Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение иммуномодулирующего действия препаратов серии грамидекс

РГ6 СО ' .

ШШИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

2 2 РЕЙ 1393 ИНСТИТУТ Е"ШЮЛОГИЛ

На правах рукописи

МЛЛКИНЛ Елена Юрьевна •

НЗУЧЕНИВ К2«УНО^ОДШ!РУЩгГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ СЕЛИ ГРА1Л1ДЕКС.

14.00.36 - аллергология и хашунологня

Автореферат диссертации на соискание згченоА степени кандидата медицинских наук

Москва 1993

Работа выполнена в Институте иммунологии Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: член-корреспондент Российской АШ,

профессор Р.М.Хаитов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Р.И.Атауллаханов

доктор медицинских наук А.А.Иванов

Ведущая органзация: - Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится "¿4" ихя.рга 1993 г. в П час, на заседании специализированного совета Д 074. 09. 01 при Институте иммунологии Минздрава Российской Федерации по адресу: 115478, г. Москва, Каширское соссе, 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздрава Российской Федерации.

Автореферат разослан "Ш " 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор медицинских наук Л.С.Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работа. В настоящее время очевидна необходимость применения.препаратов, обладавших тшуноыодулиругщим действием, в самых различных областях медицины. Потребность в безопасных иымунокорректорах диктуется наличием огромного числа заболеваний, ассоциированных с врожденными и приобретенными имму-нодефщитами. Все возрастающее воздействие на организм человека факторов внеснев среды, отрицательно влияющих ни ниыугагую систему, приводит я снияеншо устойчивости к инфекции, развитию аутоиммунных, аллергических и шгояества других заболеваний, патогенез которых связан с нарупз:зипа в гаыупнсЗ системе.

Число нммуноактивных препаратов, которые к настоящему времени наэла практическое применение в медицине, невелико, их использование ограничено, так как многие из них обладают теми или иными недостаткам.

Перечисленные факторы определяют актуальность поиска и разработки эффективных нммуномодулирухцих препаратов, изучения их имыунотропности, безопасности, решения вопроса о возможности их применения для коррекции тех или иных патологий.

В последние два десятилетия еколой Р.В.Петрова открыты и активно изучаются синтетические иммуиоиодуляторы полимерной природы, которые, благодаря своей универсальной способности к многоточечному кооперативному взаимодействию с макромолекулами плазматической мембраны лиыфоцятоп, способны изменять их функциональную активность, что открывает возможность фенотипической коррекции генетически детерминированного уровня иммунного ответа (Р.В.Петров и др. 1975-1980, Р.М.Хаитов и др. 1974-1990).

Преимуществом синтетических полимеров является большой простор для введения реакционноспособных групп, возможность создания молекул с известной структурой и изучения с их помощью многих фундаментальных вопросов иммунологии, конструирование молекул, избирательно действующих только на клетки иммунной системы (В.А.Кабанов, Р.В.Петров, P.M. Хаитов 1983).

Наиболее изученными в этом отношении являются карбоцепные полиионы: полимеры на основе поливинилпирролидона, сополимеры винилпирролидона и акриловой кислоты. Однако, данные полимеры не имеют перспективы широкого использования в клинической практике из-за слабой способности к деструкции и выведению из организма. Новое направление, активно развивающееся в Институте иммунологии, связано с модификацией нетоксичных инертных полимеров биологически активными низкомолекулярными веществами. В эксперименте показана возможность значительного усиления иымуномодулирую-щего действия малоактивных полимеров ионофорами, антибксидантами и др. (Атауллаханов Р.И., Свиридов Б.Д., Пастернак Т.Б. и др. 1988-1989). К этой группе иммуномодуляторов относится и Грами-декс, представляпций собой декстран, модифицированный грамицидином S. Конъюгат декстрана с грамицидином был ранее использован в качестве носителя антигена в работе Китаевой М.Н. по изучению иммуногенности бифункциональных молекул, содержащий антигенный и регуляторный центры (1988). Результаты этих работ, где были аЯу^ казаны иммуностимулирующие свойства конъюгата грамицидин-декст-ран, открыли перспективу использования Грамидекса (ГД) в качестве иммуномодулируицего вещества.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение иммуномодулиружщей активности, иммунокорригируицих сво-

йств и кшунологической безопасности, ряда образцов Граиидекса и выбор образца с наиболее выраженным иммуностимулирующим действи-еи, не оказшзаюсзш отрицательного воздействия на иммунную систему.

В связи с ЗТ1Ш были поставлены следующие задачи:

1. Изучить адьювшггную активность различных образцов Грами-декса, разлачакцихся по содерзагот в них грашщздина. Определить оппшалыше для тгиуноадъгаантного действия дозч коньвгата и способы его введения.

2. Изучить влшшлв. Грагадзкса па гуморалышЗ, клеточный ¡гл-цуншхй отвот, а тшстэ на ©утщнонг.п- .-{ую активность мпчрофагов.

3. Исследсгать возуояюсть ,~л.:<зггизп1ян организма к Граии-даксу.

4. Оцсить палунокорригируизю свойств полимера на модели зторичного тшунодефщито, индуцированного радиационные. облучением.

5. Исследовать влияние Граиидекса на неспецифическую резистентность пгаотных к инфекции.

Научная новизна исследования;

1. Исследована иимуномодулирущая активность нового соеди-• нения Грашщекс - коньюгата декстрана с граиицидинои. Установлена его способность стимулировэть гуиоральный иммунный ответ, сенсибилизацию Т-лиифоцитов к антигенам различного происхождения и повидать функциональную активность макрофагов.

2. Установлено, что выраяешюсть шшуностимулирукцего действия Граиидекса находится в прямой зависимости от содержания в ней грамицидина Э.

3. Показана способность Граиидекса повышать неспецифическую

резистентность животных к инфекции. Это свойство полимера коррелирует с адызвантной активностью и стимулирующим действием на фагоцитарные свойства макрофагов.

4. На модели вторичного иммунодефицита, индуцированного облучением, установлено иммунокорригируидее действие Грамидекса.

Научно-практическое значение работы.

1. Полученные дашше позволили обосновать оптимальные физико-химические показатели конъюгата (концентрацию грамицидина и молекулярную массу полимера), которые определяют вырагенность адъювантного эффекта при отсутствии анафилактогеншх свойств.

2. Выявлены наиболее устойчивые характеристики иммунологической активности Грамидекса (адаовантный эффект, протективное действие, отсутствие анафилактогенности), которые могут быть использованы при контроле новых серий.

3. Полученные данные о способности препарата повышать неспецифическую резистентность ¡зтотных к иифетарш и корригировать вторичный иммунодефицит, индуцированный радаациошшм облучением, позволяют обосновать область возможного применения Грамидекса.

4. Материалы по изучению иимуномодулирукцего действия Грамидекса включены в документацию для Фармкоштета по доклиническому испытанию потенциального препарата.

5. Использованный в работе новый метод оценки фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов ln vivo может быть предложен для применения в практике для экспериментальной оценки имму-номодулирупдего действия на макрофаги фармакологических препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодых ученых Института иммунологии Минздрава СССР

в 1989 году. Предварительная экспертиза диссертации проводилась на иеялабораторной конференции в Институте иммунологии Минздрава СССР 1990 года.

Объем работа. Материалы диссертационного исследования опн-сага на 105 страницах иапинописного текста, иллюстрированы 18 pucyintsici и 15 ?8блщо1сл. В списке использовашюй литературы 179 источников, пз них 88 отечественных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и метода исследования. Экеторт-'итд проводили на иляах гибридах (CBAxC57BLg)F1 обоего поли, мосссГ: 18-20 грэцц. полученных из питомника лабораторных животных "Столоовая".

Граиидекс прс\;.';гавляет собой кодоюгат грамицидина S и декс-трана, синтезирооашгыЯ в лаборатории искусственных антигенов Института иммунологии Мшгадрава СССР (зав.лаб. д.х.н. А В.Некрасов ).

В работе было использовано 9 образцов Граыидекса с различный содерзаниеи Граиицидина S в 1г Граиидекса. Граиидекс 31 -31,7 иг/г грамицидина (ГД-31), Граиидекс 29 - 29,0 иг/г (ГД-29), Граиидекс 22 - 22,0 иг/г (ГД-22), Граиидекс 18 - 18,8 иг/г (ГД-18), Граиидекс 17 - 17,4 иг/г (ГД-17), Граиидекс 16 - 16,6 иг/г (ГД-16), Граиидекс 11 - 11,0 иг/г (ГД-11), Граиидекс 8 - 8,0 иг/г (ГД-8). Сокращения в скобках обозначают содержание грамицидина в шимграимах на грамм Граиидекса.

Молекулярная ыасса больгашства образцов составляет 25-30 КД, за исключением Граиидекса 29, молекулярная масса которого достигала 60 кД.

Иммуноиодулирутщее действие Граиидекса оценивали по его вли-

Я1шю на гуморальное, клеточное и макрофагальное звенья иммунного ответа с использованием методов, включении в Методические рекомендации по экспериментальной; (фармакологическому) изучению им-муномодулируюцего действия фармакологических средств (Москва 1984 г.).

В исследованиях по влиянию Граыидекса на гуморальный иммунный ответ оценивали количество внтителообразуицих клеток (АОК) при иммунизации мышей эр!троцитами барана (ЭБ), возможность по-ликлонального действия препарата по количеству спонтанных АОК, специфичных к ЭБ и гаптену тршштробензосульфоновой кислоте (ТНФ), уровень спонтанных и индуцированных липополисахаридом (ЛПС) иммунных комплексов. Изучали таксе влияние Граыидекса на уровень гомоцитотропных антител, ответственных за развитие реакции гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) при повторном введении морским свинкам лошадиной сыворотки.

Влияние препарата на Т-клеточное звено иммунного ответа оценивали по изменению реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана и ТНВС (в плантарном тесте), а также в реакции торможения миграции селезеночных макрофагов (РТММ) мышей, иммунизированных вакциной БЦХ.

Изменение функциональной активности макрофагов оценивали по скорости очищения кровотока от частиц туши и интенсивности поглощения частиц туш клетками перитонеального экссудата in vivo. Последшй показатель определяли при помощи метода, разработанного сотрудниками лаборатории лекарственно-диагностических форм Института иммунологии на основе существующих методов оценки фагоцитарной активности персональных макрофагов. Фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата оценивали спектрофото-

цетрически, измеряя оптическую плотность лизата клеток, полученных промыванием брпшой полости, через 10 шшут после введения туши»

Возисхность аллергизирувдего действие Грамидекса определяли по его способности индуцировать реакщш ГНТ, ГЗТ и РШЛ при повторной контакте.

Влияние Грамидекса на неспецифюескую резистентность яивот-

/

пых к инфекции оценивали, используя Salmonella uyphimurlun 415 ц Staphilococcus aureus В-243. Микробную взвесь вводили внутри-

с q

брютнно в дозе 5x10 и 1x10 , соответственно-

На модели тгиунодефвдита, 1шдуц1фованного облучением (доза

облучегаш 2 Гр) исследовали алдозантный эффект Грамидекса (по

7

количеству АОК) !фн ого . гедешш одновременно с ЭБ (2х 10 ) в различные срока пссл-v облучеь"*, о такте оценивали радиопротек-тивное и имыуноксррипфукщее действие коньюгата, введенного за 1 неделю до облучения, одновременно с облучением, через 1 или 2 недели после.

В качестве контроля во всех экспериментах использовали животных, которым вместо Грамидекса вводили забуференный физиологический раствор (ЗФР).

Каждый эксперимент повторяли 2-4 раза. Полученные результаты обрабатывали статистически общепринятыми методами. Достоверность разности средних оценивали по критерию t Стыданта и разницу считали достоверной, если уровень значимости не превышал 0.05.

Результаты собственных исследований и их обсуждение. Всю экспериментальную часть работй можно условно разделить на три этапа: во-первых, - изучение иммуномодулирукцей активное-

ти Граиидекса, исследование его влияния на различные звенья иммунного ответа; во-вторых, - выявление возможности развития ал-лергческнх реакций на введение препарата, что характеризует безопасность его применения. И, наконец, - оценка влияния препарата на неспецифическую резистентность тавотных к инфекции на модели сальмонеллезной инфекции и иммунокорригирупдих свойств на модели вторичного иммуннодефицита, индуцированного облученаец.

Исследование иммуномодулируицего действия Граиидекса на гуморальный иммунный'ответ. При исследовании влияния различных образцов Граиидекса на накопление антителообразуюдах клеток, полимеры вводили ишотным внутрибршинно одновременно с пшуниза-цией эритроцитами барана в субоппшальной дозе (5x106). Дозы полимера варьировали от 30 до 1000 ыкг на шзп> иассой 10-20 г.

Проведенные эксперименты показали, что максимальный кшуно-стимулируиций эффект, оцениваемый по количеству АОК к ЗБ, достигается при внутрибршиннои способе введения конъигата в дозе 500 икг на мышь (25 иг/кг). При этой установлено, что гащуностшули-рупцей активностью обладают образца коньюгата: ГД-31, ГД-29, ГД-18, ГД-17, причем их адьювантное действие изменялось в зависимо-ста от содержания грамицидина (си. рис.1).

Подкоишй и пероральный способы введения оказались значительно менее эффективными. 2-2.5 кратное увеличение шасунного ответа достигается при введении Граиидекса только в сравнительно высоких дозах - 5 ыг/ишь при подкоаноы и 1-5 нг/шиь при перо-ральном введении.

Для определения возможного иеханизыа действия Граиидекса оце!швали его поликлональную активность, по способности конъигата индущфовать у нстшушзированных животных накопление плазма-

' РИС. 1

влияние различных образцов граыидекса на накопление антител образующих клеток

ОПГАЗЦЫ

тических клеток, пирлОатассгсги я:гп>'тела к рззличным антигенам, в частности,к двум тест-антигенам: эритроцитам барана и гаптену ТНЭ. Установлено, что внутрибргаинное введение ГД-31 в оптимальной иммуностимулирующей дозе 500 икг вызывало на третьи сутки 4-х кратное увеличение антителопродуцентов, вырабатывающих антитела к ЭБ и ГНФ. ПоликлональныЯ эффект был достаточно кратковременный, и к 5 суткам уровень АОК не отличался рт фоновых значений. Поликлональная активация В-клеток не сопровоядалась увеличением фонового уровня циркулирующих шдшушмх комплексов (см. табл. 1). В тозе время введение Грамвдекса повышает уровень индуцированных липополисахаридои иииушшх комплексов, что, по-видимому, отражает эдъювантный эффект Грэмидекса по отношению к Т-независимому растворимому антигену.

Таблица 1

Влияние Грамидекса на уровень фоновых и индуцированных \ иммунных комплексов

* гр- Обработка животных Количество ЦИК (в условных единицах)

1 ЗФР 25.5 + 5.1 (61)

2 Грамидекс 35.5 + 5.6 (18)

3 лпс . 69.1 ± 4.9 (15)

4 ЛПС+Грамидекс 89.9 + 7.3 *(17)

В скобках указано количество животных в группе; « -различия между группами 3 и 4 достоверны при р < 0.05

Влияше Граыидекса на аллергические реакции немедленного типа, оценивали на морских свинках, иммунизированных подкожно •лошадиной сывороткой (в разведении 1:10). Было показано, что однократное внутрибргаинное введение ГД-31 в дозе 10 мг (25 мг/кг) не усиливает анафилактической реакции, вызванной разрешающей инъекцией лошадиной сыворотки. Этот факт свидетельствует о том, что Граыидекс в оптимальной дозе, стимулирующей у мышей выработку АОК к ЭБ, не увеличивает образование гомоцитотропных антител в ответ на введение белкового антигена. И только 3-кратная инъекция конъюгата (внутримышечно и дважды подкожно в той же дозе) приводила к увеличению анафилактического индекса в 2 раза, что, по-видимому, отражает адъювантную активность препарата по отношению к еще одному типу гуморального ответа.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что Гра-мидекс оказывает активирующее воздействие на гуморальный иммунный ответ к различным по своей природе антигенам.

Влияние Грамидекса на Т-клеточное звено иммунного ответа. О влиянии препарата на Т-клеточное звено иммунного ответа судили

Таблица 2

Влияние Грамидекса на интенсивность реакции ГЗТ

Дозы Грамидекса на мыль Индекс реакции (в%) ИндёКС стимуляции ГЗТ к ТНБС в % к контролю

Тест антиген

ЭБ ТНБС

ЗФР 4 мкг 20 мкг 100 ыкг 500 мкг 19.8 + 1.01 (21) 20.3 ± 1.14 (13) 20.0 ± 1.29 (24) 19.5 ± 0.97 (23) 17.5 + 0.70 (24) 22.6 + 1.73 (17) 31.2 + 3.86*(18) 31.5 ± 2.80Ч18) 32.9 + 3.61 *(17) 37.3 ± 3.93*КЗ) 138.05 145.07 145.70 165.04

Различия меяду опытной и контрольной группами достоверны:

» р < 0.05, »» р < 0.01, »»» р < 0.001

по изменению пырзтешюсти реакции ГЗТ к корпускулярному и растворимому антигена«. Кроме того, в реакции торможения миграции макрофагов оценивал» имыуномодулирующее действие Грамидекса на сенсибилизацию лимфоцитов к микобвктериалышм антигенам вакцины БЦД. Введение ГД-31 в широком диапазоне доз, одновременно с сен-снбилизируицей дозой антигена (эритроциты барана- 2x10 или ТНБС - 0.2 мл 10 мМ), не оказывало воздействия на Т-клеточную сенсибилизацию к эритроцитам барана и стимулировало развитие реакции ГЗТ к ТНБС во всех использованных дозах полимера (см. табл.2). Максимум эффекта достигается при внутрибрюшинном введении 500 мкг препарата (увеличение индекса ревкции ГЗТ на 65% по сравнению с контролем).

Для оценки влияния препарата на сенсибилизацию Т-клеток к микобактериальным антигенам и на выработку фактора, тормозящего миграцию макрофагов при повторном контакте с антигеном, мышам вводили Грамидекс 31 в дозах 20, 100 и 500 мкг внутрибрпшнно

одновременно с вакциной БЦ1 в дозе 200 ыкг. Введение препарата приводило к усиленно процесса торможения миграции макрофагов, что отражает активирующее влияние препарата на сенсибилизацию животных к микобактериальным антигенам (см. рис. 2).

Полученные данные свидетельствуют о стимулирующем воздействии Грамидекса на Т-клеточное звено иммунного ответа, что проявляется в усилении реакции гиперчувствительности замедленного типа и увеличении продукции Т-клетками, сенсибилизированными к микобактериальным антигенам, фактора тормозящего миграцию макрофагов.

рис. г

влияние грамидекса на реакцию торможения миграции макрофагов

— вцж + зфр (контроль) -+- вцж + гр амиде кс (20 mkt)

-*- вцж + грамвдекс (100 шсг) -е- вцж + грамидекс (600 икг)

Влияние Грамидекса на макрофагальное звено иммунного ответа. Изучение влияния препарата на функциональную активность макрофагов представляется очень важным, так как по данным литера-

туры 1Ш8нно фагоциты являются звеном, определяющим результат воздействия препарата на иммунную систему. Известно, что макрофаги печени а селезенки отличаются по некоторым свойствам от макрофатов перитонеального экссудата. Поэтому было проведено исследование влияния коныггата на фагоцитарную активность как макрофагов паренхиматозных органов, так и макрофагов пернгонеального экссудата .

О фагоцитарное активности макрофагов печени и селезенки судили по скорости очищения кровотока от частиц тупи при внутри-брюеинном введении Грамидекса в оптимальной иммуностимулирующей дозе (500 ыкг). Уие через 24 часа после введения конъюгата наблюдалось значительное ускорение очищения кровотока, при этом усиление фагоцитарной активности макрофагов после введения Грамидекса сохранялось до 7 суток (таблица 3).

Таблица 3

Влияние Грамидекса на фагоцитарную активность макрофагов печени и селезенки при его введении в различные сроки

Срок после введения ГД-31 (сут.) Фагоцитарный индекс М £ ш Количество животных Достоверность отличии от контроля

Контроль (ЗФР) 4.80 + 0.07 17 -

I 5.31 + 0.09, 13 р < 0.01

7 5.03 + 0.05 16 р < 0.05

14 5.00 + 0.05 16 р > 0.05

При изучении влияния иммуномодуляторов на фагоцитарные свойства макрофагов перитонеального экссудата использовали метод оценки количества фагоцитированного материала по оптической плотности лизата клеток перитонеального экссудата (КПЗ) после внут-рибрюшшного введения мышам туши. Кроме того, подсчитывали абсо-

лтную я относительную концентрацию фагоцитирующих клеток в КПЗ, что позволяет определить механизм повышения поглощения туш: за счет притока новых клеток или вследствие увеличения фагоцитарной активности отдельных фагоцитов. Исследовали два образца Грамиде-кса, различающиеся тшуноиодулирувдей активностью, по сравнению с полиакриловой кислотой (ПАК) ыоллекулярной массой 80000 Д, полимерный иммуномодулятор с высокой адьювантной активностью. Полимеры вводили в оптимальной шшуноадьювантной дозе за 24 или 96 часов до постановки теста. Через 24 часа после введения всех указанных полимеров фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов, оцениваемая по оптической плотности лизата клеток, не изменялась. Инъекции ГД-29 и ПАК за 96 часов до введения туши повышают оптическую плотность лизата КПЗ в 1.5 и 2.7 раза соответственно, что указывает на увеличение количества поглощенной фагоцитами туши (Си. табл 4).

Обнаруженное нами увеличение количества фагоцитированных

Таблица 4

Влияние ГД и ПАК на фагоцитоз туш при их введении за 96 часов до постановки эксрерииента.

Обработка животных Кол-во животных % фагоцитов в КПЗ Концентрация фагоцитов ХЮ6/1!л Оптическая плотность лизата Фагоцитарный 1шдекс лизата

ЗФР ГД-29 ГД-22 ПАК 38 32 17 33 21.39+1.02 19.79+1.10 15.30+1.85 25.21+1.69 0.15+0.02 0.17+0.01 0.11+0.01 ** 0.23+0.02 0.101+0.006 0.154+0.006 0.073+0.008 0.270+0.120 1.84+0.09 1.31+0.11 1.11+0.22 1.45+0.13

Примечание: Различия достоверны при: " р<0.05; ** р <0.01; ***р <0.001

частиц при неизменной концентрации фагоцитирующих клеток свидетельствует о той, что усиление фагоцитоза под действием ГД-29 происходит за счет повышения фагоцитарной активности КПЗ, а не за счет притока новых клеток. Этот факт нашел свое отражение в повышении фагоцитарного индекса, вычисляемого как отношение оптической плотности лизата клеток (количество фагоцитируемого материала) к концентрации фагоцитирующих клеток. Введение ГД-22 и в этот срок не оказывает влияния на активность макрофагов.

Таким образом результаты, полученные в данном разделе работы, дают основание сделать вывод о том, что Грамидекс обладает Енрокиц спектром ст!шулируэдего действия на гуморальный и клеточный иммунный ответ к различный по природе антигенам, а такие активирует фагоцитарную функцию макрофагов. Выраженность адмн вантного эффекта Грацидекса находится в прямой зависимости от содержания в ней грамицидина. Для проявления адъювнтного действия содержание граищидина должно быть выше 22 мг/г. Из исследованных образцов наибольший адъювантныи эффектом обладают образцы полимера ГД-31 и ГД-29. Оптимальная иммуностимулирующая доза при внугрнбрзстшноу введешш составляет 500 ыкг (25 иг/кг).

Изучение возможности аллергкзации организма к Грамидексу. Параллельно с изучением тгыудомодулирующей активности Гра(яадекса проводились исследования возможности сенсибилизации организма к препарату и развития аллергических реакций при повторном его введешш. Необходимость оценки аллергизирующих свойств лекарственных веществ обусловлена высокой частотой развития и тяжестью последствий аллергических реакций, возникающих при пспользовашш лекарствешшх, особенно шсоко5.юлекулярных, препаратов. • Оценку аняфилактогешшх свойств Грамидекса проводили по общепринятой

схеме. Грамидекс 31 вводили морским свинхаы в дозе, эквивалентной оптимальной иммуностимулирующей у мышей - 25 иг/кг (10 иг на морскую свинку), и в дозе 2,5 иг/кг (1 мг/морскую сванку) через день подкожно и дважды внутримышечно. Разрешающую инъекцию проводили внутрисердечно на 21 сутки в дозах, в 2, 10 и 20 раз превышающих суммарную сенсибилирующую инъекцию (30, 60 мг).

В результате проведенных. экспериментов было установлено, что Грамидекс 31 обладает выраженной анафиляктогенной активностью, приводящей к развитию развернутого анафилактического шока. Анафилактический индекс колебался от 1.64 до 3.09, в зависимости от условий постановки эксперимента. В 38Х случаев анафилактический шок заканчивался смертью животных.

Полученные результаты определили необходимость исследования

»

анафилактогенности других образцов Грамидекса для выявления образца, обладающего мммуномодулирупцим действием и ве проявляющего анафилактогенности. Было проведено исследование еще 7 образцов Грамидекса с различным содержанием грамицидина. Сенсибилизацию проводили по указанной схеме в дозах 2,5 или 25 иг/кг. Установлено, что в исследованном ряду препаратов, помимо ГД-31, ана-филактогенноь активностью (хотя и в значительно меньшей степени) обладают образцы 18 и 16. Обращает на себя внимание тот факт, что анафилактогенные свойства, также как и адьювантная активность, возрастают при увеличении содержания в образцах коньюгата грамицидина, см. рис 3.

В программу оценки аллергизируицего действия препаратов помимо изучения анафилактогенности входит изучение возможности появления в организме специфически сенсибилизированных лимфоцитов, опосредующих развитие реакций гиперчувствительности замедленного

рис. а

анафилактогенная активность различных образцов грамидекса

АНАФИЛАКТИЧЕСКИЙ ИНДЕКС *

3 -

ИНДЕКС СТИМУЛЯЦИИ КОЛИЧЕСТВА ДОК в

- в

гд-гг

ГД-18

ГД-17

I АНАФИЛАКТИЧЕСКИЙ ИНДЕКС

ГД-1в

ИНД8КС СТИМУЛЯЦИИ КОЛИЧЕСТВА АОК

ОБРАЗЦЫ

типа при повторном введении препарата. В связи с этим изучали возможность развития реакции ГЗТ при введении ГД-31. Установлено, что реакция ГЗТ при разрешающей инъекции препарата на 7 и 14 сутки проявляется только в условиях интенсивной сенсибилизации, вызванной применением полного адыгаанта Фрейнда (рис.4). Более убедительные данные о появлении в организме тавотных лимфоцитов, сенсибилизированных к полимеру,были получены с использованием реакции торможения миграции макрофагов. Было показано, что внут-рибрипинное введение 500 мкг ГД-31 за 7 дней до постановки реакции и добавление Грамидекса в культуру спленоцитов приводило к значительному (на 5-11 Ж), по сравнению с контролем, торможению нитрации макрофагов при всех использованных концентрациях препарата в культуральной среде. Исследование с помощью этого теста

«ИС. 4

реакция гзт на введение граыидекса

ДОСТОВЕРНОСТЬ РАЗЛИЧИИ ПРИ • Г < 0.06: ~ Р < 0.01

индекс РЕАКЦИИ (*)

10 1 СРОКИ РЕАКЦИИ'

I •

I - 1ТАЫНДККС 1U0 UKT, Ш - IT АМИДЕ КС 100 MKT ♦ ПА®.

п - грамидбкс 600 ukt. и - граиидбкс 600 mkt ♦ па®.

сенсибилызирувдих свойств ГД-22, не проявляющего анафилвктоген-ной активности, показало отсутствие реакции ториохения мнгрощк макрофагов, отражающей один из этапов гиперчувствительносги зп-медленного типа.

Таким образом, Сила показана способность конъюгота ГД-21 индуцировать аллергические реакции как немедленного, так и замедленного типа, при этом анафилактогениые свойства Солее выражены. Обнаружение сллергизирувщих свойств у образца ГД-31 поставило задачу выясш!ть, связана ли анафилактогвныость полимера с антигенными детерминантами, образующимися в процессе конъюгации, или эти свойства присущи составным частям полимера - грамицидину и декстрану. С этой целью были проведены дополнительные эксперименты, где морским свинкам вводили по вышеуказанной схеме диаль-

дегид декстрана (ДАД) или грамицидин в дозах, эквивалентных их содержанию в 1 цг Граиидекса. После разрешающей инъекции указанных соединений в дозах, в 10 раз превышающих суммарную сенсибилизирующую, признаков анафилактического шока у животных не наблюдалось .

Таким образом, аллергизирующее действие Граиидекса не связано непосредственно с антигенными детерминантами грамицидина, а . определяется, по-видимому, структурами, образугщимися в результате конъюгации. Пространственная конфигурация таких структур зависит как от концентрации грамицидина, так и от молекулярной массы полимера. Кроив того, известно, что молекулярная масса типичных аллергенов колеблется от 20 до 40 кД (Conrad Н, 1981). Этим, вероятно, объясняются результаты экспериментов по определению апафилактогенности, показавшие отсутствие ансфилактогеншх свойств у Грамидекса 29, молекулярная масса которого значительно выше - 60 кД.

Полученные данные позволяют обосновать оптимальные показа- . тели синтеза эффективного образца Грамидекса, проявляющего высокую адьювантную активность при отсутствии анафилактогенности (высокое содержание грамицидина п увеличение молекулярной массы полимера).

Исследовашге влияния Грамидекса на неспецифическую резистентность животных к инфекции. Следующий зтапси работы было изучение влияния Грамидекса на неспецифичекую резистентность животных к инфекции, которое отражает его иммуноиодулирусщив свойства, характеризует возможность и безопасность его использования при инфекционной патологии. В качестве основной модели инфекционного процесса была использована модель сальмонеллезной инфек-

ции у мышей.

На первой этапе ми исследовали исход инфекционного заболевания, вызванного инъекцией Salmonella typhinairluni, в зависимости от интервала времени менду введением препарата в моментом заражения животных.

ГД-29 и ПАК (иммуностимулятор, иг содержащий в своем составе антибиотика), вводили внутрибршинно в оптимальных иммуностимулирующих дозах (500 и 200 мкг соответственно) за 7, 4 и 1 сутки до заражения, одновременно с заражением в через 1 или 2 суток после введения микробной взвеси. Установлено, что оба ющуноцо-дулятора оказывают протективное действие при инъекции ох за 4 суток до заражения и обеспечивают увеличение числа вшпгеаах газетных на 80«. п сравнению с контролем. В остальные сроки зенитный эффект был весьма слабым (снижение гибели животных не более, чей из 15-20%). Вцутрибрк^шное введение животным за 4-1 сутки и одковреиогаю с заработаем малоактивного адавввнта ГД-22 оказывало менее выраженное влияние на резистентность животных, по сравнению с ГД-31 и ГД-29. Максимальный защитный эффект его составлял всего 25-40% при введении за 3-4 суток до заражения. Важно отметить, что в наши исследованиях протективная сущность иммуномодуляторов полностью совпадала с их стимулгф действием на фагоцитоз туше ln vivo, оцениваемым по опте; ;асксГ; плотности лизата клеток перитонеального экссудата. Простота постановки, стабильность полученных результатов, отсутствие инфицирующих агентов делает перспективным использование данной методики душ прогиозкрсьпня условия постановки экспериментов по определению антиинфекционной активности препаратов.

Исследование выраженности протективного эффекта Грамидекса 31 от дозы показало, что защитное, так же как и адьювантное дей-

ствие препарата гагеет дозовул зависимость (рггс.5). При этси повышение числа вызквшх гивотных на 655! отмечалось уте при введе-гепх Григадекса в дозе, в 10 раз «еньпей оптимальной ишуноспшу-Лфуг^еП (50 шсг/шпь) п достигало 9555 при дозе 500 шаг.

влияние различных доз грамидекса на выживаемость мышей ' °

—-— ПРОТЕКПШНЫЯ ОЭФШСТ —4— АДЬЮВАНТНЬГЙ ЭФФЕКТ

Задачей слодугг;еЯ ccp:ni экспер:2!ептов Сило сравнение влияния образцов Грпиздекса с различным содерзанмен граипцздша на рогистептяссть к ппфгхщя при подмгакуч и перорзльпсч' вве-л01пп1, tojt nn:t этя путл еесдонпл япдпэтсп 60л2э удобпши1 ii безо-ппсгатп дзя прпзпапая в алгшякз. Получопшо результаты свпдото-.г-.стгзуэт о тс'что прп этах спсссОо:: вводэтая в различию сроки до зорстгвтая Грггпдежс по окзсстал характерного для впутркбрэ--~"лиоЯ х'ньсюли пирагенкого пляяния на устсЯчзтость г.огзеЯ к за-ретегопо Salmonella typhimuruai. Згпт.шогЗ сффект составлял 20-30~

при оральной пути введения препарата за 7-4 суток до заражения.

Наличие в составе Грамидекса антибиотика сразу ставит вопрос о том, что протективное действие препарата может быть следствием антибактериального действия грамицидина. Кроме того, было интересно сравнить влияние кокьюгата на неспецифическую резистентность с протективным действием носителя - декстрана, который, как известно, так же может повышать резистентность животных к инфекции как в результате иммуномодулирующего действия, так и вследствие дезинтоксикационных свойств. Для сравнения защитного действия Грамидекса, грамицидина, декстран и диальдегид декстрана (ДДЦ - ароматмодифицированный декстран для проведения конъюгации с грамицидином). Данные соединения вводили вкутрибрюотшо за 96 часов до заражения. Грамидекс использовали в дозе 500 мкг, а остальные препараты в дозе, эквивалентной их содержанию в 500 мкг коньюгата. Защитное действие Грамидекса значительно (на 60S) превосходило эффект от введения остальных веществ.

Большая выраженность протективного действия Грамидекса э. представленной ряду соединений свидетельствует, по-видимецу, о том, что для реализации процессов, обеспечивающих розистентност! животных к iu-фекции, имеет значение не отдельный кошонент данного иммуномодулятора (антибиотик или декстран), а структуры, образующиеся в результате их конъюгации.

Спосооность коньюгата повисать неспецифическую резистентность животных к инфекции была подтверждена и на модели с использованием StaphllococouB aureus. Внутрибрюшинное ведение Грамидекса в дозе 500 мкг повышало количество выживших животных на 66%, по сравнению с контролен.

Результаты исследования протективных свойг" Грамидекса с

помощыо инфекционной модели позволили сделать вывод о той, что

полимер обладает способностью усиливать неспецифическую резисте-

/

нтность животных к инфекщш.

Оценка шмунокорригирукзих свойств полимера на модели вто- _ ричного иммунодефицита, индуцированного радиационным облучением. Доклиническое исследование различных иггыуномодулируюсцих средств, определяющее перспективу их использования, включает в себя исследования на патологических моделях, что позволяет оценить активность и безопасность применения препарата в условиях икмуяосуп-рессии, а также определить возможность его использования для профилактики и коррекции различных нарушений иммухшой снсте;.-ы. В своей работе ш использовали модель вторичного юыунодефнцнта, индуцированного облучением.

В первой серии экспериментов мы исследовали адьювантное действие препарата на юшушдй! ответ облученных животных при его введении одновременно с антигенси в различные сроки восстановительного периода. Для этого цыпам (CBAxC57BLg)F1 через 1,2,3 или 4 недели после облучения в дозе 2 Гр вводили Граиидекс 29 в

дозе 500 ыкг или ЗЗР (контроль). Одновременно животных иммушзи-

7

ровали эритроцитами барана в дозе 2x10 . Через 4 дня определяли количество АОК в селезенке. Для оценки степени супрессии, вызванной облучением, ответ облученных цыпей сравнивали с ответом необлучегагых иммунизированных животных.

Из данных, представленных на рисунке б, видно, что введешсе Грамидекса 29 одновременно с антигеном увеличивает количество антителообразугсци клеток в 2 раза, независимо от степеш! супрессии. Важно отиетить, что в условиях иммунодефицита • индуцированного облучением, Грамидекс сохраняет свои адъювантные свойства у

влияние граыидекса на количество а01с в различные сроки после облучения

100

во

во

40

20

КОЛИЧЕСТВО А01С В X ОТ КОНТРОЛЯ

¡Ш 1 недоля

Ptl

-'ЗД

м

■ I tf ¿iL

2 недели 3 нкдвля 4 ивдвли

сроки после облучения уюнкнъ *ок у ШЗ оалучкш® ♦ э®р СИ о ал ученик + гд-гв

иковлучкнных животных

облученных животных. Индекс стимуляции иммунного ответе у облученных животных был равен таковому у необлученных мышей, иммунизированных эритроцитами барана в той же дозе. Во второй серки экспериментов изучено радиопротектиэное у иммунокорр^гар.'-кцев действие Гра. деке а. Введение Грамздекса облученным в дозе 2 Гр животным одновременно с облучением практически не влияло на уровень АОК, а при укллчцш препарата через 1, 2 недели после облучения гуморальный иммунный ответ увеличивался в 2-2,5 раза.

Таким образом, исследования иммуномодулирунцей активности Граиидекса в условиях вторичного иммунодефицита, индуцированного облучением, показали, что он способен проявлять адьювантную активность не только у здоровых ж ютных, но и в условиях иммуно-

о

?ИС. 7

влияние граыидекса на количество аок у облученных животных 120 100 60 ео

40 20

0 ли

СРС1СИ ВВЕДЕНИЯ ПО ОТНОШЕШ!Ю К ИСИЕ1ГГУ 0ВЛУЧЕШ1Я

УРОВЕНЬ АОК У GS3 ОВЛУЧИСШ + ЭФР СИЗ 0ВЛУЧЕ1ПВ + гд-гв

НЕОБЛУЧЕННЫХ

животных

cynpeccmi. При использованной схеме введения Граыидекс не проявляет выразеншх радиопротективных свойств. Пшунокорригарущее действие Грашщекса не зависит от степени шлсуносупрессии.

Проведенные исследования тсцуноиодулзфукщих свойств Граш-декса показали, что данный полиыер обладает широкий спектром им-ыуноыодулирукцего действия я оказывает активирукцее влияние на гуморальное клеточное и иакрофагальное звено иммунного ответа, причеи выраженность стиыулзфукцего эффекта зависит от содеряания грамицидина в препарате. Показана способность Грашадекса повисать неспецифическую резистентность животных к инфекции, которая связана с активирукзии воздействием полимера на макрофаги, а такте установлено гашунокорригирукцее действие препарата в условиях вторичного иммунодефицита, индуцированного облучением.

Проведенные эксперименты с использованием различных образцов Грамидекса показали, что многие свойства препарата сцеплены между собой. Например, показано, что образцы, оказывающие выраженное активирующее воздействие на гуморальный иммунный ответ, стимулируют функциональную активность макрофагов и способны повышать неспецифическую резистентность животных к инфекции. Образцы, не стимулирующие накопление антителообразующих клеток, не проявляют активирующего воздействия на фагоцитирующие клатка п не влияют на антиикфекционкуда резистентность. Также показано, что образцы Грамидекса, обладающие анафилактогенными свойствами, способна ьызыветь реакции гмперчувствнтельностн немедленного п замедленного типа. Прл этом большая выраженность анафилактически реакций, по сравнению с реакциями гиперчувствительности замедленного типе, позволяет ограничить контроль аллергенных свойств Грамидекса проверкой его ана^илактогенности. Результаты проведенной работы позволяют определить тот минимум поквзателеЕ, оценка которых необходима для предварительной характеристики кы-муномодулирующих свойств'и иммунологической беэопзс юста нови?, серий Грамидекса. Можно выдели!ь три основных показателя -влияние препарата на накопление антителообразующих клеток, возможность Елларгнзируяцего действия и влияние на неспецифическую резистентпост ^.г.1 к сальыонеллезной инфекции. Опыт работы с Грамидексом :: другими иимуномодуляторами, исследовавшимися в нашей лаборатории, позволяет говорить о том, что такая схема предварительной оценки оптимальна не только для новых образцов Грамидекса, но и при исследовании других иммуномодуляторов разнообразной природы.

Таким образом, результаты данной работы подтверждают перс-

пективность направления создания синтетических иммуномодуляторов путей модификации малоактивных полимеров с низкомолекулярными биологически активными веществами.

ВЫВОДЫ

1. Доказана способность препарата Грамидекс, представляющего собой декстран, модифицированный грамицидином Б, стимулировать гу- • моральный иммунный ответ к различным антигенам. Адьювантное действие Грамидекса связано с его способностью активировать В-клетки и влиять на функциональную активность макрофагов.

2. Грамидекс оказывает влияние -на- Т-клеточное звено иммунного ответа и усиливает сенсибилизацию лимфоцитов к антигенам различного происхождения.

3. На двух моделях экспериментальной инфекции показан протектив-ный эффект Грамидекса, выраженность которого коррелирует с адью-вантными свойствами различных образцов препарата и их стимулирующим воздействием на фагоцитарную активность макрофагов.

4. Иыыуномодулирувдее действие Грамидекса находится в прямой зависимости от содержания грамицидина Б в препарате. Широкое сравнительное изучение различных образцов Грамидекса позволило выбрать образец, обладающий выраженной иммуномодулирующей активностью и не проявляющий анафилактогенных свойств.

5. Грамидекс способен ускорять восстановлеййе гуморального иммунного ответа у облученных животных на различных стадиях восстановительного периода.

6. Проведенные исследования позволили выделить основные иммунологические показатели, оценка которых необходима для характеристики новых серий Грамидекса, и которые могут быть использованы при составлении фармакопейной статьи по данному препарату.

Основкые результаты дасертаций изложены в трех научных работах: ;

1) Malkina T.Yu., Karavaeva o'.'V., Zhlgadlo E.A., Larln A.S., Gorbacheva L.D., Masternak T.B. Study oí lmnunoetlmulating and protective Gramidex eííec'te. - Constituent Congrees International Society for Pathophyaiology. Abstracta. Uoscow 1991, p.Î77.

2) Е.Ю.Малкина, T.Б.Мастернак, А.С.Ларин, Е.А.Жигадло. №шу-ноадъсвантные и протективные свойства Грамидекса и его активирующее влияние на макрофаги. Иммунология, 1991, N 3, с. 55-56

3) Малкина Б.Ю., Жигадло Е.А., Мастернак Т.Б.,Горбачева Л.Д.,. Ларин А.С. Активация макрофагов иммуноиодуляторами. Тезисы докладов. 1 съезд иммунологов России. Новосибирск. 1992 г. с.288-289. - .

4) Принята в печать: Чижевская М.А., Мастернак Т.Б., Ларин А.С., Малкина Е.Ю., Иванова А.С., Манько В.М. Адьювантная активность препарата Грамидекс и их влияние на пролеферативные свойства мышиных спленоцитов. Иммунология 1992, N 3, с

УЧАСТОК МН О Ш И Т ЕЛЬ НОЙ ТЕХНИКИ 0HU Р AVH ПОПП. К ПЕЧАТИ*?./^ .W ТИРАЖ /Л>«Э.