Изучение иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов Klebsiella pneumoniae

Воюшин, Константин Евгеньевич

Диссертации по медицине → Аллергология и иммулология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов Klebsiella pneumoniae

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Воюшин, Константин Евгеньевич Москва 2007 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.36

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов Klebsiella pneumoniae

ВОЮШИН Константин Евгеньевич

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СЕКРЕТИРУЕМЫХ БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ АНТИГЕНОВ Klebsiella pneumoniae

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003054280

На правах рукописи

МОСКВА-2007

003054280

Paóora выполнена в Г У НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научные руководители:

Доктор медицинских наук Екатерина Алексеевна Курбатова Доктор медицинских наук Федор Витальевич Доненко

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Людмила Ивановна Краснопрошгта Доктор биологических наук Галина Георгиевна Честухина

Ведущее учреждение: ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича

Защита диссертации состоится 22 февраля 2007 г. в 12 часов на заседании диссергаиионного совета Д 001.035.01 при ГУ ПИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова PAMI1 (105064 Москва, Малый Казенный пер., д.5а)

С диссершшей можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМИ

Автореферат разослан " JfofófJj " 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Актуальность темы. Одним из наиболее важных с медицинской точки зрения представителей рода Klebsiella является Klebsiella pneumoniae sp pneumoniae -широко распространенный возбудитель инфекционных процессов различной локализации. Есть данные о возможной роли К pneumoniae в манифестации и обострениях болезни Бехтерева у НЬА-В27-позитивных лиц [A.Ebringer 2000, M.L.Dominuez Lopez et al., 2002, A.Cauli et al.2002].

На протяжении последних десятилетий К pneumoniae занимает одно из первых мест в структуре внутрибольничных инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами [Т. Horan et al., 1988; D.R. Schaberg et al. 1991; E.Bergogne-Berezin 1995; В.Н.Красноголовец и Б.С.Киселева, 1996; H. Sahly et al., 2000; A.Hostacka, 2001; Cheol-in Kang et al., 2006]. К группе высокого риска инфицирования относятся пациенты с иммунодефицитом, новорожденные, лица пожилого и старческого возраста [R.Podschun et al. 1998; R.Sinha et al. 2003]. Летальность от клебсиеллезного сепсиса и пневмонии составляет 20-50% [C.S.Brayan et al., 1983, M.J.de la Torre et al., 1985].

Недостаточная эффективность традиционной терапии, обусловленная растущей полирезистентностью штаммов к антибиотикам, определяет необходимость разработки иммунологических препаратов для активной иммунизации контингента групп риска, а также для иммунотерапии тяжелых случаев клебсиеллезов при использовании гипериммунной донорской плазмы, клебсиллезного иммуноглобулина или других средств пассивной иммунотерапии [L.Brade et al., 2001].

Б настоящее время в клинической практике применяют только бактериальные поликомпонентные вакцины для активной иммунотерапии пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями, вызываемыми условно-патогенными микроорганизмами, содержащие в своем составе антигены К pneumoniae (рибомунил, бронхомунал, респивакс, иммуновак-ВП-4 и др.) [F.B. Michel et al, 1978; А. Bosch et al., 1983; Б.Пертунов и др., 1991; Е.А. Курбатова, 1997; М.Р. Богомильский и др., 2001]. Эти препараты предназначены, прежде всего, для коррекции вторичного иммунодефицита.

Многолетние исследования по разработке противоклебсиеллезной вакцины не привели к созданию эффективного препарата, используемого в практике здравоохранения. В качестве наиболее перспективных антигенов для получения вакцин рассматривали капсульный полисахарид или липополисахарид (ЛПС) К pneumoniae [S.J. Cryz, 1984, 1986; Bennett-Guerrero et al., 2000]. Роль белоксодержащих антигенов К pneumoniae изучена недостаточно. В последнее время появились сообщения об иммуногенной активности белков наружной мембраны К pneumoniae, характеризующихся высоким уровнем гомологии у представителей семейства Enterobacteriaceae [Р. Jeannin et al., 2002].

Секретируемые белоксодержащие компоненты К pneumoniae, представленные ферментами (протеазы, гликозидазы и др.), токсинами, гемолизинами, белками теплового шока и др., с целью получения протективных антигенов, практически не изучались. Высокая консервативность аминокислотной последовательности этих соединений у разных штаммов К pneumoniae открывает новую область их применения для получения антигенов с внутри- и, возможно, межвидовой перекрестной протективной активностью.

Цель исследования. Получение и характеристика иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов К. pneumoniae

Задачи исследования:

1. Получить из культуральной надосадочной жидкости штаммов К. pneumoniae различной i гепени вирулентности белоксодержащие соединения и определить протеазную активность полученных фракций

2 Изучить протективную активность секретируемых белоксодержащих фракций К pneumoniae при заражении гомологичным и гетерологичными K-типами К. pneumoniae.

3. Дать химическую и иммунохимическую характеристику препаратов, полученных на основе секретируемых белоксодержащих фракций К pneumoniae

4. Исследовать иммунный ответ у животных при иммунизации секретируемыми белоксодержащими фракциями К pneumoniae

5. Изучить действие секретируемых белоксодержащих фракций на формирование неспецифической резистентности к инфекции и их противоопухолевую активность в экспериментах на животных.

6. Определить диагностическую значимость секретируемых белоксодержащих антигенов в ИФА при анализе здоровых и больных болезнью Бехтерева.

Научная новизна. Впервые при культивировании К. pneumoniae на полусинтетической среде получены протективные секретируемые белоксодержащие фракции, определены их иммунобиологические свойства и дана химическая и иммунохимическая характеристика.

Установлено, что штаммы К pneumoniae К2, К16 и нетипируемого по К-антигену штамма №204 продуцируют только один вид протеазы с молекулярной массой 21 кДа, обладающую эластазоподобной активностью, которая не зависит от степени вирулентности штамма и возрастает при прибавлении в среду культивирования субстрата протеазы - гликопротеина. Обнаружено, что фракция, содержащая данный фермент не обладает протективной активностью. Показано, что при внесении в среду культивирования гликопротеина происходит повышение продукции штаммами К pneumoniae белоксодержащих соединений в области 50 кДа и углеводсодержащих соединений в областях 25, 50, 60 и 70 кДа.

Установлено, что внутривидовой протективной активностью обладает фракция 30-50 кДа, содержащая белок, углеводы и примесь ЛПС. Основные белковые компоненты фракции имеют молекулярную массу 35 и 40 кДа и являются общими для всех исследованных штаммов (К2, К16, 204). ПротеолЬтическое разрушение белка приводит к утрате защитных свойств препарата. Методами проточной цитофлюориметрии и ИФА показано, что белоксодержащие фракции относятся к секретируемым антигенам, а не являются продуктами лизиса микробных клеток.

Показано, что препарат К.рпеитотае К2, полученный на основе фракции с молекулярной массой 30-50 кДа приводит к выработке специфических антител IgG класса, повышает уровень цитокинов IL-6, TNF-a, IL-10, IL-12 в сыворотке крови

мышей, но не является активным стимулятором неспецифической резистеност организма при испытанных дозах и схемах введения.

Выявлено, что сыворотки крови пациентов с болезнью Бехтерева содержа антитела к белоксодержащей фракции 30-50 кДа, иммунизация которой не приводи к образованию антител к органонеспецифическим и органоспецифически антигенам человека.

Практическая значимость. Секретируемая белоксодержащая фракция К pneumoniae К2 30-50 кДа может быть использована как основа для разработк противоклебсиеллезной вакцины с внутривидовой перекрестной протективно активностью для активной иммунизации пациентов групп риска и получен гипериммунной плазмы для терапии тяжелых случаев клебсиеллезной инфекции, также для разработки диагностических тест-систем.

При получении препаратов на основе секретируемых белоксодержащи фракций микроорганизмов, культивируемых на синтетических ил полусинтетических средах, можно использовать гликопротеин для определения ориентировочного диапазона локализации протективных антигенов, продуцируемых микробной клеткой в среду культивирования.

Расшифровка аминокислотной последовательности секретируемых протективных белков К. pneumoniae может явиться предпосылкой для получения генно-инженерных вакцин и иммуногенов.

Использование указанных подходов по получению протективных антигенов .да основе секретируемых белоксодержащих фракций К. pneumoniae может быть применено к получению протективных антигенов из других микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. К pneumoniae продуцирует в культуральную среду только один вид протеазы с молекулярной массой 21 кДа, обладающую эластазоподобной активностью, которая не зависит от степени вирулентности штамма.

2. Внутривидовая протективная активность секретируемых белоксодержащих антигенов К pneumoniae сосредоточена во фракции 30-50 кДа и определяется белками с молекулярной массой 35 и 40 кДа.

3. Протективная активность секретируемой белоксодержащей фракции К. pneumoniae К2 30-50 кДа реализуется по антителозависимому механизму санации организма от клебсиеллезной инфекции при участии специфических антител, в том числе IgG класса.

4. Сыворотки крови пациентов с болезнью Бехтерева содержат антитела к белоксодержащей фракции 30-50 кДа, иммунизация которыми не дает перекрестных реакций с органонеспеспецифическим и органонеспецифическим антигенами человека.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология 21 век» (г. Саратов, 28-30 сентября 2004), Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» («Сосновка», Новосибирская область, 8-10 сентября 2004 г.), на заседании Ученого совета НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 11 апреля 2006. Апробация работы состоялась на конференции отдела иммунологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 13 декабря 2006 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научных работы, из низ 2 в журналах рекомендованных ВАК РФ, подана 1 заявка на изобретение.

Структура и объем диссертации. Материалы работы изложены на 142 страницах компьютерного текста и состоят из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы — 199 источников (24 отечественных и 175 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована - 23 таблицами, 9 рисунками и 1 фотографией.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные. Мыши: белые беспородные (n=1200), СВА из

питомника Академии медицинских наук РАМН (Крюково) - (n=50); С57В1/6, самцы, из питомника «Столбовая» Московской области (п=40).

Штаммы микроорганизмов. K.pneumoniae К2 (В5055), К13 (№8660), К16

(№2046-79), К25 (2002-49-S), К48 (№229) из Эталонной международной коллекции

клебсиелл и штамм №204 (ГИСК им. JI.A. Тарасевича). Штаммы любезно предоставлены завлабораторией микробиологии условнопатогенных бактерий д.м.н., проф. А.П.Батуро).

Определение вирулентности штаммов К pneumoniae проводили на беспородных белых мышах массой 14-16 г. при внутрибрюшинном заражении и определяли LD50.

Получение белоксодержащих фракций из культуральной надосадочной жидкости штаммов K.pneumoniae представлено на рис. 1.

Штаммы К pneumoniae культивировали в ферментере фирмы «Анкум» с рабочим объемом 10 л при непрерывном перемешивании и подаче воздуха при рН 7,8 t 37°С в течение 6 часов. (Лаборатория непарентеральных методов иммунизации ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, зав. лаборатории д.м.н., проф. В.В. Сергеев).

Полученную микробную суспензию инактивировали 2% азидом натрия в течение 2 часов при 18-20 °С. Полноту инактивации микробных клеток контролировали путем высева на питательный агар.

Культивиров ание

Получение культуральной надосадочной жидкости |

I \

Ге льфильтраи^ я

Ионообменная хроматография

Ультрафильтрация

Изучение влияния условий культи в иро в ани я

Изучение_ протеазной активности

Изучение протективной активности

Рис. 1. Схематическое изображение методов получения и использования белоксодержащих антигенов культуральной жидкости К pneumoniae.

Надосадочную жидкость получали центрифугированием при 4000g в течение 30 минут при 4°С. Белоксодержащие фракции осаждали сульфатом аммония, навеску которого прибавляли к полученному супернатанту до 80% насыщения по методу N. Koide et al., 1974. Осадок ресуспендировали в 50 мл 100 мМ Na-фосфатного буферного раствора (рН 7,4). Остатки сульфата аммония удаляли при помощи хроматографии на колонке PD-10 в 100 мМ Na-фосфатном буферном растворе (рН 7,4). Фракционирование полученного препарата проводили тремя методами.

В первом случае проводили фракционирование с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-75 (Pharmacia, Швеция) в 100 мМ Иа-фосфатном буфере (рН=7,4). Колонка была предварительно уравновешена 100 мМ Ыа-фосфатным буфером (рН=7,4), содержащим 0,1% СТАВ, и откалибрована с помощью стандартных белков.

Во втором случае - при помощи ионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе в градиенте NaCl (от 0 до 0,5 М).

В третьем случае - при помощи последовательной ультрафильтрации с использованием ячейки Amicon (Millipore Corp, США) и мембран YM-100, YM-50, YM-30 и YM-10 (Millipore Corp, США) с пределами исключения 100, 50, 30 и 10 кДа соответственно. Полученные белоксодержащие фракции <30, 30-50, >50 и >100 кДа использовали для определения протективной активности.

Протеазная активность. Эластазоподобную активность определяли по скорости расщепления N-тетра-бутокси-карбонил-аланин-нитрофенилового эфира (BOC-Ala-ONp) [Schwert G., et a!., 1955 ], трипсиноподобную - N-альфа-бензоил-Ь-аргинин-этилового эфира [Visser C.,et al., 1972], химитрипсинподобную - N-ацетил-L-тирозин этилового эфира [Schwert G., et al 1955].

Молекулярную массу белоксодержащих фракций определяли с помощью электрофореза в ПААГ по методу Леммли [Laemmli U.K., 1970].

Проточная цитофлуориметрия. Исследование проводили для определения принадлежности белоксодержащих фракций к секретируемым антигенам микробной клетки на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, США). Результаты рассчитывали с помощью программы WinMdi 2.8.

Методы химического анализа. Определение углеводсодержащих соединений проводили по методу Дюбуа [Dubois М., et al., 1956]. Содержание белка определяли по методу Лоури [Lowry О.Н. et al., 1951]. О присутствии ЛПС в препарате судили по уровню 2-кето-З-дезоксиоктаната (КДО) [Waradwaker et al., 1945] и подтверждали гель-тромб ЛАЛ (лизат амебоцитов limulus) - тестом PYROGENT® (CAMBREX Bioscience, США) в соответствии с ОФС 42-0002-00. Содержание нуклеиновых кислот в препарате определяли по уровню органического фосфора [Lowry О.Н. et al., 1954].

Иммуноблоттинг. Проводили денатурирующий электрофорез в ПААГ осуществляли сухой перенос на нитроцеллюлозную мембрану. После адсорбции первичных антител (исследуемая сыворотка) проводили отмывку (3 раза в ФСБ + 0,1 % Tween-20). Затем инкубировали с коньюгатом anti-mouse IgG-HRP. После чего отмывали от не связавшегося проявителя и окрашивали диаминобензидином с Н202 в ФСБ.

Получение препаратов для иммунизации животных. К белоксодержащим фракциям прибавляли 2%-ную гидроокись алюминия (Serva, Германия) до конечной концентрации 0,02%. Инкубировали в течение ночи при +4°С, затем отмывали центрифугированием.

Протеолиз белковой фракции 30-50 кДа осуществляли с использованием протеиназы К (выделенной из Tritirachium album, AppliChem, Германия) в соответствии с рекомендациями изготовителя. После протеолиза низкомолекулярные продукты деградации удаляли из раствора ультрафильтрацией с использованием мембргнл YM-30.

Протективная активность препаратов. Мышей массой 12-14 г иммунизировали двукратно с интервалом 14 суток, чередуя внутрибрюшинное введение с подкожным. Заражали тест-штаммом на 12-14 сутки после последней иммунизации. Для определения величины LD5o в заражающей дозе одновременно вводили группе интактных мышей кратно возрастающие дозы К pneumoniae Оценивали процент выживших мышей и величину ED50 в опытных группах.

Антигенную активность исследуемых фракций определяли по оценке уровня антител в ИФА с использованием IgG мыши (ГУ НИИЭМ Н.Ф.Гамалеи). Сыворотки

в разведении 1:100 наносили на полистироловые планшеты, на которых предварительно была сорбирована в рабочей концентрации (2-3 мкг/мл) исследуемая фракция К. pneumoniae 30-50 кДа. В качестве контроля использовали пул сывороток от не иммунизированных мышей или сыворотки клинически здоровых доноров. Результаты учитывали по оптической плотности на планшетном спектрофотометре «Эфос» (Россия) при длине волны 492 нм.

Определение превентивной активности. Мышей заражали летальной дозой штамма К pneumoniae К2. Через 2 часа и дважды в последующие 2-е суток мышам вводили сыворотки 5-кратно иммунизированных мышей в разведении 1:20 Опыт сопровождали контролем заражающей дозы.

Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей определяли в ИФА при использовании тест-систем (Biosource, Бельгия), на приборе Multiscan-Plus (Labsystems, Финляндия).

Определение уровня антител к ДНК (нативная, денатурированная) проводили с помощью ИФА тест-систем [Н.Е. Ястребова с соавт.1987], а также к коллагену (Serva, Германия), эластину (INC Biomedical Inc, США), микросомальным фракциям тонкого и толстого кишечника проводили с помощью твердофазного ИФА. Отрицательным контролем служил пул сывороток от не иммунизированных мышей.

Уровень IgG антител в сыворотках больных болезнью Бехтерева (п=22) и практически здоровых лиц (п=32) определяли методом твердофазного ИФА. Сыворотки больных с верифицированным диагнозом болезни Бехтерева были получены из НИИ ревматологии МЗ РФ. В качестве отрицательного контроля использовали пул сг вороток от 100 клинически здоровых доноров. Положительными считали результаты, показавшие ДОП>+0,1 (М±2а).

Противоопухолевую активность препарата К. pneumoniae К2 30-50 кДа изучали на мышах-самцах линии С57В1/6 в возрасте 2-3 месяцев и массой 22-24 г, которым подкожно вводили клетки перевиваемого штамма меланомы В16 (банк опухолевых штаммов ГУ РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина) в область подмышечной впадины. Исследуемый препарат К pneumoniae К2 30-50 кДа вводили подкожно через 24, 48 часов, а также 7 и 14 дней после трансплантации опухолевых клеток.

Эффект оценивали по объему опухоли, числу метастазов, средней продолжительности жизни мышей.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Excell (MicroSoft corp., США) и интегрированным пакетом статистического анализа Statgraphics Plus v5.0 (Manugistics, Inc., США) с применением параметрических методов сравнения при нормальном распределении (i-критерий Стьюдента).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исходя из концепции, что бактерии секретирует в окружающую среду не только факторы патогенности, но и ферменты, необходимые для их жизнедеятельности, мы предположили, что получение протективных антигенов на основе секретируемых микробной клеткой антигенов, позволит блокировать с помощью антител механизмы ее адаптации в организме хозяина или системы жизнеобеспечения.

На первом этапе исследования была .определена вирулентность для белых мышей 6 штаммов клебсиелл наиболее часто встречающихся при заболеваниях человека (К2, К13, К16, К25, К48 и не типируемого по К-антигену - 204). Для дальнейших исследований были отобраны 3 штамма: К2 - вирулентный (LD5o - 31,6 микробных клеток), К16 - средней степени вирулентности (LD50 - 8,9x106 микробных клеток) 204 - маловирулентный (LD50 - 354,8х10б микробных клеток).

Выявлено, что все 3 штамма K.pneumoniae активно продуцирует только один протеолитический фермент с эластазоподобной активностью. Трипсиноподобной и химотрипсиноподобной активности не выявлено. Интересно, что штаммы, различающихся между собой по вирулентности на несколько порядков, имели примерно одинаковую эластазоподобную активность, которая составляла 5416, 7476 и 7302 мЕ/мл для штаммов К2, К16 и 204, соответственно (табл 1).

После прибавления в среду культивирования штамма К pneumoniae К16 субстрата протеазы - гликопротеина, выявлено увеличение общей протеазной активности с 7476 мЕ/ мл до 15731 мЕ/мл.

Таблица 1

Протеазная активность культуральной надосадочной жидкости штаммов _К pneumoniae различных по вирулентности_

3 Штамм Вирулентность штамма, Протеазная активность*

| rpyni Эластазо-подобная, мЕ/мл Трипсино-подобная Химитрипси-ноподобная

1 К2 Высокая 5416±574 0 ±

2 К16 Средняя 7476±112 0 ±

3 204 Низкая 7302±812 0 ±

Примечание * Протеазную активность считали значимой при величине более 150 мЕ/мл. Достоверных различий между группами не выявлено.

После фракционировании белоксодержащих фракций с помощью ионообменной хроматографии на ОЕАЕ-сефарозе и проведением элюции в градиенте ЫаС1 было получено 30 белоксодержащих фракций (рис 1).

Рис.1. Профиль элюции сконцентрированной осаждением сульфатом аммония культуральной надосадочной жидкости штамма К pneumoniae К16 и протеазная активность, выявленная во фракции №8.

Только одна из этих фракций (фракция №8) обладала эластазоподобной

активностью равной общей эластазоподобной активности культуральной

надосадочной жидкости. Проведение электрофореза в полиакриламидном (ПААГ)

геле показало, что выявленная п роте аза с эластазоподобной активностью имеет молекулярную массу 21 кДа (рис.2).

ее *да -л5 -36 кДа -29 кДа-24 кДа -

го кДа -14 кДа -

1 2

Рис.2. Электрофорез фракции №8 в пол и акрил ам и дно м геле.

1 - набор белковых маркеров (14, 20, 24, 29, 36, 45, 66 к Да);

2 — фракция №8, с протеазной активностью. Окраска: Coumassi Urilliant Blue G250

Гель-фильтрация бело КС одержащ и х соединений, полученных из культуральной надо садочной жидкости при прибавлении гликопротеина не выявила значимых изменений » продукции белоксодержащей фракции с молекулярной массой 21 кДа, однако появился резкий выброс белоксодержащих соединений в области 50 кДа (рис 3). Вместе с этим происходило повышение продукции в среду культивирования углеводсодержащих соединений в областях 25, SO и 60 и 70 кДа, Обращает на себя внимание, что только в области 50 к Да происходил одновременный выброс в культуральную среду белка и углеводов.

Это явилось основанием для проведения последовательной ультрафильтрации и получения белоксодержащих фракций для оценки их протективной активности. Были получены, фракции с молекуляпой массой < 30 кДа, 30-50; > 50 и >100 кДа, которые после сорбции на гидроокиси алюминия использовали в качестве препаратов для иммунизации животных (табл.2).

После 2-кратной иммунизации мышей препаратами, полученными из штамма К.pneumoniae К2, на 14 сутки их заражали гомологичных штаммом в дозе 178 LDi(l. Установлено, что протективной активностью обладал только препарат с молекулярной массой 30-50 кДа, который защищал 100% мышей от заражения. Остальные препараты были неиммуногениыми.

номер пробы

без прибавления гликопротеина -»- с прибавлением гликопротеина в начале инкубации

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

номер пробы

■ с прибавлением гликопротеина

■ без прибавления гликопротеина в начале инкубации

Рис.3. Профиль элюции белоксодержащих соединений (А), углеводсодержащих соединений (Б) в культуральной надосадочной жидкости

штамма К pneumoniae К16 без стимуляции гликопротеином и со стимуляцией гликопротеином.

Далее было установлено, что препарат Kpneumoniae К2 30-50 кДа, а также препараты этой же молекулярной массы, полученные из других исследованных штаммов - К16 и 204, обладали внутривидовой перекрестной протективной активностью (табл.3).

Таблица 2

Протективная активность препаратов из штамма К pneumoniae К2 при заражении мышей на 14 сутки после 2-кратной иммунизации штаммом К pneumoniae К2 в дозе 178 LDjq

№№ группы Молекулярная масса препарата, кДа Иммунизирующая доза, мкл Заражаю щая доза штамма К2, микр. клеток в 0,5 мл Выжило ED50, мкл

Абс. %±т

1 <30 1,0 500 1/10 10,0±9,5 >100,0

10,0 500 0/10 0±8,7

100,0 500 4/10 40,0±15,5*

2 30-50 1,0 500 4/10 40,0±15,5** 2,5

10,0 500 7/10 70,0±14,5**

100,0 500 10/1 0 100,0±6,0**

3 >50 1,0 500 0/10 0±8,7 >100,0

10,0 500 0/10 0±8,7

100,0 500 1/10 10,0±9,5

4 >100 100,0 500 1/10 10,0±9,5 >100,0

6 Не вакцинированные (контроль) 500 0/10 0±8,7

Примечание: достоверность разности между процентом выживших животных в опытных группах и в контроле, * р<0,05, ** р<0,01

Таблица 3

Внутривидовая перекрестная протективная активность препаратов из штаммов К pneumoniae после 2-кратной иммунизации при заражении через 14 суток штаммам К. pneumoniae

№№ группы Штамм ДЛЯ получения препарата Мол. масса препарата, кДа Иммунизирующая доза препарата, мкл Заражение штаммом К. pneumoniae К2 в дозе 15,8 LD50 Заражение штаммом К. pneumoniae К2 в дозе 178 LD50

Выжило ED5(i, мкл Выжило ED50, мкл

Абс. %±т Абс. %±т

1 К2 <30 1 0/10 0 Но. 0/10 0 >100

10 0/10 0 4/8 50,1 ±17,7

100 3/10 30,0±14,5 3/5 60,0±22,0

2 К2 30-50 1 1/10 10,0±9,5 8,0 4/10 40,0±15,5 3,0

10 10/10 100,0±6,0** 6/10 60,0±15,5*

100 9/10 90±9,5** 6/10 60,0±15,5*

3 К16 30-50 1 3/10 30,0±14,5 8,0 3/10 30,0±14,5 60,0

10 3/10 30,0±14,5 6/10 60,0±15,5*

100 1/10 10,0±9,5 7/10 70,0±14,5**

4 204 30-50 1 1/10 10,0±9,5 2,5 3/8 37,5±15,3 2,5

10 5/10 50,0±15,8* 6/8 75,0^3,7**

100 5/10 50,0±15,8* 8/8 100,0±8,7 **

5 Не вакцинированные 1/10 10,0±9,5 1/10 10,0±9,5

Перекрестная протективная активность препаратов была ниже, чем в гомологичной системе. Гак, если препарат К.pneumoniae К2 30-50 кДа обеспечивал 100% защиту мышей при заражении этим же штаммом в дозе более 100 Ш3(), то при заражении штаммом К i 6 эта защита составляла 60%.

Наличие общих белоксодержащих соединений у штаммов К.pneumoniae К2, fiI6 и 204 было подтверждено при проведении электрофореза в п или акр и л а м и дно м геле. При этом были выявлены общие мажорные белковые полосы в области 35 и 40 к Да. Тот факт, что бело кс оде ржащие соединения этой молекулярной массы участвуют в защите от инфекции, подтвердился в реакции иммуиоблоттинга с антителами, полученными после иммунизации мышей препаратом К.pneumoniae К2 30-50 кДа (рис.4).

М К2 К16 К204

1. 1

'fa Щ» _ ; .

ff,

К ч-

PtiL.f Иммуноблот белоксодержащих фракций К.pneumoniae К2, К16 и 204 с Молекулярной массой 30-50 кДа.

Примечание: реакцию проводили с сывороткой крови мышей (первичные антитела), взятой через 14 дней после 5-кратной иммунизации препаратом К.pneumoniae К2 30-50 к Да. В качестве конъюгата использовали антителе к иммуноглобулином мыши, меченные пер икс и да! ой хрена (вторичные антитела). М - молекулярный весовой маркер (окраска — Куммасси G-250),

Учитывая тот факт, что K.pneumoniae К2 является наиболее вирулентным штаммом за счет отсутствия у нее манозосвязывающего рецептора, часто является этиологическим фактором различных острых и хронических воспалительных

процессов у человека, а также имеет общие протективные антигены белковой природы с другими штаммами клебсиелл, более подробному дальнейшему изучению был подвергнут препарат К.pneumoniae К2 30-50 кДа.

По химическому составу препарат K.pneumoniae К2 30-50 кДа содержал 29,7 мкг/мл белка, 16,2 мкг/мл углеводов и 6 мкг/мл ЛПС (подтверждено ЛАЛ-тестом), нуклеиновые кислоты не выявлены.

Так как в полученном методом ультрафильтрации препарате К.pneumoniae К2 30-50 кДа содержались различные иммунологи чески активные соединения, нам надо было убедиться в том, что не капеульный полисахарид и ЛПС обеспечивают защиту от заражения, а секретируемые микробной клеткой белоксодержащие антигены. Было проведено дополнительное исследование но уточнению этого положения. На препарат K.pnenmoniae К2 30-50 кДа воздействовали протеи назой К для разрушения белковой составляющей. Результат и ротеол ити ч е с кого разрушения белка подтверждали при электрофорезе (рис 5, трек После этого мышей

иммунизировали этим препаратом по обычной схеме. Выявлено, что иммунизация Препаратом, в котором белковая часть была разрушена, не защищал от заражения, тогда как нат явный препарат К.pneumoniae К2 30-50 к Да, содержащий основные белковые компоненты с молекулярной массой 35 и 40 кДа обеспечивал выживаемость 90% животных в дозе более 100 LDji:, (.табл.4'),

Ml 2 3 4 5

I. ,

29 25

Рис.5. Электрофорез бел оке о держащих фракций в полиакрил амид ном геле по методу Леммлн. М - молекулярный весовой маркер (14, 20, 24, 29, 36, 45 и 66 кДа); I - культуральная надосадочная жидкость; 2 - фракция < 30 кДа; 3 - фракция 30 -50 кДа; 4 — фракция > 50 кДа; 5 - фракция 30 - 50 кДа, обработанная протеиназой К

Это исследование доказало, что протективной активностью обладают белоксодержащие соединения, хотя мы не исключаем, что ЛПС и капсульный полисахарид могут участвовать в защите от заражения.

Таблица 4

Протективная активность препарата К. pneumoniae К2 30-50 с протеолитически разрушенным белковым компонентом при заражении штаммом К. pneumoniae К2 в дозе >100 LDjo

№№ Молекулярная масса Иммуни- Заражаю- Выжило

груп- препарата, кДа зирующая щая доза Абс. %±т

пы доза, мкл штамма К2, микр. клеток в 0,5 мл

1 30-50 (белок разрушен 100 50 2/10 20±12,6

протеиназой К) 100 500 0/10 0±8,7

2 30-50 (нативный 100 50 8/10 80±12,6*

препарат) 100 500 8/10 80±12,6*

3 Не вакцинированные - 5 1/10 10±9,5

(контроль) - 50 0/10 0±8,7

- 500 1/10 10±9,5

Примечание: достоверность разности между процентом выживших животных в опытных группах и в контроле, * р<0,05

Затем мы убедились в том, что полученная белоксодержащая фракция 30-50 кДа относится к секретируемым микробными клетками соединениям, а не является продуктом лизиса бактерий. Это было доказано методом проточной цитофлуорометрии (рис 6), когда антитела, находящиеся в сыворотке животных, выживших после заражения, связывались с "микробными клетками, а антитела из сыворотки животных, иммунизированных препаратом К.рпеитотае К2 30-50 кДа, не реагировали с ней. Это также подтвердилось с помощью ИФА, когда сыворотки крови мышей, иммунизированных препаратом К.рпеитотае К2 30-50 кДа не реагировали с антигенами клеточной стенки клебсиеллю. Дополнительным подтверждением отсутствия лизиса микробных клеток в культуральной жидкости является отсутствие нуклеиновых кислот в препарате.

Препарат был не токсичен для белых мышей.

ja»QOO] 4746 (52 6 %j

10° 1П' 10s 1Q- 10'

On: 288 CV: 45.05

¡36-300] 50TO (9T.S«)

io io' 1С ioi ю;

FY.VH

<5ir.; 1SC.M CV: 13.44

Ю-1 Q23) £67 C10D-046)

iV 10' 10' l'Ol I'D-4 'I ■ -M

Рис. 6. Проточная цитофлуе:и ^етрия микробных клеток К. pneumoniae К2

A. Дот-плот клеток К. pneumoniae К2, По оси абсцисс - фронтальное светорассеивание, по оси ординат - боковое светорассеивание.

Б. Гистограмма свечения исходной популяции клеток после их инкубации со вторичными антителами, меченными FITC.

B. Гистограмма свечения исходной популяции клеток К. pneumoniae К2 после их инкубации с первичными антителами, полученными после иммунизации препаратом К. pneumoniae К2 30-50 кДа, полученным из культуральной надо садочной жидкости и вторичными антителами, меченными FI ТС.

Г. Гистограмма свечения исходной популяции клеток К. pneumoniae К2 после их инкубации с первичными антителами, полученными от мышей, выживших после заражения этим штаммом, и вторичными антителами, меченными FITC-

Так как при инфекциях, вызываемых внеклеточными патогенами, основу защитных реакций организма составляют антителозависимые иммунологические механизмы, с участием специфических IgG антител, было проведено исследование по оценке способности сыворотки, полученной от иммунизированных мышей защищать мышей от заражения К2 (табл. 5). В результате 90% мышей, получивших сыворотку иммунизированных мышей, были защищены от заражения летальной дозой штамма К pneumoniae К2. Это исследование показало, что в защите от инфекции важное значение имеют специфические антитела к секретируемым белоксодержащи м фракциям К pneumoniae.

Таблица 5

Роль антител к препарату К pneumoniae К2 30-50 кДа, полученному из культуральной надосадочной жидкости, в защите от экспериментальной клебсиеллезной инфекции (7 сутки после заражения)

№ № Сыворотка мышей, после иммунизации препаратами К pneumoniae К2 Кратность введения сыворотки* Заражающая доза, штамма К pneumoniae К2, микр. клеток Выжило/ Всего %±т

1 30-50 кДа 3 500 9/10 90,0± 9,5**

2 <30 кДа 3 500 0/10 0±8,7

3 Не вводили - 500 0/10 0±8,7

Примечание. * сыворотку вводили внутрибрюшинно через 2, 24 и 48 часов в разведении 1:20 и вводили в объеме 0,5 мл после заражения летальной дозой штамма К pneumoniae К2. ** Достоверность разности pi и 2,з <0,05

Методом ИФА было установлено, что сыворотка иммунизированных мышей содержит специфические IgG, которые появлялись в сыворотке крови через 14 дней после иммунизации, то есть на пике вторичного иммунного ответа, где ведущая роль отводится именно этому классу иммуноглобулинов. Уровень IgG антител к препарату K.pneumoniae К2 30-50 кДа повышался с 0,320±0,220 до 0,601 ±0,152 ед. оптической плотности (р<0,001)

Исследование уровня цитокинов через 2 часа после 2-кратной иммунизаци выявило высокий уровень продукции IL-6, TNF-a, IL-10, IL-12, что свидетельствуе

об активации врожденного иммунитета (табл.6). Через неделю эти показатели снижались, хотя уровень TNF-a оставался достаточно высоким.

Таблица 6

Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей после 2-кратной иммунизации препаратом К pneumoniae К2 с молекулярной массой 30-50 кДа

Срок

исследования

сыворотки

IL-lß

Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей, пкг/мл

IL-2

IL-4

IL-6

TNF-a IL-10 IL-12 IFN-y

2ч

4,1

14,8

10,3

410

127,0

(5,5)

817,1

(15,9)

8Д

(2,3)

8,1

Не

вакциниро-

14,7

17,7

23,2

51,4

3,5

6,8

Примечание. В скобках указана кратность повышения уровня цитокинов после иммунизации по сравнению с не вакцинированными

Иммунизация препаратом К pneumoniae К2 30-50 кДа в испытанных дозах практически не стимулировала резистентность мышей при заражении S.typhimurim 415 и S pneumoniae типа 3 через 24 часа после иммунизации, а также не тормозила, но с другой стороны и не усиливала роста метастазирования опухоли меланомы В16 у мышей при испытанных дозах и схемах введения.

Исследование сывороток пациентов с болезнью Бехтерева в высоком (45,5%) проценте случаев выявило у них наличие антител к исследуемой белоксодержащей фракции. Эти антитела могут играть как защитную роль, так и участвовать в развитии аутоиммунного процесса. Известно, что при болезни Бехтерева поражается не только соединительная ткань суставов, но и желудочно-кишечный тракт. Мы не обнаружили повышения уровня антител к коллагену, эластину, микросомальной фракции толстого и тонкого кишечника в сыворотках крови 5-кратной иммунизированных мышей. Иммунизация мышей также не вызывала повышения уровня антител к нативной и денатурированной ДНК.

Проведенные исследования показали, что препарат K.pneumoniae К2 30-50

кДа можно использовать как основу для конструирования противоклебсиеллезной

вакцины, для иммунизации доноров с целью получения иммунной плазмы или

иммуноглобулина для терапии больных с тяжелой клебсиеллезной инфекцией, а также при разработке диагностических тест-систем.

ВЫВОДЫ

1. Штаммы К pneumoniae К2, К16 и нетипируемого по К-антигену 204 при культивировании в полусинтетической среде продуцируют только один протеолитический фермент с молекулярной массой 21 кДа, обладающий эластазоподобной активностью, не зависящей от степени вирулентности штамма и возрастающей при прибавлении в среду гликопротеина.

2. Внесение в среду культивирования К pneumoniae гликопротеина стимулирует одновременную продукцию микробными клетками белоксодержащих и углеводсодержащих соединений в области 50 кДа.

3. Протективная активность препарата Кpneumoniae К2 30-50 кДа, содержащего белок, углеводы и незначительную примесь липополисахарида и утрачивается при протеолитическом разрушении белка.

4 Протективные белоксодержащие соединения, входящие в состав препарата К pneumoniae К2 30-50 кДа, относятся к секретируемым продуктам микробной клетки, а не являются продуктами ее лизиса.

5. Выявлено, что внутривидовая перекрестная протективной активность препарата К pneumoniae К2 с молекулярной массой 30-50 кДа, определяется основными белковыми компонентами с молекулярной массой 35 и 40 кДа, которые являются общими для штаммов К.pneumoniae К2, К16 и 204.

6. Протективное действие препарата на основе секретируемой белоксодержащей фракции К.pneumoniae К2 30-50 кДа осуществляется путем активации антителозависимых иммунологических механизмов защиты при образовании специфических антител IgG класса.

7. Иммунизация препаратом K.pneumoniae К2 30-50 кДа вызывает повышение в сыворотке крови мышей уровня IL-6, TNF-a, IL-10, IL-12, но не приводит к стимуляции неспецифической резистености организма при испытанных дозах схемах введения.

8. Пациенты с болезнью Бехтерева чаще (45,5% случаев), чем практически здоровые лица (3,1% случаев) содержат антитела к белоксодержащей фракции 30-50 кДа.

9. Антигены белоксодержащей фракции 30-50 кДа не содержат перекрестно реагирующих эпитопов с органонеспецифическими (ДНК, коллаген, эластин) и органоспецифическими (микросомальные фракции кишечника) антигенам человека

10. Секретируемая белоксодержащая фракция К pneumoniae К2 30-50 кДа может быть использована как основа для разработки противоклебсиеллезной вакцины, а также для разработки диагностических тест-систем.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воюшин К.Е., Тришин А.В., Жданович М.Ю., Савватеева JIB., Топтыгин

А Ю., Доненко Ф.В , Киселевский М.В., Курбатова Е.А., Семенов Б.Ф. протеазная активность и вирулентность ряда штаммов Klebsiella pneumoniae Медицинская микробиология 21 век. Материалы Всероссийской научно-практической конференции (28-30 сентября 2004 г.,Саратов). Под редакцией В.В.Кутырева. с. 6465.

2. Воюшин К.Е., Тришин А.В., Жданович М.Ю., Савватеева JI.B., Доненко Ф.В., Топтыгин А.Ю., Киселевский М.В., Курбатова Е.А. «Изучение взаимоствязи протеазной активности и вирулентности ряда штаммов Klebsiella pneumoniae.» Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных-заболеваний» («Сосновка», Новосибирская область, 8-10 сентября 2004 г.). с. 51.

3. Тришин А.В , Жданович М.Ю., Савватеева П.В , Топтыгин А.Ю , Доненко Ф.В , Киселевский М.В., Воюшин К.Е., Курбатова Е.А. Грубер И.М., С.И.Ёлкина, Н.Г.Калина Сопряженный синтез некоторых секретируемых факторов патогенности Klebsiella pneumoniae. Вестник Академии медицинских наук 2005. №9. С.43-47.

4. Воюшин К.Е., Тришин А.В., Доненко Ф.В., Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П., Киселевский М.В., Егорова Н.Б., Курбатова Е.А., Семенова И.Б., Семенов Б.Ф.

Секретируемые белоксодержащие антигены Klebsiella pneumoniae в системе адаптивного иммунитета. Журн.микробиол. 2006.№1. с.51-56.

4. Завяка на изобретение №2006133783 (036739). Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий. Приоритет от 22.09.2006.

Подписано в печать 15.01.07 г. Формат 60x84/16 Тираж 100 экз. Заказ № 25 Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им Н Н. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Оглавление диссертации Воюшин, Константин Евгеньевич :: 2007 :: Москва

Введение.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ АНТИГЕННЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ

ХАРАКТЕРИСТИКИ Klebsiella pneumoniae.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНЫХ 29 АНТИГЕНОВ Klebsiella pneumoniae И ИЗУЧЕНИЕ ИХ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

ГЛАВА 3. РОЛЬ Klebsiella pneumoniae ПРИ АУТОИММУННЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЧЕЛОВЕКА.

ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1. Штаммы микроорганизмов.

1.2. Питательные среды.

1.3. Лабораторные животные.

1.4. Определение вирулентности штаммов К. pneumoniae.

1.5. Получение белоксодержащих фракций из культуральной 52 надосадочной жидкости штаммов K.pneumoniae.

1.6. Определение протеазной активности белоксодерщих 55 фракций, полученных из культуральной надосадочной жидкости.

1.7. Определение молекулярной массы белоксодержащих 55 соединений, полученных из культуральной надосадочной жидкости

1.8. Проточная цитофлуориметрия.

1.9. Методы химического анализа.

1.10. ЛАЛ-тест.

1.11 .Иммуноблоттинг.

1.12. Получение препаратов для иммунизации животных.

1.13. Протеолиз белоксодержащей фракции.

1.14. Определение протективной активности секретируемых 60 белоксодержащих фракций.

1.15. Определение антител к секретируемым белоксодержащим 61 фракциям K.pneumoniae в ИФА.

1.17. Получение гипериммунных сывороток.

1.18. Определение превентивной активности сывороток.

1.19. Определение уровня цитокинов в сыворотке крови 63 иммунизированных мышей.

1.20. Определение уровня антител к органоспецифическим и 63 органонеспецифическим антигенам человека в сыворотке крови мышей, иммуниированных препаратом оргнов и тканей человека К. pneumoniae К2 30-50 кДа.

1.21. Определение IgG антител к препарату К. pneumoniae К2 63 30-50 к Да в сыворотках крови пациентов с анкилозирующим спондилитом.

1.22. Противоопухолевая активность

1.23. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 2. ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ 66 НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ ШТАММОВ K.pneumoniae И ИЗУЧЕНИЕ ЕЕ ПРОТЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

2.1. Выбор штаммов K.pneumoniae.

2.2. Культивирование штаммов K.pneumoniae и получение 67 культуральной надосадочной жидкости.

2.3. Изучение протеолитической активности культуральной 72 надосадочной жидкости штаммов K.pneumoniae различных по вирулентности

ГЛАВА 3. ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ

БЕЛОКСОДЕРЖАЩИХ КЛЕБСИЕЛЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТА К. 86 pneumoniae К2 30-50 кДа, ПОЛУЧЕННОГОГО ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ

4.1. Химический состав препарата К. pneumoniae К2 30-50 кДа, 86 полученного из культуральной надосадочной жидкости

4.2. Иммунохимическая характеристика препарата 92 K.pneumoniae К2 30-50 к Да, полученного из культуральной надосадочной жидкости

4.3. Острая токсичность препарата К pneumoniae К2 30-50 кДа, 96 полученного из культуральной надосадочной жидкости

ГЛАВА 5. РОЛЬ АНТИТЕЛОЗАВИСИМЫХ 98 ЭФФЕКТОРНЫХ МЕХАНИЗМОВ В ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА K.pneumoniae К2 30-50 кДа, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ

5.1. Роль антител к препарату K.pneumoniae К2 30-50 кДа в 98 защите от экспериментальной клебсиеллезной инфекции

5.2. Исследование сывороток больных болезнью Бехтерева 102 (анкилозирующий спондилит)

ГЛАВА 6. СПОСОБНОСТЬ ПРЕПАРАТА K.pneumoniae К2 107 30-50 КДА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ, СТИМУЛИРОВАТЬ НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОРГАНИЗМА

6.1. Стимуляция неспецифической резистентности препаратом 107 K.pneumoniae К2 30-50 КДА на моделях бактериальной инфекции.

6.2. Противоопухолевая активность препарата K.pneumoniae К2 109 30-50 кДа, полученного из культуральной надосадочной жидкости

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Воюшин, Константин Евгеньевич, автореферат

Актуальность темы. Одним из наиболее важных с медицинской точки зрения представителей рода Klebsiella является Klebsiella pneumoniae sp. pneumoniae - широко распространенный возбудитель инфекционных процессов различной локализации. Есть данные о возможной роли К. pneumoniae в манифестации и обострениях болезни Бехтерева у HLA-B27-позитивных лиц [47, 66, 67].

На протяжении последних десятилетий К. pneumoniae занимает одно из первых мест в структуре внутрибольничных инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами [13, 48, 92, 157]. К группе высокого риска инфицирования относятся пациенты с иммунодефицитом, новорожденные, лица пожилого и старческого возраста [139, 166]. Летальность от клебсиеллезного сепсиса и пневмонии составляет 20-50% [8, 139].

В настоящее время в клинической практике применяют только бактериальные поликомпонентные вакцины для активной иммунотерапии пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями, вызываемыми условно-патогенными микроорганизмами, содержащие в своем составе антигены К. pneumoniae (рибомунил, бронхомунал, респивакс, иммуновак-ВП-4 и др.) [9, 14, 20, 39, 124 и др.]. Эти препараты предназначены, прежде всего, для коррекции вторичного иммунодефицита.

Многолетние исследования по разработке противоклебсиеллезной вакцины не привели к созданию эффективного препарата, используемого в практике здравоохранения. В качестве наиболее перспективных антигенов для получения вакцин рассматривали капсульный полисахарид или липополисахарид (ЛПС) К. pneumoniae [35, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59]. Роль белоксодержащих антигенов К. pneumoniae изучена недостаточно. В последнее время появились сообщения об иммуногенной активности белков наружной мембраны К. pneumoniae, характеризующихся высоким уровнем гомологии у представителей семейства Enterobacteriaceae [94].

Секретируемые белоксодержащие компоненты К. pneumoniae, представленные ферментами (протеазы, гликозидазы и др.), токсинами, гемолизинами, белками теплового шока и др., с целью получения протективных антигенов, практически не изучались. Высокая консервативность аминокислотной последовательности этих соединений у разных штаммов К. pneumoniae открывает новую область их примненения для получения антигенов с внутри- и, возможно, межвидовой перекрестной протективной активностью.

Цель исследования. Получение и характеристика иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов К. pneumoniae.

Задачи исследования:

1. Получить из культуральной надосадочной жидкости штаммов К. pneumoniae различной степени вирулентности белоксодержащие соединения и определить протеазную активность полученных фракций.

2. Изучить протективную активность секретируемых белоксодержащих фракций К. pneumoniae при заражении гомологичным и гетерологичными К-типами К. pneumoniae.

3. Дать химическую и иммунохимическую характеристику препаратов, полученных на основе секретируемых белоксодержащих фракций К. pneumoniae.

4. Исследовать иммунный ответ у животных при иммунизации секретируемыми белоксодержащими фракциями К. pneumoniae.

Установлено, что штаммы K.pneumoniae К2, К16 и нетипируемого по К-антигену штамма №204 продуцируют только один вид протеазы с молекулярной массой 21 кДа, обладающую эластазоподобной активностью, которая не зависит от степени вирулентности штамма и возрастает при прибавлении в среду культивирования субстрата протеазы - гликопротеина. Обнаружено, что фракция, содержащая данный фермент не обладает протективной активностью. Показано, что при внесении в среду культивирования гликопротеина происходит повышение продукции штаммами K.pneumoniae белоксодержащих соединений в области 50 к Да и углеводсодержащих соединений в областях 25, 50, 60 и 70 кДа.

Установлено, что внутривидовой протективной активностью обладает фракция 30-50 кДа, содержащая белок, углеводы и примесь ЛПС. Основные белковые компоненты фракции имеют молекулярную массу 35 и 40 к Да и являются общими для всех исследованных штаммов (К2, К16, 204). Протеолитическое разрушение белка приводит к утрате защитных свойств препарата. Методами проточной цитофлюориметрии и ИФА показано, что белоксодержащие фракции относятся к секретируемым антигенам, а не являются продуктами лизиса микробных клеток.

Показано, что препарат K.pneumoniae К2, полученный на основе фракции с молекулярной массой 30-50 кДа приводит к выработке специфических антител IgG класса, повышает уровень цитокинов IL-6, TNF-а, IL-10, IL-12 в сыворотке крови мышей, но не является активным стимулятором неспецифической резистености организма при испытанных дозах и схемах введения.

Выявлено, что сыворотки крови пациентов с болезнью Бехтерева содержат антитела к белоксодержащей фракции 30-50 кДа, иммунизация которой не приводит к образованию антител к органонеспецифическим и органоспецифическим антигенам человека.

Практическая значимость. Секретируемая белоксодержащая фракция К. pneumoniae К2 30-50 кДа может быть использована как основа для разработки противоклебсиеллезной вакцины с внутривидовой перекрестной протективной активностью для активной иммунизации пациентов групп риска и получения гипериммунной плазмы для терапии тяжелых случаев клебсиеллезной инфекции, а также для разработки диагностических тест-систем.

При получении препаратов на основе секретируемых белоксодержащих фракций микроорганизмов, культивируемых на синтетических или полусинтетических средах, можно использовать гликопротеин для определения ориентировочного диапазона локализации протективных антигенов, продуцируемых микробной клеткой в среду культивирования.

Использование указанных подходов по получению протективных антигенов на основе секретируемых белоксодержащих фракций К. pneumoniae может быть применено к получению протективных антигенов из других микроорганизмов.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение иммунобиологических свойств секретируемых белоксодержащих антигенов Klebsiella pneumoniae"

8. ВЫВОДЫ

1. Штаммы K.pneumoniae К2, К16 и нетипируемого по К-антигену 204 при культивировании в полусинтетической среде продуцируют только один протеолитический фермент с молекулярной массой 21 кДа, обладающий эластазоподобной активностью, не зависящей от степени вирулентности штамма и возрастающей при прибавлении в среду гликопротеина.

2. Внесение в среду культивирования K.pneumoniae гликопротеина стимулирует одновременную продукцию микробными клетками белоксодержащих и углеводсодержащих соединений в области 50 к Да.

3. Протективная активность препарата K.pneumoniae К2 30-50 кДа, содержащего белок, углеводы и незначительную примесь липополисахарида утрачивается при протеолитическом разрушении белка.

4. Протективные белоксодержащие соединения, входящие в состав препарата K.pneumoniae К2 30-50 кДа, относятся к секретируемым продуктам микробной клетки, а не являются продуктами ее лизиса.

5. Выявлено, что внутривидовая перекрестная протективной активность препарата K.pneumoniae К2 с молекулярной массой 30-50 кДа, определяется основными белковыми компонентами с молекулярной массой 35 и 40 кДа, которые являются общими для штаммов K.pneumoniae К2, К16 и 204.

6. Протективное действие препарата на основе секретируемой белоксодержащей фракции K.pneumoniae К2 30-50 кДа осуществляется путем активации антителзависимых иммунологических механизмов защиты при образовании специфических антител IgG класса.

10. Секретируемая белоксодержащая фракция К. pneumoniae К2 30-50 кДа может быть использована как основа для разработки противоклебсиеллезной вакцины, а также для разработки диагностических тест-систем.

7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клебсиеллезная инфекция занимает одно из первых мест как причина острых и хронических воспалительных процессов различной локализации. Рост числа антибиотикорезистеных штаммов клебсиелл, снижение иммунологической реактивности организма определяют трудности терапии этой инфекции и обосновывают необходимость разработки противоклебсиеллезных иммунобиологических препаратов.

До настоящего времени нет коммерческих вакцинных препаратов для профилактики клебсиеллезной инфекции, хотя разработки в этом напрявлении ведутся уже на протяжении 20 с лишним лет во многих странах мира. Наиболее перспективными можно считать разработки J. Cryz с соавт. [53-59], которые предприняли попытку конструирования противоклебсилеллезной полисахаридной вакцины на основе капсульного полисахарида, наиболее часто встречающихся у человека К-типов клебсиелл. Однако после прохождения I фазы клинических испытаний, коммерческий препарат так и не был получен. Тем не менее, по аналогии с подходом, предложенным J. Cryz, была разработана вакцина против пневмококковой инфекции, и в практику здравоохранения введен, зарегистрированный в России препарат - «пневмо 23» на основе капсульного полисахарида 23 штаммов пневмококка.

Все исследователи, занимащиеся разработкой этой проблемы, шли по пути использования поверхностных (полисахарид, липополисахарид) и внутриклеточных (рибосомальные фракции) антигенов клебсиелл, но лишь немногие из них [98, 160, 171, 172] обратили внимание на протективные свойства белоксодержащих антигенов микробной клетки. К сожалению, кроме экспериментальных исследований, это направление не получило дальнейшего развития. Секретируемые микробной клеткой белоксодержащие соединения, полученные из культуральной среды клебсиелл, до сих пор оставались вне поля зрения исследователей.

В проведенной работе мы исходили из того, что микробная клетка секретирует в окружающую среду кроме полисахарида и ЛПС ряд белоксодержащих соединений, необходимых для ее выживания и жизнеобеспечения. Это ферменты, токсины, гемолизины, железорегулируемые белки и другие соединения, которые обладают значительной степенью гомологии как у различных серотипов клебсиелл, так и межвидовой гомологией. Учитывая то, что клебсиелла является внеклеточным патогеном, санация организма от которого происходит по антителозависимомому механизму, мы предположили, что получение протективных антигенов на основе секретируемых микробной клеткой соединений, позволит блокировать с помощью антител механизмы ее адаптации в организме хозяина или системы жизнеобеспечения. Прежде всего, мы хотели узнать есть ли различия в продукции протеолитических ферментов, которые расщепляют межклеточных матрикс и способствуют распространению инфекции в организме, между штаммами клебсиелл различной степени вирулентности. Поэтому на первом этапе исследования была определена вирулентность для белых мышей 6 штаммов клебсиелл наиболее часто встречающихся при заболеваниях человека (К2, К13, К16, К25, К48 и не типируемого по К-антигену - 204). Для дальнейших исследований были отобраны 3 штамма: К2 - вирулентный (LD50 - 31,6 микробных клеток), К16 - средней степени вирулентности (LD50 - 8,9x106 микробных клеток) 204 - маловирулентный (LD50 - 354,8х106 микробных клеток).

Для получения секретируемых белоксодержащих соединений выбранные штаммы культивировали в полусинтетической среде в ферментере. Для того, чтобы уменьшить риск лизиса микробных клеток и не допустить поступления в культуральную среду белковых продуктов распада бактерий, время культивирования было ограничено 6 часами, что совпадало с фазой замедления роста. После получения биомассы микробные клетки инактивировали и осаждали центрифугированием, а надосадочную жидкость использовали для получения секретируемых белоксодержащих фракций путем осаждения сульфатом аммония.

Прежде всего, была исследована протеазная активность культуральной надосадочной жидкости различных по вирулентности штаммов K.pneumoniae. Установлено, что K.pneumoniae активно продуцирует в культуральную среду только один протеолитический фермент с эластазоподобной активностью. Трипсиноподобной активности не выявлено, а химотрипсиноподобная активность почти не определялась. Интересно, что штаммы, различающихся между собой по вирулентности в сотни раз имели примерно одинаковую эластазоподобную активность, которая составляла 5416, 7476 и 7302 мЕ/мл для штаммов К2, К16 и 204, соответственно. При прибавлении в среду культивирования в начале процесса инкубации бактерий субстрата протеазы - гликопротеина, происходило увеличение эластазоподобной активности в 2 раза, причем это сопровождалось параллельным увеличением выработки микробными клетками углеводсодержащих соединений.

При фракционировании белоксодержащих фракций, предварительно осажденных из культуральной надосадочной жидкости сульфатом аммония, с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе и проведением элюции в градиенте NaCl было получено 30 белоксодержащих фракций. Только одна из этих фракций обладала эластазоподобной активностью равной общей эластазоподобной активности культуральной надосадочной жидкости. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле показало, что выявленная протеаза с эластазоподобной активностью имеет молекулярную массу 21 кДа.

При проведении гель-фильтрации белоксодержащих соединений, предварительно осажденных сульфатом аммония из культуральной надосадочной жидкости, полученной без прибавления и при прибавлении в среду гликопротеина в начале инкубации бактерий, мы не выявили значимых изменений в продукции белоксодержащей фракции с молекулярной массой 21 кДа, однако появился резкий выброс белоксодержащих соединений в области 50 кДа. Вместе с этим происходило повышение продукции в среду культивирования углеводсодержащих в областях 25, 50 и 60 и 70 кДа. Обращает на себя внимание, что только в области 50 кДа происходил одновременный выброс в культуральную среду белка и углеводов.

Не исключая того, что белковые соединения в среде культивирования находятся в тесной связи с полисахаридом и ЛПС, при проведении дальнейших исследований по получению белоксодержащих фракций был применен метод ультрафильтрации. Предварительно белоксодержащие соединения осаждали из культуральной надосадочной жидкости сульфатом аммония, отделяли от супернатанта, ресуспендировали в буферном растворе и фильровали через мембраны, позволяющие получить соединения с различной молекулярной массой. В итоге были получены: фракция с молекуляной массой < 30 кДа, содержащая протеазу, обладающую эластазоподобной активностью, а также фракции 30-50; > 50 и >100 кДа, которые после сорбции на гидроокиси алюминия были использованы в качестве препаратов для иммунизации животных.

После 2-кратной иммунизации мышей препаратами, полученными из штамма K.pneumoniae К2, на 14 сутки их заражали гомологичных штаммом в дозе 178 LD50. Установлено, что протективной активностью обладал только препарат с молекулярной массой 30-50 к Да, который защищал 100% мышей от заражения. Остальные препараты, включая фракцию <30 к Да с высокой эластазоподобной активностью, были неиммуногенными.

Далее было установлено, что препарат K.pneumoniae К2 30-50 кДа, а также препараты этой же молекулярной массы, полученные из других исследованных штаммов - К16 и 204, обладали внутривидовой перекрестной протективной активностью. Перекрестная протективная активность препаратов была ниже, чем в гомологичной системе. Так, если препарат K.pneumoniae К2 30-50 кДа обеспечивал 100% защиту мышей при заражении этим же штаммом в дозе более 100 LD50, то при заражении штаммом К16 эта защита составляла 60%. Внутривидовая перекрестная протективная активность выявлена также у препаратов K.pneumoniae К16 и 204, которая также была сосредоточена во фракции 30-50 к Да.

Наличие общих белоксодержащих соединений у штаммов Kpneumoniae К2, К16 и 204 было подтверждено при проведении электрофореза в полиакриламидном геле. При этом были выявлены общие мажорные белковые полосы в области 35 и 40 кДа. Тот факт, что белоксодержащие соединения этой молекулярной массы участвуют в защите от инфекции, подтвердился в реакции иммуноблоттинга с антителами, полученными после иммунизации мышей препаратом K.pneumoniae К2 3050 к Да. При этом иммунологически активные белки, связывающиеся с антителами к препарату Kpneumoniae К2, у всех трех штаммов локализовались в области 35 и 40 к Да, что свидетельствует о консервативности их аминокислотной последовательности.

Учитывая тот факт, что Kpneumoniae К2 является наиболее вирулентым штаммом за счет отсутствия у нее манозосвязывающего рецептора и наиболее часто является этиологическим фактором различных острых и хронических воспалительных процессов у человека, а также имеет общие протективные антигены белковой природы с другими штаммами клебсиелл, более подробному дальнейшему изучению был подвергнут препарат K.pneumoniae К2 30-50 кДа.

При проведении химического анализа препарата K.pneumoniae К2 3050 кДа выявлено содержание в нем 29,7 мкг/мл белка, 16,2 мкг/мл углеводов и 6 мкг/мл ЛПС. Присутствие в препарате ЛПС было подтверждено в Лимулюс-тесте, в котором были получены сопоставимые результаты (2 мкг/мл). Так как в полученном методом ультрафильтрации препарате K.pneumoniae К2 30-50 кДа содержались различные иммунологически активные соединения, нам надо было убедиться в том, что не полисахарид и ЛПС обеспечивают такую высокую защиту от заражения, а именно секретируемые микробной клеткой белоксодержащие фракции. В пользу этого предположения свидетельствовали косвенные данные: получение белоксодержащих фракций из культуральной надосадочной жидкости путем осаждения белковых соединений сульфатом аммония, мажорные белковые полосы на электрофорезе в областях 35 и 40 кДа. Однако для полной уверенности в полученных результатах этого было недостаточно. Поэтому было проведено дополнительное исследование по уточнению этого положения. На препарат K.pneumoniae К2 30-50 кДа воздействовали протеиназой К для разрушения белковой составляющей. После этого мышей иммунизировали этим препаратом по обычной схеме. Выявили, что иммунизация препаратом, в котором белковая часть была разрушена (отсутствие белковых полос на электрофорезе), не защищал от заражения, тогда как нативный препарат K.pneumoniae К2 30-50 кДа, содержащий основные белковые компоненты с молекулярной массой 35 и 40 кДа обеспечивал выживаемость 90% животных в дозе более 100 LD50. Это исследование доказало, что протективной активностью обладают белоксодержащие соединения, хотя мы не исключаем, что ЛПС и полисахарид, присутствующие в препарате, могут оказывать адъювантное действие.

Затем мы убедились в том, что полученная нами белоксодержащая фракция относится к секретируемым микробными клетками соединениям, а не является продуктом лизиса бактерий. Это было доказано методом проточной цитометрии, когда антитела, находящиеся в сыворотке животных выживших после заражения связывались с микробными клектками, а антитела из сыворотки животных иммунизированных препаратом

K.pneumoniae K2 30-50 кДа не реагировали с ней. Это также подтвердилось методом ИФА, когда сыворотки крови мышей, иммунизированных препаратом Kpneumoniae К2 30-50 кДа не реагировали с антигенами клеточной стенки клебсиелл, хотя в этом случае нельзя исключить возможной роли цитоплазматических антигенов.

Таким образом, на этом этапе исследования был сделан важный вывод о том, что протективной активностью обладает секретируемая белоксодержащая фракция K.pneumoniae 30-50 кДа, а иммунодоминантные белки имеют молекулятрную массу 35 и 40 кДа.

Токсического действия препарата на белых мышах не выявлено.

Так как при инфекциях, вызываемых внеклеточными патогенами, основу защитных реакций организма составляют антителозависимые иммунологические механизмы, было проведено исследование по оценке способности сыворотки, полученной от иммунизированных мышей защищать мышей от заражения К2. Сыворотку вводили за 2 часа до заражения в разведении 1:20 в объеме 0,5 мл. Затем заражали мышей летальной дозой культуры и продолжали введение сыворотке дважды в течение последующих 2 дней. В результате 90% мышей, получивших сыворотку иммунизированных мышей, были защищены от заражения летальной дозой штамма Kpneumoniae К2. В тоже время сыворотка мышей, иммунизированных препаратом Kpneumoniae К2 <30 кДа, содержащим эластазоподобный фермент, не защищала мышей от заражения. Это исследование показало, что в защите от инфекции важное значение имеют специфические антитела к секретируемым белоксодержащим фракциям K.pneumoniae. В ИФА было установлено, что сыворотка иммунизированных мышей содержит специфические иммуноглобулины класса G, которые выявляли в сыворотке крови через 14 дней после иммунизации, то есть на пике вторичного иммунного ответа, где ведущая роль отводится именно этому классу иммуноглобулинов.

Исследование уровня цитокинов через 2 часа после 2-кратной иммунизации выявило высокий уровень продукции IL-6, TNF-a, IL-10. Через неделю эти показатели снижались, хотя уровень TNF-a оставался достаточно высоким.

Действие препарата на стимуляцию неспецифической резистености организма было проведено на инфекционных моделях и на модели иммунозависимой перевиваемой опухоли мышей - меланоме В16. Установлено, что иммунизация препаратом K.pneumoniae К2 30-50 кДа практически не стимулировала резистеность мышей при заражении S.typhimurim 415 и S.pneumoniae типа 3 через 24 после иммунизации, а также не тормозила, но с другой стороны и не усиливала роста и метастазирования опухоли меланомы В16 у мышей.

Так как в настоящее время представителей рода Klebsiella рассматривают как пусковой фактор развития аутоиммунной патологии (болезнь Бехтерева, болезнь Крона) у лиц с генетически детерминированной предрасположенностью к этим заболеваниям, было проведено исследования по оценке влияния препарата на образование антител к антигенам органов и тканей человека после 5-кратной иммунизации. Не было выявлено повышения уровня антител к коллагену, эластину, микросомальным фракциям толстого и тонкого кишечника. 2-кратная иммунизация мышей не вызывала повышения уровня антител к нативной и денатурированной ДНК.

Исследование сывороток пациентов с болезнью Бехтерева в высоком проценте случаев выявило у них наличие антител к исследуемой белоксодержащей фракции, которые могут играть защитную роль предотвращая манифестации и обострения клебсиеллезной инфекции.

Проведенные исследования показали, что препарат K.pneumoniae К2 30-50 к Да можно использовать как основу для конструирования противоклебсиеллезной вакцины, а также для иммунизации доноров с целью получения иммунной плазмы или иммуноглобулина для терапии больных с тяжелой клебсиеллезной инфекцией.

Проведенное исследование открыло новый перспективный путь получения эффективных вакцинных препаратов на основе секретируемых белоксодержащих фракций клебсиелл, который может быть использован для получения протективных антигенов различных возбудителей. Не известно, будет ли этот путь приемлемым для получения протективных белоксодержащих фракций у представителей внутриклеточных бактерий. Это еще предстоит выяснить. Если говорить об клеточных антигенах микробной клетки и внеклеточных (секретируемых в окружающую среду), необходимо отметить сериновые протеазы, низкомолекулярные белки теплового шока, белки наружной мембраны, молекулярные массы которых попадают в данный диапазон. В том случае, если удасться определить к какому классу белковых соединений относятся выделенные белоксодержащие соединения 35 и 40 кДа, являются ли они субъединицами одной белковой молекулы или представляют собой два разных белка, можно будет использовать генно-инженерные подходы к получению рекомбинантных белков для получения иммунобиологических препаратов и в диагностических целях. При условии получения секретируемых протективных белоксодержащих фракций из других микроорганизмов, можно говорить о конструировании ассоциированной вакцины против ряда инфекционных заболеваний.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2007 года, Воюшин, Константин Евгеньевич

1. Агапова О.В. Бондаренко В.М. Бактериальные IgA-протеазы. Журн. микробиол. 1998. №2. - с.121-125.

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. //В кн.: "Статистические методы в микробиологии." М. - 1961. - 180 с.

3. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р., Elitza Golkocheva. Секретируемые факторы патогенности энтеробактерий. //Журн.микробиол. 2002. -№1. с.84-90.

4. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р., Агапова О.В. Сериновые протеазы грамотрицательных бактерий: структура, механизмы секреции, биологическая активность.// Журн.микробиол. 2002. №6. - с.80-85.

5. Бондаренко В.М., Мавзютов А.Р., Виноградов Н.А. Роль бактериальной протеазы, деградирующей секреторный иммуноглобулин А, в персистенции клебсиелл. //Журн.микробиол. 2000. №4. - Приложение. - С. 12-16.

6. Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Потатуркина-Нестерова Н.И. Проблема патогенности клебсиелл. Ульяновск 1996. 131 с.

7. Бухарин О.В., Кириллов Д.А., Кириллов В.А. Скрининг плазмид у бактерий рода bacillus, обладающих антилизоцимной активностью.Журн.микробиол. 2006. №1 с.3-6.

8. Добрев П.О. Пневмонии. М.: Медицина. 1985.

9. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Кузьмина Л.А. Итоги экспериментального и клинического изучения поликомпонентной вакцины из антигенов условно-патогенных микуроорганизмов.//Журн. Микробиол. 1997. - №6. - с.96-101.

10. Егорова Н.Б., Краснопрошина Л.И. и др. протективная активность бесклеточной клебсиеллезной вакцины в отношении сепсиса у мышей, вызываемого некоторыми серотипами Streptococcus pneumoniae. Журн. микробиол. 1985. №2. - с.60-65.

11. Ефимцева О.В. Разработка управляемых процессов культивирования K.pneumoniae для получения клебсиеллезной вакцины. Автореферат дис. канд. мед наук. М. 1991. 150с.

12. Киселев В.И., Северин Е.С., Пальцев М.А. Противоопухолевые вакцины. Белки теплового шока как индукторы противоопухолевого иммунитета. Молекулярная медицина. 2005. №1. - с.3-10.

13. Красноголовец В.Н., Киселева Б.С. В кн.: " Клебсиеллезные инфекции". Москва. "Медицина". 1996. 256 с.

14. Курбатова Е.А. Разработка поликомпонентной вакцины из антигенов условно-патогенных микроорганизмов (Экспериментальное и клинико-иммунологическое исследование. Автореферат дис. док. мед наук. М. 1997. 50с.

15. Курбатова Е.А., Егорова Н.Б., Дубова В.Г., и др. Изучение реактогенности и имммунологической эффективности клебсиеллезной вакцины на донорах. Журн.микробиол. 1990. №5. -с. 53-55.

16. Курбатова Е.А., Егорова Н.Б., Киселева Б.С. Протективная активность бесклеточной клебсиеллезной вакцины в отношении различных сероваров Klebsiella pneumoniae. Журн.микробиол. 1984. №8. - с.80-85.

17. Ласица О.И., Охотникова Е.Н., Усова Е.И., Гордиенко С.М. Наш опыт применения рибомунила у часто болеющих детей. //6 Национальный конгресс по болезням органов дыхания. -Новосибирск. 1996. - с. 94.

18. Медицинские иммунобиологические препараты. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96. Минздрав России. Москва. 1998.

19. Определитель бактерий Берджи. Пер. с англ. Хоулт Дж. и др., в 2-х томах, М., «Мир», 1997.

20. Петрунов Б., Ненков П. Исследование воздействия на иммунную систему респивакса полибактериальной вакцины для пероральной иммунотерапии и иммунопрофилактики неспецифических инфекций дыхательного трактаю // Ж.микробиол. - 1991. - №4. - с.34-35.

21. Пшеничнов В.А., Семенов Б.Ф., Зезеров Е.Г. Стандартизация методов вирусологических исследований. М. Медицина. 1974.

22. Флеров К.Ф. О патогенном действии микроорганизмов Фридлендера и Френкеля. Дис. док. М. 1895.

23. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М. Медицина. 2002 536 с.

24. Ястрбова Н.Е., Ванеева Н.П., Демин А.А. и др. Иммуноферментный анализ антител нативной и денатурированной ДНК. Иммунология. 1987.-№5.-с. 73-75.

25. Albesa I. Klebsiella pneumoniae heamolysin adsorption to red blood cells. J. Appl. Bacterid. 1989. Vol. 67. p. 263-266.

26. Alcantar-Curiel M.D., Garcia-Lattore E., Santos J.I. Klebsiellapneumoniae 35 and 36 kDa porins are common antigens in different serotypes and induce opsonizing antibodies. Arch. Med. Res. 2000. -Vol.31.-N1 -p.28-36.

27. Antonie D., Blaive В., Cabanieu G. Etude en double aveugle du Biostim dans la prevention des superinfections des patients atteins de bronchopathie chronique.//Rev. Pneumol. Clin. 1985. - V.41. - p213-217.

28. Arend W.P., Dayer J.M. Inhibition of the production and effects of inerleukin-1 and tumor-necrosis factor-a in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1995.-Vol.38. P.151.

29. Athamna A., Ofek I., Keisari Y., et al. Lectinophagocytosis of encapsulated Klebsiella pneumoniae mediated by surface lectins of guinea pig alveolar macrophages and human monocyte-derived macrophages. Infect. Immun. 1991. Vol.59. - p.1673-1682.

30. Babu J.P., Abraham S.N., Dabbous M.K., Beachey E.H. Interaction of a 60-Kilodalton D-mannose-containing salivary glycoprotein with type 1 fimbriae of Escherichia coli. Infect. Immun. 1986. Vol.54, p. 104-108.

31. Balish M.J., Jensen J., Uehling D.T. Bladder mucin: a scanning electron microscopy study in experimental cystitis. J. Urol. 1982. Vol. 128. -p. 1060-1063.

32. Barberis L.I., Eraso A.J., Pajaro M.C., Albesa I. Molecular weight determination and partial characterization of Klebsiella pneumoniae hemolysins. Can. J. Microbiol. 1986. Vol. 32. p. 884-888.

33. Bellon G., Ounis I. The preventive treatment of recurrent respiratory infections using RU 41470 in 3008 children.// Ann. Pediatr. (Paris). 1990. Vol.37.-p.535-540.

34. Benedi V.J., Vivanco F., Tomas J.M. Complement activation in Klebsiella pneumoniae. 1998. Rev.Med. Micribiol. 1998. Vol.9. -P.69-77.

35. Bennett-Guerrero E., Mcintosh T.J., Barclay G.R., et al. Preparatoion and preclinical evaluation of a novel liposomal complete-core lipopolysaccharide vaccine. //Infection and Immunity. 2000. - Vol.68. -Nil.- p.6202-6208.

36. Bjorndal H., Lindberg В., Nimmich W. Structural studies on Klebsiella О groups 1 and 6 lypolysaccharides. Acta. Chem. Scand. 1971. - Vol.25. -N3. -p.750-757.

37. Blumenkrantz, N., and G. Asboe-Hansen. 1973. New method for quantitative determination of uronic acids. Anal. Biochem.54: 484-489.

38. Bonfiles P. Prophylaxie des infections des voies respiratoire chez Г enfant par le RU 41 740.// Press.Med. 1988. - v. 17. - p. 1450-1452.

39. Bosch A., Lucena F., Pares R., Jofre J. Bacterial immunostimulant (Broncho-vaxom) versus levamisole on the humoral immune response in mice.//J. Immunopharmacol. 1983. - Vol.5. - p.107-116.

40. Brade L., Podschun R., Brade H. A monoclonal antibody with specificity for the genus Klebsiella to a common epitope lacated in the core region of Klebsiella lipopolysaccharide. J. Endotoxin Res. 2001 Vol.7. N2 p.l 19-124

41. Brennan F.M., Maini R.N., Feldman M. TNF-a: a pivotal role in rheumatoid arthritis. Br.J.Rheumatol. 1992. Vol.31. P.293.

42. Brown C., Seidler J. Potential pathogens in the environment: Klebsiella pneumoniae,& taxonomic and ecological engima. Appl. Microbiol. 1973. -Vol. 25.-p. 900-904.

43. Camprubi S., Merino S., Benedi V.J., Tomas J.M. The role of the O-antigen lipopolysacchride and capsule on an experimental Klebsiella pneumoniae infection of the rat urinary tract. FEMS Microbiol. Lett. 1993a.-Vol.lll.-P.9-13

44. Camprubi S., Merino S., Guillot J.F., Tomas J.M. The role of the O-antigen lipopolysacchride in colonization invivo of the germfree chicken gut by Klebsiella pneumoniae. Microb. Pathog. 1993b. Vol.14. - P.433-440.

45. Cancino-Diaz M., Ayala-Narvaez H., Burgos-Vargas R. et al. Recognition of В cell epitopes of the Klebsiella pneumoniae GroEl-like protein by HLA-B27 positive subjects. Microb Pathog. 2000. Vol.28. -N.4.-P.211-220.

46. Casewell M., Talsania H.G. Predominance of certain klebsiella capsular types in hospitals in the United Kingdom. J. Infect. 1979. Vol.1. - p.77-79. Cryz 687-690.

47. Cauli A., Dessole G., Nurchis P.P et al. The role of HLA-B27 molecules in the pathogenesis of ankylosing spodilitis. Reumatismo. 2002. Vol. 54. -N3. -P266-271

48. Collado A., Gratacos J., Ebringer A. Et al. Serun IgA anti-Klebsiellaantihodks in ankylosing spondilitis patients from Catalonia.

49. Scand. J. Rheumatol. 1994. Vol.23. - P. 119-123.

50. Coombes B.K., Vadez Y., Finlay B.B. Evasive maneuvers by secreted bacterial proteins to avoid innate immune response. Current biology. 2004. Vol.14.-P.856-867.

51. Cooper J.M., Rowley D. Resistance to Klebsiella pneumoniae and the importance of two bacterial antigens. Aust. J. Exper. Biol. Med. Sci. 1982. Vol.60.-p. 629-641.

52. Cryz J.S., Furer E., Germanier R. Experimental Klebsiella burn wound sepsis: role of capsular polysaccharide. Infect. Immun. 1984. Vol.43. -N1. -p.440-447.

53. Cryz S J. Progress in immunization against Klebsiella infections. Eur. J. Clin. Microbiol. 1983. Vol. - 2. - N6. - p.523-528.

54. Cryz S.J. Protection against fatal Klebsiella pneumoniae burn wound sepsis by passive transfer of anticapsular polysaccharide.//Infect. Immun. 1984. - Vol.45. -Nl. -p.139-141.

55. Cryz S.J., Furer E., Germanier. Immunization against fatal experimental Klebsiella pneumoniae pneumoniae. Infect. Immun. 1986. Vol.54. N2. -p.403-407.

56. Cryz S.J., Furer E., Germanier. Prevention of fatal Klebsiella pneumoniae burn wound sepsis following immunization with homologous capsular polysacchride. J. Infect. Dis. 1984. Vol. 150. -N6. -p.817-822.

57. Cryz S.J., Mortimer P., Cross A.S. et al. Safety and immunogenicity of a polyvalent Klebsiella capsular polysaccharide vaccine in humans. Vaccine. 1986. Vol.4, - p. 15-20

58. Cryz S.J., Mortimer P.M., Mansfield V. Seroepidemiology of Klebsiella bacteremic isolated and implications for vaccine development. J.clin. Microbiol. 1986. Vol.23, -p.687-694.

59. Domenech-Sanchez A., Martinez-Martinez L., Hernandez-Alles S., et al. Role of Klebsiella pneumoniae OmpK 35 porin in antimicrobial resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 2003. Vol. 47. - N10. -p.3332-3335.

60. Domenico P., Diedrich D.L., Straus D.C. Extracellular polysaccharide production by Klebsiella pneumoniae and its relationship to virulence.//Can. J. Microbiol. 1985. - V. 31. - N5. - p.472-478.

61. Dominguez-Lopez M.L., Bergos-Vargas R., Galicia-Serranj H et al. IgG antibodies to enterobacteria 60 kDa heat shock proteins in the sera of HLA-B27 positive ankylosing spondylitis patients. Scand. J. Rheumatol. 2002. Vol.31. -N5. - P.260-265.

62. Dominguez-Lopez M.LCancino-Diaz M.E., Jimenez-Zamudio L. et al. Cellular immune response to Klebsiella pneumoniae antigens in patients with HLA-B27+ ankylosing spondylitis. J. Rheumatol. 2000. Vol.27. -N6. - P.453-460.

63. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal.Chem. 1956. Vol.28. - N3. - p.350-356.

64. Ebringer A., Wilson C. HLA molecules, bacteria and autoimmunity. J.Med. Micribiol. 2000. Vol.49. - N4. - P.305-311.

65. Edmondson A.S., Cooke E.M., Wilcock A.P.D., Shinebaum R. A comparison of the properties of Klebsiella strains isolated from different sources J. Med. Microbiol. 1980. Vol. 13. -p.541-550.

66. Ehrenwort L., Baer H. The pathogenicity of Klebsiella pneumoniae for mice. The relationship to the quantity and rate of production of type-specific capsular polysaccharide. J.Bacteriol. 1956. Vol.72, -p.713-717.

67. Fader R.C., Davis C.P. Effect of pliation on Klebsiella pneumoniae infection in rat bladders. Infect. Immun. 1980. Vol. 30. - p.554-561.

68. Fader R.C., Davis C.P. Klebsiella pneumoniae-induced experimental pyelitis: the effect of piliation on infectivity. J. Urol. 1982. Vol.128, p 197-201.

69. Fielder M., Pirt S.J., Tarpey I. Et al. A molecular mimicry and ankylosing spondylitis: possible role of a novel sequence in pullulanase of Klebsiella pneumoniae. FEBS Lett. 1995. Vol.369. - P. 243-248.

70. Finkelman F.D., Katona I.M., Mosman T.R., Coffman R.L. IFN-y regulates the isotype of Ig secreted during in vivo humoral immune responses. J. Immunol. 1988. Vol.140. P. 1022.

71. Firon N., Ofek I., Sharon N. Carbohydrate-binding sites of the mannose-specific fimbrial lectins of enterobacteria. Infect. Immun. 1984. Vol.43, -p. 1088-1090.

72. Fontange R., Robert D., Content Y., Nis G. Study of the immunogenicity of ribosomes and ribosomal RNA extracted from Klebsiella pneumoniae and Streptococcus pneumoniae. Arzneimittel Forchung. Drug Reseach. Ribosomal vaccines. 1980. la.p 142-172.

73. Fumagalli O., Tall B.D., Schipper C., Oelschlaeger T.A. N-glycosylated proteins are involved in effecient internalization of Klebsiella pneumoniae by cultured human epithelial cells. Infection and Immunity. 1997. - Vol.65. -Nil.- p.4445-4451.

74. Germann Т., Hess H., Szeliga J., Rude E. Characterization of the adjuvant effect of IL-12 and efficacy of IL-12 inhibitors in type II collagen-induced arthritis. Ann. NY Acad. Sci. 1966. Vol.795. - P.227.

75. Gran J.T. Pathogenesis of Bechterew disease. Tidsskr. Nor. Laegeforen. 1998. Vol.118. -N30. P.4537-4540.

76. Granholm N.A., Cavallo T. Bacterial lipopolysaccharide enhances deposition of immune complexes and exacerbate nephritis in BXSB lupus-prone mice. Clin. Exp. Immunol. 1991. Vol.85. - P.270.

77. Griffiths E. The iron-uptake systems of patogenic bacteria, p. 69-137. In J.J. Bullen and E. Griffiths (ed.). Iron and infection. John Wiley & Sons. 1987. Inc. New York, N.Y.

78. Griffiths E., Chart H., Stevenson P. High affinity iron uptake systems and bacterial virulence, p. 121-137. In J.A. Roth (ed.). Virulence mechanisms of bacterial pathogens. American Society for Microbiology. 1988. Washington, D.C.

79. Guarino A., Guandalini S., Allesio M., et al. Characteristics and mechanism of action of a heat-stable enterotoxin produced by Klebsiellapneumoniae from infants with secretory diarrhae. Pediatr. Res. 1989. -Vol. 25.-p. 514-518.

80. Hanada Т., Driscol B.F., Keis M.W, Alvord E.C. LPS augments adoptive transfer of experimental allergic encephalomyelitis in the Lewis rat. Autoimmunity. 1989. Vol.2. - P.275.

81. Hang L., Slack J.H., Amundson C., et al. Induction of murine autoimmune disease by chronic polyclonal В cell activation. J. Exp. Med. 1983.-Vol.157.-P. 874.

82. Highsmith A.K., Jarvis W.R. Klebsiella pneumoniae : selected virulence factors that contribute to pathogenicity. Infect. Control. 1985. Vol. 6. -p.75-77.

83. Hirofuji Т., Kakimoto K., Mori H. et al. Characterization of monoclonal antibody specific for human type II collagen: possible implication collagen-induced arthritis. Clin.Exp.Immunol. 1985. Vol. 62. - P. 159.

84. Holmdahl R., Klareskog L., Rubin K. et al. T-lymphocytes in collagen II-induced arthritis mice: characterization of arthritogenic collagen II-specific T-cell lines and clones. Scand J. Immunol. 1985. Vol.22. -P.295

85. Hornick D.B., Allen B.L., Horn M.A., Cleg S. Adherence to respiratory epithelia by recombinant Escherichia coli expressing Klebsiella pneumoniae type 3 fimbrial gene products. Infect. Immun. 1992. Vol. 60. — p.l 577-1588.

86. Hostacka A. Klebsiella species from the viewpoint of nosocomial infection and virulence factors. Epidemiol Mikrobiol, immunol. 2001. Vol.50. N2. P.92-96

87. Jagath L., Hosmin A., Michel R.W., et al. Influence of cephalosporins and iron on the surface protein antigens of K.pneumoniae in vivo. Antimicrobe. Agents and chemother. 1988. Vol.32. - N.3. - p.364-368.

88. Jeannin P., Magistrelli G., Goetsch L., et al. Outer membrane protein A (OmpA) a new pathogen-associated presenting cells-impact on vaccine strategies. //Vaccine. - 2002. Suppl.4. - p.A23-27.

89. Jones G.W., Isaacson R.E. Proteinaceous bacterial adhesins and their receptors. Crit. Rev. Microbiol. 1983. Vol.10. - p.229-260.

90. Kabha K., Nissimiv L., Athamna A et al. Relationships among capsular structure, phagocytosis, and mouse virulence in Klebsiella pneumoniae. Infection and Immunity. 1995. V.63. - N3. - p.847-852.

91. Kabha K., Schmegner J., Keisari Y., et. Al. SP-A enchances phagocytosis of Klebsiella by interaction with capsular polysaccharides and alveolarmacrophages. Am. J. Physiol. 1997. Vol.272, p. L344-L352.

92. Kadurugamuwa J.L., Anwar H., Michel R.W. Protein antigens of encapsulated Klebsiella pneumoniae surface exposed after groth in the presence of subinhibitory concentrations of cephalosporines. 1985. -Vol.25.-N2.-p.195-198.

93. Kato N., Fujii Y., Agata N. Et al. Experimental murine model for autommune myocarditis using Klebsiella pneumoniae 03 lipopolysaccharide as a potent immunological adjuvant. 1993. Autoimmunity. Vol 14. - p.231.

94. Kauffmann F. On the serology of the Klebsiella group. Acta Pathol. Scand. 1949. Vol.26.-p.381-406.

95. Kaufmann S.H.E. Novel vaccination strategies. 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.Weinheim. 500 p.

96. Khimji P.L., Miles A.A. Microbial iron-chelators and their action on Klebsiella infection in the skin of guinea-pigs. Br. J. Exp. Pathol. 1978. -Vol.59.-p.137-147.

97. Klipstein F.A., Engert R.F. Enterotoxigenic intestinal bacteria in tropical spru. III. Preliminary characterization of Klebsiella pneumoniae enterotoxin. J. Infect. Dis. 1975. Vol. 132. -p.200-203.

98. Klipstein F.A., Engert R.F. Purification and properties of Klebsiella pneumoniae heat-stable enterotoxin. Infect. Immun. 1976. Vol. 13. p. 373-381.

99. Klipstein F.A., Engert R.F., Houghten. Immunological properties of purified Klebsiella pneumoniae heat-stable enterotoxin. Infect. Immun. 1983.-Vol. 42. p. 838-841.

100. Koebmk R., Lecher K.P., Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell // Mol. Microbiol. 2000. -V. 37. -P. 239-253.

101. Koide N., Muramatsu T. Endo-N-acetylglucosaminnidase acting on carbohydrate moieties of glycoproteins. //J. of Biol. Chem. 1974. V.249. No. 15, pp. 4897-4904.

102. Koo F.C., Stein M.D. Detection of extracellular toxin produced by burn isolates of Klebsiella pneumoniae. Curr. Microbiol. 1986. Vol. 13. -p.23-27.

103. Laemmli UK Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. Nature. 1970. V.227. p.680-685.

104. Lanzavcchia A., Sallusto F. Regulation T cell immunity by dendritic cells. Cell. 2001; 106:263-266.

105. Libon С., Haeuw J.F., Crouzet F. et al. Streptococus pneumoniae polysaccharides conjugated to outer membrane protein A from Klebsiella pneumoniae elict protective antibodies. Vaccine. 2002. Vol.20, p.2174-2180.

106. Lowell S.,Y., Stevens P. Cross-protective immunity to gram-negative bacilli: studies with core glycolipid of Salmonella minnesota and antigens of Streptococus pneumoniae. The Journal of infectious diseases. 1977. -Vol.136.-p. 174-180.

107. Lowry O.H., Roberts N.R., Leiner K.Y., Wu M.L., Farr A.L. J. Biol. Chem. 1954.-Vol.207.-p. 1.

108. Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr, and R.J. Randall. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951. -Vol.193.-p.265-275.

109. Maayan M.C., Ofek I., Medalia O., Aronson M. Population shift in mannose-specific fimbriated phase of Klebsiella pneumoniae during expermental urinary tract infection in mice. Infect. Immun. 1985. Vol. 49.-p. 785-789.

110. Maki-Ikla O., Lehtinen K., Nissila M., Granfors K. IgM, IgA and IgG class serum antibodies against Klebsiella pneumoniae and Echerichia coli lipolopysaccharides in patients with ankylosing spondylitis. Br. J. Reumatol. 1994. Vol. 33.-Nl.-P.1025-1029.

111. Maki-Ikla O., Nissila M., Lehtinen K.et al. Antibodies to Klebsiella pneumoniae, Echerichia coli and Proteus mirabilis in the sera of patients axial and peripheral with ankylosing spondylitis. Br. J. Rheumatol. 1995. -Vol. 34.-N5.-P. 413-417.

112. Maki-Ikola O., Penttinen M., Von Essen R et al. Br. J. Reumatol. IgM, IgG and IgA class enterobacterial antibodies in serum and synovial fluid in patients with ankylosing spondylitis and reumatoid arthritis. 1997. -Vol.36.-N10.-P.1051-1053.

113. Mandine E., Salles M.F., Lalisz R. et al. Murine monoclonal antibodies to Klebsiella pneumoniae protect against lethal endotoxemia and experimental infection with capsulated Klebsiella pneumoniae. Infect. Immune. 1990. Vol.58. - N9. -p.2829-2833.

114. Martinez J.L., Cercenado E., Baquero F., Perez-Diaz J.C., Delgado-Irribaren A. Incidence of aerobactin production in gram-negative hospital isolates. FEMS Microbiol. Lett. 1987. Vol. 43. - p. 351-353.

115. Matsen J.M., Spndler J.A., Blosser R.O. Characterization of Klebsiella isolates from natural receiving waters and comparison with human isolates. Appl. Microbiol. 1974. Vol. 28. - p. 672-678.

116. Merino S., Rubrires X., Aguilar A., Tomas J.M. The role of Ol-antigen in the adhesion of uriepitheal cells of Klebsiella pneumoniae grown in urine. 1997. Microb. Pathog. Vol.23. - P.49-53.

117. Meroni P.L., Barcellini W., Sguottic C. et al. Immunomodulation activity of RU 41.470. In vitro and in vivo study. // Int. J. Imunopharmacol. -1987.-v. 9.-p. 185-190.

118. Michel F.B., Dussourd d'Hinterland, Bousquet J. et al. Immunostimulation by a ribosomal vaccine associated with a bacterial cell wall adjuvant.//Infect. Immun. 1978. - Vol.20. - p.760-769.

119. Miconnet I., Coste I., Beermann F., et al. Cancer vaccine design-a novel bacterial adjuvant for peptide-specific CTL induction J. Immunol. -2001.-V. 166.-P. 4612-4619.

120. Mielants H., Veys E.M., Cuvelier C., De Vos M. Course of gut inflammation in spondilarthropathies and therapeutic consequences. Bailliere's Clin. Rheumatol. 1996. Vol.10. -P.147-164.

121. Miles A.A., Khimji P.L. Enterobacterial helators of iron: their occurrence, detection, and relation to pathogenicity. J.Med. Microbiol. 1975.-Vol.8.-p.477-490.

122. Mizoguchi K., Nakashima I., Hasegawa J., et al. Argumentation of antibody responses of mice to inhaled protein antigens by simultaneously inhaled bacterial lipopolysacchrides. Immunobiol. 1986. Vol.143. -Nl. -p.63-71.

123. Mizuta K., Ohta M., Mori M., Hasegawa Т., Nakashima I., Kato N. Virulence for mice of Klebsiella strains belonging to the 01 group: relationship to their capsule (K) types. Infect. Immun. 1983. Vol. 40. -p.56-61.

124. Murakami M., Nakajima K., Yamazaki К et al. Effects of breeding environments on generation and activation of autoreactive B-l cells in anti-red blood cell autoantibody transgenic mice. 1997. J.Exper.Med. -Vol.185.-P.791.

125. Nassif X., Sansonetti. Correlation of the virulence of Klebsiella pneumoniae K1 and K2 with presrnce of a plasmid encoding aerobaction. Infect. Immun. 1986. Vol. 54. p. 603-608.

126. Nissila M., Lahesma R., Leirisalo M. Et al. Antibodies to Klebsiella, Echerichia coli and Proteus in ankylosing spondylitis. Effect of sulphasalazine treatment. J. Pheumatol. 1994. Vol.21. - P.2082-2087.

127. Oelschlaeger T.A., Tall B.D. Invasion of culture human epithelial cells by Klebsiella pneumoniae isolated from the urinary tract. Infect.Immun.-1997. -N65. -Р.2950-2958.

128. Ofek I., Beachey E.H. Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coll Infect. Immun. 1978. Vol. 22. - p.247-254.

129. Ofek I., Doyle R.J. Bacterial adhesion to cells and tissues. 1994. Chapman & Hall, Ltd., London, United Kingdom.

130. Ofek I., Kabha K., Athamna A., et al. Genetic exchange of determinants for capsular polysaccharide biosynthesis between Klebsiella pneumoniae strains expressing serotypes K2 and K21a. Infect. Immun. 1993. -Vol.61, -p.4208-4216.

131. Old D.C., Tavendale A., Senior B.W. A comparative study of the type-3 fimbriae of Klebsiella species. J. Med. Microbiol. 1985. Vol. 20. -p.203-214.

132. Pautsch A., Schuiz G.E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain // Nat. Struct. Biol. 1998. - V. 5. - P. 10131017.

133. Podschun & Ullmann. Klebsiella spp. As nosocomial pathogens, epidemiology, taxonomy, typing methods and pathogenicity factors. Clin. Microbiol.Rev. 1998. Vol.11. - 589-603.

134. Podschun R., Fischer A, Ullmann U. Siderophore production of Klebsiella species isolated from different sources. Zentralbl Bakteriol. 1992.-Vol. 276.-p.481-486.

135. Podschun R. Phenotypic properties of Klebsiella pneumoniaemd K.oxytoca isolated from different sources. Zentbl. Hyg. Umweltmed. 1990.-Vol. 189. -p.527-535.

136. Podschun R., Penner I., Ullman U. Interaction of Klebsiella capsule type 7 with human polymorphonuclear leucocytes. Microb. Pathog. 1992. -Vol. 13. -p.371-379.

137. Podschun R., Ullman U. Klebsiella capsule type 7 in relation to toxity, susceptibility to phagocytosis and resistance to serum. J. Med. Microbiol. 1992.-Vol.36.-p.250-254.

138. Pollack M. Significance of circulating capsular antigen in Klebsiella infection. Infect. Immun. 1976. - Vol.13. - N9. - p. 1543-1548.

139. Poolman J.T. Bacterial outer membrane protein'vaccines. In Novel Strategies in design and production of vaccines // Cohen S., Shafferman

140. A., editors. Plenum Press, New York. 1996. - P. 73-77.

141. Postal J.M., Jysin J., Grenm J. Protection against fatal Klebsiella pneumoniae sepsis in the squirrel monkey saimari sciurens after immunizaion with capsular polysaccharide vaccine. Ann. Inst. Pasteur Immunol. 1988. Vol.139. -N.4. -p.401-407.

142. Przondo-Hessek A., Pulverer G. Hemagglitinins of Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca Zentbl. Bacterid. Mikrobiol. Hyg. Ser. A. 1983. Vol.255. - p. 472-478.

143. Rani M., Gupta R.K., Chibber S., et al. Protection against Klebsiella pneumoniae induced lobar pneumonia in rats with lipopolysaccharide and related antigens. 1990. Can. J. Microbiol. - Vol.36. -N12. -p.885-890.

144. Rauly I., Goetsch L., Haeuw J.F., Tardieux C., Baussant Т., Bonnefoy J.Y. Carrier properties of a protein derived from outer membrane protein A of Klebsiella pneumoniae // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 55475551.

145. Reissbrodt R., Rabsch W. Further differntiation of Enterobacteriaceae by means of siderophore-pattern analysis. Zentbl. Backteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. A. 1988. Vol. 268. - p. 306-317.

146. Riottot M.M., Fournier J.M. Direct evidence for the involvment of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect. Immun. 1981. - Vol.34. -N1. -p.126-130.

147. Riottot M.M., Fournier J.M. Pillot J. capsular serotypic specificity of the protection conferred on mice by Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations. Infect. Immun. 1979. Vol.242. - N2. -p.476-482.

148. Robert D., Normier G., Lafont S., et al. Role of the polysaccharide and of the lipopolysaccharide in the immunoprotective capacity of Klebsiella pneumoniae ribosomes. Acta. Pathol. Microbiol. Scand. Sect. C. 1984. Vol.92, p.293-299.

149. Sahly H., Kekow J., Podschun R. Et al. Comparison of the antibody response to the 77 Klebsiella capsular types in ankylosing spondylitis and various rhematic diseases. Infect.Immun. 1994. Vol.62. - P.4838-4843

150. Sahly H., Podschn R., Ullmann U. Klebsiella infections in the immunocompromised host. Adv. Exp. Med. Biol. 2000. Vol.479. -P.237-249.

151. Schwert G.W., Takenaka Y. A spectrophotometric determination of trypsin and chymotrypsin. Biochimica et biophysica acta. 1955. V.16. -N.2. - p.570 - 575.

152. Serushago B.A., Mitsuyama M., Hanola T. Role of antibodies against outer-membrane proteins in murine resistance of infection with encapsulated Klebsiella pneumoniae. J. Gen. Microbiol. 1989. Vol. 135. - N8. - p.2259-2268.

153. Shodjai-Moradi F., Ebriger A, Abuljadayel I. IgA antibody response to Klebsiella in ankylosing spondylitis measured by immunoblotting. Ann. Rheum. Dis. 1992. Vol.1. -P233-237.

154. Simoons-Smit A.M., Verweij van Vught A.M.J.J., Kanis I.Y.R., MacLaren D.M. Chemiluminiscence of human leucocytes stimulated by clinical isolates of Klebsiella. J. Med. Micribiol. 1985. Vol.19, -p.333-338.

155. Simoons-Smit A.M., Verweij van Vught A.M.J.J., Kanis I.Y.R., MacLaren D.M. Biochemical and serological investigations on clinical isolates ofklebsiella. J. Hyg. Camb. 1985. Vol.19, -p.265-276.

156. Simoons-Smit A.M., Verweij van Vught A.M.J.J., MacLaren D.M. The role of К antigens as virulence factors in Klebsiella J. Med. Micribiol. 1986.-Vol.21.-p.133-137.

157. Simoons-Smit A.M., Verweij-van Vught A.M.J.J., MacLaren D.M. Virulence of Klebsiella strains in experimentally induced skin lesions in the mouse. J. Med Microbiol. 1984. Vol.17, -p.67-77.

158. Sinha R., Panjabi C., Varma M et al. Chronic Klebsiella pneumoniae in immunocomprtent host. J.Assoc. Physicians India. 2003. Vol.51. p306-308.

159. Slopek S. In: Enterobacteriaceae Infectionen. Ed. J. Sedlak, H.Riesche. -Leipzig. - 1968.-p.531.

160. Snapper C.M., Paul W.E. Interferon-y and В cell stimulatory factor-1 reciprocally regulate Ig isotype production. Science. 1987. Vol.236. -P.944

161. Soulas C., Baussant Т., Aubry J.P., Delneste Y., Barillat N., Caron G. et al. Outer membrane protein A (OmpA) binds to and activates humanmacrophages // J Immunol. 2000. - V. 165. - P. 2335-2340.

162. Stone M.A., Payne U., Schentag C. et al. Comparative immune responses to candidate arthriogenic bacteria do not confirm a dominant role for Klebsiella pneumonia in pathogenesis of familial ankylosing spondylitis. 2004. Vol.43. - N2. - P.148-155.

163. Straus D.C. Production of an extracellular toxic complex by various strains of Klebsiella pneumoniae.// Infect. Immun. 1987. - Vol.55. -Nl.-P. 44-48.

164. Straus D.C., Atkisson D.L., Garner C.W. Importance of a lipopolysaccharide-containing extracellular toxic complex in infections produced by Klebsiella pneumoniae. //Infection and Immunity. 1985. -Vol. 50. -N3. -p.787-795.

165. Struve C., Forestier C.,Krogfelt K.A. Application of novel multi-screening signature-tagged mutagenesis assay for identification of Klebsiella pneumoniae genes essential in colonozation and infection. Microiology. 2003. - Vol. 149. - P. 167-176

166. Struve C., Krogfelt K.A. Role of capsule in Klebsiella pneumoniae virulence: lack correlation between in vitro and in vivo studies. FEMS Microbiol. Lett. 2003. Vol.218. - N 1. - P. 149-154.

167. Stuart J.M., Cremer M.A., Townes A.S., Kang A.H. Type II collagen-induced arthritis in rats: passive transfer with serum and evidence that IgG anticollagen antibodies can cause arthritis. J.Exp.Immunol. 1982. -Vol.155.-161.

168. Takahashi K., Kato Y., Sugiyama N et al. Production of murine collagen-induced arthritis using Klebsiella pneumoniae 03 lipopolysaccharide as potent immunological adjuvant. Microbiol. Immunol. 1999. Vol.43. -N8. -P.795-801.

169. Tarkkanen A.M., Vircola R., Clegg S., Korhonen Т.К. Binding of the type 3 fimbriae of Klebsiella pneumoniae to human endothelial and urinary bladder cells. Infect. Immun. 1997. Vol. 65. - p. 1546-1549.

170. Tiwana H., Natt R.S., Benitez-Brito et al. Correlation between the immune response to collagens type I, III, IV and V and Klebsiella pneumoniae in patients with Crohn"s disease and ankylosing spondylitis. Rheumatol. 2001. Vol.40. -P.l5-23.

171. Tiwana H., Walmsley R.S., Wilson C. et al. Characterisation of thehumoral immune response to Klebsiella species in inflammatory bowel disease and ankylosing spondylitis. Br. J. Rheumatol. 1998. Vol.37. -P.525-531

172. Trntham D.E., Dynesius R.A., David J.R. Passive transfer by cells of type II collagen-induced arthritis in rats. J.Clin. Invest. 178. Vol.62. - P.359

173. Trull A.K., Ebringer R., Panayi G.S. et al. IgA antibodies to Klebsiella pneumoniae in ankylosing spondylitis. Scand. J. Rheumatol. 1983. -Vol.12. P.2249-2253.

174. Tyler J.W., Spears H., Nelson R. Antigenic gomology of endotoxin with coliform mastitis vaccine strain Escherichia coli 0111:B4 (J5). J. Diary Sci. 1992.- Vol.75. -N7. -p.1821-1825.

175. Venegas M.F., Navas E.L., Gaffney R.A., et al. Binding of type 1-pilated Escherichia coliio vaginal mucus. Infect. Immun. 1995. Vol.63. -p.416-422.

176. Viallat J.R., Constantini D., Boutin C., Farnisse P. Etude en double aveugle d'un immunomodulateur d'origine bacterienne (Biostim) dans la prevention des episodes infectieux chez le bronchitique chronique. // Poumon. Coeur. 1983. - p.39-53.

177. Visser C., Blout E.R. The use of p-nitrophenyl N-tetra-butyloxycarbonyl-L-alaninate as substrate for elastase. //Biochim. et Biophys. Acta. 1972. V.268. - N1. - p.257-260.

178. Waravdekar V.S., Saslaw L.D. J.Biol.Chem. 1945 (1959) Vol. 234.

179. Weiser J.N., & Gotschlich E.C. Outer membrane protein (OmpA) contributes to serum resistance and pathogenicity of Escherichia coli K-l. Infect. Immun. 1991. Vol.59. - P.2252-2258.

180. Williams P., Chart H., Griffiths E., Stevenson P. Expression of high affinity iron uptake systems by clinical isolates of Klebsiella. FEMS Microbiol. Lett. 1987. Vol.44. - p.407-412.

181. Williams P., Lambert P. A., Brown M.R.W., Jones R.J. The role of the О and К antigens in determining the resistance of Klebsiella aerogenes to serum killing and phagocytosis. J. Gen. Microbiol. 1983. Vol. 129. - p.2181-2191.

182. Williams P.P., Ciurana В., Camprubi S. Influence of lypopolysaccharide chemotype on the interaction between Klebsiella pneumoniae and human polymorphonuclear leukocytes. FEMS Microbiol. Lett. 1990. - Vol.69. -N.3. -p.305-309.

183. Wurker M., Beuth J., Ко H.L., Przondo-Modarska A., Pulverer G. Type of fimbriation determines adherence of Klebsiellabacteria to human epithelial cells. Zentbl. Bakteriol. 1990. Vol. 274. -p.239-245.

184. Yamagchi.H., Taguchi H., Ishiyama N., Kanamori M., Ogata S. The characterization of cross-reacting protein antigenes in gram-negative bacilli. Нихон сайкингаку дзасси. 1986. Vol 41. N.4 - p.701-707.

185. Yokochi Т., Nakashima I., Kato N. Effect of capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae on the differentiation and functional capacity of macrophages cultured in vitro.Microbiol. Immunol. 1977. Vol. 21. -p.601-610.

186. Yokochi Т., Nakashima I., Kato N. Further studies on generation of macrophages in in vitro cultures of mouse spleen cells and its inhibition by the capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae. Microbiol. Immunol. 1979. Vol.23, -p.487-499.

187. Yoshino S., Sasatomi E., Mori Y., Sagai M. Oral administration of lipopolysaccharide exacerbates collagen-indued arthritis in mice. J.Immunol. 1999. Vol. 163. - p.3417-3422.

188. Yuan G., Shi G., Ding Y. Serum antisubtypical Klebsiella pneumoniae antibodies in ankylosing spondylitis. Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 1995. -Vol 34. -N3. -P.193-195.