Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Витаминно-ферментная иммуномодуляция при остром холодовом стрессе

АВАКЯН Армен Роландович

ВИТАМИННО-ФЕРМЕНТНАЯ ИММУНОМОДУЛЯЦИЯ ПРИ ОСТРОМ ХОЛОДОВОМ СТРЕССЕ

14.00.36 —аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Курск - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Прокопенко Леонид Георгиевич доктор медицинских наук. профессор Лазарев Алексей Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Чалый Григорий Андреевич

доктор медицинских наук,

профессор Сергеев Александр Васильевич

доктор медицинских наук,

профессор Афанасьев Юрий Иванович

Ведущее учреждение:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «—3 » 2005 г. в « / / » часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» по адресу: 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации».

Автореферат р а з«

Ученый секретарь диссертационного совета

/Я»

5 г .

Калуцкий П.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Общее и локальное охлаждение в настоящее время является довольно распространенным фактором воздействия окружающей среды на организм человека, что связано с активным освоением природных богатств Крайнего Севера, возникновением природных и техногенных чрезвычайных ситуаций. Локальное охлаждение все шире применяется в медицине при лечении различных заболеваний, а также как средство анестезии при выполнении оперативных вмешательств на кожных покровах и непроникающих травматических повреждениях (Турсунов Б.С, 1996; Мызенская М.Е. и др., 1996, 1997). Это обусловливает постоянный интерес исследователей к проблеме патогенеза Холодовых повреждений организма и поиска лекарственных средств, корригирующих основные звенья патогенеза холодовых травм.

Острый холодовой стресс индуцирует адренергическую реакцию, составными звеньями которой являются последовательно возникающие катехолами-новая экспансия, усиление липолиза, гиперлипидемия, разобщение окислительного фосфорилирования, активация перекисного окисления липидов, дефицит в клетках АТФ (Хочачка СП., Сомёро Дж., 1988, Иванов К.П., 1996).

Иммуносупрессия, возникающая при остром холодовом стрессе, характеризуется выраженными изменениями функциональной активности регуля-торных и эффекторных клеток иммунной системы, значительным угнетением фагоцитарной активности клеток периферической крови, макрофагов селезёнки и печени, снижением количества Т- и В-лимфоцитов в периферической крови, нарушением секреции интерферонов и интерлейкинов, разнонаправленным изменением концентрации и синтеза иммуноглобулинов различных классов (Shu E., 1993; Bhatnagar E., 1996; Kizaki E., 1995, 1996).

Одним из узловых звеньев развития иммуносупрессии при охлаждении являются эритроциты (Прокопенко Л.Г. и др., 1995; Афанасьев В.А., 1999). Охлаждение снижает энергетический и антиоксидантный потенциал эритроцитов, изменяет состав фосфолипидного матрикса и нарушает архитектонику эпито-пов их мембраны, индуцирует появление у лёгких эритроцитов свойства инду-

пировать выделение иммуносупрессирующих цитокинов прилипающими к стеклу клетками селезёнки {Прокопенко Л.Г.; 2001; Быстрова Н.А., 2003). Есть основания ожидать, что коррекция иммунометаболического состояния лёгких • эритроцитов путём нормализации энергетического и антиоксидантного статуса этих клеток и модификации гликопептидных структур наружной поверхности их мембраны окажется эффективным способом иммуномодуляции при остром холодовом стрессе. К числу фармакологических средств, обладающих указанными свойствами, относятся препараты витаминов А и Е (антиоксиданты), витамин К (энергизатор), протеолитические и гликолитические ферменты (модификаторы гликопротеидных структур). Можно предположить также, что эффекты, вызываемые этими препаратами, будут в определённой степени обусловлены их взаимодействием на уровне мембраны эритроцитов.

Цель исследования - изучение роли витаминно-ферментных взаимодействий с эритроцитами в регуляции иммунологических функций при остром хо-лодовом стрессе.

Задачи работы.

1. Изучение иммуномодулирующего действия препаратов жирорастворимых витаминов при общем воздушном и иммерсионном охлаждении.

2. Выяснение роли эритроцитов и их стромы в реализации имму-номодулирующего действия жирорастворимых витаминов.

3. Изучение иммуномодулирующего действия лизоцима при общем охлаждении организма.

4. Изучение влияния лизоцима на иммуномодулирующие эффекты, вызываемые жирорастворимыми витаминами при общем охлаждении.

5. Выяснение роли эритроцитов в реализации влияния лизоцима на им-муномодулирующую активность жирорастворимых витаминов при общем охлаждении.

6. Изучение влияния витаминов А и Е, лизоцима и протеолитических ферментов на иммупосупрессирующее и иммуностимулирующее действие локального охлаждения.

7. Изучение роли цитокинов клеток селезёнки и регионарных лимфатических узлов в реализации иммуносупрессирующего действия локального охлаждения и иммуномодулирующих эффектов, вызываемых жирорастворимыми витаминами, лизоцимом и протеолитическими ферментами.

Научная новизна. Установлена неодинаковая иммуномодулирующая эффективность сочетанного применения препаратов витаминов А, Е и К. При холодовом стрессе выраженное усиление иммунного ответа и повышение функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови вызывает совместное введение ретинола ацетата и токоферола ацетата или ретинола ацетата и филлохинона. Показана возможность усиления иммуномо-дулирующей активности жирорастворимых витаминов с помощью лизоцима. Выявлена роль эритроцитов как звена интеграции витаминно-ферментных взаимодействий, модулирующих иммунологические функции. Установлена роль цитокинов клеток периферических лимфатических узлов в реализации иммуносупрессирующего действия низкой температуры и иммуномодулирую-щего действия жирорастворимых витаминов, лизоцима и протеолитических ферментов. Обнаружен феномен криоферментной иммуностимуляции, индуцируемый сочетанным применением поверхностного локального охлаждения и введением в зону последнего лизоцима.

Практическая значимость. Экспериментально обоснована целесообразность дальнейшего изучения роли взаимодействия жирорастворимых витаминов, протео- и гликолитических ферментов в регуляции иммунологических функций при стрессе и в условиях патологии. Экспериментально обоснована перспективность изучения сочетанного применения жирорастворимых витаминов и лизоцима для коррекции иммунологических функций при различных формах стресса и патологии. Показаны необходимость всестороннего изучения механизма и возможностей практического применения феномена криофер-ментной иммуностимуляции.

Результаты диссертации включены в монографии «Иммунометаболиче-ские аспекты холодового стресса» (Курск, 1999), «Метаболическая иммуномо-

дуляция» (Курск, 2000). Материалы работы вошли в учебные рабочие программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях ряда кафедр Самарского, Северного, Ивановского, Воронежского, Курского, Российского государственных медицинских университетов и академий.

Способ стимуляции иммунного ответа, созданный в процессе работы, используется на Курской биофабрике фирмы «БИОК».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Жирорастворимые витамины - модуляторы иммунологических функций при остром холодовом стрессе.

2. Лизоцим - иммуномодулятор и корректор иммуномодулирующей активности жирорастворимых витаминов при остром холодовом стрессе.

3. Эритроциты - звено сопряжения иммуномОдулирующего действия жирорастворимых витаминов и лизоцима при остром холодовом стрессе.

4. Феномен криоферментной иммуностимуляции.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях Курского государственного медицинского университета и Центрально-Черноземного центра РАМН (1997-2004), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001), IV конгрессе Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ) (Москва, 2001), V и IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 2002), совместном заседании кафедр " биологической химии, микробиологии, спортивной медицины и реабилитации, клинической иммунологии, кожных и венерических болезней, патологической физиологии Курского государственного медицинского университета (2004).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 26 печатных работах, в том числе в 2 монографиях. Работы содержат полный объем информации, касающийся темы диссертации.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста, иллюстрирована 47 таблицами и 31 рисунками. Состоит из введения, обзора литератур (2 главы), описания материалов и методов

исследования, изложения собственных результатов (7 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 318 источников, в том числе 199 отечественных и 119 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования Объект исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 120-180 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8-10 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полненные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал ±10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток с 8 до 12 ч. с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986). Животных выводили из опыта декапитацией под эфирным наркозом.

Исследованию подвергали плазму, сыворотку крови, эритроциты, поли-нуклеарные лейкоциты периферической крови, ткань селезенки и подколенных лимфатических узлов.

Моделирование состояний, характеризующихся нарушением энергетического гомеостаза и иммуносупрессией. Общее охлаждение вызывали путем содержания крыс в индивидуальных плексигласовых камерах на воздухе при температуре минус 2 ± 0,2°С в течение 4 часов или в воде при температуре 10 ± 2°С в течение 60 минут. Режимы охлаждения выбирали с таким расчетом, чтобы после охлаждения ректальная температура снижалась на 1,5-2 С. Локальное охлаждение моделировали с помощью аппарата «Иней-3», работающего на жидком азоте. Диаметр контакта с поверхностью кожи - 0,5 см", температура в зоне контакта минус 120°С. Интенсивную физическую нагрузку модели-

ровали путем непрерывного плавания крыс с грузом 3,5-4% от массы тела в течение 4 часов (Ласкова ИЛ., 1995).

Испольювание фармакологических препаратов. Исследовали влияние на иммунологические и биохимические функции жирорастворимых витаминов и ферментов: ретинола ацетата, масляный раствор (АО «Ай-Си-Эн Октябрь», Россия), токоферола ацетата, масляный раствор (Ай-Си-Эн «Октябрь», Россия), филлохинона, раствор («Serva», Германия), менадиона бисульфит натрия, раствор (Seth Pharmaceuticals PVT. LTD, Индия), лидаза, лиофилизат (ФГУП НПО «Вирион», Россия), папаин, лиофилизат («Merk», Германия), террилитин, лио-филиш (Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов ФГУП, Россия), лизоцим, лиофилизат (Брынцалов-А ЗАО, Россия).

Способ введения препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в пособии по фармакотерапии М.Д. Машковского «Лекарственные средства» и аннотациях к использованию препаратов. Выбор разовых доз основывался на экспериментальных данных, приведенных в литературе, о влиянии препаратов на состояние мембран клеток, в первую очередь, эритроцитов (таблица I).

Таблица 1

Применение препаратов

Схема введения

llpciiapai ( liotoó IIIHVICIIIIH Patón»« до ta, ml /ь'1 К0Л11'1сс1в0 инъекции (введений) Интервал между инъекциями (введении ми), ч.

Ретинола aneiai внмрпмышечпо 15.30 5 12

подкожно 3 5 12

Токоферола auciai HIIVipilMl.IIIICMIIO 25. 50 5 12

подкожно 5 5 12

Фиъюхнпоп mivipiiMumcMiio 2 5 12

Мснадпон BIIV фПЧЫШСЧПО 1 5 12

Лишним ВИУфНМЫШСЧПО 1.5 5 12

подкожно 1 5 12

1 iaiiann почкожно 20 llP/Ki 5 12

Itppit.iiiiit^jl подкожно 201117кг 5 12

Лнд.па подкожно 2 УЕ/кг 5 12

Примечание: при одновременном парном введении препаратов использовались дозы, равные половине некотрые применялись беpз сочетанного введения

Приготовление антигена. Схемы иммунизации. Оценка интенсивности развития иммунного ответа и функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови. В качестве антигенов в опытах использовались эритроциты барана, которые вводили внутрибрюшинно однократно из расчета 2x109 клеток на 1 кг массы тела. Выраженность гуморального иммунного ответа оценивали на пятые сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа антителообразующих клеток (Мальберг К., Зигль Э, 1987) и розеткообразующих клеток (Зауэр X., 1987). Гиперчувствительность замедленного типа у крыс индуцировали внутрибрюшинным введением 109 ЭБ в 0,5 мл 0,15 М раствора натрия хлорида (сенсибилизирующая доза). Через 4 суток в подушечку стопы правой лапки вводили 106 ЭБ в 0,1 мл физраствора (разрешающая доза). Спустя 24 ч. выделяли регионарный (по месту введения ЭБ) и контрлатеральный подколенный лимфоузлы (Федосеева В.Н. и др , 1993) О выраженности ГЗТ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов и по разнице количества в них кариоцитов

Полинуклеары выделяли из крови в растворе трилона Б, разведенного культуральной средой 199 с помощью фиколл-верографина (d=l,077) (Федосеева Т.В. и др., 1993). Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по фагоцитарному индексу и фагоцитарному числу (Медведев А Н., Чаленко В.В., 1991). Кислородзависимую активность нейтрофилов оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия. Параллельно со спонтанным ставили стимулированный тест, при этом в качестве стимулятора использовали зимозан (Хаитов P.M. и др., 1995).

Выделение, фракционирование и обработка эритроцитов и стромы эритроцитов. Донорами крови служили животные опытных и контрольных групп. Кровь получали из яремной вены под эфирным наркозом через 24 ч после последнего воздействия или введения исследуемых препаратов

Эритроциты выделяли двукратным отстаиванием в 10 мл Na-фосфагного буфера, содержащего 3% декстрана Т-500 и последующей очисткой с помощью HBS-целлюлозы в Na-фосфатном буфере и фракционировали в градиенте плот-

ности яичного альбумина (Кобозев Т.В. и др., 1978). Получали 2 фракции эритроцитов: легкую ^ < 1,079 г/см1) и тяжелую ^ > 1,117 г/см').

Эритроциты опытных крыс экстракорпорально обрабатывали сывороткой аллогенных экспериментальных животных. В качестве контроля использовали сыворотку здоровых животных. Обработку проводили способом, разработанным Л.Г. Прокопенко и Ю.О. Яхонтовым (1976).

Строму эритроцитов получали методом гипоосмотического гемолиза. Менадион включали в строму эритроцитов по методу, разработанному для антибиотиков (Генинг Т.П., 1988) в модификации Ж.Ш. Жумадилова и Р.В. Ма-каренковой (1990). Для некоторых опытов получали иммобилизированные с помощью стромы эритроцитов менадион и лизоцим (Конопля Н.А., 2001).

Иммуномодулирующие свойства интактных, обработанных сывороткой или препаратами эритроцитов и их фракций, определяли путем трехкратного (с интервалом 24 ч.) внутрибрюшинного введения (по 108 клеток на 1 кг массы) интактным или опытным аллогенным реципиентам. Иммунизацию животных ЭБ проводили в последний день введения эритроцитов. Иммуномодулирующие свойства препаратов, включенных в строму эритроцитов или соиммобилизо-ванных с помощью стромы эритроцитов, устанавливали при внутрибрюшин-ном, пятикратным, с интервалом 24 часа, введении (^ частиц на 1 кг массы тела) интактным или охлажденным животным. Одновременно с последней инъекцией животных иммунизировали ЭБ. Контролем служили крысы, получавшие строму эритроцитов, не содержащую препараты.

Получение и фракционирование спленоцитов клеток периферических лимфатических узлов, получение супернатантов, разделение и очистка белков клеток селсзенки и лимфатических узлов. Клетки селезенки и периферических лимфатических узлов фракционировали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (Дерфлинг П., Вихнер 3., 1987). Прилипаю-шие к стеклу клетки дополнительно фракционировали при температурном градиенте (Родионов С.В. и др., 1985). Определение количества клеток и их жизнеспособности проводили с помощью теста поглощения трипанового синего.

Приготовленная таким образом суспензия клеток селезенки содержала 85-90% жизнеспособных клеток.

Прилипающие и неприлипающие клетки селезенки и периферических лимфатических узлов культивировали в среде 199 (5 х 10' клеток на 3 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и стрептомицин), в течение 3-6 ч. в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% углекислого газа) и готовили пул супернатантов спленоцитов или клеток лимфатических узлов, фракций прилипающих или не прилипающих клеток к стеклу, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных. Концентрацию белка в супернатантах определяли с использованием красителя Кумаси G-250 по Bredford (Шишкин С.С., 1982).

Пул супернатантов диализировали против трис-НС!-буфера (рН=8,0), приготовленного на 0,15 М растворе натрия хлорида. После диализа суперна-тант клеток концентрировали с помощью полиэтиленгликоля с молекулярной массой 40 кД и повторно диализовали против трис-НС 1 -буфера.

Очищенный и сконцентрированный супернатант спленоцитов интактных и опытных крыс фракционировали на сефадексе G-150. Для оценки ММ белков фракции, полученных при гель-хроматографии, определяли объем выхода белков с известной ММ - кристаллического бычьего альбумина (мономер, ММ 6 7 кД и димер - ММ 134 кД), кристаллического овальбумина (ММ 45 кД), ингибитора трипсина (ММ 21,5 кД), РНК-азы (ММ 13,6 кД) (Детерман Г., 1970; Ос-терманЛ.А., 1985).

Получены три фракции спленоцитарных белков: I выходила в количестве 70±7% и содержала белки с ММ более 150 кД, II выходила в количестве 20±4% и содержала белки с ММ 50-60 кД, III выходила в количестве 10±3% и содержала белки менее 25 кД. Полученные при гель-хроматографии фракции концентрировали с помощью полиэтиленгликоля. Супернатант клеток лимфатических узлов концентрировали и фракционировали на сефадексе G-50. Получены три фракции белков клеток периферических лимфатических узлов: 1 выходила

в количестве 65±10% и содержала белки более 50 кД, II выходила в количестве 25±8% и содержала белки с ММ 20*30 кД, Ш выходила в количестве 10±3% и содержала белки 15 кД и менее.

Для определения иммуномодулирующей активности супернатантов или их гель-хроматографических фракций их вводили однократно внутрибрюшин-но аллогенным реципиентам из расчета 2 мг белка на 1 кг массы тела, одновременно с иммунизацией ЭБ.

Определение биохимических показателей. О выраженности цитолити-ческого синдрома при поражении печени судили по активности АЛТ и ACT, проявления холестаза оценивали по активности ЩФ и концентрации ОБ в сыворотке крови (Меньшиков В.В., 1987). Содержание лизоцима в сыворотке определяли по О.В. Бухарину (1975). Содержание витаминов А и Е в крови определяли по l.L. Bienz и S.N. Prival (1995). Выраженность перекисного окисления липидов оценивали по содержанию в сыворотке крови диеновых конъюгатов жирных кислот (Стальная Н.Д., 1977), ацилгидроперекисей (Гаврилов В.Г., Мишкорудная М.И., 1983) и малонового диальдегида (Стальная Н.Д., Гаришви-ли Т.Г, 1997).

Оценка энергетического и антиоксидантного потенциала эритроцитов. Энергообеспечение эритроцитов оценивали по содержанию в них АТФ и 2,3-бифосфоглицерата (Виноградова И.Л., 1980), их антиоксидантный статус -по активности супероксиддисмутазы (Макаренко Е.В., 1988), каталазы (По-дильчак М.А., 1967), глутатионпероксидазы (Гаврилова А.В., Хмара Н.Ф., 1986) и глутатионредуктазы (Макаренко Е.В., 1988).

Статистическая обработка материала. Математический анализ полученных данных проводили с помощью программы «Microsoft Excel-XP» на ЭВМ «Pentium-lV». Первоначально генерировался отчет описательной статистики, содержащий информацию о среднем числе, стандартной ошибке, стандартном отклонении, дисперсии выборки. Затем оценивалась равномерность распределения выборочной совокупности по коэффициенту Колмогорова-Смирнова, достоверность различий - по критериям Вилкоксона-Манна и Уит-

ни. Уровень надежности составил 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Иммуномодулирующее действие препаратов жирорастворимых витаминов при воздушном и иммерсионном охлаждении. В крови крыс, подвергнутых воздушному и иммерсионному охлаждению, определяли содержание витаминов А и Е, ДК и МДА. Установлено, что воздушное и иммерсионное охлаждение снижало концентрацию в крови витаминов А и Е. При иммерсионном охлаждении снижение было более выраженным, чем при воздушном. Воздушное охлаждение повышало концентрацию в сыворотке крови первичного продукта ПОЛ - ДК, но не влияло на содержание одного из конечных продуктов -МДА. Иммерсионное охлаждение повышало содержание ДК и МДА.

Препараты витаминов А и Е в дозах соответственно 30 и 50 мг/кг нормализуют содержание антиоксидантов липидной природы и концентрацию продуктов ПОЛ в крови КПВО и не влияют на их величину у КПИО. Охлаждение на воздухе супрессировало развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ, угнетало ФМА нейтрофилов периферической крови. Введение данным крысам ретинола ацетата нормализовало развитие ГИО ФМА ПЯЛ и усиливало (но не нормализовало) интенсивность ГЗТ. Инъекции токоферола ацетата нормализовали функциональную активность нейтрофилов, усиливали развитие ГИО и не влияли на выраженность ГЗТ. Дозы препаратов витаминов А и Е 15 и 25 мг/кг соответственно оказывали менее выраженный эффект.

Результаты наблюдений свидетельствуют о важной роли нарушений ан-тиоксидантной защиты и увеличения выраженности процессов ПОЛ в развитии холодовой иммуносупрессии и обосновывают применение препаратов витаминов А и Е для ее коррекции при воздушном охлаждении.

Известно, что препараты витамина К, наряду с влиянием на синтез ферментов свертывающей системы гепатоцитами, оказывают антиоксидантный эффект, стимулируют процессы энергообеспечения различных клеток, влияют на активность ферментов катаболизма ксенобиотиков (Пентюк А.А. и др., 1994; Назаров П.В., Лидер В.А., 1996). В связи с этим изучено иммуномодулирующее

и антиоксидантное действие препаратов, обладающих активностью витамина К - филлохинона (2 мг/кг) и менадиона (1 мг/кг) при воздушном и иммерсионном охлаждении.

Введение препаратов неохлажденным крысам стимулировало развитие у них ГИО и ГЗТ. Наиболее выраженным оно было при введении филлохинона. Воздушное охлаждение угнетало развитие ГИО и ГЗТ. Введение менадиона и филлохинона нормализовало ГИО и ГЗТ у крыс, подвергнутых такому способу охлаждения. Иммерсионное охлаждение угнетало развитие ГИО и ГЗТ в большей степени, чем воздушное. Менадион не оказывал влияния на ГИО и ГЗТ, филлохинон усиливал, но не нормализовал эти процессы у крыс, подвергнутых иммерсионному охлаждению.

Введение менадиона и филлохинона нормализовало ФМА ПЯЛ у КПВО. Менадион не влиял на эти процессы у КПИО, а филлохинон повышал, но не нормализовал функциональную активность нейтрофилов у этих животных.

При различных формах стресса и патологий наблюдается изменение химического состава, метаболизма и иммунорегулирующих свойств эритроцитов (Алпатов СП., Сергеева Т.Н., 1996), причем в основе этих изменений лежит снижение энергетического и антиоксидантного состояния клеток, увеличение интенсивности в них перекисного окисления липидов, нарушение структуры и архитектоники гликопептидных эпитопов их мембран (Антоняк Г.Л., 1999). Принимая во внимание изложенное, было изучено влияние жирорастворимых витаминов на энергетический потенциал, антиоксидантный статус и иммуно-модулирующие свойства эритроцитов при остром холодовом стрессе.

Содержание БФГ и АТФ в эритроцитах КПВО и КПИО было существенно снижено. После иммерсионного охлаждения снижение было выражено сильнее, чем после воздушного. РА и ТА не влияли на содержание БФГ и АТФ у КПВО и КПИО. Введение филлохинона нормализовало содержание макроэрги-ческих соединений в эритроцитах КПВО и повышало, но не нормализовало величины этих параметров в клетках КПИО (таблица 2).

Воздушное охлаждение не оказывало влияние на активность СОД и увеличивало активность ГР в эритроцитах. Иммерсионное охлаждение снижало активность определяющих ферментов антиоксидантной системы эритроцитов. Применение РА и ТА не оказывало существенного влияния на активность ан-тиоксидантных ферментов в эритроцитах КПВО и КПИО. Введение филлохи-нона не влияло на активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах КПВО и увеличивало не до уровня контроля активность СОД и ГР в эритроцитах КПИО (таблица 2).

Таблица 2

Влияние жирорастворимых витаминов на иммуномодулирующие и метаболические эффекты эритроцитов КПВО и КПИО

Условия опытов Метаболический статус эритроцитов Иммуноло! нчс-

Содержание макроэргических соединений Антиоксидан! -пая активность ферментов ская активное! ь )рнгроцнтов_ появление ич-муноеупресси-рующей актив-нос ги

Воздушное охлаждение Без витаминов • снижение не влияет

Ретинола ацетат не влияет не влияет корригирует

Токоферола ацетат не влияет не влияет корршир\е1

Филлохинон нормализует не влияет нормализуе!

Иммерсионное охлаждение Без витаминов снижение снижение появление им-муносупреесн-руюшен активности

Ретинола ацетат не влияет не влияет не влияет

Токоферола ацетат не влияет не влияе! не влияе1

Филлохинон корригирует корригирует корригирует

Изменение метаболических параметров эритроцитов, вероятно, отражается на иммуномодулирующих свойствах этих клеток. Для проверки этого предположения изучали влияние охлаждения и жирорастворимых витаминов на свойства эритроцитов КПВО и КПИО. Оказалось, что охлаждение индуцировало появление у эритроцитов иммуносупрессорных свойств, выявляемых при аллогенном переносе. Супрессорная активность эритроцитов КПИО была вы-

ше, чем эритроцитов КПВО. РА и ТА уменьшают, но не отменяют супресси-рующих свойств эритроцитов КПВО. Введение филлохинона предотвращало появление иммуносупрессируюшей активности у эритроцитов КПВО. Раздельное применение РА и ТА при иммерсионном охлаждении не ослабляло имму-носупрессируюших свойств эритроцитов КПИО, а введение охлажденным крысам филлохинона снижало выраженность супрессирующей активности этих клеток (таблица 2).

На основании проведенных исследований можно предположить, что снижение энергетического потенциала эритроцитов является одной из причин появления у этих клеток иммуносупрессирующих свойств, а уменьшение выраженности метаболических сдвигов служит необходимой предпосылкой ослабления или отмены супрессирующей активности эритроцитов.

Иммуномодулирующее действие препаратов жирорастворимых витаминов при иммерсионном охлаждении, сочетающемся с выполнением интенсивной физической нагрузки. В производственных условиях, при занятиях спортом и выполнении специальных заданий действие на организм низкой температуры окружающей среды нередко сочетается с выполнением интенсивных физических нагрузок. Совместное влияние Холодовых и физических нагрузок на иммунологические функции остается мало изученным В соответствии с этим не разработаны средства иммунокоррекции после физических нагрузок, выполняемых при низкой температуре окружающей среды. Учитывая это, была изучена иммуномодулируюшая эффективность препаратов жирорастворимых витаминов после иммерсионного охлаждения, сочетавшегося с выполнением физической нагрузки.

ИОФН значительно угнетала развитие ГИО и ГЗТ, снижала ФМА ней-трофилов периферической крови (таблица 3). При ИОФН все жирорастворимые витамины по отдельности в различной степени уменьшали выраженность угнетения ГИО и ФМА полиморфноядерных лейкоцитов. Вместе с тем, витамины А и К не влияли на вызванное ИОФН снижение показателей НСТ-теста, а витамин Е не резко (но статистически существенно) увеличивал это снижение.

Совместное введение плававшим и охлаждённым крысам витаминов А и Е вызывало более выраженное увеличение показателей ГИО, ГЗТ и ФМА ней-трофилов, чем каждый из витаминов в отдельности. Совместное введение витаминов А и К нормализовало большинство показателей иммунологической реактивности и неспецифической резистентности. В отличие от этого сочетанное введение витаминов Е и К не влияло на угнетение ГИО, ГЗТ и ФМА поли-морфноядерных лейкоцитов крови, вызываемое ИОФН.

Таблица 3

Иммунометаболические эффекты жирорастворимых витаминов при сочетании холодового стресса и физической нагрузки

Эффект холодового стресса и интенсивной физической нагрузки Изучаемое явление Эффект введения А + Н, А + К

Супрессия Иммунная реактивность ' ФМА нейтрофилов I [ормали ¡ация

Иммуномодулирующая активность эритроцитов

Появление иммуносу-прессирующих свойств легких Исчезновение иммуномоду-лируюших свойств

Нет эффекта тяжелых Появление иммуностимулирующих свойств

Снижение Содержание макроэргиче-ских соединений в эритроцитах Нормалшация

Снижение Антиоксидантная активность ферментов эритроцитов Нормали $ация

Введение Е + К

На эффсюа

Изучение иммунометаболического состояния эритроцитов и влияния витаминов А, Е и К на антиоксидантный потенциал, энергетический статус и им-муномодулирующие свойства эритроцитов показало, что ИОФН значительно снижала активность ферментов антиоксидантной системы в эритроцитах и уменьшала содержание в этих клетках макроэргических соединений (таблица 3). Введение плававшим и охлаждённым животным всех жирорастворимых витаминов по отдельности уменьшало выраженность вызванного ИОФН сниже-

ния активности СОД, каталазы, ГП и ГР. В наибольшей степени этот эффект характерен для токоферола ацетата. Витамины А и Е не влияли на показатели энергетического статуса эритроцитов. В отличие от этого витамин К повышал (но не нормализовал) содержание БФГ и АТФ в эритроцитах после ИОФН.

Совместное введение витаминов А и Е, а также А и К нормализовало показатели антиоксидантного и энергетического статуса эритроцитов крыс, выполнявших ИОФН. В противоположность этому сочетанное введение витаминов Е и К не влияло на выраженность нарушения антиоксидантного и энергетического статуса эритроцитов, вызываемое ИОФН (таблица 3).

Плавание при низкой температуре индуцировало появление в крови легких эритроцитов, обладающих иммуносупрессорными свойствами. Введение витаминов Е или К плававшим и охлаждённым животным предотвращало появление у лёгких эритроцитов иммуносупрессирующих свойств. Витамин А не влиял на свойства легких эритроцитов, но индуцировал появление иммуностимулирующей активности у тяжелых клеток плававших и охлаждённых крыс.

Совместное введение плававшим при низкой температуре крысам витаминов А и Е или А и К отменяло иммуносупрессирующие свойства лёгких эритроцитов и индуцировало появление сильно выраженных иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов. В отличие от этого сочетанное применение витаминов Е и К не влияло на иммуносупрессирующие свойства лёгких эритроцитов и не индуцировало появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток после ИОФН (таблица 3).

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что применение указанных сочетаний жирорастворимых витаминов позволяет получить разнонаправленные эффекты, целесообразность которых при различных состояниях может быть неодинаковой. Этим, вероятно, объясняется отсутствие эффекта или возникновение парадоксальных эффектов при использовании препаратов поливитаминов.

Иммуномодулирушее действие лизоцима при остром холодовом стрессе. Развитие иммунологических процессов находится в тесной взаимосвя-

зи с активностью факторов неспецифической резистентности и, в частности, с содержанием в крови лизоцима, выделяющегося в больших количествах стимулированными фагоцитами. ФМА этой же системы существенно снижается при различных видах стресса и патологии, в частности, при остром холодовом стрессе. Моноцитарное звено системы является источником большого количества цитокинов, регулирующих различные механизмы неспецифической защиты и иммунологической реактивности. Принимая во внимание изложенное, есть основание считать, что возможными причинами возникновения или обострения инфекционных процессов после охлаждения являются угнетение ФМА полиморфноядерных лейкоцитов крови и снижение содержания лизоцима. Вероятно, введение экзогенного лизоцима приведет к повышению неспецифической резистентности организма и нормализации формирования иммунной реактивности на различные антигены.

Установлено, что иммерсионное охлаждение приводит к повышению в сыворотке крови содержания продуктов ПОЛ (ДК и МДА), активности ферментов АЛТ и ACT и снижению содержания лизоцима и показателей функциональной активности нейтрофилов периферической крови. На фоне этих биохимических сдвигов наблюдалось угнетение иммунологической реактивности в отношении ЭБ (рисунок 1) и появления иммуносупрессирующих свойств у лёгких эритроцитов.

Введение КПИО лизоцима дозозависимо снижало содержание ДК и МДА, активность АЛТ и ACT, увеличивало содержание лизоцима сыворотки крови, в дозе 1 мг/кг усиливало, а в дозе 5 мг/кг нормализовало развитие ГИО на ЭБ и показатели ФМА нейтрофилов (рисунок 1). Обе дозы препарата индуцировали появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов.

Инъекции эритроцитов охлаждённых и получавших лизоцим (5 мг/кг) крыс интактным животным индуцировали выделение их спленоцитами, прилипающими к стеклу при 4-10°С, иммуносупрессирующего фактора, а клетками, прилипающими при 32-37°С - хелперного фактора. Это позволяет считать, что в сосудистом русле охлаждённых и получавших лизоцим крыс есть

популяции эритроцитов, одни из которых обладают свойством индуцировать выделение супрессирующего, а другие - хелперного факторов различными по адгезивным свойствам фракциями спленоцитов.

Рисунок 1. Влияние лизоцима на ИР, ФМА нейтрофилов, содержание лизоцима и биохимические показатели ПОЛ и проницаемости клеточных мембран при иммерсионном охлаждении.

Обозначения: I - радиус окружности - пока¡<пели контрольной группы животных 3 ~............. - покамтелн в )словиях иммерсионного охлажде-

5 - • - р < 0,05 между поклзшелямн 2, 3, 4 групп по отношению к 1

6 - рлыичмя между всеми пока ¡а юля ми 3, 4 групп достоверны по от-

Введение охлажденным крысам супернатанта спленоцитов, содержащего иммуносупрессирующий фактор, не оказывало влияния на содержание продуктов ПОЛ и активность АЛТ и ACT в сыворотке крови. В отличие от этого, введение охлаждённым, не получавшим лизоцим крысам супернатанта сплено-

цитов, содержащего хелперный фактор, снижало величины показателей, характеризующих выраженность ПОЛ и проницаемость мембран гепатоцитов. Таким образом, антиоксидантное действие лизоцима при иммерсионном охлаждении опосредуется факторами, выделяющимися клетками селезенки. Вероятно, эти факторы являются элементами механизма, обеспечивающего сохранение структурного гомеостаза при остром холодовом стрессе.

В связи с вышеизложенным важно было выяснить, вызывают ли иммуностимулирующий и мембранопротекторный эффекты один и тот же фактор, или их возникновение обусловлено разными соединениями.

При разделении на сефадексе G-150 супернатанта КПИО спленоцитов, прилипших к стеклу при температуре 32-37°С, установлено, что гель-хроматографическая I фракция супернатанта, содержащая белки с ММ более 150 кД, при введении охлажденным, не получавшим лизоцим крысам, снижала содержание ДК и МДА, активность АЛТ и ACT, а также усиливала иммунный ответ на ЭБ. Фракция 11 была неактивной, а фракция 111, содержащая белки с ММ менее 25 кД, стимулировала иммунную реакцию на ЭБ, но не влияла на содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов в крови реципиентов.

Прилипающие к стеклу клетки селезёнки в основной своей массе (около 85%) являются макрофагами, которые в процессе поглощения объекта фагоцитоза выделяют пептиды, обладающие различной функциональной активностью. Вероятно, иммуностимулирующий фактор является одним из таких пептидов или группой близких по молекулярной массе и перекрывающихся по функциональной активности цитокинов пептидной природы. Не исключено, что среди выделяемых макрофагами факторов, есть соединения, усиливающие синтез ан-тиоксидантов различной химической природы. Учитывая это, исследовано влияние высоко- и низкомолекулярных фракций супернатантов спленоцитов, прилипающих к стеклу при 32-37°С, на активность СОД и ГР в эритроцитах, не получавших лизоцим крыс.

Установлено, что иммерсионное охлаждение приводит к снижению активности СОД и ГР в эритроцитах. Введение КПИО гель-хроматографической

фракции I существенно повышало активность СОД и ГР, а инъекции КПИО фракции II не влияли на биохимические показатели эритроцитов.

Таким образом, в составе супернатантов, содержащих в составе белки с ММ более 150 кД, КПИО, получавших лизоцим, содержится фактор, активирующий синтез антиоксидантных ферментов и ограничивающий выраженность ПОЛ клеточных мембран.

Эритроциты КПИО. получавших инъекции высокомолекулярной фракции, не обладали иммуносупрессирующими свойствами, а эритроциты животных, которым вводили низко молекулярную фракцию, при аллогенном переносе супрессировали развитие иммунного ответа на ЭБ.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что иммуномоду-лируюшее действие лизоцима при охлаждении обусловлено модификацией эритроцитов и выделением под влиянием модифицированных эритроцитов хелперных цитокинов прилипающими к стеклу клетками селезёнки и что, наряду с этим, действие лизоцима опосредовано (через цитокины спленоцитов) вызывает изменение антиоксидантного статуса эритроцитов. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования лизоцима для коррекции иммунологической реактивности при остром холодовом стрессе.

Лизоцим как корректор иммуномодулирующих эффектов, вызываемых витаминами А, Е и К при иммерсионном охлаждении. Приведенные выше данные показывают, что инъекции лизоцима вызывают выраженный им-муномодулирующий эффект и что действие этого фермента в определённой степени опосредуется эритроцитами. В связи с этим возник вопрос о влиянии лизоцима на иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов, которое также реализуется при участии эритроцитов.

Установлено, что раздельное введение лизоцима (5 мг/кг), менадиона (1 мг/кг), ретинола ацетата (30 мг/кг) или токоферола ацетата (50 мг/кг) слабо повышали активность полинуклеаров и развитие ГИО и ГЗТ. Сочетанное введение лизоцима с РА, ТА или менадионом приводило к более выраженному по-

вышению функциональной активности нейтрофилов и иммунологической реактивности в отношении ЭБ.

Инъекции лизоцима, ТА или менадиона не приводили к появлению в крови животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. В отличие от этого, введение РА обусловливало возникновение у тяжелых эритроцитов слабовыраженной хелперной активности. Инъекции лизоцима с РА индуцировали появление у эритроцитов иммуностимулирующих свойств, выраженность которых была существенно выше, чем у эритроцитов крыс, получавших инъекции только РА. Введение лизоцима с ТА или менадионом не сопровождалось появлением иммуномодулирующих свойств у эритроцитов.

Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что лизоцим не индуцирует появления иммуностимулирующих свойств у эритроцитов, но повышает чувствительность этих клеток к действию РА. В связи с изложенным интересно было изучить влияние эритроцитов интактных крыс, экстракорпорально обработанных лизоцимом, на функции полинуклеаров и развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ, у животных, получавших препараты жирорастворимых витаминов.

Экстракорпоральная обработка эритроцитов лизоцимом не приводила к появлению у этих клеток иммуномодулирующих свойств. Введение крысам эритроцитов, обработанных лизоцимом, не влияло на активность полинуклеа-ров и выраженность иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Инъекции эритроцитов, обработанных лизоцимом, животным, получавшим РА или ТА, повышали активность нейтрофилов и стимулировали ИР в значительно большей степени, чем введение этих препаратов без экстракорпорально модифицированных эритроцитов. Введение обработанных лизоцимом эритроцитов крысам, получавшим менадион, не оказывало влияния на активность полинуклеаров и развитие иммунного ответа. Можно предположить, что экстракорпоральная обработка эритроцитов лизоцимом сенсибилизирует их к интракорпоральному взаимодействию с витаминами А и Е. Не исключено также, что интракорпо-

ральное введение последних сенсибилизирует полинуклеары к взаимодействию с экстракорпорально обработанными лизоцимом эритроцитами.

Изучено влияние сочетанного введения лизоцима и препаратов жирорастворимых витаминов на ФМА и иммунологическую реактивность КПИО. Установлено, что лизоцим и РА нормализовали ФМА ПЯЛ крови, а также развитие ГИО и ГЗТ у охлаждённых крыс. Лизоцим, введенный с ТА, нормализовал ФМА ПЯЛ и развитие ГИО, но не оказывал существенного влияния на выраженность ГЗТ. Лизоцим с менадионом усиливали, но не нормализовали ФМА ПЯЛ и развитие ГИО, не влияли на выраженность ГЗТ (таблица 4).

Таблица 4

Влияние лшоцима, РА, ТА и менадиона на ФМА нейтрофилов и развитие ГИО и ГЗТ при иммерсионном охлаждении

Моканнслп Кош роль НО ПО, введение Л1ПО- иимаи РЛ И О, введение лшоцима и ТА НО, введение лнюинма и менадиона

11руина 2■рупиа 31руппз 4 группа 5 группа

ФИ ФЧ 47.1 ±3.8 1.5±0,Г 23,9±2.б"' 0.7±0, I*1 44.9±3.7'- 54.3±3,б"2 36,5±3, Г'11

1,4±0,1 *' !,3±0,2*2 1.0 ±0,2'' 2

11СГ-СП 13,2±0.9 7.4±0.7*1 13.8±0.8'2 12.5±1,0'" 10.5±0,8"' 2

НСТ-нпд Л(Ж 35.3± 1.9 26.4±2.8 20.5±1,б"' 9.2± ГУ 33,8±2,1'2 34,0±2,2*2 27,4±1.7"'2

23.9±2.7'" 24,8±2,б'"7 17,0±1,9"'2

РОК 55.1Н5.8 34.0±3,9М 52.7±5,Г>'2 52,7±5,8*2 45.8±4,9"11

РМ)1 4.5±0.5 5,7±0.6 2.6±0.3*' 4.3±0.5"' 2.9±0,4'' 2,8±0,3*'

|'КЛ 2,7±0 4*' 1 5,4±0,б'2 2,9±0.5'' 3,0±0,4*'

Примечание (¡Лесь и <>а.и'с): * -р<0.05, цифра рядом со шешочкон укачывает, но отношению к какой |рунпе рамичия достоверны.

Инъекции лизоцима и РА интактным крысам индуцировали появление у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующих свойств. Введение этих препаратов КПИО предотвращало появление у легких эритроцитов иммуносупресси-рующих свойств и индуцировало появление иммуностимулирующей активности у тяжелых клеток.

Сыворотка крови КПИО, получавших лизоцим и РА, при экстракорпоральной обработке индуцировала появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов интактных крыс. Эритроциты неохлаждённых крыс, получавших инъекции лизоцима и РА после экстракорпоральной обработки сывороткой

КПИО, вызывали такой же иммуностимулирующий эффект, как эритроциты, не обработанные сывороткой КПИО.

Это позволяет считать, что лизоцим и РА не влияют на накопление в сыворотке крови соединений, индуцирующих появление у эритроцитов иммуно-супрессирующих свойств, но повышают резистентность эритроцитов к действию таких соединений.

Иммуномодулирующая активность менадиона и лизоцима, связанных с эритроцитарным носителем, при остром холодовом стрессе.

Включение лекарственных препаратов в строму эритроцитов обеспечивает сохранение или повышение их фармакологической активности, а также увеличение стабильности. Эффект стабилизации обеспечивается, в частности, за счет исключения деградации соединения под действием ферментов и микроорганизмов, которые могут проникать через мембрану (Т.П. Генинг и др., 1980; М. Тривен, 1983). Большой практический интерес представляет приготовление и изучение иммуномодулирующей активности эритроцитарных стромальных сфер, содержащих включенные и сорбированные лекарственные соединения.

Изучено влияние менадиона, включенного в строму эритроцитов интакт-ных и охлажденных крыс, на развитие иммунного ответа у неохлажденных и охлажденных животных.

Строма эритроцитов интактных крыс, включившая менадион, стимулировала развитие иммунного ответа ЭБ у неохлажденных крыс (таблица 5). Строма эритроцитов охлажденных крыс, включившая менадион, также стимулировала развитие иммунного ответа у неохлажденных животных, однако стимуляция была выражена в меньшей степени, чем при введении стромы эритроцитов ин-тактных крыс, включившей менадион. Принципиально важным является тот факт, что строма эритроцитов интактных и охлажденных крыс, включившая менадион, нормализовала развитие иммунного ответа на ЭБ у охлажденных животных. Большой интерес представляет вопрос о влиянии лизоцима, модифицирующего эпитопные структуры мембран клеток, на иммуномодулируюшее действие стромы эритроцитов, включившей менадион. Установлено, что

СЭВМ. обработанные лизоцимом, стимулировали развитие иммунного ответа на ЭБ в большей степени, чем не обработанные препаратом фермента, как у здоровых животных, так и у КПИО (таблица 5).

Таблица 5

Влияние лизоцима на иммуномодулирующую активность включенного в строму эритроцитов менадиона

> С. ПИШИ (111Ы111 лок РОК

1 КоНфОДЬ (ОС! ОЧ.'ШЛ,(ОПИЯ и введения СфОМЫ >Р1МР<>1 инок) 22,6±2.8 47.2±5.4

2 Ивсдение о ромы зршроцшок шмлкшмх крыс 6е1 меиадиоп.1 24.»±2» 49,5±5.7

3 Иведепис С")ВМ 4 (¡ведение ОВМОЛ 116,7±12.4*' 154 6±14.0*м " 143,6±15,0*'2 183,5±19,3*'л

5 Очлаждение 7,6±0.9*'"4 16.2±2. I*'"1

(> Омижденис. введение с 1 ромы >ршро1Ш1ов бе! менадиона 7 (Кллжденпе, введение С')1Ш 8,3±0.9*'"' Г25.4±2,4*,"л 17,0±2.3*м 48,0±6,3*'-"

N Очдажченне введение С")11М()Л 39.7±4.3*'"' 65,5*6,9*

Изучено влияние СЭВМ и СЭВМОЛ на выделение цитокинов клетками селезенки. Оказалось, что первый препарат индуцировал выделение хелперных цитокинов прилипающими, а второй - прилипающими и не прилипающими к стеклу спленоцигами.

Практически важным является вопрос об иммуномодулирующей активности СЭВМОЛ. полученной при использовании стромы эритроцитов КПИО. Эксперименты, проведенные для решения этого вопроса, показали, что такой препарат стимулирует развитие иммунного ответа у здоровых крыс и у КПИО.

Изучено влияние иммерсионного охлаждения на активность иммуноком-петентных клеток селезенки крыс и изменение этой активности после введения охлажденным крысам СЭВМОЛ. Интактным крысам внутрибрюшинно вводили СПКС или СПКС КПИО и иммунизировали их ЭБ. Установлено, что СПКС и СНКС КПИО супрессировали развитие иммунного ответа, причем эффект СПКС был выражен сильнее, чем неприлипающих. Супернатанты клеток селезенки КПИО. получавших инъекции СЭВМОЛ при аллогенном переносе, не влияли на развитие иммунного ответа или стимулировали его.

Результаты опытов позволяют сделать вывод, что иммуномодулирующее действие препаратов обусловлено их угнетающим влиянием на функцию анти-геннеспецифических супрессоров селезенки.

Прилипающие к стеклу клетки селезенки охлажденных и получавших СЭВМОЛ крыс выделяют иммуносупрессирующие и иммуностимулирующие факторы. В связи с этим возник вопрос: выделяются ли разные по функциональной активности факторы одной субпопуляции прилипающих к стеклу клеток или они являются продуктами разных субпопуляций? Для решения этого вопроса клетки селезенки фракционировали по способности к адгезии в зависимости от температуры среды. Исследована иммуномодулирующая активность супернатантов клеток неохлажденных и охлажденных крыс, получавших СЭВМОЛ. Оказалось, что иммуносупрессирующий фактор выделяется клетками охлажденных животных, прилипающими к стеклу при 4°С и 10°С, а иммуностимулирующий фактор - клетками обеих групп крыс, прилипающими при 32°С и 37°С.

После фракционирования СПКС и СНКС на сефадексе G-150 установлено, что фракция II клеток, прилипающих при 4-10°С, обладала иммуносупрес-сирующей активностью, а фракция III клеток, прилипающих при 32-370С. - хел-перными свойствами. Фракция III СНКС при аллогенном переносе стимулиро-. вала у реципиентов развитие иммунного ответа на ЭБ в такой же степени, как и содержащий ее объем нефракционированного супернатанта.

Определение антиоксидантной и гепатопротекторной активности фракций СПКС и СНКС показало, что только фракция I супернатанта спленоцитов, прилипающих к стеклу при 32-37°С, снижает содержание ДК и МДА, активность АЛТ, ACT и ЩФ, концентрацию общего билирубина у КПИО. Остальные фракции не влияли на величину показателей, характеризующих выраженность процессов ПОЛ и состояние гепатоцитов.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что иммуномоду-лирующей и антиоксидантной активностью обладают разные цитокины, выделяемые различными популяциями спленоцитов. Они свидетельствуют о том,

что эффективным средством иммунореабилитации при иммерсионном охлаждении и, вероятно, при других состояниях, характеризующихся взаимосвязанным нарушением антиоксидантного статуса, состояния гепатоцитов и иммунологической реактивности, могут быть не отдельные цитокины, а совокупность различных, выделяемых макрофагальными и лимфоидными элементами биологически активных пептидов.

Проведено также сравнительное изучение иммуномодулирующей эффективности СЭВМОЛ и выделяющихся под ее влиянием цитокинов клеток селезенки при охлаждении, сочетавшемся с выполнением физической нагрузки.

Введение супернатанта. содержащего ИСТФ, в меньшей степени, чем инъекция СЭВМОЛ, усиливало ГИО. Таким образом, при ИОФН СЭВМОЛ как иммуномодулятор оказался более эффективным, чем индуцирующие выделение ИСГФ СЭВМОЛ. Можно предположить, что это обусловлено угнетающим влиянием ИОФН на функцию моноцитов (макрофагов), реагирующих на СЭВ-МОЛ выделением ИСТФ.

СЭВМОЛ индуцирует выделение ИСТФ не только прилипающими, но и не прилипающими к стеклу спленоцитами. Проведено сравнительное изучение иммуномодулирующей активности СПКС и СНКС, содержащих ИСТФ при ИОФН. Установлено, что СНКС вызывает менее выраженное усиление иммунного ответа, чем СНKC. Вместе с тем совместное введение СПКС и СНКС в дозах, равных половине юй, которая использована при раздельном введении, оказалось более эффект явным, чем инъекции отдельных супернатантов. Совместное введение СПКС и СНКС нормализовало развитие иммунного ответа на ЭБ у охлажденных плавающих животных.

На основании результатов проведенных исследований можно прийти к выводу о наличии в СНКС крыс, получивших инъекции СЭВМОЛ, фактора, усиливающего эффект, вызываемый ИСГФ СПКС. Следовательно, наиболее выраженный иммуномодулирующий эффект при иммунодефиците, вызываемом ИОФН (и, вероятно, при других формах приобретенного иммунодефици-тa), может бьть достигнуто путем введения совокупности иммуномодулирую-

щих цитокинов, выделяемых различными клетками селезенки.

Иммуномодулирующее действие препаратов витаминов Л и Е при глубоком локальном охлаждении. Глубокое локальное охлаждение применяется в медицине для достижения лечебного эффекта посредством изменения (стимуляции или торможения) определенных биохимических процессов или физиологических функций не повреждающими ткани криогенными воздействиями или для разрушения патологически измененных клеток. ГЛО вызывает анестезирующий, гемостатический и противовоспалительный эффекты. Основными механизмами криодеструкции является денатурация белков и связанное с ней разрушение клеточных надмолекулярных структур и органелл, нарушение клеточного метаболизма и накопление его продуктов в токсических концентрациях, ишемия, гипоксия, вызванные нарушением кровообращения с тромбооб-разованием.

В связи с этим изучено влияние ГЛО различных участков кожных покровов на развитие ГИО и ГЗТ у крыс, а также проведен анализ возможности коррекции нарушения этих форм иммунного ответа с помощью препаратов витаминов А и Е.

Установлено, что ГЛО задней конечности или передней брюшной стенки в течение 1 или 2 мин. супрессирует развитие иммунного ответа. Выраженность супрессирующего эффекта возрастает с увеличением времени экспозиции. Им-муносупрессирующее действие локального охлаждения в большей степени проявляется при воздействии на заднюю конечность.

Ретинола ацетат (3 мг/кг) или токоферола ацетат (5 мг/кг) вводили в зону охлаждения, что уменьшало выраженность вызываемой им супрессии иммунного ответа. Сочетанное их введение нормализовало развитие ГИО и ГЗТ.

Локальное охлаждение в течение I или 2 минут индуцирует выделение супрессирующих цитокинов прилипающими к стеклу клетками лимфатических узлов, регионарных к месту охлаждения. Супрессирующие цитокины обнаруживаются в составе фракции II, содержащей в основном белки с молекулярной массой 20-30 кД.

Введение РА или ТА в зону 1- или 2-минутного охлаждения индуцирует выделение иммуностимулирующих цитокинов прилипающими клетками регионарных лимфатических узлов. Хелперные цитокины обнаруживаются в составе фракции III, содержащей белки с молекулярной массой 10-15 и менее кД. Введение токоферола ацетата в зону 1- и 2-минутного локального охлаждения предотвращает выделение супрессируюцих цитокинов клетками регионарных лимфатических узлов. Таким образом, проведенные нами эксперименты позволили впервые установить важную роль цитокинов клеток лимфатических узлов в развитии иммуносупрессии при глубоком локальном охлаждении, а также возможность использования препаратов витаминов А и Е для коррекции выделения этих цитокинов и чувствительности иммуноцитов к их действию.'

Большой интерес представлял вопрос о влиянии цитокинов, секретируе-мы\ клетками периферических узлов, на метаболические процессы. Установлено, что супернатант прилипающих к стеклу клеток лимфатических узлов, регионарных к месту 2-минутного ГЛО, при аллогенном переносе снижает активность СОД и каталазы в эритроцитах, не влияет на содержание витаминов А и Е и повышает концентрацию ДК и МДА в плазме крови интактных крыс. Супер-нагант неприлипающих клеток такими свойствами не обладает. Прилипающие клетки лимфоузлов локально охлажденных крыс, получавших ретинола ацетат или токоферола ацетат при аллогенном переносе, не оказывали влияния на показатели, характеризующие выраженность ПОЛ и состояние антиокислительных систем эритроцитов (рисунок 2).

Исследование метаболических эффектов СПКЛУ охлажденных и получивших жирорастворимые витамины крыс показало, что цитокины, повышающие активность СОД и каталазы, снижающие содержание ДК и МДА, выделяются в составе фракции I прилипающих клеток, содержащих белки с молекулярной массой, превышающей 50 кД. Ретинола ацетат не влияет на активность фракции I прилипающих клеток, но индуцирует появление цитокинов, обладающих антиоксидатными свойствами, в составе фракции 111 прилипающих клеток, содержащей белки с молекулярной массой 10-15 кД. Введение токофе-

рола ацетата не индуцирует выделения антиоксидантных цитокинов, но предотвращает накопление в СПКЛУ прооксидантных соединений (рисунок 2)

Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что в реализации прооксидантного действия локального охлаждения и антиоксидантного эффекта витаминов А и Е определенную роль играют цитокины, выделяемые клетками периферических лимфатических узлов

Рисунок 2. Неиммунные эффекты цитокинов лимфатических узлов крыс с ГЛО, получавших жирорастворимые витамины

Обозначения: - блокирование неиммунных )ффектов [Ж) введением виымипл Е, 0\)~ появление неиммуниых эффектов введением вшамина Л

Иммуномодулирующее действие протеолитических и гликолитиче-ских ферментов при локальном охлаждении. Глубокое локальное охлаждение вызывает в зоне действия криоагента гибель части клеток и денатурацию макромолекулярных соединений (белков, гликозаминогликанов и протеоглика-нов). Последние легче, чем нативные, гидролизуются протеолитическими и гликолитическими ферментами. Гидролитические ферменты катализируют образование различных по величине фрагментов биополимеров, которые, взаимо-

действуя с иммуноцитами кожи и регионарных лимфатических узлов, могут быть индукторами выделения ими цитокинов, оказывающих влияние на функции различных звеньев иммунной системы целостного организма. Принимая во внимание изложенное, большой интерес представляет вопрос об иммуномоду-лирующем действии протеолитических и гликолитических ферментов при глубоком локальном охлаждении.

Введение папаина (20 ПВ/кг) в зону охлаждения не оказывало существенного влияния на развитие ГИО и ГЗТ при глубоком локальном охлаждении. В отличие от этого аналогичные инъекции террилитина (20 ПЕ/кг), лидазы (2 УЕ/кг) или лизоцима (1 мг/кг) усиливали, но не нормализовали развитие обеих форм иммунного ответа.

Изучение влияния системного введения ретинола ацетата (15 мг/кг) на эффект, вызываемый локальными инъекциями протеолитических и гликолити-ческих ферментов, показало, что ретинола ацетат не вызывал иммуномодули-рующего эффекта у локально охлажденных крыс. Введение папаина охлажденным животным, получавшим ретинола ацетат, не влияло на выраженность у них ГИО и ГЗТ, а инъекции террилитина усиливали (но не нормализовали) развитие этих процессов. В отличие от этого введение лидазы и лизоцима охлажденным крысам, получавшим ретинола ацетат, нормализовало развитие у них обеих форм иммунного ответа (таблица 6).

Таблица 6

Влияние РА, протеолитических и гликолитических ферментов на развитие иммунного ответа при ГЛО

Условии опыт ДОК РОК РМЛ РКЛ

1 Кои фоль (Гк"1 I ЛС) и введения 2(1,3±2,9 58,2±6,3 4,8±0,6 5,7±0,6

ферменюв)

2 I ЛО 10,5±1,4*' 28,7±3.4*' 2,6±0,3*' 3,2±0,4*'

3 1ЛО + 1>Л 11.2±1.4*[_ 30.3±3,5*' 2,7±0,3*' 3,4±0,4*'

4 1 ЛО + РЛ + наманп 10.2±1.5*' 28,5±3,6*' 2.8±0,4*' 3,0±0,4*'

5 1 Ж)+ РА + юрри шиш IX (¿2,3 39,4±4,3*1"1 3.7±0,5*1"4 4,9±0 5*

(> 1 ЛО+ РА + 'Ш ипл 25.7±2,8*>ч Зб.ЗгЬб.О*2"1 4,7±0,6*2"л 5,5±0.6*2"'

7 1 ЛО + РА-гипоним 27.7±3,1*'4 60,2±6.4*2"'1 5,7±0,7*-"'

Эти данные свидетельствуют о повышении под влиянием лизоцима чувствительности клеток лимфатических узлов локально охлажденных крыс к действию эритроцитов, интракорпорально модифицированных витамином А.

Принимая во внимание тот факт, что иммуномодулирующее действие витамина А в определенной степени опосредуется тяжелыми эритроцитами и выделяющимися под влиянием последних цитокинами спленоцитов, было изучено влияние эритроцитов крыс неохлажденных, получавших ретинола ацетат, на выделение цитокинов клетками лимфатических узлов локально охлажденных аллогенных реципиентов. Охлаждению подвергали подушечку задней лапки.

Установлено, что ГЛО приводит к выделению прилипающими к стеклу при 4-10 °С клетками лимфатических узлов иммуносупрессирующих цитоки-нов. Введение локально охлажденным крысам лизоцима не влияло на активность супрессирующих цитокинов клетками, прилипающими при 4-10 °С, и вместе с тем индуцировало выделение хелперных цитокинов клетками, прилипающими при 32-37°С. Инъекции эритроцитов крыс, получавших ретинола ацетата охлажденным локально без введения лизоцима крысам не влияли на активность цитокинов клеток лимфатических узлов. В отличие от этого введение таких эритроцитов локально охлажденным и получавшим инъекции лизоцима животным повышало хелперную активность клеток лимфатических узлов, прилипающих при 32-37°С, и индуцировало выделение иммуностимулирующих цитокинов неприлипающими клетками.

Эти данные свидетельствуют о повышении под влиянием лизоцима чувствительности клеток лимфатических узлов локально охлажденных крыс к действию эритроцитов, интракорпорально модифицированных витамином А. Таким образом, при глубоком локальном охлаждении, так же, как при общем, выявлено участие эритроцитов в реализации витаминно-ферментных способов иммуномодуляции.

Локальное охлаждение применяют как средство анестезии при выполнении оперативных вмешательств на кожных покровах и с целью обезболивания

при непроникающих травматических повреждениях. Вопрос об иммуномоду-лирующем действии кратковременного локального охлаждения и о возможности его фармакологической коррекции остается открытым.

Изучены иммуномодулирующие эффекты, возникающие при поверхностном (кpaтковременном - 10 или 20 сек.) локальном охлаждении, роль цитоки-нов, выделяемых клетками регионарных лимфатических узлов, в реализации этих эффектов и выяснена возможность их коррекции введением лизоцима.

Охлаждение участка передней брюшной стенки или стопы задней конечности в течение 10 или 20 сек. стимулировало формирование ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ. Выраженность стимулирующего эффекта возрастала с увеличением времени экспозиции. Иммуностимулирующее действие ПЛО в зоне передней брюшной стенки и задней конечности было выражено одинаково. Введение лизоцима (I мг/кг) в зону локального 10- или 20-секундного охлаждения усиливало вызванную последним стимуляцию развития ГИО и ГЗТ (рисунок 3). При локальном охлаждении в течение 20 сек. и при введении лизоцима без охлаждения не обнаружено выделения иммуномодулирующих цитокинов клетками лимфатических узлов, регионарных к месту охлаждения. Введение лизоцима в зону охлаждения индуцировало выделение иммуностимулирующих цитокинов не прилипающими к стеклу клетками регионарных лимфатических узлов.

В связи с изложенным возникло предположение о возможности использования сочетанного применения ПЛО с местным введением лизоцима для им-мунокоррекции и иммунореабилитации после физических нагрузок. Плавание в течение 4 ч. с грузом 3,5-4% массы тела в воде, имеющей температуру 30 ± 2°С, вызывало выраженное угнетение развития ГИО и ГЗТ. Сочетание физической нагрузки с ПЛО или введением лизоцима не изменяло иммуносупрессирующе-го эффекта плавания. ПЛО в сочетании с местным введением лизоцима усиливало (но не нормализовало) развитие ГИО и не влияло на интенсивность ГЗТ в условиях физической нагрузки.

Супернатант прилипающих клеток лимфоузлов крыс, плававших в воде после ПЛО и местного введения лизоцима, при аллогенном переносе интакт-ным животным супрессировал развитие ГИО и ГЗТ, а супернатант неприли-пающих клеток не оказывал влияния на эти процессы.

Установлено, что введение супернатантов прилипающих клеток лимфоузлов этих животных плававшим крысам, не влияло на развитие у них ГИО и ГЗТ, индуцированного ЭБ, а инъекции супернатанта неприлипающих клеток уменьшало выраженность угнетения обеих форм иммунного ответа. При совместном введении супернатанта прилипающих и не прилипающих к стеклу клеток имела место нормализация величин показателей, характеризующих ГИО, и уменьшение выраженности изменений показателей ГЗТ плавающих крыс (таблица 7).

Таблица 7

Влияние СКЛУ крыс после ПЛО и введения лизоцима на развитие ГИО и

ГЗТ после плавания

Условия опыга лок РМЛ 1

1 Контроль (без плавания и введения супернатат а) 22,2±2,6 4 7±0,6 |

2 Плавание 7,6±0,9"1 1,9±0,2''

3 Плавание + СПКЛУ 7,0±0,8*' 1.7±0.2'' '

4 Плавание+ СНКЛУ 12,5±1,7*' ' 2,2±0,3"'

5 Плавание + СПКЛУ+ СНКЛУ 20,3±2,6*'м 3 3±0,5'1"4

Выявленный в условиях наших экспериментов способ индукции выделения клетками периферических лимфатических узлов цитокинов, обладающих иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами, основанный на сочетании ПЛО с местным введением лизоцима, вероятно, может быть использован в комплексе иммунореабилитационных мероприятий при интенсивных физических нагрузках. Не исключено также, что кратковременное локальное криогенное воздействие, сочетающееся с местным введением лизоцима, проте-олитических и гликолитических ферментов послужит основой для разработки технологии получения терапевтически эффективных цитокиновых композиций.

В реальных условиях существования организма наиболее частым является сочетание системного действия стрессорного агента или патогена и локального действия применяемых лекарственных препаратов. Принципиально важно сформулировать единую концепцию метаболической иммуномодуляции при таком сочетании (рисунок 4) Предпринимая попытку представить основные контуры этой концепции, мы основывались на постулированном ранее положении о важной роли эритроцитов в метаболической регуляции иммунологических функций (Прокопенко Л Г. и др., 1992, 1995). В соответствии с этим постулатом стресс-индуцирующий агент, оказывающий системное влияние, индуцирует выделение гепатоцитами метаболитов, в первую очередь липопротеи-дов низкой плотности и гликозаминогликанов, которые, взаимодействуя с мембраной легких эритроцитов, индуцируют появление у них иммуносупресси-рующих свойств (Прокопенко Л .Г., 2001).

Модифицированные сывороточными соединениями легкие эритроциты активируют спленоциты, прилипающие к стеклу при 4-10°С, и усиливают выделение ими супрессирующих цитокинов. Последние, в свою очередь, вызываю! развитие иммуносупрессирующих эффектов, взаимодействуя не только с мембраной легких эритроцитов, но и встраиваясь непосредственно в структуры цитоплазматической мембраны иммуноцитов.

Местно (подкожно или внутримышечно) введенные лекарственные препараты могут активировать поглощающие их макрофаги печени, прерывая

осуществление последовательности реакций, имеющих место при действии стресс-индуцирующих агентов. Мишенью для местно введенных соединений являются также клетки регионарных лимфатических узлов, которые в ответ на полученный сигнал выделяют цитокины, взаимодействующие с мембраной тяжелых эритроцитов. Последние активируют спленоциты, прилипающие к стеклу при 32-37°С, и индуцируют выделение ими хелперпых цитокинов. Не исключено, что местно введенные препараты, проникая в сосудистое русло, непосредственно модифицируют тяжелые эритроциты и активируют иммуноциты.

Рисунок 4. Метаболические механизмы иммуносупрессии и иммуномодуля-ции.

Принципиально важное значение имеет тот факт, что клетки лимфатических узлов и селезенки, наряду с иммуномодулирующими цитокинами, выделяют соединения, угнетающие продукцию и подавляющие активность метаболитов, обладающих иммуносупрессирующими свойствами. Это обосновывает перспективность углубленного изучения иммунометаболического действия ци-токинов различных иммунокомпетентных клеток.

Представленная концепция увязывает метаболические функции печени, физико-химические свойства эритроцитов и цитокинсинтезирующую активность макрофагальных клеток селезенки и лимфатических узлов в регуляции иммунологической реактивности организма при стрессе и в условиях патологии Представленная на рисунке схема взаимосвязей различных звеньев постулируемой системы является открытой Она позволяет детализировать механизм осуествления каждой из показанных на ней связей и включать в нее новые звенья без нарушения основной структуры Это обусловливает возможность использования представленной схемы для планирования новых исследований при решении проблем управления иммунологическими функциями при различных состояниях организма

ВЫВОДЫ

1 Воздушное и в большей степени иммерсионное охлаждение, сочетающееся с выполнением интенсивной физической нагрузки, угнетает иммунную реактивность организма и функционально-метаболическую активность нейтро-филов периферической крови, снижает содержание в крови витаминов А и Е, повышает концентрацию продуктов перекисного окисления липидов, уменьшает антиоксидантный и энергетический потенциал эритроцитов, индуцирует появление у фракции легких эритроцитов ^<^079 г/см') иммуносупрессирующих свойств

2 Иммуосупрессорный и прооксидантный эффекты острого холодового стресса корригируются препаратами витаминов А, Е и К. Иммуномодулирую-щее и антиоксидантное действие витаминов при воздушном охлаждении выражено сильнее, чем при иммерсионном Природный витамин К - филлохинон -обладает более выраженной иммуномодулирующей активностью, чем синтетический аналог витамина - менадион

3 Раздельное введение ретинола ацетата, токоферола ацетата и филлохи-нона охлажденным и выполнявшим физическую нагрузку крысам уменьшает выраженность угнетения иммунной реактивности организма и функционально-метаболической активности нейтрофилов, повышает антиоксидантный и энер-

гетический (филлохинон) потенциал эритроцитов, ослабляет иммуносупресси-рующие свойства легких эритроцитов (токоферола ацетат и филлохинон), индуцирует появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток (ё<1 ,117 г/см3) (ретинола ацетат).

4. Сочетанное введение охлажденным и выполнявшим физическую нагрузку животным ретинола ацетата и токоферола ацетата или ретинола ацетата и филлохинона нормализует иммунную реактивность организма и функционально-метаболическую активность полиморфноядерных лейкоцитов, антиок-сидантный (оба сочетания) и энергетический (ретинола ацетат и филлохинон) статус эритроцитов, отменяет иммуносупрессируюшие свойства легких эритроцитов, индуцирует появление выраженных иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток. Введение токоферола ацетата с филлохиноном таких эффектов не вызывало.

5. Лизоцим эффективно корригирует иммунологические функции при остром холодовом стрессе. Иммуномодулирующее действие лизоцима при охлаждении обусловлено модификацией эритроцитов и выделением под их влиянием хелперных цитокинов прилипающими к стеклу клетками селезенки. Ли-зоцим опосредованно, через цитокины спленоцитов, нормализует активность ферментов антиоксидантной системы эритроцитов.

6. Совместное введение лизоцима и ретинола ацетата при остром холодо-вом стрессе корригирует иммунологические функции эффективнее, чем введение каждого из этих препаратов в отдельности. Сочетанное применение лизо-цима с токоферола ацетатом и менадионом менее эффективно. Лизоцим и ретинола ацетат не влияют на накопление в сыворотке соединений, индуцирующих появление у эритроцитов иммуносупрессирующих свойств, но повышают резистентность эритроцитов к действию таких соединений.

7. Выраженный иммунокорригирующий эффект при иммерсионном охлаждении, сочетающемся с выполнением интенсивных физических нагрузок, вызывают стромальные сферы эритроцитов, включавшие менадион и модифицированные экстракорпоральной обработкой лизоцимом. Действие таких сфер

опосредуется совокупностью цитокинов, выделяемых прилипающими к стеклу клетками селезенки. Среди цитокинов прилипающих спленоцитов есть соединения, обладающие антиоксидантной и гепатопротекторной активностью.

8. Глубокое локальное охлаждение супрессирует развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцирует выделение прилипающими к стеклу клетками регионарных лимфатических узлов цитокинов, обладающих прооксидантными и иммуносупрессирующими свойствами. Введение токоферола ацетата или филлохинона в зону охлаждения предотвращает выделение прилипающими клетками цитокинов, обладающих прооксидантными свойствами, а инъекции ретинола ацетата индуцируют выделение неприлипающими клетками хелперных цитокинов.

9. Террилитин, лидаза и лизоцим усиливают развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа при глубоком локальном охлаждении. Ретинола ацетат значительно повышает иммуномодули-рующее действие лидазы и лизоцима. Эффект ретинола ацетата и лизоцима реализуется при участии эритроцитов.

10. Поверхноаное локальное охлаждение вызывает иммуностимулирующий эффект. Лизоцим, введенный в зону поверхностного охлаждения, существенно усиливает хелперный эффект последнего. Иммуностимулирующее действие поверхностного локального охлаждения, сочетающегося с введением лизоцима, опосредуется цитокинами клеток лимфатических узлов, регионарных к зоне охлаждения и введения фермента.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследования являются базой для углубленного экспериментального изучения иммупомодулирующей и антиоксидантной активности соиммобили-зованных форм жирорастворимых витаминов и гликолитических ферментов.

2. Результаты исследований являются основанием для проведения клинической апробации сочетанного применения жирорастворимых витаминов и гликолитических ферментов в качестве средства иммунореабилитации лиц,

подвергшихся охлаждению и выполняющих интенсивную физическую нагрузку. Апробация проводится в Курской областной клинической больнице, кожно-венерологических диспансерах Курска, Белгорода, Курском областном центре медицинской профилактики.

3. Данные разработки служат основой для разработки технологии получения терапевтически эффективных цитокиновых композиций при локальных криогенных воздействиях, сочетавшихся с местным введением лизоцима, про-теолитических и гликолитических ферментов.

4. Материалы диссертации могут быть использованы в учебном процессе медицинских вузов с целью расширения знаний о роли витаминно-ферментного взаимодействия с эритроцитами в регуляции иммунных функций при различных формах патологии и стресса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующее действие локального охлаждения// Актуальные вопросы дерматовенерологии [Текст]: Сб. тр. / А.Р. Авакян, Н.Н. Бондарева, Л.Г. Прокопенко. - Курск, 1997. - С . 69-71.

2. Авакян, А.Р. Криоферментная иммуномодуляция [Текст] / А.Р. Авакян, Л.Г. Прокопенко // Актуальные вопросы дерматовенерологии. - Курск, 1997.-С. 73.

3. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующее действие ферментов при локальном охлаждении [Текст] / А.Р. Авакян // Пятый рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: Тез. докл. - М., 1998. - С. 429.

4. Авакян. А.Р. Иммуномодулирующее действие витаминов А и Е при локальном охлаждении [Текст] / А.Р. Авакян, И.Л. Бровкина // Человек и его здоровье: Сб. науч. работ. - Курск, 1999. - Вып. 2. - С. 90-92.

5. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующее действие препаратов витаминов А и Е при повторяющейся холодовой нагрузке [Текст] / А.Р. Авакян, М.И. Лу-

кашев, ИЛ. Бровкина // Человек и его здоровье: Сб. науч. работ. - Курск, 1999.-Вып. 2.-С. 95-97.

6. Иммуномегаболические аспекты холодового стресса [Текст]: [Монография] / Л.Р. Авакян, Л.Г. Прокопенко, В.А Афанасьев и др. - Курск, 1999. -118с.

7. Авакян, А.Р. О роли цитокинов клеток периферических лимфатических узлов в развитии иммуносупрессии при иммерсионном охлаждении [Текст] / Л.Р. Авакян, И.Л. Бровкина // Актуальные вопросы медицины и фармации: Сб. науч. тр. - Курск, 1999. - С. 4.

8. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующее и антиоксидантное действие витамина К при воздушном и иммерсионном охлаждении [Текст] / А.Р. Авакян, ВА Афанасьев, И.Л. Бровкина // Актуальные вопросы медицины и фарма-ции.-Курск. 1999. -С. 3.

9. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов при во {душном и иммерсионном охлаждении [Текст] / А.Р. Авакян, ИЛ. Бровкина, Н.А. Быстрова // Метаболическая иммуномодуляция / Под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопли. - Курск, 2000. - С. 142-151.

10. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующее и антиоксидантное действие витамина К и рибоксина при воздушном и иммерсионном охлаждении [Текст] / АР. Авакян. И.Л. Бровкина. НА Быстрова// Метаболическая иммуномодуляция/ Под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопли. - Курск, 2000.-С. 151-159.

11. Авакян, А.Р. Витамины А и Е как иммуномодуляторы при глубоком локальном охлаждении [Текст] / А.Р. Авакян, И.Л. Бровкина, Н.А. Быстрова// Метаболическая иммуномодуляция / Под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопли. - Курск, 2000 С. 159-168.

12. Авакян, А.Р. Криогенная иммуномодуляция и ее усиление витамином Л [Текст] / Л Р. Авакян, И.Л. Бровкина, Н.Я. Прокопенко // Метаболическая иммуномодуляция / Под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопли. - Курск, 2000. -С. 168- 175.

13. Иммуномодулирующее и антиоксидантное действие витаминов А и Е при воздушном и иммерсионном охлаждении [Текст] / А.Р. Авакян, Б.С. Уте-шев, Н.А. Быстрова, И.Л. Бровкина // Эксперим. и клинич. фармакология -2001. - Т. 64, № 1. - С. 60-63. - Библиогр.: 27 назв.

14. Иммуномодулирующее действие препаратов витаминов А и Е при глубоком локальном охлаждении [Текст] / А.Р. Авакян, Б.С. Утешев, Н.А. Быстрова, И.Л. Бровкина // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2001. - Т. 64, № 3. - С. 56-60. - Библиогр.: 12 назв.

15. Авакян, А.Р. Феномен криоферментной иммуностимуляции [Текст] / А.Р. Авакян//Аллергология и иммунология -2001.-Т. 2,№ 2.-С. 153.

16. Лазарев, А.И. Иммуномодулирующее действие гиалуронидазы и ли-зоцима при термическом повреждении кожных покровов [Текст] / Л.Г. Прокопенко, А.И. Лазарев, А.Р. Авакян // Аллергология и иммунология. - 2001. -Т. 2, №2.-С. 156-157.

17. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующая активность стабилизаторов клеточных мембран, инкапсулированных в эритроцитарном носителе при остром холодовом стрессе [Текст] / А.Р. Авакян, Л.Г. Прокопенко // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2001. - № 2 (8). - С. 3-9.

18. Лазарев, А.И. Иммуномодулирующее действие связанных с эритроци-тарным носителем мембранопротекторов и выделяемых под их влиянием цито-кинов при остром холодовом стрессе [Текст] / А.И. Лазарев, Л.Г Прокопенко, А.Р. Авакян // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2001. -№2 (8).-С. 10-17.

19. Лазарев, А.И. Иммунометаболический статус эритроцитов и его коррекция жирорастворимыми витаминами при остром холодовом стрессе [Текст] / А.И. Лазарев, Л.Г. Прокопенко А.Р. Авакян // IX Междунар. конгр. «Человек и лекарство»: Тез. докл. - М., 2002. - С. 567.

20. Лазарев, А.И. Иммуномодулирующее действие энергизирующих препаратов при остром холодовом стрессе [Текст] / А.И. Лазарев, Л.Г. Проко-

пенко, А.Р. Авакян // IX Междунар. конгр. «Человек и лекарство»: Тез. докл. -М., 2002. - С. 567.

21. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующее действие препаратов жирорастворимых витаминов после интенсивных физических нагрузок, выполнявшихся при низкой температуре окружающей среды [Текст] / А.Р. Авакян // Патол. физиология и зксперим.терапия. - 2002. - № 3. - С. 26-29.

22. Лазарев, А.И Иммуномодулирующее действие лизоцима при остром холодовом стрессе [Текст] / А.И. Лазарев, Л.Г. Прокопенко, А.Р. Авакян // Антибиотики и химиотерапия. — 2002. - Т. 47. № 2. — С. 3-6.

23. Иммуномодулирующие действие активаторов обмена, углеводов и липидов при остром холодовом стрессе [Текст] / А.Р. Авакян, А.И. Лазарев, Л.Г. Прокопенко. Б.С. Утешев // Эксперим. и клинич. фармакология. — 2002. — Т. 65, №3.-С. 50-53.

24. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующие действие кратковременного глубокого локального охлаждения и его усиление витамином А [Текст] / А.Р. Авакян, И.Л. Бровкина, А.И. Лазарев // Патол. физиология и эксперим. терапия. -2003. №2. - С П-15.

25. Авакян, А.Р. Иммуномодулирующая активность менадиона и лизоци-ма, связанных с эритроцитарным носителем, при остром холодовом стрессе [Текст] / А.Р. Авакян, А.И. Лазарев, Л.Г. Прокопенко // Курский науч.-практ. весгн. «Человек и его здоровье». - 2004. - №4. - С. 3-8.

26.Авакян, А.Р. Лизоцим как корректор иммуномодулирующих эффектов, вызываемых витаминами А, Е и К при остром холодовом стрессе [Текст] / А.Р. Авакян, А.И. Лазарев, Л.Г. Прокопенко // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2004. -№4. - С. 9-14.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ, ЕДИНИЦЫ ИЗМЕРЕНИЯ

АЛ Г - аланинаминотрансфераза, ммоль/(ч х л)

АОК - антителообразующие клетки, 103/селезенка

ACT - аспартатаминотрансфераза, ммоль/(ч х л)

АТФ - аденозинтрифосфат, мкмоль/мл эритроцитов

БФГ - 2,3 - бифосфоглицерат, мкмоль/мл эритроцитов

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ГИО - гуморальный иммунный ответ

ГЛО - глубокое локальное охлаждение

ГП - глутатионпероксидаза, мкмоль/мл эритроцитов

ГР - глутатионредуктаза, мкмоль/мл эритроцитов

ДК — диеновые конъюгаты ненасыщенных жирных кислот, нмоль/л

ИО - иммерсионное охлаждение

ИОФН - иммерсионное охлаждение, сочетавшееся с физической нагрузкой

ИР - иммунная реактивность

ИСТФ - иммуностимулирующий фактор

КПВО - крысы, подвергнутые воздушному охлаждению

КПИО - крысы, подвергнутые иммерсионному охлаждению

МДА - малоновый диальдегид, мкмоль/мл эритроцитов

ММ - молекулярная масса

НСТ-инд. - индуцированный тест восстановления нитросинего тетразолия, %

НСТ-сп. - спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия, %

НФСС - низкомолекулярная фракция супернатанта спленоцитов

ОБ - общий билирубин, мкмоль/л

ПЛО - поверхностное локальное охлаждение

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

РА — ретинола ацетат

РКЛ - разница количества кариоцитов в регионарных и контралатераль-

ных лимфатических узлах, млн

РМЛ - разница массы регионарного и контралатерального лимфатических узлов, мг

РОК - розеткообразующие клетки, 103/селезенка

СКЛУ - супернатант клеток лимфатических узлов

СКС - суперна гант клеток селезенки

СНКЛУ - супернагант неприлипающих клеток лимфатических узлов СНКС - супернатант не прилипающих к стеклу спленоцитов СОД - супероксиддисмутаза, ЕД /мл эритроцитов

CПКЛУ - супернатант прилипающих клеток лимфатических узлов СПКС - супернаганг прилипающих к стеклу спленоцитов

СЭВМ - строма эритроцитов, включившая менадион

СЭВМОЛ - строма эритроцитов интактных крыс, включившая менадион, обработанная лизоцимом ТА - токоферола ацетат ФИ фагоцитарный индекс, % ФМА - функционально-метаболическая активность

ФЧ - фагоцитарное число, количество частиц в одной клетке ЩФ щелочная фосфатаза, моль/(ч х л)

ОБ - эритроциты барана

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 12.11.2004 г. Подписано в печать 21.12.2004 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 62А. Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

* *

• j :•

16 ФЕВ 2005'' ; 1753

Актуальность исследования. Системное переохлаждение человека достаточно часто возникает в экстремальных ситуациях, на производстве, при занятиях спортом. Увеличение миграций больших масс людей в полярные и приполярные регионы и высокогорные территории, развитие мореплавания в Арктике и Антарктике делают актуальной проблему защиты человека от переохлаждения и адекватной помощи лицам, получившим холодовые травмы в аварийных ситуациях. Возникает необходимость разработки средств и способов защиты человека от низкотемпературных воздействий [120, 197].

Применяемые в настоящее время в клинической практике лечебные мероприятия основываются в большой степени на эмпирическом опыте и в основном обеспечивают симптоматическое лечение. Проводимое лечение в недостаточной степени учитывает особенности метаболических механизмов развития ответной реакции организма на холодовое воздействие и поэтому не позволяет целенаправленно влиять на отдельные ключевые звенья патогенеза хо-. лодовых повреждений [3]. Это нередко приводит к низкой эффективности медицинской помощи, возникновению осложнений как на ранних, так и на более поздних этапах лечения лиц, подвергшихся действию низких температур.

Изложенным обусловлен неослабевающий интерес исследователей к проблеме патогенеза холодовых повреждений организма и поиска лекарственных средств, коррелирующих различные звенья патогенеза холодовых травм.

Острое действие низкой температуры индуцирует адренэргическую реакцию, составными звеньями которой являются последовательно возникающие катехоламиновая экспансия, усиление липолиза, гиперлипидемия, разобщение окислительного фосфорилирования, дефицит в клетках АТФ, активация фосфо-липаз клеточных мембран [63, 191]. Разобщение окислительного фосфорилирования является причиной увеличения потери электронов дыхательной цепью, ускорения генерации активных форм кислорода и повышение интенсивности процессов перекисного окисления липидов клеточных мембран. Последнее наряду с активацией фосфолипаз и детергентным действием свободных жирных кислот приводит к нарушению структуры и снижению функциональной активности клеток различных физиологических систем, в том числе иммунной системы [103].

Нарушение функций иммунной системы, наблюдающееся при охлаждении, является одной из основных причин возникновения или обострения инфекционных, аллергических и аутоиммунных процессов, ускорения развития атеросклеротических, изменений сосудов, гипертонической болезни, ишемиче-ской болезни сердца [51]. Причиной тяжелых заболеваний, возникающих после охлаждения, часто являются очаги хронической инфекции (тонзиллиты, отиты, холециститы, синуситы, гаймориты, бронхиты, кариозные зубы) [89]. С наличием очагов хронической инфекции у лиц, подвергающихся охлаждению связывают возникновение воспалительных и дистрофических изменений миокарда, абсцессов легких, панкреатитов, заболеваний почек и мочевыводящих путей, флебитов, артритов, артрозов [197].

Иммуносупрессия, возникающая при остром холодовом стрессе, характеризуется значительным снижением концентрации лизоцима в крови угнетением фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов крови, макрофагов селезёнки и печени, снижением количества Т-лимфоцитов в периферической крови, угнетением их реакции на митогены, увеличением количества и активности Т-супрессоров, снижением соотношения Т-хелперы/Т-супрессоры, нарушением пролиферативной активности В-лимфоцитов, клеток образующих аутологичные розетки, разнонаправленным изменением концентрации и синтеза иммуноглобулинов различных классов, нарушением синтеза и выделения иммуноцитами интерферонов и интерлейкинов [212, 277, 306].

Наиболее резкое угнетение иммунологических функций наблюдается при иммерсионном охлаждении. Иммуносупрессия, индуцированная таким охлаждением недостаточно эффективно коррегируется препаратами, которые нормализуют иммунологическую реактивность, сниженную воздушным охлаждением [139, 145, 146].

Выраженность иммуносупрессии, развивающейся после охлаждения, а также частота связанных с этим патологических процессов, обусловливают актуальность поиска средств эффективной коррекции нарушений иммунологических функций у лиц, подвергающихся действию низкой температуры окружающей среды. Учитывая важную роль усиления свободно радикальных реакций и перекисного окисления липидов при остром холодовом стрессе, можно ожидать, что эффективными иммуномодуляторами в этих условиях окажутся антиоксиданты. Проведенные ранее исследования показали, что (З-каротин и эссенциале корригируют антиоксидантный статус и иммунологическую реактивность при воздушном охлаждении, но недостаточно эффективны при иммерсионном холодовом стрессе [26, 92, 139].

Важным узловым звеном развития иммуносупрессии при охлаждении являются эритроциты [13, 14, 139]. Охлаждение снижает энергетический и антиоксидантный потенциал эритроцитов, изменяет состав фосфолипидного мат-рикса и нарушает архитектонику эпитопов их мембраны, повышает ее вязкость, снижает диформируемость клеток индуцирует появление у лёгких эритроцитов свойства индуцировать выделение иммуносупрессирующих цитокинов прилипающими к стеклу клетками селезёнки [147, 148, 150, 151, 155]. Есть веские основания ожидать, что коррекция иммунометаболического состояния лёгких эритроцитов путём нормализации энергообеспичения и антиоксидантного статуса этих клеток; а также модификации гликопептидных структур наружной поверхности их мембраны, окажется эффективным способом иммуномодуля-ции при остром холодовом стрессе. К числу фармакологических средств обладающих указанными свойствами относятся препараты витаминов А и Е (антиоксиданты), витамины К (энергизатор) протеолитические и гликолитические ферменты (модификаторы гликопротеидных структур). Можно предположить также, что эффекты, вызываемые этими препаратами будут в определённой степени обусловлены их взаимодействием на уровне мембраны эритроцитов.

Охлаждение действует на организм не только как экологический фактор, но и как средство лечения некоторых заболеваний [112, 180]. В этом случае оно может быть как системным (общим), так и локальным. Общее охлаждение, применяемое с лечебными целями по характеру вызывающих его воздействия может быть воздушным, иммерсионным и фармакологическим, локальное охлаждение, чаще всего является аппаратным. В зависимости от мощности и времени действия криоагента локальное охлаждение может вызывать как иммуно-супрессирующий так и иммуностимулирующий эффекты [195]. В ряде случаев возникает необходимость усиления первого и ослабления второго. Не исключено, что это, как и при системном охлаждении может быть вызвано применением жирорастворимых витаминов и гидролитических ферментов.

Целью исследования - изучение роли витаминно-ферментных взаимодействий с эритроцитами в регуляции иммунологических функций при остром холодовом стрессе.

Задачи исследования:

1. Изучение иммуномодулирующего действия препаратов жирорастворимых витаминов при общем воздушном и иммерсионном охлаждении.

2. Выяснение роли эритроцитов и их стромы в реализации иммуномодулирующего действия жирорастворимых витаминов.

3. Изучение иммуномодулирующего действия лизоцима при общем охлаждении организма.

4. Изучение влияния лизоцима на иммуномодулирующие эффекты, вызываемые жирорастворимыми витаминами при общем охлаждении.

5. Выяснение роли эритроцитов в реализации влияния лизоцима на им-муномодулирующую активность жирорастворимых витаминов при общем охлаждении.

6. Изучение влияния витаминов А и Е, лизоцима и протеолитических ферментов на иммуносупрессирующее и иммуномодулирующее действие локального охлаждения.

7. Изучение роли цитокинов клеток селезёнки и регионарных лимфатических узлов в реализации иммуносупрессирующего действия локального охлаждения и иммуномодулирующих эффектов, вызываемых жирорастворимыми витаминами, лизоцимом и протеолитическими ферментами.

Научная новизна. Установлена неодинаковая иммуномодулирующая эффективность сочетанного применения препаратов витаминов А, Е и К. При холодовом стрессе выраженное усиление иммунного ответа и повышение функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови вызывает совместное введение ретинола ацетата и токоферола ацетата или ретинола ацетата и филлохинона. Показана возможность усиления иммуномо-дулирующей активности жирорастворимых витаминов с помощью лизоцима. Выявлена роль эритроцитов как звена интеграции витаминно-ферментных взаимодействий, модулирующих иммунологические функции. Установлена роль цитокинов клеток периферических лимфатических узлов в реализации иммуносупрессирующего действия низкой температуры и иммуномодулирую-щего действия жирорастворимых витаминов, лизоцима и протеолитических ферментов. Обнаружен феномен криоферментной иммуностимуляции, индуцируемый сочетанным применением поверхностного локального охлаждения и введением в зону последнего лизоцима.

Практическая значимость. Экспериментально обоснована целесообразность дальнейшего изучения роли взаимодействия жирорастворимых витаминов, протео- и гликолитических ферментов в регуляции иммунологических функций при стрессе и в условиях патологии. Экспериментально обоснована перспективность изучения сочетанного применения жирорастворимых витаминов и лизоцима для коррекции иммунологических функций при различных формах стресса и патологии. Показаны необходимость всестороннего изучения механизма и возможностей практического применения феномена криофер-ментной иммуностимуляции.

Результаты диссертации включены в монографии «Иммунометаболиче-ские аспекты холодового стресса» (Курск, 1999), «Метаболическая иммуномо-дуляция» (Курск, 2000). Материалы работы вошли в учебные рабочие программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях ряда кафедр Самарского, Северного, Ивановского, Воронежского, Курского, Российского государственных медицинских университетов "и академий.

Способ стимуляции иммунного ответа, созданный в процессе работы, используется на Курской биофабрике фирмы «БИОК».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Жирорастворимые витамины - модуляторы иммунологических функций при остром холодовом стрессе

2. Лизоцим - иммуномодулятор и корректор иммуномодулирующей активности жирорастворимых витаминов при остром холодовом стрессе

3. Эритроциты - звено сопряжения иммуномодулирующего действия жирорастворимых витаминов и лизоцима при остром холодовом стрессе

4. Феномен криоферментной иммуностимуляции.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях Курского государственного медицинского университета и Центрально-Черноземного центра РАМН (19972004), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001), IV конгрессе Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РАА-КИ) (Москва, 2001), V и IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 2002), совместном заседании кафедр биологической химии, микробиологии, спортивной медицины и реабилитации, клинической иммунологии, кожных и венерических болезней, патологической физиологии Курского государственного медицинского университета (2004).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Воздушное и в большей степени иммерсионное охлаждение, сочетающееся с выполнением интенсивной физической нагрузки, угнетает иммунную реактивность организма и функционально-метаболическую активность нейтро-филов периферической крови, снижает содержание в крови витаминов А и Е, повышает концентрацию продуктов перекисного окисления липидов, уменьшает антиоксидантный и энергетический потенциал эритроцитов, индуцирует появление у фракции легких эритроцитов (<1< 1,079 г/см3) иммуносупрессирующих свойств.

2. Иммуносупрессорный и прооксидантный эффекты острого холодового стресса корригируются препаратами витаминов А, Е и К. Иммуномодулирую-щее и антиоксидантное действие витаминов при воздушном охлаждении выражено сильнее, чем при иммерсионном. Природный витамин К - филлохинон -обладает более выраженной иммуномодулирующей активностью, чем синтетический аналог витамина - менадион.

3. Раздельное введение ретинола ацетата, токоферола ацетата и филлохи-нона охлажденным и выполнявшим физическую нагрузку крысам уменьшает выраженность угнетения иммунной реактивности организма и функционально-метаболической активности нейтрофилов, повышает антиоксидантный и энергетический (филлохинон) потенциал эритроцитов, ослабляет иммуносупресси-рующие свойства легких эритроцитов (токоферола ацетат и филлохинон), индуцирует появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток 1 с1<1,117 г/см ) (ретинола ацетат).

4. Сочетанное введение охлажденным и выполнявшим физическую нагрузку животным ретинола ацетата и токоферола ацетата или ретинола ацетата и филлохинона нормализует иммунную реактивность организма и функционально-метаболическую активность полиморфноядерных лейкоцитов, антиоксидантный (оба сочетания) и энергетический (ретинола ацетат и филлохинон) статус эритроцитов, отменяет иммуносупрессирующие свойства легких эритроцитов, индуцирует появление выраженных иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток. Введение токоферола ацетата с филлохиноном таких эффектов не вызывало.

5. Лизоцим эффективно корригирует иммунологические функции при остром холодовом стрессе. Иммуномодулирующее действие лизоцима при охлаждении обусловлено модификацией эритроцитов и выделением под их влиянием хелперных цитокинов прилипающими к стеклу клетками селезенки. Лизоцим опосредованно, через цитокины спленоцитов, нормализует активность ферментов антиоксидантной системы эритроцитов.

6. Совместное введение лизоцима и ретинола ацетата при остром холодовом стрессе корригирует иммунологические функции эффективнее, чем введение каждого из этих препаратов в отдельности. Сочетанное применение лизоцима с токоферола ацетатом и менадионом менее эффективно. Лизоцим и ретинола ацетат не влияют на накопление в сыворотке соединений, индуцирующих появление у эритроцитов иммуносупрессирующих свойств, но повышают резистентность эритроцитов к действию таких соединений.

7. Выраженный иммунокорригирующий эффект при иммерсионном охлаждении, сочетающемся с выполнением интенсивных физических нагрузок, вызывают стромальные сферы эритроцитов, включавшие менадион и модифицированные экстракорпоральной обработкой лизоцимом. Действие таких сфер опосредуется совокупностью цитокинов, выделяемых прилипающими к стеклу клетками селезенки. Среди цитокинов прилипающих спленоцитов есть соединения, обладающие антиоксидантной и гепатопротекторной активностью.

8. Глубокое локальное охлаждение супрессирует развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцирует выделение прилипающими к стеклу клетками регионарных лимфатических узлов цитокинов, обладающих прооксидантными и иммуносупрессирующими свойствами. Введение токоферола ацетата или филлохинона в зону охлаждения предотвращает выделение прилипающими клетками цитокинов, обладающих прооксидантными свойствами, а инъекции ретинола ацетата индуцируют выделение неприлипающими клетками хелперных цитокинов.

9. Террилитин, лидаза и лизоцим усиливают развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа при глубоком локальном охлаждении. Ретинола ацетат значительно повышает иммуномодули-рующее действие лидазы и лизоцима. Эффект ретинола ацетата и лизоцима реализуется при участии эритроцитов.

10. Поверхностное локальное охлаждение вызывает иммуностимулирующий эффект. Лизоцим, введенный в зону поверхностного охлаждения, существенно усиливает хелперный эффект последнего. Иммуностимулирующее действие поверхностного локального охлаждения, сочетающегося с введением лизоцима, опосредуется цитокинами клеток лимфатических узлов, регионарных к зоне охлаждения и введения фермента.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследования являются базой для углубленного экспериментального изучения иммуномодулирующей и антиоксидантной активности соиммобили-зованных форм жирорастворимых витаминов и гликолитических ферментов.

2. Результаты исследований являются основанием для проведения клинической апробации сочетанного применения жирорастворимых витаминов и гликолитических ферментов в качестве средства иммунореабилитации лиц, подвергшихся охлаждению и выполняющих интенсивную физическую нагрузку. Апробация проводится в Курской областной клинической больнице, кожно-венерологических диспансерах Курска, Белгорода, Курском областном центре медицинской профилактики.

3. Данные разработки служат основой для разработки технологии получения терапевтически эффективных цитокиновых композиций при локальных криогенных воздействиях, сочетавшихся с местным введением лизоцима, про-теолитических и гликолитических ферментов.

4. Материалы диссертации могут быть использованы в учебном процессе медицинских вузов с целью расширения знаний о роли витаминно-ферментного взаимодействия с эритроцитами в регуляции иммунных функций при различных формах патологии и стресса.