Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Экспериментальное исследование ранозаживляющих свойств дигидрокверцетина при термической травме кожи.

На правах рукописи

ЩУКИНА Ольга Геннадьевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИХ СВОЙСТВ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА ПРИ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ КОЖИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2013

13 ПАР 2014

005546030

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ангарская государственная техническая академия» и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства»

Научные руководители: Юшков Геннадий Георгиевич

кандидат медицинских наук, доцент Баринов Владимир Александрович доктор медицинских наук, профессор

Официальные Оковитый Сергей Владимирович

оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой фармакологии и клинической фармакологии Башарин Вадим Александрович доктор медицинских наук

Федеральное государственное казенное образовательное учреждение военно-профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, профессор кафедры военной токсикологии и медицинской защиты

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологйи человека» Федерального медико-биологического агентства России

Защита состоится /Гг. в часов на заседании

диссертационного совета Д/ 208.030.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства» по адресу: 192019, г. Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства».

Автореферат разослан _20

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Луковникова Любовь Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В настоящее время высокие показатели ожогового травматизма являются одной из актуальных проблем медицины и общества в целом (Гусейнов Т.С. и соавт., 2013; Зиновьев Е.В., 2013). Почти два миллиона человек в мире получают ожоги ежегодно, приблизительно сто тысяч обожженных нуждаются в госпитализации и тысячи ожогов заканчиваются летальным исходом (Миронов С.П. и соавт., 2007; Гребенюк А.Н., Баринов В.А., Башарин В.А., 2008; Вазина И.Р., Бугров С.Н., 2009). При этом зачастую, несмотря на лечение, заживление ран происходит с образованием рубцов (Абаев Ю.К., 2003), что определяет необходимость создания новых лекарственных средств, улучшающих течение пролиферативно - репаративных процессов в ране.

В настоящее время интенсивно изучаются вопросы патогенеза раневого процесса при термической травме кожи, влияния различных фармакологических средств на течение и исходы длительно незаживающих ран (Абаев Ю.К., 2003). В фармакологии активно развивается направление создания лекарственных средств на основе растительного сырья (Сафонов В.В., Сафонова М.Ю., Лесиовская Е.Е., 1999). Это обусловлено высокой биологической активностью веществ растительного происхождения, благодаря сочетанию в них целого комплекса соединений, способных действовать на организм как самостоятельно, так и проявляя синергизм друг к другу (Лесиовская Е.Е., Саватеева-Любимова Т.Н., 2011). В отличие от синтетических лекарственных средств, многие вещества, синтезируемые растениями, являются физиологичными по отношению к человеку (Барабой В.А., 1984).

В последние годы для лечения ожогов и профилактики послеожоговых осложнений все большее внимание привлекают биологически активные вещества растительного происхождения, связывающие и нейтрализующие свободные радикалы, а также другие токсические соединения на поверхности ран (Никулин A.A. и соавт., 1992; Кулатаева А.К., 2006; Нестерова Ю.В. и соавт., 2009; Наумов A.A. и соавт., 2010). Применение антиоксидантов определяется важной ролью процессов свободнорадикального и перекисного окисления в заболеваниях и травмах, сопровождающихся повреждением и воспалением тканей, включая ожоги (Оковитый C.B., 2003). Показано, что многие биологически активные вещества растительного происхождения, входящие в состав лекарственных средств и содержащие в своём составе антиоксиданты, способны оказывать противогипоксическое, антимикробное и противовоспалительное действие, проявляя синергизм с другими природными и синтетическими фармакологическими средствами (Саватеева-Любимова Т.Н, Лесиовская Е.Е, Сивак К.В., 2008). Одним из таких веществ является дигидрокверцетин (ДКВ), который был впервые выделен из древесины лиственницы сибирской в лаборатории природных соединений Иркутского института органической химии Сибирского отделения РАН (Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Дьячкова С.Г., 1997).

Степень разработанности темь*. Дигидрокверцетин выделяют из комля и щепы лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.), даурской (Larix dahurica Turcz.) и лиственницы Гмелина (Larix Gmelinii), произрастающих на территориях северовосточной и восточной части России, а также в Северной Америке. Лиственное сырьё ценно тем, что 80 % дигидрокверцетина находится в комле, который, как правило, не используется лесозаготовителями и остается на лесосеках.

Разнообразие биологических эффектов ДКВ, многие из которых были обнаружены В.К. Колхир, H.A. Тюкавкиной, В.А. Быковым (1995), в значительной степени связано с его антиоксидантнйми свойствами. ДКВ существует в виде четырех энантиомеров, что отражается на его физико-химических свойствах. Рядом авторов проведена оценка антиоксидантной активности производных этого вещества и взаимосвязь полученных эффектов с их химическим строением (Роговский B.C., Матюшин А.И., Шимановский H.JL, 2010).

Дигидрокверцетин широко используют в пищевой промышленности, в косметологии и фармакологии. К настоящему времени известны такие фармакологические эффекты дигидрокверцетина, как антиоксидантный, капилляропротекторный, противоспалительный, гастропротекторный,

гепатопротекторный, радиопротекторный, гиполипидемический, диуретический, которые по ряду показателей в 3 — 5 раз превосходят соответствующие эффекты кверцетина и рутина (Плотников М.Б., Тюкавкина H.A., Плотникова Т.М., 2005).

Однако действие дигидрокверцетина на раневую поверхность и на заживление ожоговых поражений кожи практически не исследовано. Не изучено токсическое влияние на организм ДКВ, выделенного из лиственницы сибирской по новой технологии с применением мембранных фильтров и не дана оценка безопасности данного вещества, что является необходимым условием при создании новых лекарственных форм (Лесиовская Е.Е., Саватеева-Любимова Т.Н., 2011).

Таким образом, исследование влияния местного применения ДКВ на течение и исход термического ожога кожи, с оценкой безопасности этого вещества, является актуальной научной задачей, что и обусловило выбор цели настоящей работы.

Цель работы: экспериментально оценить ранозаживляющую эффективность дигидрокверцетина при термической травме кожи и обосновать возможность его использования в составе лекарственных форм для наружного применения.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. В экспериментальных исследованиях на кроликах оценить эффективность дигидрокверцетина при его применении в составе мазевой лекарственной формы для лечения термических ожогов кожи IIIA степени.

2. Установить основные механизмы противоожоговых эффектов дигидрокверцетина.

3. В острых и хронических экспериментальных исследованиях на двух видах лабораторных животных оценить безопасность применения дигидрокверцетина.

4. Установить основные поражаемые органы и характер токсического действия дигидрокверцетина на организм экспериментальных животных.

Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые:

- показана возможность использования дигидрокверцетина при его наружном применении для лечения термических ожогов кожи;

- установлено, что ДКВ при местном применении облегчает течение ожоговой болезни, способствует благоприятному протеканию процесса заживления раны и полностью предотвращает образование грубого рубца при термических ожогах кожи IIIA степени;

- выявлено, что ключевые звенья механизма действия ДКВ в эффективных (терапевтических) дозах связаны с его антирадикалыюй активностью, способностью стимулировать антиоксидантную защитную систему организма, оказывать местное противовоспалительное, мембраностабилизирующее и детоксицирующее действие, улучшать состояние микроциркуляции;

- показано, что ДКВ является малотоксичным веществом, не обладает местно-раздражающим действием, хорошо переносится и безопасен при длительном применении;

- установлены основные поражаемые органы при поступлении в организм ДКВ в высоких дозах (печень, сердце) и определено, что его токсичность связана с прооксидантной активностью.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость исследования состоит в раскрытии основных механизмов противоожоговой эффективности ДКВ при его наружном применении в составе мазевой лекарственной формы для лечения термических ожогов IIIA степени. Установлены закономерности реакции организма на длительное введение ДКВ в разных дозах и определены уровни доз, в которых дигидрокверцетин проявляет антиоксидантные и прооксидантные свойства.

Практическая значимость исследования заключается в доказательстве благоприятного влияния местного применения ДКВ на протекание процесса заживления ожоговой раны, наиболее важным результатом которого является предотвращение образования грубого рубца при термических ожогах кожи IIIA степени. Экспериментально обоснована схема местного применения ДКВ при ожогах и представлены рекомендации по разработке гидро- и липофильных форм для наружного применения на его основе.

Материалы исследования используются в НЦ реконструктивной и восстановительной хирургии СО РАМН в научно-исследовательской работе по созданию модели раневой болезни и её лечения на лабораторных животных в условиях эксперимента (акт внедрения от 25.02.2010), в учебном процессе кафедры «Экология и безопасность деятельности человека» ФГБОУ ВПО «Ангарская государственная техническая академия» (АГТА) при изучении курса «Основы токсикологии» (акт внедрения от 15.02.2010), в работе отдела токсикологии НИИ биофизики ФГБОУ ВПО ATTA (акт внедрения от 4.02.2010), в системе

Регионального управления Госсанэпиднадзора для оценки производств сопутствующих химических соединений на предприятиях, контролируемых территориальным органом Госсанэпиднадзора ФМБА России (акт внедрения от 19.02.2010).

Методология и методы исследования. Диссертационное исследование выполнялось в несколько этапов. На первом этапе изучалась отечественная и зарубежная литература по проблеме исследования. На втором этапе отрабатывалась экспериментальная модель термической травмы кожи, а также адекватные методы оценки противоожоговой эффективности и безопасности ДКВ. На третьем этапе проводились экспериментальные исследования ранозаживляющих свойств ДКВ при термическом ожоге кожи у кроликов. На четвертом — экспериментальные исследования по оценке безопасности ДКВ в острых и хронических опытах. На пятом - анализировались результаты собственных исследований, формулировались и обосновывались научные положения и выводы, вытекающие из результатов работы.

Для решения поставленных задач и достижения поставленной цели проведены экспериментальные исследования на трех видах животных (кролики, крысы, мыши). Использованы современные токсикологические, физиологические, биохимические, гематологические, патоморфологические и физико-химические методы с последующей статистической обработкой полученных данных.

Положения, выносимые па защиту:

1. Дигидрокверцетин в составе мазевой лекарственной формы эффективен при лечении термических ожогов кожи IIIA степени, обеспечивая процесс заживления ран без повреждения свежеобразованной кожи и без образования грубого рубца.

2. В основе ранозаживляющего действия дигидрокверцетина при термических ожогах кожи лежат его свойства стимулировать антиоксидантные механизмы защиты клеток от окислительного стресса, улучшать микроциркуляцию, уменьшать воспалительные процессы в ране, оказывать местное детоксицирующее действие.

3. В дозах, рекомендуемых для лечения ожоговой болезни, дигидрокверцетин не оказывает неблагоприятного побочного действия на организм, безопасен при длительном применении. Основными органами, поражаемыми при введении в организм дигидрокверцетина в высоких дозах, являются сердце и печень.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности определяется репрезентативным объемом выборки экспериментальных животных, применением комплекса современных методов экспериментальных исследований (токсикологических, физиологических, морфологических, гистохимических, биохимических, гематологических) и адекватных приемов математической статистики.

Материалы диссертации доложены и обсуждены: на XI международной научной школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2007г); на международной научно-практической конференции «Дальневосточная весна-2008» (Комсомольск-на-Амуре, 2008); на III съезде токсикологов России (Москва, 2008); на научно-практической

конференции «Лабораторные животные как основа экспериментальной медицины» (Томск, 2009); на международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы электрофизиологии и незаразной патологии животных» (Улан-Удэ, 2009); на ХХ1П международной научно-практической конференции «Современная медицина: актуальные вопросы» (Новосибирск, 2013); на VI Международной научной конференции «Европейские прикладные науки: современные подходы в научных исследованиях» (Штутгарт, Германия, 2013).

Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ отдела токсикологии НИИ биофизики ФГБУ ВПО ATTA и ФГБУН «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства» в 2007 - 2013 гг. по теме НИР: «Исследование влияния дигидрокверцетина, полученного по новой технологии с применением мембранных фильтров, на термический ожог кожи».

Личное участие автора. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны совместно с научными руководителями на основе многолетних целенаправленных исследований. Автор самостоятельно обосновала актуальность темы диссертации, ее цель, задачи и этапы научного исследования. Лично проведен анализ литературы, отработана экспериментальная модель оценки фармакологической активности ДКВ, освоены и самостоятельно выполнены токсикологические, физиологические, биохимические методики, приемы забора биологического материала для патоморфологических исследований, способы окраски и приготовления гистологических препаратов. Лично выполнены экспериментальные исследования по изучению ранозаживляющих свойств дигидрокверцетина при термической травме кожи и проведена оценка безопасности ДКВ на лабораторных животных, с их последующей статистической обработкой и анализом полученных данных. Личный вклад автора составляет 90-95%.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 23 научных работах, из них 8 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент № 2405536 РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста: состоит из введения, обзора научной литературы, главы с изложением результатов экспериментальных исследований, главы с обсуждением результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (152 отечественных и 46 зарубежных источников). Содержит 7 таблиц, 78 рисунков и 1 приложение.

Методы статистической обработки цифрового материала. Полученные цифровые данные обрабатывали с помощью пакетов прикладных программ "Microsoft Excel" и "Biostat". Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р<0,05 (Петри А., Сэбин К., 2009). Для оценки значимости различий результатов, представленных в альтернативной форме, использовали точный метод Фишера для четырехпольной таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе 1 проведен литературный анализ данных о биологически активных веществах природного происхождения — флавоноидах, их фармакологических свойствах, роли процессов свободнорадикального и перекисного окисления в патогенезе термической травмы кожи, для обоснования использования ДКВ при лечении ожоговых ран.

Глава 2 посвящена моделированию термической травмы кожи в эксперименте, методам исследования, которые бьии использованы в работе, и методам статистической обработки полученных данных.

В главе 3 изложены результаты собственных исследований автора.

В главе 4 представлено обсуждение результатов исследований.

В заключении подводятся итоги выполненных исследований, приведены выводы и практические рекомендации.

Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования выполнены на 21 нелинейных кроликах (самцы, возрастом 5-5,5 месяцев, массой 3-3,5 кг), 220 нелинейных белых крысах (самцы, возрастом 2,5-3 месяца, массой 150-180 г), 90 нелинейных белых мышах (самцы, возрастом 2-2,5 месяца, массой 18-22 г), выращенных в условиях вивария-питомника лабораторных животных НИИ биофизики ФГБОУ ВПО ATTA из родоначальной популяции животных, поступивших из племенного хозяйства Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии ФС по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Вектор» (г. Новосибирск).

Исследуемые образцы субстанции ДКВ были получены по новой технологии с применением мембранных фильтров из лиственницы даурской (Гмелина) по ТУ 2455001-53364601-05. Выделенный из лиственницы высокочистый ДКВ представляет собой белый или слегка с желтым оттенком мелкокристаллический порошок с температурой плавления 220-222°С, хорошо растворимый в ацетоне, метаноле, этаноле, этилацетате, плохо — в воде. Структурная формула ДКВ представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Структурная формула дигидрокверцетина

Количественное определение ДКВ в образцах препарата (контроль чистоты и качества) проводилось методом ВЭЖХ в этиловом спирте с концентрацией 0,8-1,1

мг/мл на хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», Новосибирск, Россия). Содержание основного вещества в образцах ДКВ относительно ГСО составило 97,0 %.

Исследование ранозаживляющей эффективности дигидрокверцетина при его применении в составе мазевой лекарственной формы при термических ожогах кожи проводили в экспериментах на кроликах. Термический ожог кожи IIIA степени на спине у кроликов вызывали контактным высокотемпературным способом, который позволял получить стандартные по площади и глубине ожоги кожи. Время экспозиции нагретой до 500°С контактной пластинки не превышало 30 с. Ожог наносили животным под легким эфирным наркозом на предварительно выстриженный участок кожи. Площадь ожога составляла около 16 % от поверхности тела кролика.

Для лечения ожогов применяли мазь с ДКВ, изготовленную в отделе токсикологии НИИ биофизики ФГБОУ ВПО АГТА. Мазь наносили на рану марлевым тампоном ежедневно, начиная со вторых суток. Препаратом сравнения являлось облепиховое масло - зарегистрированный официнальный препарат, используемый как стимулятор репарации тканей при ожогах, отморожениях, трофических язвах и других длительно неэпителизирующихся раневых поверхностях (Чекман И.С. и соавт, 1986; Машковский М.Д., 2005). В качестве основы для мази с ДКВ был выбран свиной нутряной жир, который содержит компоненты, близкие к составу облепихового масла, совместим с тканями организма человека, хорошо смешивается с углеводородами и застывает при комнатной температуре, вследствие чего при нанесении па рану мазь не стекает с её поверхности. Благодаря таким свойствам свиной жир (топленый пищевой) используется как вспомогательное вещество в составе в мазей для лечения ран, например, в мази «Биопин» (5-10%).

Для анализа заживления раны по типу вторичного натяжения был выбран тест J1.H. Поповой, заключающийся в том, что на рану накладывали стерильную пластинку целлофана и на нее наносили контуры раны. Рисунок переносили па миллиметровую бумагу и подсчитывали площадь раны. Измерения повторяли через 3, 7, 14, 21, 30,40 дней и вычисляли коэффициент WpaHbl (%), характеризующий скорость уменьшения площади раневой поверхности за сутки по отношению к предыдущему результату по формуле:

w

раны g (1),

где:

S -площадь раны при предшествующем измерении, мм2;

S„ -площадь раны в настоящий момент, мм2;

t - число дней в интервале измерения (предыдущем и последующем).

Толщину кожной складки в области раны (в мм) определяли с помощью микрометра - толщинометра ТР-1-10. Модуль комплексного сопротивления кожи (кОм) определяли с помощью омметра.

Для исследования гематологических показателей у кроликов брали кровь из ушной вены и с помощью анализатора Hemolux-19 определяли в ней гемоглобин (г/л), эритроциты (1012/л), лейкоциты (109/л). Содержание ретикулоцитов (10,2/л) и уровень СОЭ определяли унифицированными методами.

Для определения биохимических показателей крови у кроликов (содержание общего белка и альбуминов в сыворотке крови (г/л)), использовали автоматический биохимический анализатор EuroLyzer (Австрия).

Для морфологических исследований под слабым эфирным наркозом в асептических условиях, проводили забор образца раневой поверхности па границе со здоровыми тканями с последующим гемостазом. Кусочки поверхности кожи (участок непораженный и раневой) расправляли на фильтровальной бумаге, фиксировали в 10 % растворе формалина, проводили через спирты и запивали раствором -парафин/воск в соотношении 95/5. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином по ван-Гизону (Меркулов Г.А., 1969)

Исследование антиоксидантного действия ДКВ осуществляли в опытах на нелинейных белых крысах при сочетанном его введении с прооксидантом дициклопентадиеном (ДЦПД), моделируя тем самым состояние процессов свободнорадикального и перекисного окисления в области ожоговой раны. При этом формировали следующие экспериментальные группы животных: I группа — контроль (п =10); II группа - получавшие ДЦПД в дозе 600 мг/кг и через 30 минут ДКВ в дозе 86 мг/кг (n=10); III группа - получавшие ДКВ в дозе 86 мг/кг за 30 мин до введения ДЦПД в дозе 600 мг/кг (n=10); IV группа - получавшие ДЦПД в дозе 600 мг/кг (п=10).

ДЦПД и ДКВ крысам вводили внутрижелудочно через атравматичный зонд. Обследование осуществляли через 1 час после введения ДЦПД. В крови определяли показатели, характеризующие процессы свободнорадикального и перекисного окисления, а также антиоксидантной защиты: уровень малопового диальдегида (МДА); гидроперекиси липидов (ГПЛ); активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) (Калетина Н.И., 2008); уровень восстановленного глутатиона (GSH) (Zhao Lina, 2006).

Доклинические исследования безопасности ДКВ проводили, руководствуясь Методическими указаниями по изучению общетоксического действия лекарственных средств (Хабриев Р.У., 2005).

Острые эффекты ДКВ при его однократном введении оценивали в опытах па белых нелинейных мышах (п=70) и белых нелинейных крысах (п=30) по следующим показателям: 1) выживаемости животных при 14-суточном периоде наблюдения с расчетом среднелетальной дозы (LD50) по методу Кербера; 2) общему состоянию животных (масса тела, потребление пищи и воды, состояние шерсти); 3) поведенческим показателям; 4) гистологическим исследованиям препаратов сердца, печени, почек с гистохимической оценкой активности ферментов, содержания гликогена и общих липидов. Также влияние ДКВ на организм животных (белые крысы, п=12) при однократном введении в динамике оценивали по результатам ЭКГ во II стандартном отведении со скоростью 25 мм/с (прибор ЭК 1Т -03М). При оценке

острой токсичности ДКВ растворяли в воде для инъекций до получения однородной суспензии и вводили внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд в дозах от 1000 мг/кг до 10000 мг/кг.

Раздражающее действие ДКВ на слизистую оболочку глаза исследовали закапыванием в конъюктивальный мешок кролика одной капли взвеси (концентрация 100 г/л). Второй глаз - контроль. Оценку повреждающего действия ДКВ на слизистую оболочку глаза кролика проводили по балльной системе (Majda А., Chuscielska К., 1973).

Эффекты ДКВ при его хроническом введении оценивали по физиологическим, в том числе поведенческим, гематологическим, биохимическим и гистохимическим показателям, а также по выживаемости животных. Коэффициент кумуляции по Жданову рассчитывали при повторном ежедневном введении препарата белым мышам в дозе 2000 мг/кг. Хроническое введение ДКВ осуществляли в течение 90 суток. Использовали 150 белых нелинейных крыс-самцов массой 180-220 г, разделенных на 15 групп (5 групп на каждый этап обследования) по 10 крыс в каждой:

1 группа - получавшие ДКВ в дозе 86 мг/кг (ожидаемая эффективная);

2 группа - получавшие ДКВ в дозе 860 мг/кг (промежуточная);

3 группа - получавшие ДКВ в дозе 3000 мг/кг (ожидаемая токсическая);

4 группа - получавшие витамин Р в дозе 86 мг/кг (позитивный контроль);

5 группа — контроль.

Расчетные дозы ДКВ и витамина Р животные получали ежедневно с кормом. Доклинические исследования проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755) и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ВОЗ, 1985).

Результаты собственных исследований

Ранозаживляющее действие мази с дигидрокверцетином.

К концу первых суток после нанесения кроликам ожога на поврежденной поверхности кожи в основном завершались изменения, свойственные первой фазе течения раневого процесса, и имело место образование сухого струпа, характерного для ожога IIIA степени. Площадь поврежденной поверхности в этот период была одинакова во всех группах, так как ожог наносился стандартной контактной пластинкой (таблица 1). Отсутствие видимых признаков первичного инфицирования позволило начать лечение раны мазью с ДКВ и облепиховым маслом через 24 часа после нанесения ожога.

На третьи сутки эксперимента, то есть через двое суток после начала лечения, во всех группах животных произошло увеличение ожоговой поверхности относительно первых суток. Площадь раны, обработанной мазью с ДКВ, была меньше как по отношению к контролю, так и в сравнении с группой животных, которым наносили на рану облепиховое масло (таблица 1).

Сутки Площадь раны, мм2

Контроль ДКВ Облепиховое масло

1 20500 ±2" 20500 ± 2" 20500 ±2"

3 25433 ± 408 23412 ± 653" 26037 ±529

7 292452 ±316 25408 ± 587* 29900± 239

14 23331 ± 297 20637 ± 266* 25154 ±467*

21 15408 ±232 35900 ± 329* 19237 ±318*

30 5916 ± 163 7972 ± 195 7782 ± 131

40 1719 ± 158 1535 ± 167 1178 ± 169

47 175 ± 17 172 ± 19 171 ± 17

Примечания: 1) * - отличия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05; 2) ** - погрешность прибора

Гистологическое исследование кожи животных во всех группах в этот период выявило коагуляционный некроз эпидермиса, сосочкового и сетчатого слоев дермы. В контрольной группе (рисунок 2) наблюдался выраженный струп (1), некротические массы (2) и выраженный отёк дермы (3), коллагеновые волокна были набухшие и имели беспорядочную ориентацию. В группе животных с применением ДКВ (рисунок 3) наблюдали менее выраженную отечность эпидермиса (1) и дермы (2), образование грануляционной ткани (3). Отмечались очаговые образования грануляционной ткани, исходящие из пограничного слоя раневой поверхности.

Рисунок 2 - Участок кожи на 3 сутки после ожога у кролика из контрольной группы. Окраска: гематоксилин-эозин.

Рисунок 3 - Участок кожи кролика на 3 сутки после ожога при применении ДКВ. Окраска: гематоксилин-эозин.

На седьмые сутки эксперимента отмечалось дальнейшее увеличение площади раневой поверхности в контрольной группе. Следует отметить, что увеличение поврежденной поверхности, как характерный фактор в процессе раневой болезни, отмечалось H.A. Адамской (2005). По сравнению с третьими сутками площадь раны увеличивалась и в обеих подопытных группах, однако, площадь раны у животных с аппликацией ДКВ, была по-прежнему меньше, чем у животных контрольной группы и группы с использованием облепихового масла (таблица 1).

На седьмые сутки в контрольной группе животных (рисунок 4) гистологические исследования выявили коагуляционный некроз эпидермиса (1), отслоение эпидермиса от дермы по краю раневой поверхности (2), выраженную отечность соединительно-тканных волокон (3), беспорядочную ориентацию, некроз и паранекроз эпителия, волосяных фолликул (4).

В группе животных с применением ДКВ (рисунок 5) наблюдали активную пролиферацию эпидермиса (1) под струпом (2). То же наблюдали в группе животных, леченых облепиховым маслом (рисунок 6).

Рисунок 4 — Препарат кожи кролика на 7 сутки после ожога без лечения (контроль). Окраска по ван-Гизону

Рисунок 5 - Препарат кожи

кролика на 7 сутки после ожога и аппликации мази с ДКВ.

Окраска: гематоксилин-эозин

Рисунок 6 - Препарат кожи кролика на 7 сутки после ожога и аппликации облепихового масла. Окраска: гематоксилин-эозин

На четырнадцатые сутки наступила стадия заживления. Струп уменьшался в размерах, и началось его отделение от раневой поверхности. К этому сроку во всех группах раневая поверхность уменьшилась благодаря эпителизации её краевых частей. Наблюдалось формирование сосочков, волосяных фолликул и сальных желез. Жизнеспособные клетки пласта, окружающего дефект, продвигались со всех сторон под струп, эпителизируя поверхность одновременно образующейся грануляционной ткани. В контрольной группе сосочковая зона дермы была представлена пучками коллагеновых волокон, расположенных беспорядочно и рыхло (рисунок 7). В группе животных леченных ДКВ в сосочковой зоне дермы активно шла пролиферация кровеносных капилляров (указано стрелкой на рисунке 8). В группе животных с аппликацией облепиховым маслом в сосочковой зоне дермы коллагеновые волокна расположены компактно и рыхло (рисунок 9).

На двадцать первые сутки продолжалось отхождение струпа. В группе, леченой облепиховым маслом, площадь раны уменьшилась, но оставалась больше, чем в контрольной группе. Струп в обеих группах имел жесткую поверхность, которая затрудняла удаление его хирургическими инструментами и мешала животным при движениях, цепляясь за стенки клетки и доставляя им при этом дискомфорт.

У животных, которым проводили лечение мазью с ДКВ, проникновение в ткани действующего вещества создавало условия для эпителизации поверхности

Рисунок 7 - Препарат кожи кролика на 14 сутки после ожога. Контроль. Окраска: гематоксилин-эозин.

Рисунок 8 - Препарат кожи кролика на 14 сутки после ожога и аппликации ДКВ. Окраска: гематоксилин-эозин.

Рисунок 9 - Препарат кожи кролика на 14 сутки после ожога и аппликации облепихового масла. Окраска: гематоксилин-эозин.

раны, что привело к размягчению струпа и более легкому отторжению его. В процессе отторжения струпа имело место заметное растяжение кожных покровов у кроликов группы, леченой мазью с ДКВ, при этом площадь раны увеличилась более чем в два раза по сравнению с контрольной группой (таблица 1). Это расценивается нами как положительный признак, свидетельствующий об эластичности вновь образующихся кожных покровов. Увеличение площади раны при применении облепихового масла также имело место, но в меньшей степени и несколько раньше -с четырнадцатых суток наблюдения.

К двадцать первым суткам после ожога под растущим эпидермальным регенератом во всех группах постепенно появился тонкий слой грануляционной ткани. К этому же времени произошла очистка в соединительной ткани от омертвевших компонентов дермы и придатков кожи. В поверхностных частях раны клетки грануляционной ткани располагались без видимой ориентировки. В более глубоких слоях заметно уменьшилось количество сосудистых петель и клеток. При этом межклеточное вещество приобрело выраженное волокнистое строение, в большей степени выраженное у кроликов с аппликациями облепихового масла, кое-где волокна оформились в толстые пучки.

К тридцатым суткам эксперимента отмечалось отторжение струпа и резкое уменьшение площади раневой поверхности у кроликов во всех группах. В группе, которой проводилось лечение мазью с ДКВ, струп по-прежнему был мягкий и не беспокоил животных, легко удалялся с помощью хирургических инструментов. Движение животных этой группы стало свободным, их поведение и состояние было заметно более благоприятным, чем в контрольной группе.

За период с двадцать первых по тридцатые сутки в группе животных с применением ДКВ скорость уменьшения площади раны, оцениваемая по индексу Л.Н. Поповой, ежесуточно уменьшалась на 8,6 %. При использовании облепихового масла данный показатель снижался ежесуточно на 6,6 %, а в контроле он составлял

6,8 %. Это свидетельствовало о выраженной эффективности местного лечения раны мазью с дигидрокверцетином. Средняя скорость заживления раны за период с двадцать первых по тридцатые сутки в группе животных с лечением ДКВ была выше в 2,9 раза, чем в контроле и в 2,4 раза выше, чем при лечении облепиховым маслом. К тридцатым суткам в контрольной группе и группе с аппликациями облепихового масла произошло заживление с образованием грануляционной ткани. Микроскопически отчетливо видно проникновение эпидермиса под струп (1) и заполнение им раневой поверхности, однако небольшие участки раневой поверхности замещались коллагеновыми волокнами, образующими рубец (2) (рисунок 10). Несмотря на высокую скорость заживления раны у кроликов с применением ДКВ, площадь раны в этот период не достигла значений контрольной группы, однако микроскопически характеристика репаративно-пролиферативных процессов в тканях раневой поверхности была заметно более благоприятной, чем в контроле и при лечении облепиховым маслом.

Так, в группе с лечением ДКВ поверхность кожи представлена покровным эпителием, образующим "гребешки", глубоко внедряющихся в дерму (1), которая практически не отличалась от участка неповрежденной кожи (рисунок 11).

Рисунок 10 - Препарат кожи кролика. Рисунок 1 1 - Препарат кожи кролика.

Термический ожог, контроль на 30 сутки. Термический ожог, аппликации с ДКВ Окраска по ван-Гизону. на 30 сутки. Окраска: гематоксилин-эозин.

К сороковым суткам раны у животных затянулись. У всех животных в контрольной группе и в группе с аппликацией облепиховым маслом, в месте ожога заживление происходило с формированием избыточной грануляционной ткани, с развитием фиброза, ведущего к рубцовой контрактуре (келоидный рубец). У кроликов с аппликацией мазью с ДКВ, в 100% случаев (р=0,01) образовывался нежный рубец с небольшим фиброзом (нормотрофический рубец). Во всех группах животных наблюдалось интенсивное зарастание шерстью здоровой кожи.

Что касается электрического сопротивления кожи, то через 24 часа после нанесения ожога этот показатель достоверно возрос во всех группах, что свидетельствовало об отмирании эпидермиса и дермы, нарушении кровообращения и образования сухого струпа, хорошо проводящего ток (Буреш Я.. Петрань М., Захар И., 1962). В последующем периоде наблюдения, в группе, леченой мазью с ДКВ, показатель электрического сопротивления кожи превышал значения контрольной

группы, что может быть объяснено большим количеством некротизированных тканей, способствующих прохождению электрического тока, и свидетельствует о сформировавшемся «зрелом» струпе.

Толщина кожной складки (показатель, характеризующий отечность раневой поверхности) уменьшилась в группе с аппликацией ДКВ к третьим суткам эксперимента, то есть в процессе формирования струпа, по сравнению с контрольной группой. На седьмые сутки во всех группах произошло увеличение толщины складки кожи, связанное с утолщением струпа. В период, от седьмых суток к сороковым, толщина складки кожи у кроликов с аппликацией мази с ДКВ незначительно менялась, приближаясь к контролю. С применением облепихового масла толщина складки кожи менялась неравномерно относительно контроля.

Влияние на общее состояние животных. Местное применение дигидрокверцетина, помимо влияния на течение ожога и его исход, оказало также положительное системное действие на общее состояние кроликов, их поведение и потребление пищи, что характеризует более благоприятное течение ожоговой болезни. Масса тела кроликов в группах, которым проводилось лечение мазью с ДКВ и облепиховым маслом, увеличивалась к сороковым суткам на 10% от исходных значений (р<0,05). В то же время в контрольной группе животных масса тела к 40-м суткам только достигала исходного (фонового) уровня (рисунок 12).

1 3 40 -контроль ----ДКВ .......облепихоБое масло

* - отличия достоверны при р < О.ОД

Рисунок 12 - Динамика массы тела кроликов (в % от исходной) при термическом

ожоге кожи

Гематологические и биохимические показатели. В крови у животных к исходу первых суток после нанесения термического ожога имело место повышение эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина. СОЭ и ретикулоцитов. Температура тела животных и температура раневой поверхности в этот период также повышались, что свидетельствовало о начале ожоговой болезни. После седьмых суток, а именно, когда

был образован струп на раневой поверхности, количество эритроцитов, лимфоцитов, лейкоцитов, уровень гемоглобина и СОЭ нормализовались во всех группах.

Количество ретикулоцитов оставалось в пределах нормы на протяжении всего эксперимента. Обращает на себя внимание стабильность СОЭ на протяжении всего эксперимента в группе с аппликацией ДКВ. в то время, как в контрольной группе и в группе, леченой облепиховым маслом, этот показатель сохранялся на более высоком уровне (рисунок 13).

Такие биохимические показатели, как общий белок и альбумин в сыворотке крови, на протяжении всего эксперимента у животных достоверно не изменялись и оставались в пределах физиологической нормы. Вероятно, это связано с тем, что значимые изменения биохимических показателей имеют место при поражении поверхности кожи более 20% (Кузин МИ., 1982; Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990).

4,00

г 3,50 4 ¡Л

//к

3.00 2,50 -2,00 -1,50

1,00

14

21 30

40

—*—контроль —♦ ■ ДКВ -■•--обл.мас.чо

Рисунок 13 - Динамика СОЭ у кроликов при термическом ожоге кожи

Оценка эффективности дигидрокверцетииа как антиоксиданта на модели интоксикации дициклопентадиеном

В специально проведенном эксперименте было показано, что ДКВ при однократном профилактическом введении белым нелинейным крысам в дозе 86 мг/кг (III группа) тормозит процессы ПОЛ, индуцированные дициклопентадиеном, введенным внутрижелудочно в дозе 600 мг/кг. Выраженное антиоксидантное действие ДКВ при его применении за 30 минут до введения такого мощного прооксиданта, как ДЦПД, проявлялось в практически полном предупреждении снижения уровня восстановленного глутатиона, а также роста гидроперекисей липидов и МДА в крови, что было характерно для действия ДЦПД (таблица 2). Активность аланинаминотрансферазы в крови у животных III группы также практически не изменялась.

Таблица 2 - Показатели ПОЛ в крови у белых крыс при пероральном введении ДЦПД в дозе 600 мг/кг и ДКВ в дозе 0,086 г/кг (М ± т)__

Группы животных

Показатели I группа контроль II группа ДЦПД +ДКВ III группа ДКВ +ДЦПД IVrpynna ДЦПД

1 2 3 4 5

МДА, нмоль/мл 4,8±0,3 8,2±6,8 4,3±0,3 8,2±0,2*

ГПЛ, ед.опт.пл./мл 1,6±0,1 2,0±0,3 1,3±0,1* 2,0±0,1*

ALT, ед/л 63,4±0,9 113,0±15,2* 66,1 ±3,5 139,0±13,9*

Восстановленный 4,1 ±0,2 2,5±0,5* 5,7±0,4 1,4±0,1 *

глутатион, мкмоль/мл

Примечание: * - различия с контролем достоверны (р < 0,05).

Такие эффекты можно объяснить высокой антирадикальной активностью природного антиоксиданта ДВК, наиболее активно тормозящего процессы свободнорадикального окисления, а впоследствии и ПОЛ, еще на стадии кислородной инициации. Такая точка зрения в целом согласуется с данными литературы (Magdalan )., Szelag A., Chledba Е, 2007), однако сведений о столь выраженных антирадикальных эффектах ДВК в опытах in vivo в доступной литературе мы не обнаружили.

Известно, что при снижении уровня глутатиона, токсичность соединений, детоксицирующихся с его участием, повышается, поэтому конъюгаты ДЦПД и его метаболитов с глутатионом могут приводить к более выраженной интоксикации (Кулинский В.И., Колесническо Л.С., 2009). Снижение уровня GSH связано с его расходованием в глутатионпероксидазной реакции, обеспечивающей утилизацию ГПЛ. Это согласуется с представлениями Yoshikawa Masayuki о снижении концентрации глюкозы, на фоне нагрузки сахарозой, при введении животным флавоноидов природного происхождения (Yoshikawa М., Wand Т., Morikawa Т, 2007). В случае введения ДКВ после применения прооксиданта ДЦПД антиоксидантная эффективность дигидрокверцетина резко снижалась и практически не отражалась иа показателях ПОЛ, хотя уровень восстановленного глутатиона у подопытных животных (II группа) снижался меньше, чем под влиянием ДЦПД.

Экспериментальное исследование токсичности дигидрокверцетина и безопасности его применения

Исследование острой токсичности и местно-раздражающего действия

Исследование острой токсичности ДКВ при введении внутрь. По результатам подсчета гибели животных после однократного введения ДКВ среднелетальная доза ДКВ для мышей, рассчитанная по формуле Кербера, составляла LD5o:=7667±345 мг/кг. Для крыс значения LD50 ДКВ составляли >10000 мг/кг. Эти токсикометрические параметры позволяют отнести ДКВ к веществам 4 класса опасности.

Исследование кумуляции ДКВ при введении внутрь. Группе мышей вводилась ежедневно минимально смертельная доза 2000 мг/кг. Гибель мышей к концу 3-х суток составила 50%. Перед гибелью у животных наблюдались уменьшение подвижности, парез задних конечностей, одышка. Оставшиеся в живых были угнетены, некоторые сидели нахохлившись. Расчет коэффициента кумуляции (К=7667/6000= 1,28) свидетельствует о выраженной кумуляции ДКВ (11%).

Раздражающее действие ДКВ на слизистую глаза кроликов. После закапывания суспензии ДКВ на конъюнктиву глаза кроликам через 15-20 минут наблюдали слабое слезоточение, без отёчности и инъекции сосудов - не более I балла. Через 30-60 минут слезоточение прекращалось. Наблюдение за животными в течение последующих 14 суток не выявило патологических последствий аппликаций.

Исследование местно-раздражающего действия ДКВ на мышах. При аппликации ДКВ, местных признаков повреждения тканей не установлено, как и эффекта резорбции - динамика прироста массы тела животных и показателей состояния организма соответствовало контрольному уровню.

Исследование сердечно-сосудистой системы в острых опытах на крысах. Результаты анализа показателей ЭКГ (таблица 3) свидетельствуют, что ДКВ при однократном внутрижелудочном введении крысам в дозе 5000 мг/кг вызывает в первые сутки достоверное повышение зубца Я, на 3-й сутки - снижение ЧСС, а на 7-е тахикардию.

Таблица 3 - Динамика показателей ЭКГ у крыс (М±т)

№ сутки Частота, уд/мин Высота зубца Я, тУ

1 контроль 524 ± 8,6 0,36 ± 0,03

2 ДКВ (5000 мг/кг) / 1 сутки 510 ±5,8 0,45 ± 0,03*

3 ДКВ (5000 мг/кг) / 3 сутки 486,8 ± 4,7* 0,33 ±0.01

4 ДКВ (5000 мг/кг) / 7 сутки 580 ± 4,6* 0,43 ±0,07

5 ДКВ (5000 мг/кг) / 14 сутки 500 ± 14,1 0,40 ± 0,07

Примечание: * - отличия достоверны при р < 0,05

Морфологические исследования внутренних органов у крыс. При морфологическом исследовании препаратов сердца, после однократного введения ДКВ, на третьи сутки хорошо видно расширение капилляров, просветление цитоплазмы миофибрилл (рисунок 14).

.... • < - . '' Рисунок 14-11репарат миокарда крысы на 3 сутки после однократного воздействия ДКВ в дозе 5000 мг/кг. Окраска: гематоксилин-эозин.

Гистохимическое исследование препаратов печени на 3-й сутки после нутрижелудочного введения крысам ДКВ в дозе 5000 мг/кг выявило увеличение гликогена в опыте (4-5 баллов) по отношению к контролю (до 3 баллов). Незначительно увеличилась активность моноаминооксидазы (МАО) и активность щелочной фосфатазы (ЩФ). Активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) не отличалась от контроля.

На 14-е сутки в подопытной группе макроскопически отмечали более светлое окрашивание печени и почек (рисунок 15).

12 3 4^

Рисунок 15 - Макроскопическое исследование почек на 14 сутки: опыт (1-3), контроль (4)

Гистохимически установлено, что активность МАО и ЛДГ в печени на 14-е сутки была на уровне контроля, активность СДГ снижена на 1-1,5 балла, а ЩФ выше контроля на 1 балл. Активация дыхательных ферментов и ЩФ указывает на изменения проницаемости мембран. Выявленные изменения в печени свидетельствуют, что воздействие ДКВ в токсичных дозах сопряжено с изменениями активности сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, моноаминооксидазы и щелочной фосфатазы.

Исследование хронической токсичности

Влияние ДКВ на организм при многократном воздействии. В группе крыс, получавших препарат в дозе 86 мг/кг, включённый в суточный рацион (доза выбрана как ожидаемая эффективная), двигательная активность к концу первого месяца была выше, чем в контрольной группе. Норковый рефлекс в сочетании со статическим мышечным напряжением превышал контроль в 2,5 раза. В группе крыс, получавшей препарат в дозе 860 мг/кг, двигательная активность была пониженной к концу первого месяца в 14 раз. Норковый рефлекс у животных к концу первого месяца увеличился в 1,5 раза; ко второму месяцу он стабилизировался. Воздействие ДКВ вызвало стрессовое состояние животных, что проявлялось в пассивном передвижении и беспокойстве - «норковый рефлекс». Статическое мышечное напряжение к первому месяцу превышало контроль в 1,5 раза. Эти данные свидетельствуют, что ДКВ проявлял себя как стимулятор физической активности животных. Повышенное содержание сульфатов в моче, к первому месяцу, выявило наличие метаболитов и вывод их из организма. Группа крыс, получавших ДКВ в дозе 3000 мг/кг, внешне не отличалась от остальных, но так же, как и группа, получавшая препарат в дозе 860 мг/кг, проявляла снижение двигательной активности к первому месяцу наблюдений. Увеличилось количество АЛТ, характеризующей, изменения в печени и сердце, а также содержание глюкозы, мочевины, общего белка, количество меркаптуровых кислот в моче крыс.

Ко второму месяцу эксперимента спонтанная двигательная активность крыс уменьшилась в 2,7 раза, а к третьему в 3 раза. Показатели «норкового рефлекса» возросли в 1,5 раза по сравнению с контролем, оставаясь стабильными и к третьему месяцу наблюдений.

К концу третьего месяца показатели норкового рефлекса, статического мышечного напряжения, содержание гемоглобина не изменялись и были близки к контролю, что характеризует стабилизацию поведения животных. Содержание меркаптуровых кислот в группах, получавших ДКВ и витамин Р в дозе 86 мг/ кг, было близко к контролю и только в группе, получавшей ДКВ дозе 3000 мг/кг, превысило контроль в 1,1 раза. Вьивлено увеличение содержания глкжуроновой кислоты в моче животных при повышении дозы препарата во всех группах.

Содержание глюкуроновой кислоты в печени в группах, получавших ДКВ и витамин Р в дозах 86 мг/кг было меньше, чем в контроле. При увеличении дозировки ДКВ в 10 и 100 раз наблюдали рост показателя. Статическое мышечное напряжение животных, получавших ДКВ, к концу третьего месяца снизилось, оставаясь, однако, выше, чем в контроле в 1,2 раза. К третьему месяцу состояние организма животных в целом стабилизировалось на уровне, близком к контролю. Это свидетельствует о привыкании организма к ДКВ.

В результате анализа полученных данных сформировалось представление о ДКВ как о биологически активном веществе, способном вызывать токсические эффекты при введении в больших дозах (дозы 860 мг/кг, 3000 мг/кг). В меньших дозах (до 100 мг/кг) проявлялись антиоксидантные эффекты ДКВ, также как при его однократном профилактическом введении в дозе 86 мг/кг перед введением в организм животных прооксиданта - дициклопентадиена. Изучаемые биохимические параметры после введения ДКВ изменялись в зависимости от дозы и срока воздействия (таблица

4).

Таблица 4 - Биохимические показатели в крови у крыс после введения ДКВ (М±т)

Срок Группа Показатели

С8Н мкмоль/г (печень) МДА нмоль/г (кровь) ГПЛ ед.опт.пл/г (кровь) АК мкмоль/л (кровь)

1 2 3 4 5 6

30 суток контроль 5,88 ± 0,31 37,05 ± 0,98 40,37 ±0,97 28,85 ± 1,35

ДКВ 86 мг/кг 6,84 ±0,19* 27,05 ± 2,43* 33,00 ± 2,30* 41,41 ±0,84*

ДКВ 860 мг/кг 5,99 ±0,41 50,38 ± 3,94* 43,93 ± 2,94 27,62 ± 2,00*

ДКВ 3000 мг/кг 5,33 ± 0,37 53,21 ± 3,49* 42,87 ± 3,34 37,66 ± 1,91*

вит. Р 86 мг/кг 6,26 ±0,35* 24,74 ± 3,83* 40,17 ± 0,91 34,51 ±2,25*

60 суток контроль 6,45 ± 0,73 57,95 ± 1,34 50,17 ± 1,85 25,08 ± 0,93

ДКВ 86 мг/кг 6,78 ±0,42 29,49 ±1,87* 45,50 ± 1,46* 37,05 ± 0,92*

ДКВ 860 мг/кг 6,81 ± 0,28 49,87 ±3,54* 54,10 ± 1,01* 25,74 ± 0,46

ДКВ 3000 мг/кг 7,04 ±0,27 35,44 ±2,40* 51,17 ± 5,33 25,30 ±0,80

вит. Р 86 мг/кг 6,59 ± 0,34 45,51 ±3,66* 47,77 ± 1,95* 27,26 ± 0,75

Продолжение табл. 4

1 2 3 4 5 6

контроль 5,36 ± 0,78 57,31 ± 1,46 57,43 ± 1,86 28,39 ±0,36

90 ДКВ 86 мг/кг 6,35 ± 0,23 50,77 ±3,99 52,60 ±1,99* 35,77 ±0,36*

су- ДКВ 860 мг/кг 5,64 ±0,28 58,33 ± 4,59 56,43 ± 3,81 28,39 ± 1,14

ток ДКВ 3000 мг/кг 4,41 ± 0,20 49,87 ± 1,70 57,33 ± 1,23 27,78 ± 1,61

вит. Р 86 мг/кг 5,48 ±0,12 52,69 ± 1,68 57,00 ± 0,96 28,49 ± 0,23

Примечание: * - отличия от контроля достоверны при р < 0,05

Применение ДКВ и витамина Р в дозах 86 мг/кг в первый месяц эксперимента приводило к повышению ОБН. Уровень МДА к концу первого месяца у групп, получавших ДКВ и витамин Р в дозах 86 мг/кг снизился, а при введении ДКВ в дозах 860 мг/кг и 3000 мг/кг, напротив, превышал контроль в 1,5-1,7 раз. Количество гидроперекисей липидов у животных, получавших ДКВ в дозе 86 мг/кг, было меньше на протяжении всего периода введения. Уровень аскорбиновой кислоты в первый месяц наблюдений достоверно увеличивался у животных, получавших ДКВ и витамин Р в дозе 86 мг/кг в 1,5 раза в сравнению с контролем. В группе животных, получавшей ДКВ в дозе 86 мг/кг, более высокий уровень аскорбиновой кислоты отмечался до конца эксперимента.

Таким образом, при хроническом введении дигидрокверцетина в дозе 86 мг/кг превалировали признаки его антиоксидантной активности, а при высоких дозах ДКВ, напротив, проявлял дозозависимую прооксидантную активность, что приводило к ухудшению состояния животных и проявлению общетоксических эффектов на организм экспериментальных животных с преимущественным поражением со стороны сердца и печени.

Заключение

Проведенные экспериментальные исследования на кроликах, показали, что при использовании мази с дигидрокверцетином в лечении ожога кожи ША степени в 100% случаев исходом термической травмы является образование нежного рубца с небольшим фиброзом (нормотрофический рубец). У животных, которым проводили лечение мазью с ДКВ, проникновение в ткани активно действующего вещества создали условия для эпителизации поверхности раны, что привело к размягчению и легкому удалению струпа. В период отторжения струпа у животных, леченных мазью с ДКВ, происходило растяжение кожных покровов с увеличением площади раны более чем в два раза по сравнению с контрольной группой. Этот факт расценивается нами, как положительный признак, свидетельствующий об эластичности вновь образующихся кожных покровов за счет связывания гидроксильных групп ДКВ с липидами клеточных мембран. Вероятно, именно в период образования «молодого» рубца дигидрокверцетин оказывал влияние на синтез коллагена, подавляя быстрый рост грануляционной ткани. Следовательно, процесс восстановление эпителиального

слоя шел скорее и вновь образованный эпидермис обретал эластичные свойства, что приводило к заживлению раны без образования грубого рубца.

Ранозаживляющее действие ДКВ на раневую поверхность можно объяснить как прямыми антирадикальными свойствами ДКВ, проявляющимися на стадии кислородной инициации и связанных с нейтрализацией активных форм кислорода, так и с образованием комплекса флавоноид - фосфолипид, при формировании которого модифицируется пространственная структура фосфатидилхолина, что влечет изменение плотности и проницаемости клеточных мембран. Соответственно изменяется обмен между внутриклеточной и внеклеточной средой, что обуславливает переход прооксидантной и антиоксидантной систем организма на новый уровень равновесия. Антирадикальные и антиоксидантные свойства ДКВ способствуют уменьшению воспаления и отечности раневой поверхности, улучшению кровообращения за счёт морфологически установленного неоангиогенеза, и успешному регенераторному процессу. При аппликации на рану ДКВ эпителиальные слои формируются быстрее, чем грануляционная ткань, вероятно, за счет образования водородных связей гидроксильных групп ДКВ с коллагеном. Возможно также, что ДКВ оказывает влияние на синтез коллагена. Увеличение поверхности раны на двадцать первые сутки, после отторжения струпа, объясняется растяжением верхних эпителиальных слоев кожи за счет их эластичности, что в значительной степени обеспечивает условия для более полноценного заживления раны без образования грубого рубца. Такие эффекты местного действия ДКВ на раневую ожоговую поверхность, наряду с полученными нами данными о его низкой токсичности и безопасности применения, дают основания для заключения о возможности использования ДКВ в составе лекарственных форм для наружного применения и о целесообразности разработки наружных лекарственных форм дигидрокверцетина виде мази и геля с использованием гидрофильных и липофильных основ.

ВЫВОДЫ

1. Дигидрокверцетин в составе мазевой лекарственной формы улучшает процессы ранозаживления у кроликов при термическом ожоге кожи ША степени. Об этом свидетельствует динамика показателей ранозаживления (меньшая площадь раневой поверхности в период формирования струпа с 3 по 14 сутки и 2,9 раза более высокая скорость уменьшения площади раны после отхождения струпа с 21 по 30 сутки). Струп в группе животных с лечением ДКВ был мягким, меньше беспокоил животных, легко удалялся хирурическими инструментами, что предотвращало повреждение свежеобразованной кожи.

2. Местное применение дигидрокверцетина облегчает течение ожоговой болезни при термическом ожоге кожи ША степени. Об этом свидетельствует динамика массы кроликов. Если к 40-м суткам после нанесения ожога у кроликов в контрольной группе отмечалось только восстановление исходной массы тела, то в группе с использованием ДКВ прирост массы тела составлял 10% (р<0,05). Показатели СОЭ в группе животных с применением ДКВ на протяжении периода

формирования струпа были достоверно ниже, чем в контрольной группе и при применении облепихового масла, и на протяжении всего дальнейшего срока наблюдения не выходили за пределы нормы. Наблюдение за животными свидетельствовало о лучшем общем состояние при лечении раны ДКВ.

3. Местное применение дигидрокверцетина при лечении термического ожога кожи Н1А степени в эксперименте обеспечивает более благоприятный исход заживления раны, способствует восстановлению эпителиального слоя без образования грубого рубца в 100% случаев, в то время как в контрольной группе, а также при использовании облепихового масла образование келоидного рубца имело место у всех животных. Рубец у животных с аппликацией мазью с ДКВ был гладким и не выступал над непораженной поверхностью кожи.

4. Дигидрокверцетин в составе мазевой лекарственной формы оказывает противовоспалительное действие и стимулирует процессы ангиогенеза, улучшая тем самым микроциркулляцию эпидермиса, что подтверждается патоморфологическими исследованиями биопсийного материала раневой поверхности на третьи и седьмые сутки после нанесения ожога.

5. Дигидрокверцетин, введенный внутрижелудочно в дозе 86 мг/кг за 30 минут до острого отравления прооксидантом дициклопентадиеном, проявляет выраженную антиоксидантную активность, снижая концентрацию продуктов перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид, гидроперекиси липидов) и обеспечивая высокий уровень восстановленного глутатиона в крови у белых крыс.

6. Дигидрокверцетин относится к веществам 4 класса опасности - малоопасное вещество (ОГ50 для мышей при введении в желудок составляет 7666 ±345 мг/кг; для крыс значения ОЬ50> 10 г/кг) и обладает кумулятивными свойствами (коэффициент кумуляции для мышей составляет 1,3). В токсических дозах ДКВ оказывал преимущественное негативное влияние на сердце и печень, в наибольшей степени выраженное через 3 суток после введения вещества крысам. При дозе ДКВ 5000 мг/кг в этот период имело место уменьшение частоты сердечных сокращений и высоты зубца Я на ЭКГ, при патоморфологическом исследовании сердца - расширение капилляров и просветление цитоплазмы миофибрилл, а также гистохимически выявленное увеличение на 4-5 баллов ЩФ, МАО и гликогена в печени.

7. При многократном введении дигидрокверцетина в дозе 86 мг/кг по истечении первого месяца был выявлен стимулирующий эффект по показателям двигательной активности (достоверное увеличение до 37,3±2,14 движений/3 мин.), исследовательской активности, статической выносливости, что, по-видимому, связано с его антиоксидантными свойствами (достоверное уменьшение МДА в крови до 27,05 ± 2,43 нмоль/г). В высоких дозах (860 мг/кг и 3000 мг/кг) ДКВ, напротив, проявлял дозозависимую прооксидантную активность (достоверное увеличение МДА в дозе 860 мг/кг до 50,38±3,94 нмоль/г, в дозе 3000 мг/кг до 53,21±3,49 нмоль/г), что приводило к ухудшению общего состояния животных, проявляющемся в угнетении двигательной активности животных в 2,5 - 3 раза, потере аппетита и, как следствие -снижению массы тела на 25 - 30%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется разработка лекарственных форм для наружного применения на основе дигидрокверцетина виде мази и геля с использованием гидрофильных и липофильных основ.

2. Целесообразно в установленном порядке проведение доклинических испытаний дигидрокверцетина с исследованием его специфических видов токсичности.

3. Рекомендуется использование комплекса методических приёмов оценки заживления ожоговых поражений для доклинической оценки противоожоговой активности новых лекарственных средств на основе действующих веществ, полученных из природного сырья.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щукина, О.Г. К оценке острой токсичности дигидрокверцетина из лиственницы Сибирской / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, В.В. ИгуМеныцева // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2007. -Т. 1.-С. 152-156.

2. Щукина, О.Г. К обоснованию исследования токсикологических и терапевтических свойств дигидрокверцетина / О.Г. Щукина, В.В. Игуменыцева, H.A. Мальппкина, Г.Г. Юшков, A.A. Гущина // Сб. научных трудов ATTA. - 2007. -Т. 1. - С.199-203.

3. Щукина, О.Г. Исследование некоторых ферментативных процессов в организме животных при пероральном введении антиоксиданта дигидрокверцетина / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, В.В. Игуменыцева // VII Международная науч.-пракг. конференция «Экология и безопасность жизнедеятельности». -Пенза, 2007. - С. 223-224.

4. Щукина, О.Г. Исследование реакции организма на пероральное введение антиоксиданта дигидрокверцетина / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, В.В. Игуменыцева // третья Всероссийская научно-техническая Интернет-конференция «Современные проблемы экологии и безопасности». - Тула, 2007. - С.36-38.

5. Щукина, О.Г. Биологическое значение дигидрокверцетина как природного антиоксиданта / О.Г. Щукина, H.A. Малышкина, В.В. Игуменыцева // XI Междунар. науч. школа- конференция студентов и молодых ученых «Экология южной Сибири и сопредельных территорий». - Абакан, 2007 — Вып. № 11. - Т. 2. -С.135-136.

6. Щукина, О.Г. Исследование процессов пероксидации в организме животных при пероральном введении дигидрокверцетина / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, Ю.И. Черняк // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - № 4. - С. 46-48.

7. Щукина, О.Г. Флавоноиды - антиоксидантная защита организма. / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, В.В. Игуменыцева // Вестник АГТА. - 2008. - Т. 2, Ks 1. - С 76-78.

8. Щукина, О.Г. К механизму токсического действия дигидрокверцетина / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, A.A. Гущина // 3-й съезд токсикологов России 2-5 декабря 2008 г. Москва. Тезисы докладов. - М.: М-во здравоохранения и соц. развития Российской Федерации [и Др.]., 2008. - С. 538-540.

9. Щукина, О.Г. Динамика* показателей периферической крови крыс при многократном внутрижелудочном введении дигидрокверцетина в различных дозах в условиях эксперимента / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков // Междунар. науч.-практич. конференция в области экологии и безопасности жизнедеятельности «Дальневосточная весна-2008». — Комсомольск-на-Амуре, 2008 - С. 436-438.

Ю.Щукина, О.Г. Биоэтические проблемы выявления механизма действия фармакологических веществ в условиях экспериментально-биологического моделирования на примере дигидрокверцетина / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, A.A. Гущина // Материалы всероссийской научной конференции молодых ученых «Наука. Технологии. Инновации». - Новосибирск: Изд-во НГТУ, 2008. — Ч. 7. -С.77-79.

11. Щукина, О.Г. Исследование периферической крови при пероральвом введении дигидрокверцетина / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, В.В. Игуменыцева // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - Ч. 1, № 3 (23). - С. 39.

12. Щукина, О.Г. К возможности определения дигидрокверцетина в биосубстратах методом ВЭЖХ / О.Г. Щукина, Г. Г. Юшков // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2008. - Т. 2. - С. 267-269.

13.Щукина, О.Г. К проблеме объективизации оценки кардиотропного действия некоторых химических веществ природного происхождения (на примере дигидрокверцетина) / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, В.В. Бенеманский // Мат. междунар. науч.-практич. конф., «Актуальные вопросы электрофизиологии и незаразной патологии животных». - Улан-Удэ: Изд-во БГСХА, 2009. — Ч. 2. - С. 173-175.

Н.Щукина, О.Г. К возможности использования кроликов при моделировании ожоговой болезни / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков II Материалы науч.-практич. конф. -Томск: Изд-во Печатная мануфактура, 2009. - С.113-115.

15. Щукина, О.Г. Ожоговая болезнь, её моделирование на лабораторных животных для испытания новых лекарственных средств. / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, В.В. Игуменыцева//Вестник АГТА.-2009.-Т. 3,№ 1.-С 143-146.

16. Щукина, О.Г. К возможности лечения термического ожога кожи препаратом на основе дигидрокверцетина в условиях эксперимента / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, В.В. Бенеманский // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2009. - Ч. 2, № 1 (25). - С. 601.

17. Игуменыцева, В.В. Установление эффективности природного антиоксиданта для профилактики интоксикации дициклонентадиеном (ДЦПД) / В.В. Игуменыцева, Г.Г. Юшков, О.Г. Щукина // Вестник Российской военно-медицияской академии. - 2009. - Ч. 2, № 1 (25). - С. 350-351.

18. Черняк, Ю.И. Состояние процессов нероксидадии у крыс в отдаленном периоде после хронического введения дигидрокверцетина / Ю.И. Черняк, О.Г. Щукина // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2009. - Т. 147, № 5. - С. 532-535.

19. Патент на изобретение № 2405536 РФ, МПК7 А61 К 9/06, А61 К 31/37, А61 К 35/12, А61 Р 17/02. Мазь для лечения термических ожогов и способ лечения с её использованием / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, В.В. Игуменыцева, H.A.

Малышкина; - № 2008109778/1$; Заявл. 13.03.08; Опубл. 10.12.2010, Бюл. № 34.

20.Бенеманский, В.В. Об ин тегральной оценке состояния перекисного окисления липидов и антиокендантной защиты в токсикологическом эксперименте /

B.В. Беиеманский, Г.Г. Юшков, В.В. Игуменыцева, О.Г. Щукина // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - Ч. 2, № 4 (86). - С. 167-169.

21.Щукина, О.Г. Роль витаминов в питании / О.Г. Щукина, Г.Г. Юшков, Н.А. Малышкина // Материалы науч.-практич. конф. - Ангарск: Изд-во АГТА, 2013. -

C.54.

22. Щукина, О.Г. Ранозаживлякицее средство природного происхождения на примере мази с дигидрокверцетином / О.Г. Щукина, В.А. Баринов, Г.Г. Юшков // XXIII Международная научно-практйчёская конференция «Современная медицина: актуальные вопросы». - Новосибирск: Изд-во «СибАК», 2013 - С. 145-151.

23. Shchukina, O.G. Influence digidroqtiercetin on formation of cicatricial fabric at a thermal burn of skin / O.G. Shchukina, V.A. Barinov // European Applied Sciences: modern approaches in scientific researches, proceedings of the 6th International scientific conference. ORT Publishing. Stuttgart, 2013. - P. 17-18.

Список сокращений

АД — артериальное давление АК — аскорбиновая кислота

ACT - аспартатаминотрансфераза ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГПЛ - гидроперекиси липидов ГСО - государственный стандартньш образец

ДКВ — дигидрокверцетин

ДЦПД - дициклопентадиен

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МАО - моноаминооксидаза

МДА - малоновый диальдегид

ПОЛ — перекисное окисление липидов

С ДГ - сукцинатдегидрогеназа

ЩФ — щелочная фосфатаза

ЭКГ - электрокардиограмма

ввН — восстановленный глутатион

1ЛЭ5о — среднесмертельная доза

Подписано в печать 19.12.13. Формат 60x90 1/8. Печать трафаретная. Усл.печ.л. 1,7. Уч. печ.л. 1,7. Тираж 100 экз. Заказ 2308.

Ангарская государственная техническая академия 665835, Ангарск, ул. Чайковского, 60