in vitro. С этой целью исследовали влияние М- и Л-активкнов на клетки участницы раневого процесса: макрофаги, нейтрофилы и фибробласты.

М- и Лгактивины изменяют метаболический профиль фагоцитов: оказывают мощное примирующее действие на Рс-опосредованный фагоцитоз нейтрофилов, индуцируют генерацию мощных биооксидантов J® и нейтрофилами, играющих важную роль в бактерицидной и килларной активности фагоцитарных клеток (таблица1 ). Этим, по-видиаому, можно объяснить противовоспалительное и противомикробное дейотзие комплексов цитокинов при введении в рану.

Инкубация фибробластов кожи человека с комплексами цитоккнов приводила к повышению лролиферативной активности клеток и ¡;зпенсам синтеза коллагена ими. л-активин ингибировал синтез кол.;агена г,¡'.б-

- ЗУ -

робластаии, Зтог эффект зависел от дозы. Однако, использование фибро-бластов того не штамма, ко более поздних пассажей в качестве клеток-мишеней, уровень продукции коллагена которых оказался исходно снижен*' »••и, позволяло выявить стимулируюций эффект аКЦ иа синтез коллагена (Л0К=196,7±?,6£, р-£ 0,05).

Д-антивин активно стимулировал продукций коллагена фиброблас-тами (|10Кш264,7+16,0, р^.0,05).

Таким образом, М- и Л-аятивины, регулируя функции фагоцитов и фибробластов, способствуют активации процессов естественного заживления раны. В то же время,комплексные препараты цитокинов одновременно способствуют подавлении избыточного разрастания соединительной ткани и образованию патологического рубца. Это может быть обусловлено индукцией синтеза ПГ2 в фагоцитах под действием комплексов ци-

2

токинов (табл. I ).

Полученные данные об активации процессов заживления раны под действием И- и Л-активинов и их комбинации, а также результаты по регулирующему действию на функции фагоцитов и фибробластов 1а тиго явились предпосылками для разработки принципиально нового метода локальной иммунокоррекцки - аутолимфокиногерадии.

Сущность метода заключается в локальном применении естественной комбинации эндогенных цитокинов, секретируемых стимулированными аутологичаыми мононуклеарными клетками периферической крови.

Основные варианты метода разработаны в экспериментальной подели раневого процесса у кролика. Результаты планиметрического анализа, макроскопического и морфологического состояния ран продемонстрировали высокую эффективность метода, проявляющуюся в снятии воспалительных явлений, ускорении сроков зпн^елизации, ааальгезирующем аффекте (рис. 7 ). Это обусловлено считанным действием комбинации естественных цитокинов, секретируемых «ШК в оптимальных концентрациях и соотношениях.

На основании проведенных in vitre и in ▼!.▼<» экспериментов можно в общем виде представить механизм действия аутологичного су-пернатавта и фракций цитокинов (Ы- а Л-активинов) на заживление pas следующим образом (рис.| ).

Стадий воспаления

\)Фогоиитоз

2)Кис/юрод-ныЬ ВзрыЁ

3)Секреция

ПГ

Ь) Угнетение pi ц грации

Ставив регенерации

Пролиферация синтез нома гена и коллагеназы

ИМ ФИО-ы.

А I ПГ » /

Ф

Рис. в Действиз комплексов пятоканов на рпнавой пропесс.

к

Введенные экзогенно цитокины выполняют двойственную функцию. С одной стороны, они инициируют иммиграцию клеток крови в рану. Это подтверждается морфологическими исследованиями раневого отделяемого. На 4-й день после лечения еулериатантои и фракциями цитокк-нов количество мононуклеаров в 1,5-2 раза превышало количество гра-нулоцитов.

Локализация клеток в ране, стимуляция кислородного метаболизма МФ, вейтрофилов и фагоцитоза погибших тканей и бактерий обеспечивается ¿1ИФ, ЛИФ, ИФН-^ и ФНО-еО , присутствующими в супернатэнте. В конечном итоге происходит очищение раневой поверхности от гнолно-некротических масс и ускоренное наступление фазы регенерации. С дру-

гол стороны, цитоккны способствуют быстрому рекрутирование клеток-продуцентов медиаторов воспаления, т.е. запускает цитокиновый каскад клетками раны.

Нельзя также исклшить и непосредственное действие Ш£Ц и ЖЦ на синтез коллагена ь пролиферации фибробластов. Это способствует созреванию грануляционной ткани и завершению регенерации полным восстановлением дефекта без образования грубых рубцов. Иод действием цитокинов включаются механизмы ограничения избыточного разрастания соединительной ткани. Постепенное накоплений ИГ происходит за счет выброса их стимулированными М. Образовавшиеся ЛГ по принципу отрицательной обратной связи регулируют функциональную активность мф, ЛФ и фибробластов. Такой эффект ПГ, а также усиление выработки кол-лагенаэы под действием ИЛ-1, присутствующего в комплексных препаратах, становится преобладающим в ходе раневого процесса и,,.возможно, препятствует образованил грубых коллагеновых рубцов.

интересные результаты были получены при апробации метода ауто-лимфоккнотераяии в лечении проникающих ранений роговицы. Своеобразие процессов воспаления и регенерации роговицы обусловлено отсутствием кровеносных сосудов и недостатке макрофагоподобных клеток, ЛФ, фибробластов в ее центральных участках. При патологии различные клеточные элементы мигрируют сюда из зоны лимба.

Известны единичные работы по влиянию отдельных рекомбинантных цитошшов на процессы регенерации эпителия роговицы ( кпааата з. et аХ., 1990;. ВгаьаеН Н.К. аХ.1991).

применение комплексов эндогенных цитокинов предупреждало-грубое рубцевание роговицы в эксперименте.

¿ажным является тот факт» чго наибольший эффект комплексов цитокинов проявляется в первые две недели после нанесения раны. По-видимому, цитокшы влияют на самые ранние этапы воспалительных и регенераторных процессов. Это подтверждает эксперимент, в котором ле-

чение супернатантом культур мНК проводили спустя один месяц после нанесения раны. Изменения величины рубца при этом не отмечалось.

На основании данных о действии М- и Л-активинов на фагоцитарные клетки и фибробласты можно предположить, что действие комплексов ци-токинов проявлялось в торможении воспалительной реакции и угнетении избыточной пролиферации фибробластов возможно путем ингибирования миграции макрофагов и лейкоцитов к очагу повреждения из зоны лимба. "а исключено также, что введенные экзогенно цитокшш индуцируют выработку имиунопептидов в тканях глаза и таким образом нормализуют процессы заживления роговицы.

Опыт клинического применения аутолимфокинотарапии Положительные результаты применения метода аутолимфокинотерапии в эксперименте явились основанием для испытания метода в клинике.

ban выбор остановился на группе больных с тяжелыми воспалительными вялотекудими процессами челэстно-лицевой области: хронический ла-родонтит и остеомиелит.

Хронический пародонтиг представляет собой модель постоянно текущего инфицированного воспаления, трудно поддающегося лечении, несмотря на широкое применение средств и методов. До сих пор не вскрыты патогенетические механизмы дародонтита. Большая роль в развитии воспалительного процесса в пародонте придается иммунологическим факторам. В целом иммунологические нарушения при пародонтите характеризуются, как вторичный Т-зависимый иммунодефицит. iJ то же время,при заболеваниях пародонта отмечены изменения в фагоцитарном звене иммунитета, выражающиеся в снижении хемотаксиса нейтрофилов их фагоцитарной активности. В связи с этим является патогенетически обоснованным включение в комплекс лечебных мероприятий при пародонтите иамунокорригируадей терапии. Учитывая значительное угнетение иммунных процессов на уровне слизистой и с целью активации фагоцитов, представляется целесооор^j-ным применение метода аутолки^окинотерзпии.

Данный иэтод был апробирован в группе 54-х больных с хронический народонтитом. Клинический эффект применения супернатанта культур лШК представлен в таблице 5-е и 5-6. Он заклвчадся а быстрой святии признаков воспаления, отсутствии инфицирования, кровоточивости, в значительном сокращении сроков эаителизации (до 4-6-ти суток) после лоскутной операции, продлении сроков ремиссии до полутора лет. Аутолимфокинотералия ограничивает использование антибиотиков, т.к. сулернатант культур иШК не является чужеродным для пациента и совершенно безвреден для него в отношении переноса вирусов гепатита В и

сшд. ••■ ; .

л \

Для объяснения положительного клинического аффекта аутолимфоки-

котерашш в лечении лародонтита провели серии экспериментов по изучении и- и Л-номллексов цитокинов, выделенных из супернатантоя культур ¿.НК на фибробласты десны и нейтрофилы из крови пародонта. Л-активнн оказывал стимулирующее влияние на синтез коллагена фибробластами десны (ЮК=136,4+?,8#, р ¿0,05). Для Ы-активина было обнаружено модулирующее влияние на коллаген-синтетическую функцию фибробластов десны . в зависимости от баэального уровня продукции коллагена, так же как и для фибробластов кожи. В экспериментах со сниженным уровнем ксшлаге-. на (отсутствие аскорбиновой кислоты) в среде и-активин увеличивал его выработку фибро'бластаии. '

и- и 1-конплексы цитокинов увеличивали также показатели фагоцитарной активности нейтрофилоз, полученных из крови пародонта, у больных с хроническим пародонтитом практически до нормальных значений (цагоцитарное число =58,0+4,5) в контроле - 23,5+5,8). Положительный клккический эффект был получен при использовании метода аутолимфоки-нотерапии а комплексном лечении гр«вматического остеомиелита челюсти.

Таким образом, применение комплекса эндогенных цитокинов оказывает ьнальгезируоций эффект, снижает воспалительные явления, активирует процессы заживления.

Таблица 5-а

Клинический эффект аутолиыфокинотерапии у больных с народовтяток

(консервативное лечение)

Группы больных

Критерии

Базовой способ

1-------

1 Аутолшфошш-| терапия

1___________

Отсутствие кровоточивости

Отсутствие болей

Снятие воспаления (отрицательная проба Писарева)

Срок пребывания на больничной листе

Срок ремиссии применение антибиотиков

3-4 сут

3-4 сут 7-8 сут

9-11 сут

2-4 мес.

обязательно

I сут

1-2 сут

2-3 сут

3-4 сут

10-12 мес. ограничено

Таблица 5-6

(оперативное лечение)

Группы больных

Критерии

Исчезновение болей

Исчезновение признаков воспаления

Отпадение швов

Полная эпителнзация

Срок пребывания на больничном листе

Срок ремиссии

Базовый способ 1

^ Аутолиыфокино-терая»:я

!

1-2 сут

2-3 нед

10-14 сут 12-14 сут

9-11 сут

3-5 мес.

3-6 час

4-5 сут

3-5 сут

5-7 сут

3-5 сут

1-1,5 года

- <iO -

аетод аутолим^окинотерапии доказан при экзогенных поражениях тканей, трофических язвах, трансплантации коли, нарушении заживления раны в группах повышенного риска (люди пожилого возраста, диабетики, нарушения иммунитета и др.)* "РИ воспалительных заболеваниях слизистой полости рта (пародонтит, стоматит), кожи (дерматиты), кости (остеомиелиты) при онкологических поражениях кожи, при повреждении тканей глаза.

Таким образом, в результате проведенного исследования были получены факты, вносящие новые представления о-, механизмах иммунопеп-тидной регуляции функций макрофагов.

На оснований этих данных разработаны новые подходы локальной шмунокоррекции - аутолимфоккнотерапии, заключающейся в топическом применении естественной комбинации цитокинов, секретируемых ИНК. Можно ожидать, что дальнейшее расширение исследований открывает уникальные перспективы создания нового поколения иммунофирмакологичес-ких препаратов на основе различных композиций шмунопелтидов, что позволит проводить целенаправленную коррекцию различных патологических состояний.

-41-ВЫВОДЫ

1. Разработан способ получения биологически активных комплексов естественнкх цитокинов (М- к Л-актидиноа) из культур активированных и оноиуклеарных клеток периферической проз» человека и животных, оказывающих иммуностимулирующее действие на клетки фагоцитарной системы in vitro U in vivo.

2. С помощью методов изоэлектрофокусирования, электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии и биологического тестирования охарактеризованы комплексы естественных цитокинов.

ш-активин содержит как минимум 3 полипзптидов с молекулярной массой 10-30 кД;значениями изоэлекгряческоА точки в диапазоне 3,75-6,7 и обладает активностями интерлейкинов-1,2#фактора некроза ояухоли-et, фактора, угнетаэдего миграций макрофагов и интерферона. .

Л-активин представлен 3 компонентами с молекулярной массой 60-80 кД, значениями pi в области 4,3-4,8активностьа фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов и интерлейкина-1.

3. U-активин существенным образом изменяет цетаболическиа профиль мононуклеарных фагоцитов человека к ыьши: активирует секрецию биологически активных молекул (активных форл кислорода, интерлей-кина - фактора некроза опухоли-л-,лростагландинов Е2 и £¿00)* 'Jr¡¡8~ тает миграцию, индуцирует цитот'оксачность к клеткам меланозы В.16

и противопаразитарную активность к i.aorovani.

.4. tl-активин более эффективен по сравнению с рекоабйнантньии цитокинаии, такими, как интерлейкин-I, кнгерлейкин-2, ¿актор некроза опухоли-oi в активации кислородного иетаболизаа макрофагов, секреции интерлеИкина-I, индукции противоопухолевой цитотоксично-сти в отношении клеток меланомы В.16.

5. Ча основании экспериментальных результатов сформулирована гипотеза о двух типах цитокцн-зависииого премирования фагоцитов:

а) длительного для макрофагов, связанного с интенсификацией синтеза белка, характеризующегося необходимостью длительного контакта клеток с цигокинаыи (3-40 часов) и выраженной степенью прими-рования;

б) кратковременного или нейтро^илов-сопровокдающегося относительно невысокой степенью проявления эффекта и меньшим временем (0,5-3 часа) его развития. Циклогексемид отменял примирующий эффект цитозинов в культуре нейтрофилов. •

6. С учетом данных сбшшуномодулмрующем действии М-ективина

на функциональную активность макрофагов разработана модель адоптивной терапии меланомы B.I6. Трансплантация макрофагов перитонеаль-ного экссудата интактных милей и мышей-опухоленосителей, примиро-ванных vitro м активином, вызывала торможение роста опухоли и увеличивала продолжительность жизни мшаей вдвое.

?. йа экспериментальных моделях кожно-фасциальных ран и проникащих ранений роговицы у кроликов разработан новый метод иммуно-коррекцаи - аутолшфокикотерапия, основанный на локальном применении комплекса эндогенных цитокиноа, секретируемых аутологичными ыононуклеарныии клетками периферической крови.

Показана рзшающая роль комплексов естественных цитокинов в снятии воспалительных явлений, активации процессов естественного заживления.

8. Продемонстрирована высокая эффективность аутолимфокиноте-рапии в комплексной лечении больных с хроническими воспалительными заболеваниями челястио-лицевоЛ области (хронический пародонтит, остеомиелит), заключающаяся в ускорении сроков элителизации, снятии воспаленил, анальгезии, отсутствии аллергических ослогнений, продлении сроков ремиссии.

Список работ, опубликованных по теме диссертация

1. Выработка Актора, угнетающего миграцию макрофагов и рост кела-комы Б.16 под действием БЦК//Балл.эксп.,биологии и медицины.

- 1980. -й 9. - С.346-348 (соавт.Пыльнова Т.».., Соколова £.3., Ковальчук).

2. Костно-мозговые судрессоры ШФ-лродукции при опухолевом росте: Доклады АН СССР. - 1982. - Т.266, fe 2. - С.497-499 (соавт.Коваль-чук Л.В., Сидорович И.Г., Власов A.A., Соколова £.3.).

3. Механизмы клеточной регуляции выработки ОУи! в эксперкменте//Сизко-логический журнал. - I9S2. 4. - С.387-393 (соавт.Петров Р.В., Ковальчук Л.В., Сотникова H.S., Сэнолоза Е.З.).

4. Феномен спонтанной миграции макрофагов и лейкоцитов ин вктро//Иммунология. - 1983. -tö I. - С.44-49 (соавт. Детроа Р.З., Ковальчук Л.В., Крымкина Т.Н., Соколова Е.В.).

5. Оценка спонтанной миграции лейкоцитов ин зитро и продукции фактора, ингибирующего миграции лейкоцитов лрови человека: йетод.рекомендации. - ¡¿оскаа, 1Э83 (соавт.Петров Р.В., Ковальчук Л.З., Крымкина Т.Н., Соколова Е.Б.).

6. Экспериментальные и клинические подхода к изучение регуляции выработки фактора, угнетающего миграцию//3 кн.: Клеточные факторы регуляции иммуногенеза. - Новосибирск,Наука, 1985. - С.39-50 (со-авт.Айтматова Г.С., Ковальчук Л.З.).

7. Оценка действия некоторых шиунологически активных препаратов в системе выработки ФУМ//3 кн.: Коррекция нарушений Иммунитета в клинике и эксперименте.Труды 2 ИОЛХМ ии.Н.й.11ирогова.-1935.

- С.56-60 (соавт.- Соколова Е;В., Крымкина Т.Н., Сотникова Н.Ю.).

8. Оценка и'ммуноыодулируэдего действия-интерферона в системе кайтро-фил-лимфоцит//В кн.:Зcec.кoнф.^,^iHтepфepoн-S5',: Тез.докл.-Тоилкси, 1985. - С.108-109 (соавт.Осмоловская С.В.Гвоздева H.A.).

9. Регулирующее влияние клеток костного мозга на функцию Т-лиы^оцияов человека//Бюлл.экспер.5иол.и медицины. - 1985. 4. - с.462-453 (соавт.Власов А.А.,11огорельская Ji.U.).

10. Выделение и тестирование факторов, влияющих на позвигность иикро-фагов и лейкоцнтов//Лаб.дело. - 1986. - № 10. - С.612-614 (соьвг. Гвоздева H.A., Москвина С.Н.).

11. Изучение факторов, влияющих на подеижность и фагоцитоз неитроц-.лоз периферической крози челове;га//Ьдлл.эксиер.оиол.в медицины.-!¿36. К? 8. - 0.210-213 (соавт.Гвоздева H.A., Цховрео'оза А.о.,лов^льчук Л.В., Чередезв А.Н.).

12. Регуляторное действие пептидов иммунной системы на функциональную активность моноцитов и естественных киллеров человека ин виг-* ро/Дмыунология. - 198?. -А» 4. - С.57-61 (соавт.Ковальчук Л.В., Чекнев С.Б., Ризе Т., Соколова Е.В., Гвоздева H.A.).

13. Лиифокин с активностью фактора, мигрирующего миграцию опухолевых фибробластов//к.мыу колотая. 1987. -Я» 4. - С.62-64 (соавт.Горлица H.К., Гвоздева H.A., Стонанс И.Н., Чередеев А.Н.).

14. Кмпунолептидные стимуляторы клеток фагоцитарной системы//В сб. Итоги науки и техники ВШаГИ, иммунология. - 1988. - Т.26,

- С.103-167 (соавт.Ковальчук Л.В., Доскаина С.Н., Карасева М.В., Соколова Е.В., Линднер Д.П., Степенко О.Н.).

15. Влияние регуляторных миелопептидов человека на выработку фактора, угнетающего миграцию леикоцитов//£юлл.зкспер.биологии и медицины. -1988. -as I. - С.53-55 (соавт.Ковальчук Л.В., Осмоловская C.B., Борисова А.¡1., Глазко A.B.).

16. Активация моноцитов во время гамодиализа/Дер.архив.-1988. ->'й 6.

- С.57-60 (соавт.Степук ¡i.A., Осмоловская C.B., Ковальчук Л.В., Ярмолинский U.C.).

17. ¿егудяторные механизмы пролиферативной активности клеток иммунной «.стемы/У-Тез.трудов 9 Европейского иммунологического конгресса. - Рки, 1988. - С.241 (соавтЛередееь а.h.,Ковальчук Л.В., Навлак A.C., ¿.звекова Ё.А., Потапова A.A.).

18. Лимфокинотерапия раневого процесса в зксперименте//Бюлл.экспер. биологии и медицины. - 1989. -te 9. - С.213 (соавт.Баярт Б., Коваль

' чук Л.В.).

19. Регуляция лимфокинами фагоцитарной активности нейтрофилов больных воспалительными заболеваниями пародонта//Стоматология.~1989. te 6. - С.12 (соавт.Иванюшко Т.П., Баярт Б., Ковальчук Л.В.).

20. В-активин в системе взаимодействия лимфоцит-моноцит//В сб.научн. трудов 2 ЫОЛШ им .Н.п.Яирогова "Механизм иммунорегуляции и иммунная биотехнология". Москва, 1989. - C.I8-2I (соавт.Осмоловская C.B.).

21. Особенности оценки продукции лимфокинов, регулирующих функции клеток фагоцитарной системы при воздействии циклоспорина А//Лаб. дело. - 1989. - Ш. - 0.65-<;8 (соавт.Баярт Б., Ковальчук Л.В., Москвина С.Н., Осмоловская C.B.).

22. Лечение раневого дефекта лим ¡¡окинами//шонгольская медицина.

- 1989. —Кг 2. - С.43-46 (соавт.Баярт £., Ковальчук Я.В.).

23. Исследование кмаунокорригируящего действия лиифоккнов в системах ин вктро/Дюнгольская медицина. - 1989. чй I. - С.44-46 (соавт.

(соавт.Баярт Б., Ьванотко Т.П., Ковальчук Л.В., йсаев В.H.).

24.Роль зффекторных лимфокинов в регуляции функциональной активности фагоцитарных клеток//В кн.: Моделирование и характеристика фагоцитарных реакций. - Горький* 1989,- С.48-50 (соавт.Ковальчук Л.З., Цховребова А.З., Баярт Б., Н.А.Гвоздева).

25.Аутолиифокинотераяия - новые подхода клинического применения лии-фокинов/Д Всес.имиунол.съезд: Тез.докл. - Сочи, 1989. - С.267. (соавт.Ковальчук Л.В., Баярт £.).

26.йарушение секреторной способности моноцитов человека при ряде гематологических латологий//В сб.Тез.докл.Республиканской научн. конф. "Йиаунодефйцигы и Ш-система". - Ташкент, 1989. - 0.42 (соавт.Осмоловская C.B., Погорельская £.11.). 1

27.Дисбаланс выработки интерлейкина-I и циклооксигеназных продуктов в иммунопатогенезе болезней человека//В трудах 7 международного конгресса по иммунологии. - Зап.Берлин, I9S9. - С.645 (соавт. Ковальчук Л.В., Павлик A.C., Осмоловская C.B., Заречкеаа Н.В.).

28.Суперлимф в регуляции функциональных свойств макрофагов//В тр.международной конференции "Молекулярные аспекты иммунного ответа инфекционных заболеваний".-йталия, Рим, 1989. (соавт.Ковальчук Л.В., Апциаури Н.Э., Карасева i.В., Шуйкина Э.Е.).

29.Эндогенные лимфокины в лечении воспалительных заболеваний челюст-но-лицевой области//В тр.международного симпозиума "Проблемы им-мунофармакологии".-Тбилиси, 1990. - С.22 (соавт.Ковальчук Л.В., Карасева J.B., кванюшко Т.П.).

30.Эффект предстимуляции макрофагов - как критерий оценки активности иммунофармакологических препарагов//Там же. - С.30. (соалт.Ко-вальчук Л.В., Апциаури Н.Э., луйкина З.ь'., Никоненко В.В.).

ЗГ.кммукопептидный диагностикум в оценке функциональной активности клеток фагоцитарной системы//В тр.Всес.конф."Экологические аспекты иммунопатологических состояний". - Алма-Ата, 1990. - Î.I.

- С.З (соавт.Ковальчук Л.В.).

32.Генетические аспекты регуляции функций макрофагов цитокиивии//В тр. Всес.симп.с меяд.участием "Система мононуклеарных фагоцитов в корме и при патологии". - Новосибирск, 1990. - С.71 (соавт.Ковальчук Л.В., Апциаури Н.Э., йуйкина Э.Ь.).

33.Стимуляция секреции интерлейкина-I и фагоцитарной функции моноцитов иммунопептидами//Там же. - C.It5 (соавт.Цховребова А.З.).

34.Цитокин-зависимая регуляция продукций СНО-я;*. актлзиых -j-opa кислорода макрофагами интактных мкаей с иеланомой и.16//До;:л.Art Cóvi'.

- 1991. - "Г.318, 6. - ^.1503-1506 (соайг.лзя-.тьчук «.В., ibpí:¿!G-

нова £.ß., Карасева' ¡¿.В., Апцааури Н.Э., Соколова Е.В., Тито-вец P.E.).

35. комплекс эндогенных цитокинов в регуляции функциональной активности фагоцитов//В тр.1 Учредительного конгресса Международного общества патофизиологов, -il.,I99I. - С.176 (соавт.Ковальчук Л.В., Клебанов Г.Н., Апциаури Н.Э., Шуйкина Э.Е.).

36. Комбинация естественных цитокинов в лечении раневого процесса// В трудах И Европейского сиыиозиуиа по илцунологии. - Хельсинки,

1991. - 0.9Ö-I3 (соавт.Ковальчук Д.В., Карасева 41 .В., Ьванюшко Т.П.).

37. Priming of phygocytes by cytokines and water soluble products ef lipid peroxidation//;!. Biomedical Science.- 1991.- V. 2,(3). P.11-21 (et cl.Kovalchuk X.V..Klebonov G.I.,Ribarov Aptaiauri Zi.3., Genlcow L. ).

38. Синергизм цитокинов в нримировании резидентных макрофагов//В сб. тезисов докладов I съезда иммунологов России. - Новосибирск,

1992. - С.102 (соавт.Ковальчук Л.В., Апциаури Н.Э., Титовец P.E.).

39. Экстракорпоральная цитокин-завискыая терапия меланомы В.16

и 3KcnepMieiiT8/7?aa ке. - С.477 (соаэт.Титовец P.E., Соколова Е.В.)

40. Премирование резидентных макрофагов иымунопэптидаии//Доклады АН COiP. - 1992. - Т.323. - C.3S4-358 (соавт.Ковальчук Д.В., Титовец P.E., Апциаури Н.Э., Извекова S.A.).

41. ¡гшыуноцигокиновый статус человека. Подходы к оценке//В сб.тезисов международного скипозиума по аллергологии и клинической иммунологии. -Алма-Ата, 1992. - С.157 (соавт.Ковальчук Д.В., йавлик A.C.).

42. Лиифокинотерапия проникающих ранений роговицы//В сб.Тез.докл. I съезда иммунологов России. - Новосибирск, 1992. - С.249. (соавт.Крайнова Т.А., Балашова Д.й.).

Подписано в neiaib ff, DX, 109J-. _ ' _ __Зак. /50 Тир. -fOQ

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ .ПЕТИТ»