Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение иммунофармакодинамики биофлавоноидов и синтетических биологически активных веществ

*

•s J.

АКАДЕМИЯ ВДИЦШШК НАУК. СССР

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛШЕ ИНСТИТУТ КЛИНИЧЕСКОЙ ЙМУНШЮГЛИ

IIa правах рукописи

ЖУК ЕЛЕНА МЬБЕРТОВВД

УДК 61^.35.015.11+615.231] 017Л ИЗУЧЕНИЯ! ЙНТНОФАМАКОДШАШКИ Б'ЮФЛ.\Б0Й0ИД03 Й СИНТЕ1ЖЕСКИХ БИШЮГЛМЖЙ АКТИВ11ЫХ SSECTB.

I4.0Ö.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских Шую

Новосибирск - 1991

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии СО АМН СССР, г.Новосибирск.

Научный руководитель: доктор медицинских наук

В.С.Ширинский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А.И.Аутеншиос

кандидат медицинских наук, ■ доцент А.П.Колесников

Ведущая организация: 2-й Московский.ордена Ленина государственный. медицинский институт им. Н.И.Пи-рогова

Защита состоится "_"_ 19_г. в_часов

на заседания специализированного совета К.001.01.01 (Аллергология и иммунология) при Институте клинической иммунологии СО АлШ СССР (630091, г.Новосибирск, ул.Ядринцовская, 14).

С диссертацией мочено ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО АШ СССР.

Автореферат разослан 0Щ/1&РЬ$> 1991 г.

Ученый секретарь специализированного сонета,

кандидат биологических наук О.Т.Кудаева

t

•«•i.ri. , I

ь-тдел j ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.Проблема медикаментозной иммунорегуля-ции является одной из актуальных для современной медицины, что обусловлено ростом числа заболеваний, вдатогенезе которых имеют значение различные нарушения функция иммунной системы.Это определяет необходимость разработки, различных аспектов иммунокоррегирушей терапии, включая поиск новых эффективных иммуномодуляторов, оптимальных схем юс применения, а такхе оценки иммунофармакодинамических свойств широко используемых в медицинской практике препаратов.

В настоящее время шмунофармакрлогия располагает больной группой иммуномодуляторов, как экзогенных, химически чужеродных для организма веществ, так и эндогенных факторов и их синтетических аналогов, однако наши представления о механизме их действия и фармакодинамических особенностях фрагментарны.

В истории использования иммукоактивньгс средств можно выделить несколько этапов (Ратников В.П., 1989):

- I этап характеризуется применением препаратов, одновременно влиявших на различные популяции Г, В лимфоцитов, вспомогательных клеток моноцитов/макройагов, способных интет рально ингибз-ровать или стимулировать гуморальный и клеточный иммунный от- ' вет;

- 2 этап характеризуется появлением препаратов с относительно избирательным влиянием на популяции Т и В лимфоцитов, моноци-тов/макросЬагов;

- 3 этап, продолжающийся сегодня, определяется поиском средств, неспецифично и селективно изменяющих активность субпопуляций лимфоидных клеток, моноцитов/Макрофагов, которые позволяют осуществлять наиболее физиологические воздействия на клетки, участвующие в иммунном ответе.

Лдя решения вопроса о селективном действии новых биологически активных веществ (БАВ) на субпопуляция лимфоидных клеток,' иммунофармакологи должны располагать доклинической системой скрининга, которая была бы воспроизводимой, селективной, прогнозируемой (Утешев Б.С., 1984).

Исключительно важным в этой системе является раздел изучения йармаколинамики иммунотр^пных средств. Фармакодинамшса это количественная оценка биологических и терапевтических аф-

фектов леках)ственных веществ (Сатоскар P.C. с соавт., 1986). Только знание фармакодинамики позволит установить неспедифи-чесную селективность действия соединений на клетки иммунной системы.

Отсюда вытекает необходимость разработки таких экспериментальных приемов in vi-tr», которые позволили бы отбирать перспективные иммуноактивные препараты селективного действия.Если для оценки иммунного статуса человека имеются унифицированные методы (IUIs/who repor-t, 1988), то для доклинического скрининга неспецкфической селективности и механизма действия иммунотропных средств такие методы отсутствуют.

• Среди большого числа новых иммунокоррегирующих препаратов наиболее перспективны эндогенные регуляторы иммунного ответа, биофлавоноиды, ряд синтетических соединении, металлорганичес-кие, имидазолсодержашие препараты.Интерес к этим группам соединений обусловлен их известной химической структурой, широким спектром биологической активности, возможностью целенаправленной модификации структура.

В течение ряда лет лаборатория иммуношармакологии ИКй СО АМН СССР ь рамках плановых научно-исследовательских работ по теме "Поиск новых высокоэффективных, пригодных для клинического применения иммуноактивных средств" (государственный регистр № 01890005065) проводит доклинические испытания ряда препаратов, полученных из Центрального Ботанического сада АН СССР г. Новосибирска и Иркутского Института органической химии СО АН СССР.Часть препаратов оказались перспективными для дальнейшего тестирования.

Цель и задачи исследования.Изучить в экспериментальных системах in vi-tro иммунофармакодинашку биосЬлавоноидов и синтетических БАБ и разработать методы оценки избирательности их действия.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

I.Разработать систему иоделей in vitro, пригодных для определения селективности действия новых BAÜ на субпопуляции клеток, участвующих в иммунном ответе. '¿.Изучить влияние на популяции и субпопуляции юноцитов («¡ц) и лимфоцитов здоровых людей и больных ревматоидным артритом

(РА) новых имидазолсодержащих препаратов кобаэола и ацизола.

3.Изучить влияние на популяции и субпопуляции Щ и лимфоцитов синтетических препаратов кремнийорганичесного соединения ми-вала и производного уксусной кислоты тоекрезана.

4.Изучить влияние на популяции и субпопуляции Щ и лимфоцитов биойшавоноидов из лекарственных растений Сибири.

Основные результаты исследования и их новизна.Научная новизна работы состоит в получении новых данных об имг.г/нофарма-кодинамическюс свойствах ряда новых биофлавоноидов из лекарственных растении, произрастающих в Сибирском регионе, шидазолсодержащих препаратов, скяатрана мивала и производного уксусной кислоты трекрезана.

Впервые азучены фармакодинамичесх.ие свойства эттк сее;л-нений: влияние на спонтанную и митогенив^,,,. ц;:рованр/е уткиаф*-рацшо несепарированных и сепарированных кулътур коконуклеарнш клеток (МЯК), активность 'Г эффекторных (ТэЛ) и неспецифических Т супрессорных лимфоцитов (Тс), содержание Б лимфоцитов разного фенотипа у здоровых людей и больных РА.

Впервые установлено, что мивал обладает стимулирующим пролиферацию МНК влиянием, обусловленным преимущественно усилением продукции лимфокинов (ЛК) 'Г лимфоцитами и изменением функции ,МЦ с гиперпродукцией иростаглашшна Е? (ПГЕ2).Препарат стимулирует активность спонтанных Тс при нормальных показателях последних, но не влияет при снижении их активности, стимулирует активность Тэф.

Впервые установлено, что трекрезан устаивает пролиферацию' культуры ¡/¡ПК, преимущественно влияя на В лимфоциты, а также активируя продукцию ЛК у здоровых людей и больных РА и только у больных РА продукцию монокинов (Ж).Препарат угнетает функции Тэф лимфоцитов и снижает активность Тс при нормальных исходных значениях.

Впервые установлено, что биофлавоноид из корня шиповника (БК!!) относительно селективно стимулирует пролиферацию и диф-ференцировку В лимфоцитов, стимулирует продукцию ЛК с регулирующим пролиферацию влиянием и МК с преимущественным влиянием у доноров.БКЕ повышает активность Тс лимфоцитов при ее снижении, не влияет на активность Тэф.

Установлено, что кобазол обладает слабо выраченным инги-

бируюцим влиянием на пролиферацию МНК только у больных РА.Аци-зол, биофлавоноиды из кровохлебки и манжетки (БК и БЫ) не активны in vitro.

)Впервые показано, что грекрезан и ЕКШ стимулируют пролиферацию несепарированных и сепарированных МНК у больных РА, при этом БКШ повышает до уровня у здоровых людей активность Тс, что оправдывает их клинические испытания при этом тяжком страдании.

Впервые показано, что у трекрезана и БКШ можно предполагать наличие Т независимой В митогенной активности.

Теоретическая значимость работы заключается в обосновании механизма иммуностимулирующей активности мивала, трекрезана, БКШ, продемонстрированных в экспериментах in vivo.Полученные-данные помогут исследователям в определении комплекса методов оценки иммуноактивного -влияния и механизма действия при клинических испытаниях препаратов.

Практическая 'значимость заключается в том, что определены фарьедодинамические свойства новых перспективных жд-.т/коакт явных препаратов.Результаты исследований, сопоставимые с данными,, полученными in vivo, являются основанием для клинических испытаний мивала, трекрезана и БКШ у больных аутоиммунными заболеваниями, вторичными иммунодефицитами и в качестве превентивных средств в группах риска по развитию вторичных иммуноде-фицитов. .

Предложена система скрининга фармакодинамических свойств новых, иммуноактивных прзпаратов, позволяющая выявлять относительную селективность их влияния на популяции и субпопуляции клеток, участвующих в иммунном ответе, особенности действия ЕАВ при нормальных и измененных показателях функционирования иммунной системы.

Основные положения, выносимые на защиту. I.Тестирование БАВ по их влиянию на пролиферацию несепариро-. ванных и сепарированных МНК, стимулированных полиююнальны-ми митогенами, у доноров и больных РА позволяет оценить им-мунофармакод^намику соединений и выявить селективность их действия.

2.Мивал стимулирует пролиферацию Т лимфоцитов преимущественно у здоровых людей, усиливая продукцию ЛК Г лимфоцитами и угнетая продукцию ПгЕ2 МЦ» обладает относительно селективным влиянием на Т лимфоциты, что позволяет рекомендовать его для клинических испытаний в качестве препарата для профилактики вторичных иммунодефицитов.

3.Трекрезан и БКШ стимулируют пролиферацию, селективно действуя на В лимфоциты, при этом трекрезан усиливает продукцию ростстимулиругацих ЛК у доноров и больных РА и МК у больных РА, а БКШ усиливает продукцию регулирующих В клеточный рост Ж и МК со стимулирующим влиянием на пролиферацию Т и В лимфоцитов, что позволяет рекомендовать эти препараты для клинических испытаний при аутоиммунных заболеваниях, вторичные иммунодефицита* и в качестве превентивных средств при вторичных кадмунодешицитах.

4.Коо'азол угнетает пролиферацию у больных РА, повышая активность Тс лшф)цитов и изменяя продукцию медиаторов, влиянии« на пролиферацию; ацизол, БК и Ш не влияют на пролиферацию.

Объем а структура диссертации.Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста.Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, изложенных в 5-ти главах,' заключения и выводов.Иллюстрирована 10 таблицами и 29 рисунками.Список литературы состоит из 246 источников, в том числе 40 отечественных авторов.

Апробация работы и публикации.Материалы работы были доложены и обсуждены на конференции молодых ученых СО АМН СССР (Новосибирск,, 1990), Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1990), конференции молодых ученых-ревматологов Урала и Сибири (Первоуральск, 1990), Всесоюзной конференции "Биологическая активность соединений кремния, германия и олова" (Иркутск, 1990), Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Система мононуклеарных фагоцитов" (Новосибирск, 1990), рабочем совещании "Иммуномодуляторы природного происхождения" (Дладявосгок, 1990), Всесоюзной .конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991), I Республи-

каноком съезде иммунологов и аллергологов Таджикистана (Душанбе, IS9I).

Диссертация апробирована на расшгренном семинаре Лнстя-тута клинической иммунологии СО AjvIH СССР 14 июня 1991 года. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Изучали влияние новых ЕАВ на показатели периферической крови 488 человек, в том числе 392 практически здоровых доноров и 96 больных РА, согласно диагностическим критериям Американской ревматологической ассоциации (1987).

Тестировали БКШ, БК, .Ш, выделенные химический путем из лекарственных растений Сибири к любезна предоставленные сотрудниками Центрального Ботанического сада АН СССР г.Новосибирска, кремнийсрганический препарат мивал, производное уксусной кислоты трекрезан, кобальт-содержащее производное пмидазола кобазол и цинк-содержащее производное имидазола ацизол, синтезированные и любезно предоставленные сотрудниками Иркутского Института органической химии СО АН СССР.Коммерческий препарат левамизол (CaiMochem-behring Corp.) использовали как зта-лонный для проверки эффективности предлагаемых методик изучения иммунофармакодинамики соединений и сравнения свойств новых БАВ.

Рабочие концентрации препаратов получали а среде 199, стерилизацию проводили через милякпэровые фильтры с диаметром пор 0,22 мкм ("Владапор", Владимир).

Культуру МНК получаля из периферической крови в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографина, плотность 1,078 Г/см3 (Бейум А., 1930) .Получение не-л и А клеток \Щ) проводили методом адгезии прилипающих .v'tffi к. пластиковой поверхности в чашках Петри (Михеенко Т.В., 1987), не-Т клеток - методом двухкратного осаждения Е-розеткообразующих меток (a.rai 8. et al, 1983).Получение обогащенной популяции В лимфоцитов, освобожденных от ¡Дд, осуществляли путем двухкратного осаждения Е-оозеткообразущих клеток с предваритэльнил адгезией прилипающих клеток на чашках Петри.

Культивирование лимфоцитов проводили в питательной среде RFMI-1640 ("Вектор", Новосибирск), дополненной 9,0% пулирозан-

ной термоинахтивироьанной человеческой сыворотки АВ(1У), 2 t.ií нзгт^-буфера (Plow), 0,3 мкг/мл i-глютамина (flow) и антибиотиком гентамицкном 100 мкг/мл.БАВ вносили в культуры в концентрациях Ю-8-Ю-5 г/мл в первый день в количестве 33$ от общего объема.В jnhkvl без препарата вносили такое не количество среды 199.В качестве митогенов использовали фитогемагглютинин (ФГА, CalMochera-behring Corp., S МКгАш), МИТОГеН ЛаКОНОСа Ш, Signa, 10 ккг/мл).Интенсивность пролиферации оценивали по включению %-тимидина в нуклеопрогеидные фракции клеток.

Получение сулернатантов (СН).МНК. и не-А клетки иькубзво-вали в среде 199, дополненной 2% феталъноИ телячьей сыворотки (ТТ.Г5), 33« от общего объема БАБ, при 37°С.Через SO минут клетка отмывали и дополнительно инкубтаовали в среде 199, содержащей 2* таСЗ, 43 часов.

А клетки, иртактные a в присутствие I -ш'/»и як толе.Ладена, аккуоировали в среде 199, дополненной Ir¿ pes и V3i БАВ, при 37°С.Через 60 м:снут отмывали от препарата и инкубировали в среде 199, дополненной ?сз, еще 24 часа.

Изучение ачияния БАЗ на активность Тэф.йспо .ьзовали мето- • дшеу, предложенную сотрудницами t'Kíl СО КШ СССР (Лозовой В.П. с соавт., 1990) .Лейкоциты отмывали от плазмы, суспендировали в среде 1Э9, дополненной 20,£ АВ(1У) сыворотки и вносили в лунки, планшета.Добавляли мягоген ФГА и ЕАВ или СН лейкоцитов, обработанных БАВ.При получении СН лейкоциты 60 минут инкубировала с БАВ a АВ(1У) сыворотки, затем отмывали и инкубировали еще 13 часов.

Инкубацию лейкоцитов в лунках проводили 18 часов при 37°С, после чего удаляли неприлигшие клетки, снимали трипсином прилипшие к пластику клетки и подсчитывали их количество в камере Гоояева.С помощью полученных чисел высчитывали индексы миграции и ингибицли миграции (Ш и ШМ) и показатель эффекторных функций (ЛЭО).

Для оценки влияния БАВ на активность Тс УШК инкубировали со средой 199 (спонтанные) или ФГА (ФГА индуцированные Тс) и ЕАВ при 37°С 24 часа.Затем клетки отмывали, обрабатывали мито* мицином С, вносили в культуру аллогенных МНК, которые стимулировали ФГА и инкубировали 72 часа.После оценки уровня проли®»-. рации высчитывали индекс супрессии (Brien c.J. , 1988).

Изучение влияния БАВ на количество В лимфоцитов разного

ujS

фенотипа проводили методом непрямой иммунофлюоресценции (сЬс11б±-Маг1;1п Б. et а1. , 1986) с мышиными моноклональными ан-птелами ИПО-З и ИПО-Ю ("Лаагностикум", Львов) и кроличьими антителами, меченными флуоресцеизотиоцианатом (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи) .Титр моноклональных антител и иммунной сыворотки подбирали согласно рекомендациям изготовителя.

Статистическая обработка проведена методами вариационной статистики (Гублер Е.В., 1978; Лакин Г.Ф., 1980).Стандартную обработку вариационных, рядов осуществляли на микрокалькуляторе "Электроника Ж 51".Высчитывали значение средних арифметических величин и ошибок средних.Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью непараметрического Т парного критерия Вилкоксона.Корреляционный анализ проводили, используя непараметрический коэффициент корреляции рангов Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Система скрининга иммунофармакодинамики БАВ.

Из комплекса методов, входящих в арсенал клинических иммунологов,. была использована методика изучения пролиферации Т и В лимфоцитов.При этом мы исходили из того, что пролиферация играет чрезвычайно важную роль в становлении нормальных и патологических реакций гуморального и клеточного типа и является регулируемым -процессом.

. Следовательно, одной из тест-систем для оценки иммунофар-маходинамики БАВ может быть метод пролиферации культур несепа-рированних. и сепарированных ШК, стимулированных митогенами, активность которых зависит от наличия в культуре пЩ, Т и В лимфоцитов.

Доскольку иммуноактивные препараты могут действовать как на нормальную, так и угнетенную функцию клеток, то тестирование БАВ проводили у здоровых людей и больных РА.Выбор ЕА опре-. делялся четкими диагностическими критериями и хорошо изученными изменениями в иммунном статусе.

Предложенная система скрининга включает 4 этапа.

На первом этапе проводится предварительная оценка фарма-водинамики БАВ по их влиянию «а спонтанную и стимулированную подиклональннми митогенами пролиферацию культуры неседариро-ванных МНК.Спонтанная пролиферация МНК под влиянием препарата

позволяет установить его активность в отношении созревания клеточной культуры.Добавление БАВ в культуру МНК, активированных митогеном, позволяет выяснить вопрос, действует ли препарат только на начальных этапах активации или его влияние не зависит от степени активации клеток, участвующих в иммунном ответе.При этом результаты, полученные у здоровых и больных людей, могут различаться.

На втором этапе проводится оценка селективности действия БАВ.Ддя этого тестируется влияние препарата на пролиферацию не-А, не-Т клеток и обогащенной культуры В лимфоцитов.Мы предпочли использование непрямых экспериментов как более простых в исполнении для оценки роли ;;]Д (культура не-А клеток) и более информативные - культура не-Т клеток, а также прямые эксперименты - обогацэнная культура В лимфоцитов.

На третьем этапе проводится уточнение характера влияния БАВ на функциональную активность Щ и Т лимфоцитов методом получения СН клеточных культур доноров и вольных РА и тестирования та активностей з культурах нчсепарированных и сепарированных 7;НК, активированных гжгогеншли, у доноров.

СИ '-'¡¡К содержат „¡К '.1 ДК, ОН не-А клеток - только ЛК, СН - только „Ж.Среди .ледлаторов, вираоатнваемнх ¡М, регуляцию пролиферации осуществляют интерлейкин-1 (ИЛ—Г) л Пг^Дяя дифференцированное оценка их роли в серии экспериментов использовали СН лД, инкубированных с I мкг/мл индометацина, ингибитора простагландинсинтетазы (СН глЦ/инд).

Тестируя СН в культуре несепарированных ЖК, оценивали влияние БАВ на продукцию Т л В клеточных ростовых факторов, в культуре сепарированных ¡ЧЕК - не-Т клетки - продукшао В клеточных ростовых факторов.

11а четвертом этапе проводится оценка влияния БАВ на суб-дояуляц/Ш лимфоцитов.Протестировано влияние препаратов на активность Тс, ТэФ, количество 13 лимфоцитов разного фенотипа, позво.пяющее оценить влияние на дифференцировку В клеток.

На основании проведенного анализа корреляционных связей но уровню их значимости установлено, что методики 2 и 3 этапов дают дополнительную информацию о 'механизме действия БАВ.

Предложенная система не претендует на роль обобщающей, но мо.нег быть использована для фармакодинамического скрининга новых иммуноактивных препаратов.

}[ммуно(!армакодинамика эталонного препарата левамизола.

Показано, что у доноров левамизол не влияет на спонтанную и активированную митогенами пролиферацию.У больных 1'А он в т,5 раза стимулирует спонтанную и ФГА актнвированную пролиферацию, не действуя при этом на МЛ активированную.

В культурах сепарированных МНК у доноров левамизол неак-тивен.У больных РА препарат также неактивен, но данные, полученные в культуре несепарированных ¡'ЛНК, позволяют предположить действие на пролиферацию через МЦ и Т лимфоциты с преимущественным влиянием на последние, гак как в культуре не-Т клеток Щ содержатся,, но препарат неактивен.

При тестировании активностей СН клеток, инкубированных с препаратом, было установлено, что у доноров левамизол не изменяет продукцию ЛК и МК.У больных РА пролиферация изменяется под влиянием СК, что позволяет предполагать, что левамизол действует у них на продукцию медиаторов.Пролиферация изменяется в культурах несепарированных и сепарированных wlHK, что обусловлено, вероятно, влиянием левамизола на продукцию Т и В клеточных ростовых медиаторов.Соединение усилизает продукцию ИЯ-1 МЦ и не влияет на продукцию urEg.

Таким образом, при тестировании в нашей системе скрининга левамизол неактивен у доноров, стимулирует пролиферацию у больных РА за счет активации продукции 'Г и В клеточных факторов роста Т лимфоцитами и Ж Щ, не действуя ка В лимфоциты прямо, но влияет опосредованно, через медиаторы.Полученные результаты соответствуют данным по изучению механизма действия левамизола другими авторами (Harris Б.Й., I9ci7; Fimball Е.5., 1991).

Левамизол не влияет на активность Тэф лимфоцитов у доноров и усиливает их у больных РА за счет стимуляции продукции Ж, влияющих на эффекторные функции .Препарат не изменяет количество В лимфоцитов разного фенотипа, что позволяет отрицать его прямое влияние на процессы дифференцировки В клеток.

Таким образом, результаты исследования эталонного препарата левамизола, фармакодднамика которого достаточно хорошо изучена, в нашей тест-системе свидетельствует о соответствии полученных результатов данным других авторов и о том, что предложенная система скрининга молет бить использозана для изучения фармакодинамики других иммуноактивных веществ.

Изучение иммунофармакодинамики кобазола.

Установлено, что кобазол не влияет на спонтаяную и активированную иятогенами пролиферацию культуры МНК доноров и угнетает только спонтанную пролиферацию несепарировашшх МНК у больных ГА.Супрессия не обусловлена токсическим воздействием, так как количество жизнеспособных клеток в культурах, содержащих и несодержащих препарат, одинаково.

В культурах сепарированных МНК доноров и больных РА кобазол неактивен.

гЛожно предполагать, что препарат действует на Т лимфоциты опосредованно, через угнетение функций ЭД.Против прямого влияния кобазола на Щ свидетельствует неактивность препарата в культуре не-Т клеток, в которой содержатся МЦ.

При оценке, влияния кобазола на активность Тс выяснено, что препарат повышает активность ФГА индуцированных Тс болышх-РА, причем в тэх та концентрациях, в которых он угнетает пролиферацию кесегтариро-занных fiKK.

Поскольку кобазол в экспериментах ir. vivo (Колесникова О.П., IS90) ке изменял иммунный ответ мышей разню: генотипов к эритроцитам барана, а такке учитывая наши данные об отсутствии значительного влияния на пролиферацию культур лимфоцитов, дальнейшие исследования препарата представлялись нецелесообразными.

Тестирование активность ацизола.

При оценке алияния на пролиферацию несепарированных и сепарированных МНК, спонтанных и активированных митогенами, ацкзол оказался неактивным у доноров и больных РА.

Изучение иммунофармакодинамики мивала.

Как показано на рисунке I, мивал усиливает спонтанную пролиферацию несепарированных »IHK доноров и больных РА в 3,5 раза, угнетает ФГА индуцированную и не влияет на МЛ индуцированную пролиферацию.

При удалении из культуры МНК МЦ стимулирующее влияние препарата снижается, что может свидетельствовать в пользу взаимодействия препарата с Щ.В культурах не-Т и В лимфоцитов мивал неактивен.

Для уточнения действия БАВ на МЦ и Т лимфоциты были про-

Рисунок I. ВЛИЯНИЕ МИВАЛА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ НЕСЕПАРИРОВАННЫХ ИНК.

Доноры

ийш/мен х Ю3

I?!]

п=8 + МЛ

Больные РА

пролиферация на пролиферация на 5 сутки

п=10 + МЛ

3 сутки

Нг -н

ж- *

I - культура без БАВ, 2 - с БАБ в дозе хО-8 г/мл, 3-е

ЕЮ в дозе 1С ' г/мл, 4 - с БАВ в

дозе 10 г/мл.

Таблица I.ВЛИЯНИЕ СН КЛЕТОК ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ С МЙВАЛОМ НА

ПРОЛИФЕРАЦИЮ ПРЕПАРИРОВАННЫХ И СЕПАРИРОВАННЫХ МНК.

Тест- СН Доза Доноры Больные РА

п/п сис- БАВ . (п=10) (п=8)

тема

!Л + м Р М + м Р

I. МНК+ - - 19879+1721 18724+2082

2. СН МНК - 20273+2105 19130+2829

3. ТО-8 25330+2754 3-2* 24816+2408 3-2*

4. ТО"7 27748+2962 4_оХ 25295+2528 4-2*

п. ю-6 29362+1893 5-2* 27936+2239 5-2*

6. СН не-А ю-8 ю-7 21255+1739 18253+2519

7. 29740+1524 7-6* 26563+2244 г, /-о

8. 31883+2172 8-6* 27028+2465 8-6*

9. Ю"6 38243+1330 9-8* 30370+2809 9-6*

10. СН МЦ ю17 21052+1405 13706+2233

II. 27759 КГ625 11-10* 20376+2020 Ц-10*

12. СН ЛД/инд - 22821+2207 13795+3558

13. 1.0 24716+3365 17736+3678

14. Не-Т+ - - 5406+818 5884+502'

15. сн ;мс - 5705+732 5141+920 .

16. 10~8 5459+755 7206+895

17. ю-7 6049+1035 6189+959

18. ТО"6 5573+985 7205+937

19. СН не-А К)"8 6278+646 5513+646

20. 5619+1021 7422+633

21. 1и-7 5960+992 5713+539

22. Ю-'0 5420+963 5201+964

23. СН МЦ Ю:? 6644+712 3188+402

24. 8643+919 5482+464

2 т. СН :,1Ц/ннд - 6826+881 -¿243+329

26. 10"' "670+940 ч404+319

* - ?<1>,05.

тестированы активности СН клеток после инкубации с препаратом.

Как следует из-таблицы I, СН МНК и СН не-А клеток доноров усиливают пролиферацию несепарированных МНК, при этом активность вторых превышает активность первых.СН Щ усиливают пролиферации^ СН Щ/инд неактивны .В культуре не-Т клеток СН неактивны.СН клеток больных РА оказывают такое же влияние, но менее интенсивное.

Мокно предполагать, что препарат угнетает продукцию 11гЕ2 и не влияет на продукцию МК, так как СН Щ стимулируют пролиферацию, СН Щ/инк неактивнн.Мавал усиливает продукцию ХК со стгмулзруюшим рост Т клеток влиянием, так как СН не-А клеток активны в культуре МНК, но не не-Т клеток.

Таким образом, можно предполагать, что мивал усгахдвает у доноров и больных РА с преимущественным влиянием у топоров продукцию Т клеточные ростовых ЛК и угнетает продукций? Пг'^ ьЩ.

Препарат стимулирует активность спонтанных Тс доноров к не влияет ва.ФГА гндуцкрованные.Неактивен он к в отнс5<?и;я; 1с больных РА.

Мивал усиливает Тэф функции за счет повышения иродукц;,:; ЛК в больней степени у больных РА, чем у здоровых локе-й.

Соединение не изменяет количество В лимфоцитов разного фенотипа и, следовательно, не влияет на их дифферзнцировк.у.

Итак, мивал стимулирует пролиферацию за счет повышения продукции ЛК Т лимфоцитами и угнетения продукции ПгЕ^ (АД, его активность более выражена при нормальных показателях пролиферации. Препарат активирует спонтанные Тс только у доноров, активирует Тэф.Хотя направленность воздействия мивала к левами-зола на пролиферацию одинакова, оба препарата относительно селективно действуют -на Т клетки, их механизм действия различен.

Изучение иммукофармакодинамики трекрезана.

Как следует из рисунка 2, трекрезан усиливает спонтанную я- мжтогениндуцированную пролиферацию несепарированных МНК доноров, усиливает спонтанную и не влияет на митогениндуцирован-ную пролиферацию у большое РА.

В культуре не-А клеток влияние трекрезана на пролиферации не изменяется по сравнению с культурой несепарированных МНК.

Трекрезан стимулирует спонтанную и МЛ активированную про-

Рисунок 2. ВЛИЯНИЕ ТРЕКРЕЗАНА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ НЕ СЕПАРИРОВАННЫХ 1Ж.

лмп/мин х 10'"

- Н- Ни НН г*

I . М5-

12 3 4 пролиферация на 3 сутки

12 3'4 пролиферация на 5 сутки

12 3 4 пролиферация на 3 сутки

12 3 4 прслвферацЕЯ на 5 сутки

I - культура без ЕАВ, 2 - с БАБ в дозе 10"8 г/шг, 3 - с БАВ в дозе Ю"7 г/ил, 4 - с БАВ в доз<з

Ю-6 г/шк

Таблица 2.ВЛИЯНИЕ СН КЛЕТОК ПОСЛЕ ИККУБАЦЛИ С ТРЕКРЕЗАНЫ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ НЕСЕПАРйРОВАННсК 4 СЕПАРпРОМгПШХ ;ЛНК.

№ Тест- СН Доза Доноры Больные РА

п/п сис- БАВ (п=9) 1 п—6)

тема

й + м Р ¿'I + м Р

I. МНК+ - - 20558+2450 22957+3140

2. Ж сп ;.'ШК Ю-8 22602+1125 19591+1078

3. 17386+1025 3-2* 25338+2586 3-2*

4. ю-7 17187+2161 4-2* 24529+2295 4-2*

5. 10"ь 16509+1338 5-2* 32189+2423 •5-2*

6. СН не-А - 24275+2104 28314;+2310

7. го-8 21555+2546 54117+4503 7-6*

8. ю-7 29508+2725 3-5* 31 "■65+333; 8-6*

9. то~ь 31267+2159 9-5* 61979+3463 9-6*

Ю. СН щ - 22395+1158 25059+28ч6

II. Ю"7 •¿4417+3540 83308+3571 11-10*

12. СН МЦ/ивд - 23030+1450 22491+3305

13. Ю"7 22859+2799 61450+6466 13-т2*

14. Не-Т+ - - 5374+517 5455+526

15. МЛ СН МНК 10~8 5577+309 5384+271

16. 5584+605 5838+487

17. ю-7 6436+626 6512+419

18. ю-6 ■ 6380+437 7741+257 13-15*

19. СН не-А - 5535+642 5390+739

20. ю-8 5958+394 10100+814 20-19*

21. ТО"7 7387+621 21-19* 5173+743

22. ю-6 7904+555 22-19* 9773+835 22-19*

23. СН мц то17 6725+840 4756+457

24. 6324+548 8835+457 24^23*

25. СН Щ/инд - 7542+489 - 3556+429

26. 10 . 7675+390 8386+494 26-25*

* - Р<0,05.

лиферацию культур не-Т и В лимфоцитов доноров и больных РА. ■

Таким образом, трекрезан стгмулируег пролиферацию обогащенной культуры В лимфоцитов.Активация клеток МЛ не изменяет интенсивности воздействия препарата.

При тестировании активностей СН клеток, после инкубации'с трекрезаном (таблица 2) установлено, что СН МНК доноров угнетают пролиферацию, СН не-А клеток усиливают ее в культуре несепа-рированных МНК, активированных МЛ, СН МЦ и СН Щ/инд неактивна. В культуре не-Т клеток, активированных МЛ, только СН не-А клеток усиливают пролиферацию, остальные СН неактивны.

СН МНК, не-А клеток, МЦ и МЦ/инд больных РА усиливают пролиферацию несепарированных и сепарированных МНК, активированных МЛ.

Из полученных данных*следует, что трекрезан у доноров не влияет на продукцию МК МЦ, так как СН МЦ и СН МЦ/инд- неактивны, усиливает продукцию ЛК с В клеточной ростовой активностью. У больных РА трекрезан усиливает продукцию В и Т ростовых ЛК Т лимфоцитами и МК МЦ.

Результаты 2 и 3 этапов тестирования трекрезана-позволяют говорить об относительно селективном влиянии его на В лимфоциты.

Трекрезан стимулирует ФГА индуцированные и' угнетает спонтанные Тс доноров и стимулирует ФГА индуцированные -у больных РА.Препарат угнетает эффекторные функции Т лимфоцитов у доноров, но в еще большей степени у больных РА.

Трекрезан увеличивает количество более дифференцированных В лимфоцитов, при этом его влияние у больных РА менее выражено.

Таким образом, трекрезан,- как и левамизол, стимулирует пролиферацию, но с помощью иного механизма.Тре'крезан относительно селективно стимулирует пролиферации и дифференцировк-у В лимфоцитов, усиливает у доноров продукцию ЛК, стимулирующих рост В лимфоцитов, угнегаег активность спонтанных Тс/ активирует у больных РА продукцию ЛК и Ж, не влияет на спонтанные Тс .Препарат угнетает эффекторные функции Т лимфоцитов.

Изучение иммунофармакодинамики БИИ.

Как следует из рисунка 3, БКШ усиливает у доноров и больных РА спонтанную и МЛ активированную пролиферацию и не влияет

Рисунок 3. ВЛИЯНИЕ ЕКШ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ НЕСЕПАРИРОВАННЫХ ЫНК.

12 3 4 пролиферация на 3 сутки

12 3 4 пролж!ерацт.ш .га 5 сутки

12 3 4 пролиферация на 3 сутки

I - культура без ЕАВ, 2-е БАЗ в дозе Ю~8 г/мл, 3 - с БАВ в дозе 1С"7 г/мл, 4 - с БАВ в дозе

10~6 г/мл.

12 3 4 пролиферация на 5 сутки

Таблица З.ЖЙЯШЕ GH КЛЕТОК ПСаТЕ ИНКУБАЦИИ С EfŒI НА

ПРОЛИФЕРАЦИЮ ННСЕПАВ') РОВАНШХ. И СЕПАРИРОВАННЫХ МНК.

J i и/а Тест-система сн Доза БАВ Доноры (n=8) Больше PA (n--8)

!vï + M P M + m ?

X. МНК+ - - 17688+1838 18835+2962

2. сн im иг* 16-578+1307 I6164+2668

3. 16854+2537 17639+2124

4. ю-7 I688I+II2I I6239+4123

ü. Ю-6 17122+2042 18639+2670

6. СН не-А - 22998+3209 23027+3212

7. иг8 I9G06+3278 27807+3018

8. кг7 Ï92I5+3936 26671+2644

9. I0"ß 20537+2593 26010+2765

10. СН Щ ю17 21586+2508 23750+3637

II. 45330+2585 II- -10* 25862+4195

12. Cíí иЩ/инд - 21953+2059 22319+2755

13. lu-7 54884+2395 13-12* 27461+27-51

14. Не—Т+ - ю-8 5168+767 5474+660

15. ..Я СН МНК 5814+439 6315+441

К. Iü"8 6694+444 8704+482 16-15*

17. io-7 8101+533 17- -15« 8668+509 17-15*

IB. IO-6 10273+668 18- -15* 8639+541 18-15*

19. СН не-А - 6372+701 4323+454.

20. IO"8 5610+492 20- -19* 2253+726 20-19*

21. IO"7 4642+548 21- -19* 2051+987 21-19*

22. I0"5 4828+651 22- -19* 1662+832 22-19*

СН Щ - 6835+357 5380+787

24. TO"7 13670+351 24- -23* 5501+890

25. ОН МЦ/инд - 7224+ />20 5124+436

id. 10 18060+436 26- -25* 5799+842

х - P<<J,üb.

на ФГА активированную.Его действие несколько превышает активность левамизола.Характерно снижение чувствительности МНК к БКШ при активации их поликлональными митогенами, особенно Т клеточным митогеном ФГА.

Как -у доноров, так и у больных РА при истощении культуры от МЦ пролиферация мало изменяется.Препарат стимулирует пролиферацию, спонтанную и активированную Ш1, у доноров и больных РА в культуре не-Т и В лимфоцитов.

БШ стимулирует пролиферацию В лимфоцитов, возможность прямого и опосредованного МЦ я Т лимфоцитами влияния уточнялась экспериментами по тестированию СН.

Как следует из таблицы 3, СН МНК и СН не-А клеток донорое неактивны в культуре !«Ж, активированных Ш1.СН 1Щ и СН йЦ/инд усиливают пролиферацию.СН МНК, СН МЦ и СН МЦ/инд усиливают, а СН не-А клеток угнетают пролиферацию не-Т клеток, активированных МЛ.

СН МНК и не-А клеток больных РА проявляют аналогичное влияние, СН МЦ и СН Щ/инд неактивны.

СН МЦ/шд доноров более активны, чем СН МЦ, поэтому, вероятно, препарат усиливает продукцию МК Щ и не влияет :?- продукции ПтЕ^».Можно предполагать, что БКШ усиливает продукцию 3 клеточных регуляторных Ж Г лимфоцитами.Его активность более вырачсена у здоровых людей.

На основании результатов 2 и 3 этапов тестирования БШ можно предполагать его относительно селективное влияние на 3 лимфоциты.

БКШ не действует на Тс у доноров и усиливает активность спонтанных Тс у больных РА.Препарат не влияет на Тэф функции и стимулирует дифференцировку В лимфоцитов.

Таким образом, БКШ стимулирует пролиферацию, но в отличие от левамизола обладает относительно селективным влиянием на пролиферацию и дифференцировку В лимфоцитов, усиливая продукцию Ж МЦ и Ж с регулирующим В клеточный рост влиянием Т лимфоцитами преимущественно у доноров.Препарат повышает активность неспецифических Тс при ее снижении, не влияет на активность Тэф лимфоцитов.

Тестирований активностей БК и ЕМ.

ЕК и Ш не влияют на пролиферацию культур ШК.

Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что скрининг иммунофармакодинамики 7 новых BAJ3 выявил 3 перспективных пре- ; парата: мивал, трекреаан и БИВ.Соединения различаются по фар-макодднашческим эффектам между собой и от эталонного препарата левамизола.

Учитывая высокую биологическую активность .этих препаратов, малую токсичность, данные об юс иммуностимулирующем влиянии в экспериментах in vivo (Колесникова О.П., IS90), дополненные результатами наших: исследований, можно рекомендовать их для клинических испытаний в качестве иммуноактивных средств в лечении органонеспецифических аутоиммунных заболеваний, вторичных иммунодефицитав и как превентивные ередства в группах риска по развитию вторичных иммунодефицитов.

Предложенная система скрининга воспроизводима, позволяет выявлять относительную селективность действия иммуноактивных" -средств.Эталонный препарат левамизол обнаружил при тестировании в ней те же результаты, что я в других многочисленных системах. При использовании нашей системы скрининга установлено соответствие данных, полученных in vitro,_ результатам экспериментов in vivo.Все это позволяет использовать данную систему для оценки фармакодинамики иммуноактивных препаратов.

ВЫВОДЫ.

I.Оценка уровня пролиферации несепарированных и сепарированных" мононуклеарных клеток, стимулированных митогенами, у здоровых людей и больных с нарушениями функционирования клеток иммунной системы составляют систему скрининга иммунофармакодина-мики иммуноактивных средств.

2.Фармакодинамический эффект силатраяа мивала характеризуется '• активацией преимущественно Т лимфоцитов за счет усиления продукции ростовых лкмфокинов и угнетения продукции проста-гландина Ео, стимулирующим влиянием на Т эффекторные и не- ' специфические Т супрессорнне лимфоциты; в отличие от левамизола действие мивача более выражено в культурах клеток здо-■оовых людей, чем больных ревматоидным артритом.

3.Производное уксусной кислоты трекрезан относительно селектив-

но стимулирует пролиферацию и дифференцировку В лимфоцитов, усиливает продукции лимфокинов и монокинов у больных ревматоидным артритом, не влияя на продукцию монокинов у доноров, угнетает активность неспецифическнх Т супрессорных и Т эф-фекторных лимфоцитов.

4.БиоФлавоновд из корня шиповника относительно селективно стимулирует пролиферацию и диффеюенцщювку В лимфоцитов, стимулирует продукцию монокинов и регулирующих В клеточный рост лимфокинов, повышает активность неспецифических Т суп-рессоров у больных ревматоидным артритом.

5.Фармакодинамические свойства мивала, трекрезана, биофяавоно-вда из корня шиповника, различающиеся между собой и отличающиеся от свойств эталонного препарата левамизола, их иммуностимулирующая активность in vivo дозволяют рекомендовать их для клинических испытаний в качестве лечебных и профилактических средств пои вторичных иммунодефицитах и аутоиммунных заболеваниях.

6.Ишдазолсодержащий препарат кобазол в отличие от левамизола умеренно угнетает пролиферацию культур жшонуклеарных клеток больных ревматоидным артритом, повышая активность неспецифя-ческих Г супрессорных. лимфоцитов и усиливая продукцию рост-ингибируших лимфокинов и монокинов.

7.Имидазоясодержащта препарат авдзол, биофлавоноидц из кровохлебки и манжетки не влияет на пролиферацию у доноров и больных ревматоидным артритом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1Дук Е.А.Методические подходы к изучению иммуноактивных свойств биологически активных веществ ин витро/Л'олодые ученые-медики науке и практическому здравоохранению: Тез. докл. конф. молодых ученых СО АШ CCGP.-Новосибирск,I99G.-C.II-I2.

2.Жук Е.А.Тест-смстема in vitro для изучения механизма действия иммуноактивных препаратов//?ез. докл. Всесоюзн. совещания "Культивирование клеток животных и человека".-М., 1990.-

0. 91-92.

3.Жук Е.А., Ширинский В.С.йммунотропнне свойства силатранов и герматраиов//Биологнческая активность соединений кремния, германия и олова: Тез. докл. 1У Всесоюзн. конф.-Иркутск,

1990.-С. 27.

4.Жук Е.А.Влияние оиофлавоноида на пролиферативную активность лимфодитов//экологические аспекты иммунопатологический состояний: Тез. докл. Всесоюзн. конф.-ivl., Алма-Ата,1990.-

Т. 1,-0. 18.

S.Shirinsii V.3, , ZïraV. В.A. The influence of Moflevonoiâэ and silatrane? on monocytes in vitro//All Union Symposium witli tlie participation of foreign scientists: Abstracts,-' FovosiMrsb, 199C.-P. 1*2.

6.Жук E.А.Тест-система in vitro для оценки эффективности им-муноактивной терапии//Реабилитация иммунной системы: Тез. докл. П Международного симн.-Цхалтубо, 1990.-С. 45.

7.Ширинский B.C., Жук В.А.-Влияние биофлавоноидов из лекарственных растении Сибири на пролиферацию лимфоцитов in vitro//Нммуномодуляторы природного происхождения: Тез. докл. рабоч. совет.-Владивосток, 1990.-С. 30-32.

8.Ширинский B.C., Жук Е.А.Характеристика и клиническое применение иммуностимулирующих препаратов//Тер. архив..-1990.-й 12.-С. 125-132.

9.Ширинский B.C., Кук Е.А., Сенникова O.A.Проблемы иммуностимулирующей терапии//Тез. докл. I Республ. съезда иммунологов и аллергологов Таджикистана.-Душанбе, I99I.-C. 154.

10.Жук E.A.K вопросу использования Р-виташнных соединений у больных ревматоидным артритом//Клиническая витаминология: Тез. докл. Всесоюзн. конЛ.-М:, I99I.-C. 253-254.

11.Ширинский B.C., Жук Е.А.Проблемы иммуностимулирующей тера-пяи//Иммунология.-1991.-.№ З.-С. 7-10Г

12.Кук Е.А.Йммунотерапевтические подходы к лечению ревматоидного артрита//Латогенез хронического воспаления: Тез. докл. Всесоюзн. симпозиума с международным- участием.-Новосибирск,

1991.-C. 85-86.