Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и изучение свойств иммуномодуляторов и биологических препаратов для профилактики и лечения болезней молодняка сельскохозяйственных животных

На правах рукописи

ДЕВРИШОВ ДАВУДАЙ АБДУЛСЕМЕДОВИЧ

РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНЕЙ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

16.00.03-ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология и иммунология. 03.00.23 -биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учепон степени доктора биологических паук

Москва - 2000 г.

Работа выполнена в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор, академик РАСХН Е.С. Воронин

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Л.И. Никифоров доктор биологических наук, профессор Н.Д. Скичко доктор биологических наук, профессор АЛ. Ковтун

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности.

Защита диссертации состоится 03 июля 2000 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д120.36.02. в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии'имени К.И. Скрябина по адрсеу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии

Автореферат разослан « 0~{ » июня 2000 г.

Г?№. Ч- 1/э

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Острые кишечные (ОКЗ) и респираторные заболевания молодняка (ОРЗ) по широте распространения и охвату поголовья занимают ведущее место в патологии сельскохозяйственных животных. Отход молодняка в первые месяцы жизни (падеж, санитарный брак) в зависимости от уровня ведения животноводства достигает з среднем 10-50% и более.

Практически повсеместно регистрируемая, заболеваемость молодняка свидетельствует о том, что эти заболезния не случайны и возникают как следствие постоянно присутствующих в среде обитания животных неблагоприятных факторов, закономерно вызывающих патологические изменения в организме.

Основными причинами гибели молодняка в первый месяц после рождения являются -ОКЗ. Устойчивость телят к ОКЗ зависит от уровня факторов естественной резистентности организма новорожденных животных, активности колострального иммунитета, который находится в прямой зависимости от качества молозива и его своевременным получением новорожденным молодняком.

Исследованиями Воронина Е.С. с соавт (1991) установлено, что молодняк в большинстве случаев, рождается с низкой резистентностью организма. У таких животных понижена неспецифическая защитная реактивность в новых услових обитания и на фоне высокой обсемененности внешней среды, а зачастую и молозива условно патогенными микроорганизмами (УПМ), в результате чего происходит их инфицирование и опережающее заселение кишечника, УПМ и как следствие возникают диареи, в этиопатогенезе которых активно участвуют энтеробактерии. Имеющиеся и широко используемые в настоящее время моновакцины против колибактериоза и сальмонеллеза, для иммунизации животных не всегда эффективны, поскольку в этиологии диарей в большинстве случаев участвует ассоциация 3-5 а иногда и большего количества возбудителей, преимущественно из семейства энтеробактерии.

Существенную роль в лечении и предупреждении ОКЗ играют препараты способствующие востановлению нормальной микробной среды в кишечнике, к ним относятся пробиотики (молочнокислые лакто- и бифидобактерии), которые наряду с антагонистическим действием благоприятно влияют на усвояемость корма, участвуют в биосинтезе витаминов группы В, ряда незаменимых аминокислот (Грязнева Т.Н., 1994).

Переболевание в раннем возрасте ОКЗ, содержание в помещении животных с разным иммунобиологическим фоном, воздействие различных стрессов, приводит к развитию иммунодефицитного состояния, способствующего повышенной восприимчивости молодняка к различным ауто- и экзопатогенам, и в итоге к массовым респираторным болезням. В настоящее время известно 10-15 различных

вирусных и бактериальных агентов и их ассоциации, способных вызывать респираторные болезни телят (Девришов Д.А.,1987)

Полиэтиологичность ОРЗ снижает эффективность применения специфических препаратов. Кроме того, респираторные болезни возникают с 15-20-дневного возраста и применение вакцин в этом возрасте также неэффективно, т.к. иммунная система у молодняка способна полноценно реагировать на антигены с 1,5-2 месячного возраста. В этой связи существенную роль в профилактике и лечении ОКЗ и ОРЗ играет разработка средств способствующих повышения уровня факторов естественной резистентности организма и устраняющих иммунодефициты у животных. Актуальность проблемы иммунокоррекции связана еще с тем, что, в основе многих болезней лежат вторичные иммунодефициты (Лопухин Ю.М. Петров Р.В.).

В связи с полиэтиологичностью ОКЗ и ОРЗ молодняка животных, недостаточной эффективностью применяемых в практике средств их профилактики и лечения, на первое место встает разработка новых ветеринарных иммук-.'биологических препаратов (ВИБТТ) и средств повышения резистентности организма животного.

Цель работы. Целью работы являлось изучение этиопатогенетических фа«- " острых кишечных и респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота и разработка новых ветеринарных иммунобиологических препаратов и методов их применения для профилактики и лечения телят от этих болезней.

Задачи исследований. Для достижении поставленной цели необходимо было реш;ггь следующие задачи:

• изучить этиопатогенетические факторы ОКЗ и ОРЗ у молодняка животных;

• изучить функциональную активность факторов естестественной резистентности организма молодняка;

• разработать средства иммунокоррекции и изучить их влияние на организм живогамх при различных патологических состояниях;

• разработать ассоциированную инактивированную вакцину и поливалентную сыворотку против колибактериоза, сальмонеллезы, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка животных, изучить их биологические свойства и профилактическую эффективность;

• изучить биологические свойства и протективную активность лактобактерина и бактериофагов при острых кишечных заболеваниях молодняка крупного рогатого скота.

Научная новизна. Установлено, что заболеваемость острыми кишечными и респираторные болезнями молодняка зависит от уровня факторов естестественной резистентности организма животных, концентрации УПМ в кишечнике и ее пато-генности Острые кишечные заболевания протекают на фоне иммунодефицита В-

лимфоцитов и недостаточности гуморальных факторов, а респираторные при иммунодефиците — Т-лимфоцитов.

Впервые разработаны иммуномодуляторы с высокой биологической активностью -Т-активин и В-активин и изучено их фармакологическое действие.

Впервые выявлена протективная и лечебная активность иммуномодуляторов Т-активина и В-активина при кишечных и респираторных болезнях телят.

Впервые обосновано применение иммуномодуляторов при профилактике инфекционных болезней животных, а также при производстве иммунных лечебно-профилактических сывороток в целях стимуляции антителогенеза.

Путем эпизоотологических исследований, подбора соответствующих штаммов, условий их культивирования, инактивации и сорбции антигенов впервые разработаны технология изготовления и способ применения ассоциированной инактивирован-ной вакцины и поливалентной сыворотки против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка животных, при иммунизации которой синтезируются антитоксические, антиадгизивные и антигемолитические антитела, позволяющие повысить уровень защитных свойств молозива у привитых коров, тем самым увеличить сохранность молодняка за счет пассивного колострального иммунитета.

Выделены и селекционированы производственные штаммы фагов и разработаны препараты бактериофагов против клебсиеллеза, стафилококковой, протейной и синегнойной инфекции телят.

Изучена антагонистическая активность лактобактерина в отношении энтеро-бактерий и его профилактическая эффективность при ОКЗ телят.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований нами получены 4 авторских свидетельств и патент

Разработаны и утверждены установленным порядком нормативные документы, регламентирующие промышленное производство и применения: технических условий -12; наставлений и инструкций по применению -12; технологических инструкции по производству и контролю -12.

Разработаны и утверждены Методические рекомендации по выделению и идентификации условно-патогенных энтеробактерий и сальмонелл при острых кишечных заболеваниях молодняка сельскохозяйственных животных. Москва, ВАСХНИЛ, 1990.

Рекомендации по профилактике и лечению диарей и респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных. Утверждены Департаментом ветеринарии МСХиП РФ М. 1997.

Материалы работы включены в учебные программы по курсу Биотехнология для студентов сельскохозяйственных вузов по специальности 310800.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на международных (20-и), Всесоюзных (8-и), Всероссийских (3-х), межвузовских (5-и) и др. на-

учных, научно-практических конференциях. Отдельные этапы работы были представлены на публичное обсуждение на ВДНХ СССР и по результатам награждены серебряными медалями (1989; 1990)

Всего опубликовано 102 научных работ, в том числе по теме диссертации - 60.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:

• изучения этиологических факторов кишечных и респираторных болезней молодняка животных и роли иммунного статуса в их проявлении;

• разработка и изучение свойств иммуномодуляторов Т-активина и В-активина при болезнях молодняка;

• разработка и применения ассоциированной инактивированной вакцины и сыворотки поливалентной против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят, ягнят и пушных зверей (вакцина ОКЗ);

• изучение биологических свойств11 протективной активности лактобакте-рина и специфических бактериофагов при кишечных инфекциях телят.

•Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 2 5О страницах машинописного текста. В работе имеются 58 таблицами 67 рисунками и диаграммами. Список использованной литературы включает 321 работ отечественных и зарубежных авторов. В приложении представлены копии документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

Собственные исследования Материалы и методы. '

Экспериментальные исследования проводили в период 1985-1999гг. в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им.К.И.Скрябнна, а также на базе ФГУП «Покровский завод биопрепаратов», Нижегородского НИИЭМ, НИИ микробиологии МО РФ, МИФХМ, Института иммунологии РАМН и животноводческих хозяйств различных регионов России (Московская область: совхоз «Ямской», колхозы им.Горького, «Ленинец», им.Кирова, 1-го Мая, учхоз «Леоновский», ОПХ «Воскресенский», Краснодарский край: конезавод «Лабинский»; Ставропольский край: совхоз «Банковский», колхоз «Победа», Тульская область: колхоз им.Ленина, совхозы «Гремячевский», «Большевик» и др.) и стран СНГ (Кыргызстан, Казахстан).

Материалом исследования служили молодняк крупного рогатого скота в возрасте от 1-го дня до 180 дней и стельные животные (коровы). Для оценки состояния животных использовали общие с специальные методы клинического контроля физиологических показателей. Исследование материала от больных и здоровых животных и объектов внешней среды проводили с применением современных методов выделения и идентификации условно патогенной

микрофлоры включающих бактериологические, серологические, биохимические, а также методы ускоренной идентификации - СИБ (системы индикаторные бумажные) и ПБДЭ (пластины бактериологические дифференциальные энтеробактерий) и количественный метод анализа (И.Н.Блохина, Е.С.Воронин идр, 1990; Р.В.Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вольшанская, 1989). При изучении факторов пагогеиности выделенных культур изучали продукцию экзо- и энтеротоксинов (прогревание и биопробы) и наличие адгезивной активности (с антиадгезивными сыворотками и в реакции Д-маннозорезистетности. Вирулентные свойства штаммов определяли титрованием на белых мышах массой 18-20 г. путем внутриброюшинного инфицирования их кратными дозами 12-18 часовой культурой бактериальной взвеси в объеме 0,5 мл., а также путем экспериментального воспроизведения инфекции на безмолозивных 3-х дневных телятах. Наработку экспериментальных серий вакцины производили в биологических ферментерах объемом 0,01-0,65м3. Глубинное культивирование в жидкой питательной среде проводили на казеиновом бульоне (триптическом гидролизате казеина), а также на разработанной синтетической питательной среде. Для инактнвирования штаммов использовали 40% формалин, разведенный физиологическим раствором в соотношении 1:1, с расчетом его концентрации в инактивируемом объеме взвеси бактерий не более 0,4% и этанол в соотношении 4:1 с последующим соответсвенно нейтрализацией и декантацией. Кинетику инактивации изучали в различные сроки после добавления инактиванта методом высева на питательные среды (МПА, МПБ, агар Эндо, тиоглеколевую среду). Длительность инактивации формалином составляла 15-20 дней, этанолом 2-е суток. Для адсорбции антигенов применяли гель гидроокись алюминкя.(ГОА) Полная технологии изготовления и контроля вакцины приведена в соответствующих нормативно-технических документах (НТД).

При оценке протективной активности испытуемых препаратов, а также математическом анализе других данных, использовали статистические методы обработки результатов в описании И.П Ашмарина и А.А. Воробьева (1962).

Изучение роли вирусов парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринотрахеита, (ИРТ), адено, респираторно-синцитиального (PC), и вируса диареи -болезни слизистых (ВД-БС) в патологии органов дыхания проводили серологическими методами с использованием коммерческих наборов в реакциях РИГА, РТГА, РДП, ИФА а также имуннофлуоресцентного метода (ИФ) выявление вирусных антигенов в эпителиальных клетках слизистой носоглотки (Девришов Д.А., 1985).

При оценке иммунологической реактивности у животных определяли бактерицидную активность по степени подавления роста тест-микроба (E.coli 04) испутыемой сывороткой крови, уровень лизоцима по степени литической активности сыворотки крови в отношение Micrococcus Lysodeikticus, количество иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии и функциональную

активность фагоцитов периферческой крови по Емельняненко П.А. с соавт.(1980).

Для оценки клеточных факторов иммунной системы определяли Т-лимфоциты методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) и В-лимфоцитов в реакции розеткообразования с эритроцитами нагруженными С3 -компонентом комплемента (эритроциты быка).

Выделение изолятов фагов проводили из сточных вод животноводческих хозяйств мегодом обогащения (Адаме М., 1961. Чистые линии фагов получали последовательным клонированием морфологически однотипные негативных колоний. Активность фагов определяли по литическому действию методом Аппельмана. Оценку эффективности бактериофагов проводили на новорожденных телятах.

Результаты исследований.

Этиологические факторы и иммунологические показатели у телят при острых кишечных заболеваниях.

'Л;:;! клинико-эпизоотологическом исследовании телят больных острыми кишечными и респираторными заболеваниями установлено многообразие этж'.ч лаческих факторов способствующих возникновению и осложнению патологического процесса (нарушения зоогигиенических условий содержания и кормления беременных животных, несвоевременная выпойка первой порции молозива, высокая обсеменность внешней среды условно-патогенными микреопанизмами (УПМ), иммунодефицита, стрессы и т.д.), которые приводят к болл: >:яи проявляющих с симптомокомплексом ОКЗ (синдром диареи) у новорожденных телят. Независимо от первичности того или иного фактора клигглсски ОКЗ проявляются схожими симптомами. Заболевание начинается с 1-3-х дневного возраста и проявляется профузным поносом с быстро начинающимся обезьо»>;йанием.

В начальный период ОКЗ у молодняка преимущественно связаны с алиментарно-функциональными причинами, в дальнейшем, в патогенез болезни включаются УПМ и диареи приобретают характер инфекционного заболевания, обусловленного чрезмерным размножением в кишечнике энтеротоксигенными, энтеро патогенными и адгезивными энтеробактериями. Данное заключение под ■вердается результатами проведенных диагностических исследований исследований здоровых и больных ОКЗ животных.

Бактериологическими методами от здоровых телят было выделено более 200 вид';п культур, в структуре которых превалировали нормальная кишечная микрофлора. При количественном подсчете микробных клеток в исследуемом материале установлено, что условно-патогенная микрофлора (УПМ) содержалась в концентрации 103-106, абифидо- и лактобактерии в концентрации Ю'-Ю" живых

''.W^feyUiSiîife^iitîÈn li-'ii

а'м!

микробов в одном грамма. Таким образом, у здоровых телят в кишечнике наряду с нормальной микрофлорой присутствуют и УТ1М, но в допустимых концентрациях -до 10s ,\шкр.хл./г.

Диаграмма 1 .Бактериограмма кишечника здоровыхз телят, % отношение.

При исследовании материала or больных и павших от GK3 телят было выделено и идентифицировано большое количество микроорганизмов из семейства

Enterobacierisceae (диаграмма 2). Всего было выделено более 1 ООО различных культур среди которых ведущее место по количеству изолятов и распространенности занимали

энтерспатогенные (ЕРЕС) и энтероадгезивные (ЕАЕС) E.coli; Рг. vulgaris, Рг. mirabilis К].pneumonia Staphylococcus aureus; S.ihyphimimum, S. dublin S.emeriti ai s и т.д. . Концентрация УПМ микроорганизмов была достоверно высокой по сравнению с данными полученных от здоровых животных. Так все энтеропатсгенные изоляты выделялись в концентрации 108-109, бифядо- и лактобактгряи из содержимого кишечника как от больных тая к павших животных че зыделяли

№

ад

Пьмйжям» DfdHrtJOCOtf

□eaîc Birec

OUdSMIll ■Спйвл®

Ose*

Диафамма 2. Бактериограмма кишечника телят больных QK3, (% отношение)

В Найма О yersinia HPœufenonas

□ Serratia

И Entera coccus EîCitobacter

□ Staph}! ccoccus

□ Salmonella

□ E.coli

□ Klebsiella

□ Prelaw ЯЕРЕСиЕАЕС

Из патологического материала от больнкх ОКЗ животных наибольшее количества

зшеробакгерин зыделяли из содержимого кишечника, особенно в средней части тонкого отдела кишечника (до Ю10-1012 микр.кл.мл).

Функциональная активность факторов неснецифкческой резистентности и нммунограмма у новорожденных телят.

Изучение факторов неспецифической резистентности новорожденных телят

показало, что при диареях фагоцитарная активность нейтрофилов достоверно снижается (Р<0,05), а фагоцитарная активность моноцитов остается на уровне здоровых животных.

Высокую активность у здоровых животных проявлял комплемент, его содержание почти в 15 раз был выше, чем у телят с синдромом диареи Уровень лизоцима в сыворотке крови у здоровых телят был ниже, чем у больных (Р<0,05).

Полученные результаты свидетельствовали об угнетении индукции комплемента, усилении фагоцитоза и синтеза лизоцима у больных животных, что характерно при воспалительных реакциях.

Исследованиями гематологических и иммунологических показателей также выявлены существенные изменения в морфологических и иммунологических показателях крови. Количество лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобина у больных выме, чем у здоровых, но при этом насыщенность эритроцитов гемоглобином низкая., что видимо, связано с токсикозом и процессами дегидратации организма бол.илх телят. В сыворотке крови больных телят отмечено значительное снижение общего белка.

Существенные изменения были отмечены при исследовании иммунологических параметров. Так у больных животных абсолютное и откосителькое количество лимфоцитов, Т- и В-клеток в периферической крови снижается, особенно В-лимфоцитов (Р<0,05). Такую же тенденцию отмечали при исследовании уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови. Количество ^ О, М и А было достоверно низким по сравнению с аналогичными показателями у здоровых. В тоже время эти показатели у здоровых животных находились на нижней границе физиологической нормы или были ниже.

Учитывая, что не каждое изменение параметров иммунного статуса служит осноь^нием для дачи конкретных заключений, нами была проведена оценка полученных результатов путем определения степени иммунных расстройств (СИР) у тент (: :бл.!). Если рассчитанная величина составляла 0-29%, то считали, что это соответствует первой СИР; 30-60% -второй СИР; более 60% -третьей СИР.

Таблица 1. Показатели степень иммунного расстройства организма телят (%)

Лимфограмма Иммукогбулин ы Ком плем ент Лиз оци м Функциональная активность нейтрофилов Функционал ьная активность моноцитов Кровь

Лимф оциты Тлим В- лим в М А ФА ИФ ИЗФ ФА ИФ Э Лк

14 11 60 25 30 50 93 33 44 38 28 4 30 15 30

Анализ результатов определения СИР свидетельствовал о выраженных иммунных расстройствах у больных ОКЗ животных В-системы иммунитета. СИР ^

составляло 25-50%; В -лимфоцитов 60%; лейкоцитов 30,6%; комплемента и лизоцима 93 и 33,6% соответственно; фагоцитарной активности нейтрофилов 44%.

Таким образом, при ОКЗ у телят отмечаются изменения в иммунной системе, характеризующиеся понижением уровня гуморальных факторов естественной резистентности (комплемента, ФА нейтрофилов и моноцитов) и значительной недостаточности В-лимфоцитов. Следовательно, при ОКЗ у телят наблюдается иммунодефицит В-системы.

Этнологические факторы ОРЗ и иммунологические показатели периферической крови телят.

Этиологические факторы ОРЗ сложны и многообразны, нашими исследованиями доказано, что индукторами заболевания являются неудовлетворительные условия содержания, переболевания в раннем возрасте ОКЗ и иммунодефицитные состояния.На рис.1 представлена кинетика основных симптомов ОРЗ у телят.

С целью изучения этиологии ОРЗ нами проводились диагностические исследования материала от больных телят из 25 хозяйств различных регионов России иммунофлуоресцентным (ИФ) и серологическим методами (СР).

ИФ исследованиями мазков, приготовленных из материала, полученного из глубины носовой полости у 97 % телят с признаками поражения респираторных органов выявляли специфическое свечение с характерной локализацией в эпителиальных клетках слизистой носовой полости антигенов вирусов парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, адено-, респираторно-синцитиального и диареи. Многообразие выявляемых вирусов способствовало возникновению смешанных инфекций. В абсолютном большинстве случае у животных обнаруживали одновременно ассоциации 2-4 вирусных антигенов.

I 2 34 5 й 7 Й 9 Ю Ч Е В И 15 1Ь Г7 ®

Рис. 1. Основные клинические симптомы при ОРЗ у телят.

Моноинфекции выявляли в 28,9% случаев, среди которых наиболее часто регистрировали ПГ-3. При смешанных инфекциях было установлено 13 различных

сочетаниях когда в эпителиальных клетках мазков из носовой полости выявляли одновременно несколько вирусных антигенов, среди которых ведущее место занимали ассоциация вирусов ПГ-З и ИРТ (19,3%) (рис.2); ПГ-3,

ИРТ и адено (14%), у 4,7 % больных телят выявлены ассоциации четырех вирусов. Гораздо реже у больных животных регистрировали моноинфекции, особенно вызываемые вирусами РС и ВД-ВС. Серологическими методами в сыворотках крови полученных от больных телят обнаруживали антитела к вирусам в Рис.2. Смешанная вирусвая инфекция бодее 50о/о случаев (положительным считали (ИРТ+ЯГ Специфическая флуоресценция , , . , ___ .

титрантител 1:64-1:320 и выше).

антигенов в ядрах

При бактериологических исследованиях секционного материала, мазков и выделений из носовых полостей также были выделены УПМ (стафилококки, стрептококки, клебсиеллы, эшерихии, пастереллы (преимущественно при тяжелых формах), пробей, сальмонеллы).

Таким образом, полученные нами результаты указывают на первичную роль вирусов и вторичную осложняющую роль УПМ при респираторных заболеваниях.

Иммунологическими исследованиями 70-ти животных 15-30 дневного возраста у более 80 % телят выявляли иммунодефицитное состояние. Так, относительное количество Т-лимфоцитов было низким и колебалось в пределах 11,0- 15,8% ,. Количество В-лимфоцитов находилось в пределах 8-13 %. Бактерицидная и лизоцимная активность сыворотки крови также были на низком уровне (25±5 % и 28+9 мг/мл соответственно).

Фагоцитарная активность нейтрофилов при ОРЗ понижается (Р<0,05), а активность моноцитов активируется (Р>0,05). Активность комплемента угнетается (Р<0,05), а лизоцима усиливается. В иммунограмме у телят больных ОРЗ также отмечали снижение абсолютного и относительного количества лимфоцитов и Т-лимфоцитов. Количество иммуноглобулинов у больных животных было сниженным.

Таким образом, на фоне пониженной естественной резистентности организма телят повышается восприимчивость к инфицированию вирусами ПГ-3, ИРТ, адено, РС и их различными сочетаниями, повышается вируленнтность аутофлоры органов

дыхания, что приводит к возникновению ОРЗ.

При ОРЗ у телят наблюдается выраженный вторичный иммунодефицит Т-системы иммунитета. В крови наблюдается лифоцитопения, Т-лимфоцитопения, снижение комплементарной активности сывороз ;и крови и индукции иммуноглобулинов всех классов.

Таким образом, резюмируя, в целом можно заключить что у новорожденных телят отмечается первичный иммунодефицит гуморальных факторов и В-клеток, что проводит к ОКЗ, а при ОРЗ вторичный иммунодефицит Т-системы иммунитета.

Вышеизложенные результаты показывают, что факторы гуморальной и клеточной резистентности организма животных определяют устойчивость животных к различным эндо- и экзопатогенам. В связи с этим, разработка лекарственных средств активации факторов естественной резистентности является весьма актуальной задачей.

Разработка Т-актнвина и изучение некоторых его иммунобиологических

свойств.

Известно, что у млекопитающих органом регуляции иммунного статуса являются вилочковая железа (тимус), который вырабатывает медиатор Т-клеточного иммунитета.

Т-активин - был получен из тимуса молодых животных (преимущественно крупного рогатого скота до 12 месячного возраста) путем его ацетоновой экстрации и очистки и представляет собой комплекс иммунокоррегирующих пептидов. Технология производства Т-активина разработана НИИФХМ АМН РФ (Лопухин Ю.М., Арион В.Я. и др.) и МГАВМиБ (Воронин B.C., Девришов ДА.) и внедрена на Покровском заводе биопрепаратов.

Лекарственная форма Т-активина содержит 100мкг/мл биологически активных пептидов с молекулярной массой от 1500 до 6000 далыон и выпускается в виде стерильного 0,01% раствора для инъекций.

При изучении влияния Т-активина на эритроцитарный и лейкоцитарный состав крови здоровых животных. Результаты исследований, показали, что у животных после введения Т-активина возникают изменения в лейко-эритроцитарном составе крови с тенденцией к их повышению, которые, однако, не выходят за пределы физиологической нормы. В лейкограмме периферической крови отмечали относительный и абсолютный лимфоцитоз, мазках из селезенки в первые две недели после введения Т-активина выявляли лимфопению (Р<0,05), что свидетельствуют об интенсивном эмиграции лимфоцитов из костного "мозга.

Таким образом, можно предположить, что Т-активин способствует селективной миграции клеток из костного мозга (выход лимфоцитов и задержка нейтрофилов), в периферическую кровь и способствует трансформации иммунокомпетентных клеток, а также повышает эритропоэтические характеристики

периферической крови.

При введении Т-активина (в дозе 5 мкг на мышь в течение 5 дней) мышам линьи nude, а также животным с исскуственным иммунодефицитом наблюдалась нормализация количества ЕК- и Т-киллеров.

Таким образом, Т-активин является высокоэффективньм иммуномодулирущим средством. При иммунодефицитных состояниях он нормализует количественные и функциональные показатели Т-системы иммунитета, стимулирует продукцию медиаторов клеточного иммунитета, в том числе, восстанавливает активность Т-киллеров, функциональную активность стволовых гемопоэтических клеток и нормализует ряд других показателей, характеризующих напряженность Т-клеточного иммунитета.

Разработка В-активина и «{учение его некоторых иммунобиологических

свойств.

Разработка препарата производилась на базе Института иммунологии АМН (Петров Р.В., Степаненко Р.Н., Сергеев Ю.О. и др) и МГАВМиБ (Воронин Е.С. Девришов Д. А.).

Установлено, что клетки костного мозга продуцируют ранее неизвестные низкомолекулярные вгщества обладающие- иммуностимулирущей активностью.и получивщиг название миелопептидов. При этом их стимулирующий эффект наиболее выражен при наличии иммунодефицита. Эти свойства, а также отсутствие видовой специфичности при реализации активности миелопептидов явились основанием дня создания на основе данной группы низкомолекулярных пептидов лекарственного препарата с иммунокоррегирущей активностью - В-активин.

В дстивин получают путем культивирования клеток костного мозга ребер свиней в купьтуральной среде с дальнейшей выделением из культуральной среды бис.'-; ч;!ческ:1ми методами, такими как гельхроматография и ультрафильтрация. С использованием этих подходов была разработана промышленная технология изготовления препарата В-активин внедренная на Покровском заводе биопрепаратов (ТУ-10-09-37-90).

В-активин выпускается во флаконах (ампулах), с содержанием 0,003-0,009 г миелопептидов молекулярной массой 1000-3000 дальтон.

Определение оптимальной дозы иммуномодуляторов.

Определение оптимальной фармакологической дозы препаратов Т-активин и В-активин проводили на телятах в возрасте 10-15 дней и 30-45 дней. Всего в опыте было использовано 60 телят, которые были разбиты на группы аналоги по 5 голов в ■ каждой.

Большое значение в проявления иммуномодулирующего действия Т-активина и В-активина имеют способ введения, момент начала применения, продолжительность и доза. По нашим данным эффективными способами введения ИМ являются внутримышечный и подкожный, но учитывая механизм действия, более предпочтительным является подкожный. Подкожное введение обеспечивает высокое проникновение препаратов в лимфатическое русло и не дает общих и местных реакций. Большое значение имеет кратность применения препаратов. Многократные инъекции (не менее 3-х) более эффективны, чем одноразовое введение иммуномодулято-ра, так как, являясь комплексами низкомолекулярных пептидов, обеспечивают и поддерживают достаточно высокий фон факторов естественной резистентности и стимуляцию антителообразования к широкому набору антигенов сталкивающийся макроорганизм в условиях обитания.

В первой серии опытов изучали иммунокоррегирующее действие различных доз препаратов при иммунодефицитных состояниях Т- и В-системы иммунитета, во второй серии определение терапевтической дозы при профилактике и лечении кишечных и респираторных болезней телят инфекционной этиологии. Испытание препаратов проводилось для Т-активина в диапазоне 1-5 мкг/кг массы тела, для В-активина в диапазоне 0,1-0,4 мкг/кг. Оба препарата вводили подкожно в области средней трети шеи с соблюдением правил асептики. Кратность введение обоих препарата -1 раз в день в течение 3-х дней подряд. При появлении симптомов заболевания препараты вводили дополнительно 2-3 дня в тех же дозах и кратности.

При изучении влияния различных доз ИМ на клинико-иммунологические показателя телят, характеризующих уровень естественной резистентности организма животных установлено что, ИМ активируют индукцию факторов естественной неспецифической резистентности. Применение Т-активина в дозе 2мкг/кг и выше повышал уровень Т-клеток на 5-16%, В-лимфоцитов на 4-16%, как в ранние сроки (на 3-й день), так и на 10-й день исследований. Активизировал синтез сывороточных бактерицинов (БА) и лизоцима почти в 2 раза. Под влиянием Т-активина повышается уровень иммуноглобулина О по сравнению с показателями контрольных животных (10,3±0,6-14,3±0,3) до 17,3±2,3-28,3±2,9 мг/мл.

Применение В-активина в дозах 0,2-0,Змг/кг обеспечивало стимуляцию изучаемых параметров. Количество Т-лимфоцитов повышалось на 3-6%, стабильно возрастало выработка В-лимфоцитов (на 13-19%). В-активин повышал БА сыворотку крови и содержание ^ в в большей степени, чем Т-активин.

Введение Т-активина в дозе 1 мкг/кг не оказывал положительного действия на иммунологические показатели, а доза 5мкг/кг хотя и проявляла иммунокоррегирующее действие, но на некоторые показатели оказывала ингибирующее действие, что видимо, связано с включением механизма обратной связи, когда неадекватное стимулирование вызывает в организме ответные реакции, которые препятствуют развитию этих процессов.

Наряду с изучением иммунологических показателей за животными проводился ежедневный контроль клинического состояния. У телят получавших Т-активин в дозе 2-5мкг/кг симптомов заболевания не отмечали. Оптимальная терапевтическая доза препарата В-активян находилась в пределах 3-9 мг/кг массы тела. Указанные дозы стимулировали факторы защиты организма животных.

Таким образом, установлено что, оптимальной терапевтической дозой препарата T-axTv¡Biin является 2-4мкг/кг массы тела, В-активина 0,2-0,3 мг/кг массы тела.

Также установлено, что самостоятельное применение ИМ эффективно только с профилактической целью и на ранних стадиях заболевания. Применение ИМ при развитии патологического процесса с клиническими признаками средней тяжести эффективно з сочетании с комплексом симптоматических и патогенетических средств.

Экспериментальное изучение протективной активности иммуномодуляторов В-активина и Т-активина

Г- ••льггах на белых мышах по изучению протективных свойств ИМ при экспериментальных бактериальных инфекциях, как при раздельном введении, так и сое i ..., лом применении Т-активина и В-активина был установлен профилактический эффект различной стяпени выраженности. ИМ вводили за 24 ч до зарже^мя и на 2, 3, 4 и 5-е сутки после заражения.

У мк:пен инфицированных летальной дозой (2LD50) S. typhimurium, E.coli, Р. multo:.'.1а, Р. \ulgaris и Kl. pneumoniea протективная активность Т-активина в среи.нгч составляет 70% при выживаемости в контрольной группе 10-15% (колибактериозе и сальмонеллезе) и 100%-ой гибели контрольных животных в грур>.е инфицированных пастереллами, клебсиеллами и протеями. Профилактическое действие В-активина на мышах инфицированных знте;.йг-:: ктср*!ями в среднем составил 73%. Совместное применение В-активина и Т-акткв-ч-'з. повышали выживаемость на 5-15%.

Механизмы протгхтивного действия ИМ при заражении животных бакт еркальиыми культурами изучены недостаточно. По нашим данным введение Т-ахтившкт и В-активина инфицированным животным, приводит к усилению гуморальных и клеточных факторов неспецифической защиты организма. Активная poj; в -'ничтожении бактерий принадлежит иммунным макрофагам. ИМ усиливает фап.щисаряую активность макрофагов, и подавляют размножение паразитирующих в них ы}'кроб'!Ь,х клеток повышают титры противомикробных антител.

Установлено, что наибольшее влияние на функциональную активность макрофагов оказывает В-активин. Он повышал интенсивность фагоцитоза; по фагоцитарному индексу - в 1,5-3,0 раза, по фагоцитарному числу - 2-6 раза. В то же время подвижность клеточной мембраны перитониальных макрофагов под его влиянием увеличивается в 1,5-6,5 раза, а цитопатогенное действие бактерий

снижалось в 2-7 раза. При изучении бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови было обнаружено, что введение В-активина мышам за 24 ч до заражения и в течение 3-4-х дней после заражения летальной дозой энтеробактерий и пастерелл, повышает их активность в 3-4 раза.

Также отмечено, что применение ИМ увеличивало титры агглютинирующих антител приблизительно в 2,6 раза по сравнению с данными у контрольных животных. Уровень специфических антител определяли на 16 сутки после заражения.

Представленные выше данные свидетельствуют о том, что входящие в состав Т-активина и В-активина низкомолекулярные пептиды обеспечивают выраженную протективную активность препаратов. Протективное действие при инфекциях, по-видимому, обусловлено снижением обсемененности организма, вследствие активизации факторов естественной резистентности и клеточных механизмов защиты организма (фагоцитоза, Т- и В-клеток) и стимуляции образования противомикробных антител.

Таким образом, препараты Т-активин и В-активин являются ИМ оказывающие иммунокоррегирующее действие при иммунодефицитных состояниях организма животных, стимулирует антителообразование, оказывает протектитвное действие при инфекциях и не оказывают отрицательного влияния на животных.

При исследовании протективных свойств В-активина на развитие бактериальной инфекции у поросят, вызванной заражением летальной дозой (21Л}50) Б. сЬокгаеэий и Б. 1урЫшипит показало, что, введение препарата поросятам за сутки до заражения и на 1,2 и 3 дни после заражения предохраняет животных от гибели. Выживаемость в опытной группе животных за 15 суток наблюдения составила 60% при 100% гибели в контрольной группе. Наилучший результат был, достигнут при введении В-активина за 3 дня до заражения. В этом случае выживаемость в опытной группе животных составила 100% при 60% гибели в контрольной группе.

Лучшие результаты были получены при экспериментальном воспроизведении сальмонеллеза у телят (табл.2). Заражение телят проводили смесью культур Б.с1иЫт и ЗлурЫтипит в дозе 2иэ50 (2*10"). Суточные агаровые культуры смешивали в равных количествах и вводили телятам перорально (возраст телят 25-30 дней).

Т-активин и В-активин телятам вводили подкожно: Т-активин в дозе 4мкг/кг (0,04мл/кг), В-активин телятам -0,2мг/кг. 1 раз в день в течение 3-х дней подряд. При появлении симптомов заболевания у обработанных ИМ телят, проводили дополнительный курс инъекций в лечебных дозах.

Как видно из приведенных в таблице данных, симптомы заболевания характерные для сальмонеллеза отмечали у телят всех групп, но степень из выраженности у телят обработанных иммуномодуляторами была значительно ниже, чем у контрольных животных. В контрольной группе болезнь протекала в тяжелой

форме и 2 теленка на 4 и 5 день погибли.

Бактериологическими методами из паренхиматозных органов и сердца павших телят были выделены исходные штаммы сальмонелл, что свидетельствовало о сепсисе.

Таблица 2. Протективная активность ИМ при экспериментальном сальмонеллезе у телят.

Показатели Т-активин В-активин Т-активин +В-активин Контроль (физ.р-р)

Всего телят 5 5 5 5

Заболело голов 5 5 5 5

% 100 100 100 100

Пало голов 0 0 0 3

% 0 0 0 60

Протективная активность % 100 100 100 40

Гематологическими иммунологическими методами у инфицированных сальмонеллами телят наблюдали тенденцию к увеличению количества лейкоцитов, но более знначимо этот показатель изменялся у контрольных животных (Р<0,05). В лейкограмме отмечали в начале инфицирования нейтрофилию со сдвигом ядра влево, переходящую в лимфоцитоз, более выраженный при применении Т-активина. В иммунограмме у телят обработанных В-активином отмечали достоверное повышение относительного и абсолютного количества В-лимфоцитов и 1§0, в то время, как эти изменения у телят, обработанных Т-активином были не столь существенными.

Экспериментальное изучение протективной активности ИМ при ОРЗ вирусной этиологии.

Воспроизведение вирусных инфекций в экспериментальных условиях проводилось на телятах в возрасте 1,5-2 месячного возраста.

В первом опыте инфицирование производилось вирусом ПГ-3 (штамм Белорусский с титром 4,5 ТЦЦ50/М.-0 Заражение телят проводили одновременно интраназально в дозе по 2,0 см3 в каждую ноздрю и интратрахеально в дозе 5,0 см3. Клиническими наблюдениями у инфицированных телят отмечали симптомы респираторной болезни, характерные для ПГ-3. От всех инфицированных телят ИФ выявляли парагриппозный антиген в материале из носоглотки с характерной локализацией в цитоплазме эпителиальных клеток.

Специальными методами исследований материала от инфицированных и контрольных животных было установлено, что введение Т-активина и В-активина за сутки до заражения и 3-й дня подряд после заражения приводит к увеличению

противовирусных антител в РТГА в более чем два раза превышающий титр, у животных контрольной группы, (табл.3).. В мазках от животных обработанных ИМ при люминесцентной микроскопии наблюдали гранулярное свечение в цитоплазме цилиндрических клеток, у контрольных животных в диффузное и гранулярное свечение как в цилиндрическом так и в плоском эпителии.

Таблица 3. Протективная активность ИМ при экспериментальном ПГ-3 у телят.

Группа К-во животных Синдром ОРЗ, гол/% Протективная активность, % Титр антител в РТГА

Т-активин 5 1/20 80 1:128

В-активин 5 3/60 40 1:256

Т-активин + В-активин 5 1/20 80 1:256

Контроль 5 5/100 0 1:32

К периферической крови у контрольных животных отмечали резкий лейкоцитоз на 3-7-й день, переходящий в лейкопению (рис.16). У телят обработанных Т-активином количество лейкоцитов изменялось не существенно до 7-го дня, а на 10 день исследований повышалось до 10,9±0,68 тыс. мкл. и в дальнейшем их уровень снижалось до исходных величин. Аналогичные изменения отмечали также у телят при применении В-акгивина, но с более выраженным лейкоцитозом на 10-й день наблюдений (Р<0,01). У животных, которым вводили одновременно Т-активин и В-активин повышение количества лейкоцитов, происходило в более ранние сроки инфицирования (Р<0,01).

Более значимые изменения наблюдали в лейкограмме. Абсолютное и относительное количество лимфоцитов у животных, которым вводили ИМ, достоверно возрастало особенно при совместном применении ИМ В контрольной группе в начале (на 3-й день) количество лимфоцитоз резко возрастало, в дальнейшем отмечали лимфоцитопению (Р<0.01). Изменения количество нейтрофилов у животных всех групп имело тенденцию к снижению (Р0<01). На 710-й день исследований у всех телят отмечали нейтрофилез, который сохранялся у животных в контрольной группе до конца срока наблюдений (Р<0,05). В опытных группах, где применяли В-акггивин как раздельно, так и в сочетании с Т-активином относительное и абсолютное количество нейтрофилов достоверно снижалось и сохранялось на более низком уровне, чем при применении только Т-активина.

При определении индексных показателей изменений параметров лейкоцитов было установлено достоверное повышение активности лимфоцитов, опытных животных (рис.4) при одновременном повышении лейкоинтоксикационного индекса у контрольных животных (рис.3).. Количество эритроцитов и содержание гемоглобина в крови существенно не менялось.

Рис.З.ЛИИ индекс

-о— D-актпшгн

Рис. 4. Степень влияния IIM на динамику лимфощгтон в периферической крови телят инфицированных вирусом ПГ'-З

дни исследований

Опыты по заражению вирусом ИРТ проводили на 12-ти клинически здоровых телятах 2-2,5 месячного возраста, не содержащих в сыворотке крови антитела к данному вирусу. Телята были разбиты на четыре группы сформированных по принципу аналогов. Для заражения использовали вирус ИРТ штамм Оренбург, с титром 107 ТЦД so/мл. Иммуномодуляторы вводили одновременно с зароажением и в дальнейшем в течение 3- дней подряд. За всеми животными вели клинические наблюдения и брали материал (кровь и носоглоточные смывы) для гематологических, иммунохимических, иммунологических, иммунофлуоресценгных и вирусологических исследований: до заражения и на 3, 7,10, и 18-й дни после заражения.

Первые симптомы заболевания наблюдали на 2-3 день и характеризовались обильными серозными истечениями из носовой полости, гиперемией видимых слизистых оболочек, саливацией. Отмечали лихорадку ремитирующего типа, тахикардию и брадикардию. С 4-го дня симптомы заболевания усиливались, у телят появлялись сухой, отрывистый кашель и серозный конъюнктивит.

Таким образом, результаты клинических наблюдений за животными контрольной группы и проведенные специальные исследования позволяют заключить, что в экспериментальных условиях на телятах был воспроизведен ИРТ.

Симптомы респираторной патологии у телят, которым применяли ИМ проявлялись в легкой форме, и характеризовались серозным ринитом, редким сухим кашлем, повышением температуры тела на 0,5-1,2°С. Симптомы ринита сохранялись 6-8 дней. У телят, которым вводили одновременно В-активин и Т-акггивин, респираторный синдром отмечали на 2-3-и сутки, продолжительность болезни составляла в среднем 4-6 дней.

В гематологических показателях инфицированных телят контрольной группы

отмечали некоторое снижение количества эритроцитов (с 7,37+1,13 до 5,15+1,536,29+0,75 млн/мкл.) ЦП и СГЭ после заражения возрастали, что указывало на явления токсикоза и гипоксемии. Количество лейкоцитов также снижалось с 5,46+1,03 до 4,80+1,17 тыс/мкл. (Р>0,05). В лейкограмме отмечали эозинофилопению, нейтропению (количество нейтрофилов снижалось более чем в два раз -с 0,82 ±0,62 до 0,32 +0,17 тыс/мкл. Процесс нейтропении сопровождался регенеративным сдвигом влево. Абсолютное количество лимфоцитов существенно не менялось и находилось в пределах от 4,56+0,67 до 4,73±0,0,76 тыс/мкл, а относительное их количество возрастало (Р>0,05).

Существенные изменения наблюдали в динамике показателей функциональной активности нейтрофилов инфицированных животных. Так процент фагоцитоза после заражения повышался с 60,04±3,84 до 73,6±3,33 % на 3-й день, до 85,00+5,50 % - на 7-й день и 79,64±4,01 % - на 10-е сутки, а индекс фагоцитоза в период с 3-го по 10-й день наблюдения увеличивался с 0,81+0,30 до 3,2+0,55.

В группах где примененяли ИМ процент фагоцитоза возрастал более существенно по сравнению с данными контрольных животных (с 65,4+2,64 % до 93,5+2,34 % на 3-й день и до 100 % на 7-й и 10-й день. Индекс фагоцитоза при этом увеличился на 7-10-й день до 3,45+0,38 до 6,57±0,15. При этом следует отметить более благоприятное действие Т-активина.

Переваривающая способность нейтрофилов изучалась на ранних (через 30 мин) и поздних (через 90 мин) стадиях фагоцитоза. У контрольных животных при заражении их вирусом ИРТ происходило значительное снижение переваривающей активности нейтрофилов в начале инфицирования и в дальнейшем подъем, но менее выраженный, чем при применении ИМ.

Таким образом, при ИРТ у телят наблюдается угнетение функциональной активности нейтрофилов.

При применении ИМ активность нейтрофилов повышается как на стадии поглощения так и переваривания, чужеродных антигенов.. Изменения ФА нейтрофилов при применения разных иммуномодуляторов имели общую тенденцию, но при этом следует отметить более выраженную активность Т-активина по сравнению с результатами полученных при применении В-активина.

Применение ИМ вызывало достоверное увеличение концентрации лизоцима и БА сыворотки крови. При введении В-активина наблюдали достоверное повышение содержания иммуноглобулина О на 10-18-й день, а концентрация иммуноглобулина М существенно не изменилась. Введение Т-активина вызывало повышение концентрации иммуноглобулинов класса М с 7 по 10-й день наблюдения и класса О - на 10-18-й день. Комплексное применение ИМ способствовало существенному повышение уровня иммуноглобулина в к 18-му дню (табл.4).

Таблица 4. Влияние ИМ на уровень иммуноглобулинов в и М в сыворотке

крови телят, зараженных вирусом ИРТ.

День исследований Количество иммуноглоб линов мг/мл Группы животных

Контроль В-активин Т-активин В-активин + Т-активин

До заражения 1ё м 17,60±3,4 2,96+0,30 18,33±3,45 3,0110,03 16,6010,70 2,55+0,14 19,0812,62 3,1510,30

3 день после заражения 17,12 ±2,11 3,25+0,25 17,3412,04 2,8510,27 23,2113,66 2,85+0,15 20,0613,31 3,15Ю,31

7 день после заражения ^М 24,10±1,66 3,02+0,00 19,6212,87 2,7510,17 19,0212,08 3,25+0,25 21,9211,62 3,0510,39

10 день после заражения ^М 24,82±1,45 3,42±0,22 28,50+2,81 2,82+0,10 26,0213,63 3,55+0,05 20,3212,62 2,82+0,32

18 день после заражения ^М 18,12±2,95 3,47+0,55 27,0611,06 2,9310,10 24,60+1,75 2,74+0,05 27,02+2,32 3,2110,41

При оценке влияния ИМ на клеточные факторы иммунной системы показано, что процентное содержание зрелых В-клеток у телят обработанных ИМ достоверно не изменилось на протяжении всего периода наблюдений. Однако необходимо отметить значительные индивидуальные колебания этого показателя. Популяция Т-лимфоцитов претерпела более существенные изменения в сторону их достоверного увеличения.

У контрольных животных на 3-7-й день отмечено снижение Т-лимфоцитов практически в 2 раза - с 31,37±1,24 % до 17,0510,55 % и 16,73±3,8 % соответственно.

Таким образом, вирус ИРТ оказывал депрессивное влияние на Т-лимфоциты, а применение ИМ предотвращало их снижение.

При анализе результатов клинических наблюдений, установлено, что при применении ИМ у телят симптомы вирусной инфекции проявлялись в более легкой форме . При этом у 20% животных которым применяли Т-активин, а также Т-активин совместно с В-активином отсутствовали явные признаки болезни.

У контрольных животных заболевание у 80% животных протекала в тяжелой форме.

При применении ИМ элиминация вируса происходила ускоренно и с более выраженной стимуляцией антителообразования. У животных контрольной группы выделение вируса и его индикация ИФ методом сохранялось на 18 день наблюдений. Титр антител к вирусу ИРТ к концу срока наблюдений был на более низком уровне, по сравнению с показателями у животных обработанных ИМ.

Резюмируя полученные результаты в целом можно отметить, ИМ оказывало протективное действие на телятах при экспериментальном ИРТ, т.к. инфекция у

зараженных животных протекала в легкой форме, все животные выздоравливали без дополнительных лечебных мероприятий. На клеточные и гуморальные факторы защиты организма влиял положительно. При применении Т-активина у телят повышалось концентрация иммуноглобулина й и вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови. Применение В-активина предотвращало снижение процентного содержания зрелых Т-лимфоцитов, повышало поглощающую способность нейтрофилов крови и предотвращало снижение их переваривающей активности. Продолжительность болезни при этом сокращалась на 2-4 дня. Однако элиминация вируса из организма происходило более длительное, время, чем при применении Т-активина. У телят, получавших Т-активин, в сравнении с другими подопытными группами, происходила наибольшая активизация фагоцитарного процесса на всех этапах.

Производственные испытания протективной активности ИМ при острых кишечных ремпираторных заболеваний телят.

С целью профилактики ОКЗ у телят препараты Т-активин и В-активин применяли с первого дня жизни. Производственные испытания ИМ производилось в хозяйствах Тульской и Московской областей Ставропольском крае и др. . Всех рождающихся телят по мере рождения делили на группы и обрабатывали испытуемыми препаратами, а в контрольной группе - средствами традиционно используемых в хозяйствах (антибиотики, гипериммунные сыворотки).

Результаты испытаний свидетельствовали о достаточно высоком уровне протективной активности ИМ при ОКЗ у телят. Так профилактический эффект при использовании Т-активина был на уровне -54%, В-активина -43%, а применение антибактериальных и гипериммунных сывороток (антитоксических сывороток против колибактериоза и сальмонеллеза) обеспечивала защиту от диарейных заболеваний в 9% случаев.

Профилактическое действие Т-активина и В-активина обеспечивается за счет коррекции иммунодефицитного состояния организма новорожденных телят и стимуляции факторов неспецифической защиты.

Установлено, что после введений В-активина у новорожденных телят значительно возрастало количество В-лимфоцитов в сравнении с показателями контрольных животных. Применение Т-активина также стимулировало выработку ' В-лимфоцитов. (рис.3).

Диаграмма 3. Иммунокоррегирующее действие Т-активина и В-активина на В-лифоциты.

В-активин Контроль Т-активин

На рис.4 приведены результаты исследований в в сыворотке крови у новорожденных телят на фоне промененияИМ. Как видно у телят, которым применяли ИМ, количество ^ в в крови достоверно возрастает, достигая максимальных значений на 7-й день жизни

У контрольных животных уровень ^ в находился на низком уровне и на 7-й день, отмечали резкое его снижение, что видимо, связано с недостаточностью всасывания молозивных антител в кишечнике вследствие диарей и низкой опсонирующей активностью макорофагов.

Такое заключение подтверждается исследованиями функциональ ной активности нейтрофилов периферической крови. Установлено, что Т-активин и В-активин достоверно усиливает их активность. Т-активин повышает в большей степени процент фагоцитоза, а В-активин индекс фагоцитоза.

При изучении динамики сывороточных факторов резистентности, установлено, что при применении ИМ бактерицидная активность достоверно возрастает, а активность лизоцима в начале резко повышается и этот показатель, был выше, чём у контрольных животных. У контрольных животных БА был на низком уровне, а ДА имело место к ее резкому повышению. При изучении фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов в периферической крови телят, которым применяли ИМ с профилактической целью, установлено достоверное возрастание фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов. Т-активин усиливал процент фагоцитоза в большей степени фагоцитов нейтрофильного ряда, а В-активин моно-цитарного.

Проведенные дальнейшие испытания ИМ свидетиельствовали, что наряду с протективной активностью они оказывают и терапевтическое действие, превосходящее традиционное лечение на 20%. Отход молодняка (падеж и вынужденный убой по причине ОКЗ) в группах, где применяли ИМ, в среднем составил 2%, в контрольных группах более 9-20%. Также установлено, что терапевтическое действие ИМ напрямую связано с началом их применения, а также тяжестью течения болезни. Применение ИМ только в начале возникновения заболевания. Применение их при развитии болезни было малоэффективным, но в сочетании с антибактериальными и симптоматическими средствами ускоряет процесс выздоровления и реабилитации.

Таким образом, ИМ при применении с первого дня после рождения оказывали высокое профилактическое действие при ОКЗ молодняка крупного рогатого скота, а

Рис.4. Динамика [¡С I сыворотке крови мг/мч новорожденных телят на фоне

30,0 25,0 Н 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0

применения Т-активина и В-активина..

/С—

! V \ / —О— В-аетивин /

// —Ж ■ контроль /_

1 5 7 10

дня исследований

в случае возникновения заболевания патологический процесс протекал более легкой форме и использование Т-активина и В-активина в лечебных дозах на фоне диетотерапии обеспечивало выздоровление в среднем в более 93% случаев. Применение ИМ в комплексе лечебных процедур при тяжелых формах диарейного синдрома повышает эффективность лечения ОКЗ.

Профилактика и лечение острых респираторных заболеваний молодняка животных иммуномодуляторами.

При испытании протективной активности ИМ в производственных условиях при ОРЗ также были получены положительные результаты. Первую инъекцию препаратов телятам проводили непосредственно перед переводом их из профилактория индивидуального содержания в групповые клетки, перемещением в другое помещение, а также перед транспортировкой в откормочные и репродуктивные фермы. В дальнейшем курс профилактики повторяли при каждом перемещении телят на новый этап выращивания и при их перегруппировках.

ИМ проявляли высокую протективную активность при ОРЗ (табл.5). При применении Т-активина уровень заболеваемости телят на 5,4% ниже, чем при использовании В-активииа (7,3% и 12,7% соответственно). Следует отметить также более высокие среднесуточные привесы в группах где применяли Т-активин (в среднем на 15%).

Таблица 5. Результаты профилактической эффективности иммуномодуляторов

при ОРЗ телят (обобщенные данные).

Наименование препарата Общее количество животных Заболело телят Продол-житель-ност болезни Выбыло Среднесуточный прирост массы тела Профи- лактич- ская- эфектив- ность

голов' гол % дней гол % грамм %

Т-активин 2700 196 7,3 5-7 38 1,48 780 92,7

В-активин 1100 140 12,7 4-6 40 . 3,6 675 87,3

Антибиотики (контроль) 1720 678 39,4 10-15 178 10,3 480 60,9

При выборочных иммунологических исследованиях у телят опытных и контрольных групп выявляли иммунодефицитное состояние.. При введении животным ИМ наблюдали статистически достоверное повышение показателей иммунной защиты организма. Отмечали повышение бактерицидной активности сыворотки крови в среднем до 67,4+13,7%., количество Т-лимфоцитов повышалось с 22 до 40 %, В-лимфоцитов с 8-11 до 15 -24% в среднем, усиливались показатели функциональной активности фагоцитов.

Применение ИМ с лечебной целью на ранних стадиях ОРЗ также было более эффективным, чем антибиотикотерапия (табл.6). При иммунологических исследованиях у больных телят имело место иммунодефицитное состояние по Т-клеткам. Количество Т-лимфоцитов уже через 48-72 часа после введения больным животным ИМ достоверно увеличивалось на 46-50 %, усиливало функциональную активность фагоцитов -ФА и ИФ, соответственно, с 39,25+4,3 % - 54,0±1,8 % и 7,75+0,54 -10,0±1,2 до 63,5±3,8 %- 77,25±1,09 % и 15,5±0,3 -17,5±2,4.

Табл. 6. Лечебная эффективность ИМ при острых респираторных заболеваниях телят.

Способ лечения Общее кол-во животных Выздоравливали Рецидив болезни Выбыло Эффективность %

На 6-7 день На 10-14 день

Гол. % Гол. % Гол. % Гол. %

Т-активин 280 250 89,3 18 6,4 27 9,5 12 4,3 95,7

В-активин 270 183 67,7 72 26,6 32 11,8 15 5,6 94,3

Антибиотикотерапия 509 101 9,8 365 71,7 253 49,7 43 8,4 91,5

Таким образом, иммуномодуляторы Т-активин и В-активин проявляют высокую терапевтическую активность, способствующее клиническому выздоровлению телят, при этом выздоровление наступало в более ранние сроки, чем при применении антибиотиков и симптоматических средств. Терапевтическое действие ИМ видимо проявляется за счет активации локальных и общих факторов резистентности и регуляции эндокринных и нуклеотидных систем организма животных, играющих важную роль в процессах иммунологического гомеостаза, т.к. выявлено благоприятное влияние их на уровеннь тиреоидные гормоны и циклические нуклеотиды.

Результаты испытания иммуномодуляторов при лечении и профилактике болезней телят в хозяйствах, пострадавших от радиоактивного загрязнения.

Исследования проведены в загрязненных хозяйствах с плотностью залегания радиоцезия от 15 до 40 Ки/км. Гомельской (колхоз им.ХХН Партсъезда Хойникского района) и Брянской (колхоз «Комсомолец» Новодыбковского района) областей совместно с заведующим кафедрой радиобиологии Лысенко Н.П.

Объектом исследования служили телята 1-10 дневного возраста основным заболеванием которых являлась диареи (ОКЗ), а также 1,5-2-х месячные животные, наибольшей степени страдающие респираторными заболеваниями различной этиологии.

Иммуномодуляторы применяли по вышеизложенной схеме. Контрольным животным применяли антибактериальные и симптоматические средства лечения.

Специальными методами исследований биологических жидкостей (крови и сыворотки) от животных их зоны повышенной радионуклидной загрязненности установили, что среднее содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и гемоглобина находилось у них в пределах нижних границ физиологической нормы. У отдельных животных количество тромбоцитов и эритроцитов было ниже физиологических границ. При радиоиммунологическом обследовании у них выявлен выраженный гипотериоз, обусловленный низким содержанием тиреоидных гормонов: тироксина и трайодтиронина. Иммунологическими методами выявляли имму-нодефицитное состояние гуморальных и клеточных факторов резистентности.

Результаты сравнительной эффективности иммуномодуляторов при ОКЗ и ОРЗ телят показывает, что иммуномодуляторы предохраняют от кишечных болезней 7085% животных, что на 20-35% выше, чем при использовании традиционных средств. Падеж снижался в 3-:-6 раза. Наилучшие результаты достигали при совместном применении обоих ИМ. Профилактическая эффективность ИМ при ОРЗ была ниже по сравнении с их применением в хозяйствах чистых от радионуклидов. У животных контрольной группы все животные переболевали респираторными заболеваниями и отход составил 33%, что почти в 2 раза выше, чем при профилактике ИМ.

При гематологических и иммунологических исследованиях отмечали достоверное повышение уровня показателей крови, количества Т- и В-лимфоцитов, содержание лизоцима и бактерицидной активности сыворотки крови, усиление фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови.

Результаты комплексного применения ИМ и гппериммунных сывороток при профилактике и лечении болезней молодняка животных.

Нами были проведены исследования по сравнительной эффективности ИМ и гипериммунных сывороток при ОКЗ и ОРЗ молодняка с целью совершенствования лечебно-профилактических мероприятий.

Результаты сравнительных испытаний ИМ и гипериммунных сывороток и со-четанного их применения представлены в табл.7.

Табл.7. Профилактическая эффективность поливалентных гипериммунных сы-

вороток и ИМ при острых кишечных респираторных болезнях.

Способ профилактики (наименование препарата) Количество животных, голов Заболело Выбыло (в/убой, санитарный брак)

голов % голов %

Профилактика ОКЗ

Т-активин + В-активин 360 123 34,2 11 3,0

Сыворотка ОКЗ 1200 341 28,4 30 2,5

Сыворотка ОКЗ + Т-активин и В-активин 12 00 254 21,2 21 1,7

Профилактика ОРЗ

Т-активин + В-активин 1650 376 22,8 38 2,3

Гипериммунная сыворотка (ВД+ПГ-3+РС+АД) 1710 724 42,3 54 3,2

Гипериммунная сыворотка (ВД+ПГ-3+РС+АД) + Т-активин и В-активин 720 119 16,5 4 1,0

Таким образом, совместное применение иммуномодуляторов и гипериммунной сыворотки оказывает наиболее высокий профилактический эффект

Результаты применение иммуномодуляторов при болезнях поросят.

В условиях интенсивного свиноводства заболеваемость желудочно-кишечными болезнями поросят первого месяца жизни составляет 80-85 % и, в основном, они приходятся на первые десять и 26-42 день жизни, при этом смертность достигает 2030 %.

Нами были использованы ИМ для повышения естественной резистентности организма поросят, снижения их заболеваемости и отхода от желудочно-кишечных болезней.

Т- и В-активин поросятам вводили подкожно с внутренней стороны бедра в дозах: 0,2 мл/кг и 0,4 мг/кг, соответственно. Иммуномодуляторы применяли один раз в день на I-, 3-, 5-, 10- и 33-й день жизни (всего пять инъекций).

Поросятам опытных групп наряду с применением иммуномодуляторов проводили весь комплекс профилактических мероприятий, предусмотренных технологией выращивания (применение средств против алиментарной анемии, вакцинация против колибактериоза и энтеротоксемии). Поросятам контрольных групп применяли только средства, предусмотренные технологическим циклом выращивания.

Полученные результаты свидетельствовали, что ИМ были более эффективны, чем используемые в хозяйстве средства. Заболеваемость диареями периода новорожденное™ в среднем снижалась на 30%, падеж на 15%. Количество поросят заболевающих пневмоэнтеритами в период отьема (35-40-ой день жизни поросят) также снижалось на 36%, а отход на 2%.Скорость развития поросят обработанных ИМ была выше, на 25%, чем у контрольных,

Результаты применения ИМ для стимуляции антителообразования при производстве гипериммунных сывороток.

Изучение иммуностимулирующих свойств В-активина при получении гипериммунных сывороток проводилось на примере получения сыворотки против рожи

свиней и поливалентной сыворотки против колибактериоза, сальмонеллеза, клебси-еллеза и протейной инфекции молодняка животных.

В качестве продуцентов при получении гипериммунной противорожистой сыворотки использовались здоровые свиньи крупной белой украинской породы, в возрасте не старше полутора лет, массой не менее 100 кг.

1-я группа свиней (5 голов)- контрольная, иммунизировалась согласно инструкции по изготовлению и контролю сыворотки против рожи свиней, утвержденной ГУВ Госагропрома СССР от 23 июля 1987 г. Схема включала 13 инъекций неконцентрированного живого антигена (12-часовая культура Е.ЛузюраЙшс штаммы 1689, 1329, 1933). Интервал между введением антигена составил 7 дней. Начиная с 9-й инъекции внутримышечные введения антигена сочетались с внутривенными. В 1-м мл неконцентрированного живого рожистого антигена содержалось 500 млн микробных клеток. Общая доза введенного антигена составила 1662,5 млрд.м.кл. Длительность гипериммунизации-91 дней.

2-й группе свиней (5 голов) гипериммунизация проводилась по схеме, включающей введение концентрированного живого рожистого антигена. Всего было сделано 7 инъекций. За 3-й дня до гипериммунизации всем животным опытной группы вводили иммуномодулятор В-активин в дозе 10 мг на животное. В дальнейшем В-активин применяли одновременно с антигеном в течение 6-и последующих инъекций антигена. Общая доза введенного антигена составила 1928 млрд. м.кл. (1-я и 2-я инъекций - 10 млрд.м.кл./мл; 3-, 4-, 5-я - 40 млрд.м.кл/ мл; 6-, 7 -я в концентрации 80 млрд.м.кл.мл). Длительность гипериммунизации составила -49 дней.

Установлено, что введение В-активина в дозе 10 мг на животное за три дня до гипериммунизации и в течение первых 6-и инъекций антигена приводило к наиболее активному антителообразованию. После 7-й инъекции возрастающих доз антигена у этой группы продуцентов была получена активная гипериммунная сыворотка при величине ЕД50=О,О25 см3. Коэффициент стимуляции по сравнению с 1-й группой, получавшей аналогичные дозы живого антигена, составил на 7-ю инъекцию 4 по результатам пробы роста (Р<0,5). У продуцентов 1-й группы, получавших антиген без иммуностимулятора активная гипериммунная сыворотка по результатам биопробы была получена лишь после 10 инъекций антигена. ЕД^ при этом составила 0,025 см3. Введение В-активина с рожистым антигеном животным продуцентам гипериммунной сыворотки индуцирует на 7-ю инъекцию антигена иммунный ответ, сопоставимый по силе с ответом после введения 13 инъекций такого же антигена без иммуномодулятора.

Применение В-активина в дозе 10 мг/на животное позволило уменьшить количество инъекций антигена с 13 до 7, что сократило цикл иммунизации на 42 дня. При этом отмечено, что введение концентрированного антигена в меньшей инъецируемой объеме не оказывает отрицательного воздействия на организм животных.

И так, впервые, установлено, что В-активин, при введении в начальный период продуктивной фазы иммунного ответа, стимулирует антителогенез на антиген рожи свиней, сокращает цикл иммунизации на 42 дня, что позволяет снизить себестоимость гипериммунной сыворотки и ускорить получение биологически активного препарата в более короткие сроки.

Во второй серии опытов изучали иммуностимулирующее действие В-активина при получении сыворотки поливалентной против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят и ягнят (сыворотка ОКЗ) Опыты проводились на 30 волах массой 450-500кг.

Иммунизацию проводили смесью антигенов 10 штаммов знтеробактерий (E.coli 09, E.coli От, E.coli Ош; Pr. vulgaris, Pr. mirabilis; Kl. pneumonia Kis. Kl. pneumonia Kj ; S. typhimurium, S. dublin, S. enteritidis), инактивированных этанолом и депонированных на ГОА. Антигены вводили подкожно в предлопаточную область и средней трети шеи с интервалом 5-7 дней в дозе: 1-ая инъекция 10,0мл, 2-5-я по 20,0мл. Общая концентрация готового антигена составила 15 млрд.м.кл/мл. В-активин и Т-активин вводили подкожно вместе со смесью антигенов в установленных дозах. Результаты сравнительной гипериммунизации представлены в табл. 8

. Табл. 8. Результаты испытания ИМ при гипериммунизации волов-продуцентов

сыворотки ОКЗ.

Группа Антиген Кратно сть иммун изации Концентра ция антигенов Специфическая активность сыворотки (средние значения титра антител в РА, РИГА)

Смесь антигенов:Е.соМ +Salmonella+ Proteus+ Klebsiella млрд .м.к/ мл E.coli Salmon ella Proteus Klebsie На

Контро ль Смесь энтеробак терий 5 15 685,7± 326,5 514,2± 163,2 542,8± 220,4 514,2± 244,8

Опьгт-1 Смесь энтеробак терий +В-активин 5 15 742,8+ 293,8 685,7± 163,2 914,2± 391,8 914,2+ 391,8

Опыт-2 Смесь энтеробак терий +Т-активин 5 15 914,2± 391,8 742,8± 293,8 800+ 228,5 628,5± 195,9

Как видно из представленных данных одновременное применение В-активина при гипериммунизации волов титр антител при тех же дозах антигена возрастает в среднем на 44%, при введении антигена совместно с Т-активином прирост титров антител у опытных животных по сравнению с их уровнем в контрольной группе был выше на 36,7%.

Клиническими наблюдениями за иммунизированными животными было установлено более легкая переносимость антигенной нагрузки при введении их с ИМ.

Таким образом, ИМ усиливают синтез антител на вводимые антигены, снижает их реактогенностъ.

Разработке ассоциированной инактивированпон вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных.

Применение ассоциированньгх вакцин в сравнении с многократными прививками различными монопрепаратами имеет несомненные преимущества в плане значительного сокращения времени на создание иммунитета одновременно к нескольким инфекциям и совершенствования громоздких профилактических мероприятий.

Однако разработка ассоциированных вакцин сдерживается из-за слабой изученности параметров культивирования вакцинных штаммов и компоновки вакцины, явления конкурентности и синергизма, имеющих существенное значение при иммунизации животных множеством антигенов микробного происхождения.

Разработка вакцины ОКЗ осуществлялась с учетом данных биологического мониторинга и базировалась на использовании штаммов возбудителей, имеющих наибольшую этиопатегенетическую значимость и распространенность в кишечной патологии. При подборе производственных штаммов были изучены более 1000 бактериальных культур выделенных от больных животных. С учетом патогенетически значимым признаков - адгезивных свойств, энтеротоксигенности и плазмидного профиля было отобраны 10 наиболее часто встречающих у больных животных штаммов энтеробактерий с целью их использования для производства, ассоциированной вакцины (табл.9). Табл. 9. Биологические свойства вакцинных производственных штаммов микробных культур ассоциированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза

ипротейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных.

Свойство о* о" "о о М О "о о м ос О "о и М Р.уи^апэ 135 Р.тпаЬШэ 26 К.рпеитота 12 г-«н- м-оо .2 'с о е 3 1> п а. 8.1урЫтигщт Б.11иЫт Б.еЩегШсНз

Подвижность + + + + + - - + + +

Оксидаза - - - - - - - - - -

Фенилаланин - - - - + + - - - -

Сероводород - - - - - - - + + +

Галактозидаза + + + - - + + - - -

Цитрат натрия - - - - - + + + + +

Малонат № - - - - - + + - - -

Лизин + + + - - + + + + +

Орнитин + + + - + - - + + +

Индол + + + + - - - - - -

Мочевина - - - +/- + + + - - -

Сорбит + + + - - + + + + +

Инозит - - - - - + + + - -

Фогес-Праскауэр - - - - - + + - - -

Вирулентность (1ЛЭ50)внутрибрю-шинно для белых мышей, млн.мк.ю 225 400 400 200 400 325 400 200 400 200

Адгезивные свойства С А1 П К 99 ^88 к83 СРА1 К99: САП СРА1, П СРА1, П I Тип I Тип

Серологические свойства Нб 0»: К99 038: К88 Поли. сыв. Рг.ОД 0)0: н2 К]8 К, 01,4,5.13: 1,2 09,и: о,.,* Н§,т

В опытах на белых мышах было установлено, наличии синергидного эффекта в воздействии факторов патогенности возбудителей ОКЗ на организм животных (табл.10).

Табл. 10. Характеристика вирулентности штаммов энтеробактерий.

Сочетание микробных культур в материале для заражения Пало животных через 72 часа после заражения, %

Е.соН-0138:К88 20

Е.соН-09:К99 10

Е.соН-0п,:СА1,П 20

Б.егйегШсНз 20

Б.(1иЫт 20

5.1ур1нтилит 20

К.рпеитоп1ае-К13:К59:САП 20

К.рпеитотае-К2:СРА1 ,П 20

Р.ттЬШз ОД:К88 20

Р.-щ^апэ Ош:Н2:СРА1 20

Е.соН 0138:К88+Е.соИ 09:К99 + К.рпеитотае-1,2 20

Е.соН 0138:К88+Е.соК 09:К9>, + Р.уи^аш +Р.гшгаЬШз 20

Е.соН 0138:К88+Е.соН 09:К99 + З.епгеп1!с&+ 8.с1иЬНп+ 5.1урЫтигшт 40

Р.уи1£апз+ Р.тпаЬШз+ К.рпеитошае К]8+ К.рпеитошае к2 40

Р.уи1§апз+ Р.1шгаЫНз+ 3.етегтсН5+ Б^иЬНп+ ЗЛурЫтипит 50

К.рпеитошае 2шт.+ 5.еп1егШ(11з+ Б^иЬПпн- Б^рЫтипит 50

К.рпеитошае-2шт.+ Р.уц^апз+ Р.ппгаЬШ5+ 5.етегМё1з+ 5.ёиЬ1т+ Б^рЫтипит 70

Р.уи^апз+ Р.гшгаЬШз+ Е.со1М,2+ К.рпеитотае-1,2 60

Е.со!ь1,2+ К.рпеитотае-1,2+ 5.етеписНз+ Б.с1иЫт+ З.гурЬтипит 60

Р.уи1§апз+ Р.гшгаЫНз+ Е.соН-1,2+ 3.еШ:егШ(Мз+ 8.с1иЫт+ Б.ГурЫтипит 60

Смесь всех штаммов 100

Изучение вирулентных свойств вакцинных штаммов также проводилось на те-

лятах (табл.11).

Таблица 11. Результаты экспериментального воспроизведения острого кишечного заболевания на новорожденных телятах ассоциацией энтеробактерий.

Группа Кол-во телят Наименование антигенов Заражающая доза на животное Заболело Средняя продолжительность болезни Пало

гол Млрд.м. кл гол суток гол

Опытная 5 P. vulgaris 0шН2 10 5 Все телята заболевали через 4-8 час 3-5 5

E.coli 09К99 10

S.dublin 10

K.pneuraonia е К]8К99 10

Контрольная 5 Не ин-фиц. I 4

Первые симптомы отмечали через 4-8 часов после инфицирования и характеризовались угнетением общего состояния животных, повышением температуры тела у 3-х телят из 5-и инфицированных. Через 12-24 часа после инфицирования у всех телят наблюдали диарею различной степени выраженности, гипертермию (до 40,5-41,5°), тахикардю (до 90 ударов в минуту), брадикардию. На 23-е сутки - профузный понос от водянистого до коричнево-зеленного цвета с примесью слизи и крови, температура тела снижалась ниже нормы (Зб,2°-Зб,9°С), сердечные тоны прослушивались слабо, дыхание поверхностное редкое. У всех телят отсутствовал аппетит, отмечали признаки дегидратации и интоксикации. На 3-й сутки 40% инфицированных телят пали и на 5 день пали все зараженные животные.

В контрольной группе животных, находящихся вместе с инфицированными телятами признаки заболевания наблюдали только у одного животного. Отмечали непродолжительный понос, снижение аппетита.

От всех инфицированных и контрольных животных из фекалий были выделены исходные штаммы, при этом при количественных исследованиях отмечали увеличе-

ние концентрации микроорганизмов (2,7*10М,6*1010 микр.кл.г) с усилением симптомов заболевания.

Бактериологическими исследованиями материала от инфицированных и павших животных были выделены исходные штаммы, что указывало на отсутствие конкуренции энтеробактерий использованных для заражения. Наоборот, клинические симптомы и бактериологические данные указывали на синергидное их действие на животных.

Бактериальная инфекция, индуцированная энтеробактериями не кантагиозна, т.к в наших опытах не было отмечено случаев заболевания при совместном содержании зараженных и незараженных животных.

Для проведения экспериментальных и производственных исследований по изучению протективных свойств вакцины были наработаны лабораторные и промышленные серии ассоциированной вакцины.

Полученные научные результаты обобщены и оформлены в виде регламента производства ассоциированной инактивированной вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных (вакцина ОКЗ) и ТУ.

Экспериментальные серии вакцины готовили на лабораторном оборудовании в биологическом ферментСре с У=0,01 м3, промышленные серии в реакторах У=0,65м3. Культивирование всех штаммов энтеробатерий проводится раздельно в соответствии с разработанным технологическим регламентом в следующей последовательности. Рабочие лиофилизированные культуры в ампулах ресуспендировали физиологическим раствором и пересевали на жидкую питательную среду, приготовленную на основе ферментативного гидролизата мяса, в 5 л бутыли и культивировали при температуре 36...38 °С и аэрациий стерильным воздухом из расчета 4...6 объемов на объем питательной среды в течение 20...28часов. Выход биомассы составлял 20...40 млрд. микробных клеток по ОК.

Затем полученные субкультуры, не содержащие посторонней микрофлоры, пересевали на жидкую ферментативную (гидролизат казеина с содержанием 200-220 мг% аминного азота, пептона 0,2-0,4%) или синтетическую ПС в аппараты - культиваторы У=0,65 м3 (коэффициент заполнения 0,6). Выращивание культур проводили при температуре 36..38 °С , постоянном перемешивании и аэрацией стерильным воздухом в объеме 0,2...0,3 объемов стерильного воздуха на объем ПС в минуту, при небольшом разрежении, создаваемом в полости аппарата-культиватора. Активную реакцию среды поддерживали в пределах 6,8...7,0 ед. рН. Корректировку рН среды осуществляли добавлением 25% раствора аммиака В процессе культивирования осуществляли постоянное перемешивание (500-600 об.мин), начиная с 4 часа выращивания, добавляли 50% раствор глюкозы со скоростью 8...10 мл/ л в час в течение 4...6 часов (до концентрации 0,1-0,2%). Выращивание проводили в течение 10...14 часов (до получения в реакторах концентрации культуры в пределах 50...60 млрд.

микробных клеток по ОК). Данная концентрация была определена исходя из иммунизирующей дозы вакцины и компонентного состава готового препарата, так как при ее уменьшении не удастся создать необходимые концентрации каждого отдельного компонента (всего их 10) без концентрирования, в то же время при более высоких концентрациях биомассы время инактивации возрастает в 2...4 раза.

По окончании процесса выращивания, микробные массы инактивировали в течение 15...25 суток при температуре 30...37 "С добавлением формалина (с содержанием не менее 36% формальдегида) до концентрации 0,4 % и перемешивание 2-3 раза в сутки в течение 5-10 минут. Контроль полноты инактивации проводили высевом на плотные ПС (или тиогликолевую среду).

По достижении полноты инактивации в полученной суспензии определяли содержание свободного формальдегида и при необходимости проводили его инактивацию 19% раствор метабисульфита калия до конечной концентрации не более 0,1%.

Также был отработан режим инактивации этанолом в соотношении микробная взвесь - этанол 1:4 при перемешивании. Полная инактивация достигается через 48 часов. После отстоя (декантации) в реакторе образуется плотный осадок инактивиро-ванной бактериальной массы. Надосадочную жидкость, состоящую из этанола и питательной среды, удаляют с помощью сифона, а к осадку добавляют изотонический раствор хлорида натрия до исходного объема микробной взвеси

После проверки полноты инактивации проводили смешение компонентов до конечной концентрации в смеси 30* 109 микробных тел в мл. по ОК. К приготовленной бактериальной массе добавляли равный объем 60-70% взвеси гидрата окиси алюминия в физиологическом растворе. Проводили контроль до розлива и после фасовки по ТУ.

При технологии изготовления вакцины ОКЗ впервые разработаны и внедрены в производство синтетические питательные среды для глубинного культивирования энтеробактерий, позволившие повысить урожайность биомассы при культивировании и иммуногенность готовой вакцины, а также снизить в препарате содержание балластных белков.

Готовый вакцинный препарат представляет собой гомогенную суспензию желтоватого цвета с рыхлым осадком. Соотношения компонентов по оптической концентрации и объемных % приведены в табл.12.

Табл.12. Компоненты вакцины ОКЗ

Наименование штаммов Концентрация млрд.микр.кл. в 1 мл Объемные %

Е.соП 09 К99 1,8-2,2 5,0-6,0

Е.соИ 0|38:К88 1,8-2,2 5,0-6,0

Е.соН 200 (0И9) 1,8-2,2 5,0-6,0

Р.уи^апБ 198 1,8-2,2 5,0-6,0

Pr.mirabilis 199 1,8-2,2 5,0-6,0

Kl.pneumoniae 201 1,8-2,2 5,0-6,0

K.pneumoniae 202 1,8-2,2 5,0-6,0

Salmonella typhimurium 195 0,9-1,1 2,0-3,0

Salmonella enteritidis 197 0,9-1,1 2,0-3,0

Salmonella dublin 196 0,9-1,1 2,0-3,0

Гидроокись алюминия 32,0-35,0

Фенол 0,2-0,25

Хлорид натрия, изотонический рас- осталь-

твор ное

Оценку иммуногенных свойств экспериментальных серий вакцины ОКЗ с различными соотношениями компонентов проводили в опытах на белых мышах (массой 16-18г) и кроликах (массой 2-2,5 кг). Вакцину в указанных в табл. 13 концентрациях вводили кроликам однократно подкожно в дозе I мл, мышам в дозе 0,5мл - внутри-брюшинно. Первой группе вводили минимальное количество вакцины, второй группе - среднее, третьей - максимальное, четвертой - меньше минимального и пятой -больше максимального значений.

Результаты определения безвредности и специфической активности на белых мышах и кроликах представлены в табл. 13-14.

Табл. 13. Экспериментальные серии вакцины с различной концентрацией анти-

генов в объемных процентах / концентрация по оптической плотности мл..

Крмпоненты вакцины <min min средн max >max

Энтеробактерии 33,4 /11 41/13,5 46/15,3 51/17 54,8 / 18,6

гидроокись алюминия 30,0 32,0 33,5 35,0 37,0

Фенол 0,1 0,2 0,22 0,25 0,3

NaCl 0,85%раствор Остальное (до 100%)

Примечание: Микробные взвеси сальмонелл взяты в концентрации 0,9±0,1 млрд.микр. кл. в1 мл, а остальных микробов в концентрации 1,8±0,2 млрд.микр.кл/мл.

Было установлено отсутствие антагонистического действий компонентов вакцины, что обосновывает возможность их ассоциации, (табл.13). При этом уровни специфических антител при средней и максимальной концентрации существенно не отличались, а дальнейшее увеличение концентрации не приводило к увеличению уровней специфических антител. Использование для иммунизации вакцины в дозах меньше минимальных оказалось неэффективным, так как не вызывало выработку антител в титрах, обеспечивающих защиту против бактериальных инфекций.

Таблица 14. Результаты определения безвредности вакцина ОКЗ на белых мышах и

кроликах.

Вид жи- Доза вакци- Кол-во Дни наблюдения (гибель животных -

вотного ны животных гол)

голов 1 2 3 4 5 6 7

Min 5 0 0 0 0 0 0 0

Белые Средняя 5 0 0 0 0 0 0 0

мыши Мах 5 1 0 0 0 0 0 0

Кролики 2,0мл (34 млрд.мк.кл.) 3 0 0 0 0 0 0 0

Из данных табл.14, видно, что ассоциированная вакцина в испытуемых дозах безвредна для лабораторных животных.

При изучении специфической активности различных доз вакцины установлено, что средняя доза обеспечивает выработку оптимального уровня антител, существенно не отличающий от уровня вырабатываемого при шах дозе и значимо выше ,чем при min дозе препарата( табл. 15). Кроме того, безвредность вакцины определялась на группе клинически здоровых коров (5 животных). После клинического осмотра коровам вводили ассоциированную вакцину в концентрации микробных клеток 17 млрд.м.кл.мл (средняя концентрация микробных тел) подкожно в область средней трети шеи в объеме 7 мл (всего 120+1 млрд. микробных клеток). Учет реакции на введение вакцины проводили через 8-10 и 24 ч путем внешнего клинического осмотра и термометрии. Как местные, так и общие реакции на введение вакцины практически отсутствовали. Лишь у двух животных наблюдалось незначительное слюноотделение и припухлость на месте введения проходящие на 3 сутки.

Таблица 15 Уровень специфических антител в сыворотке крови иммунизиро-

ванных животных /кролики/

Вид антигена Обратные титры антител

min средняя max

фон 21 сутки фон 21 сутки фон 21 сутки

Е. coli 09 К99 0 400 10 500 10 600

E.coli 0,38 К88 20 200 20 800 20 800

E.coli 200 (0|19) 20 200 10 600 0 700

Pr. vulgaris 10 400 20 800 0 800

Pr. mirabilis 10 400 0 880 20 1000

Kl.pneumoniae 201 0 400 20 600 10 800

Kl.pneumoniae 20 200 10 800 0 700

202

S.dublin 10 200 10 400 20 600

S.typhimurium 20 200 0 400 40 700

S. enteritidis 0 100 10 400 10 400

Таким образом, вакцина предложенного состава полностью безвредна для животных.

Иммунизацию коров проводили по следующей схеме:

Трем группам клинически здоровых коров (по 5 голов в группе, всего 15 животных) вводили ассоциированную вакцину в концентрации 15 млрд..м.кл.мл подкожно двукратно с интервалом 14 дней в область средней трети шеи, в объеме 7 мл.

Второй и третьей группам вводили в качестве контроля в соответствии с утвержденными наставлениями по применению, коммерческие вакцины формолтиомерса-новая против колибактериоза и концентрированная формолквасцовая вакцина против сальмонеллбэа телят. Иммунологическая активность вакцин по уровню антите-лообразования к входящим в вакцины антигенам приведена в табл. 16.

Таблица 16. Результаты исследований антителообразования.

Вид антигена Уровень специфических антител (обратные титры)

Вакцина ОКЗ Коммерческие вакцины

Против колибактериоза Против сальмонеллеза

фон Через 21 дн. фон Через 21 дн. фон Через 21 дн.

E.coli 26,6+7,5 400,0±175 23,3+7,5 366,6±0,05 34,4+19,5 40,3+19,5

Salmonella 13,3+3,7 633,3±175,0 19,1+7,5 24,1 ±7,5 40,3±19,5 431,5±189,5

Klebsiella 35,0±17,5 600,0+150,0 19,7+7,5 45,8+19,5 20,5±7,5 40,3±19,5

Proteus 60,0±20.0 933,3±300,0 40.0±16.2 50,0±17,5 74,5±19,5 40,0+17.5

Анализ полученных данных показывает, что в крови коров, иммунизированных вакциной ОКЗ, отмечалось не только более высокий уровень специфических антител к эшерихиям и сальмонеллам, чем после иммунизации моновакцинами того же назначения, но дополнительно присутствовали в достаточно высоких титрах антитела к клебсиеллезному и протейному антигенам. Более высокая профилактическая активность предложенной вакцины по сравнению с известными вакцинами того же назначения была подтверждена испытаниями, проведенными в условиях животноводческих хозяйств.

Производственные испытания вакцины ОКЗ

Исследования проводились на стельных коров в сервис период и новорожденных телятах родившихся от иммунизированных коров, а также телятах в возрасте 2560 дней..

В связи с установленным нами благоприятным действием Т-активина на иммунологические показатели организма животных и усилением индукции антител были также проведены исследования по совместному применению Т-активина и вакцины ОКЗ с целью стимуляции антителообразования, при этом вакцину вводили однократно (табл. 17).

Табл. 17.Титры специфических антител в сыворотке крови иммунизированных ко-

ров(^2).

Группа им-муниз. животных Антигены Сроки исследований после иммунизации

фон через 14 дн через 28дн

Вакцина ОКЗ E.coli Proteus Klebsiella Salmonella 2,70+0,56 3,5+0,64 2,4+0,34 3,5+0,31 5,90±0,78 7,40±0,45 6,70±0,78 8,00+0,29 6,70±0,37 7,66+0,28 7,44+0,34 8,11+0,31

Вакцина ОКЗ + Т-активин E.coli Proteus Klebsiella Salmonella 2,66+0,21 2,55+0,24 1,44±0,29 3,33+0,23 6,22+0,32 7,77+0,27 8,00±0,29 8,44±0,18 5,88+0,11 6,77±0,15 6,44±0,24 7,11+0,26

Контроль E.coli Salmonella 3,50 + 0,29 3,40±0,40 5,1 ±0,23 5,87+0,44 5,71+0,29 6,14+0,26

Таким образом, иммунизация глубокостельных коров вакциной ОКЗ способствует выработке достаточно высокого уровня защитных антител. Ревакцинация вакциной ОКЗ приводит в развитию вторичного антительного ответа. Применение вакцины одновременно с иммуномодулятором приводит к достоверному возрастанию титра антител в более ранние сроки и соответственно снижаются затраты на проведение профилактических мероприятий.

Содержание иммуноглобулина в в сыворотке крови у иммунизированных ко-ровдостоверно повышается у животных 1-й и 2-групп. Максимальную концентрацию иммуноглобулинов Э и М во всех группах отмечали в первый день лактации: в первой опытной группе ^ О 44,2±8,9 мг/мл, ^ М 14,7±0,8 мг/мл; во второй опытной группе Jg в 57,9±5,6 мг/мл, М 12,0+0,9 мг/мл; в контрольной группе - % О 32,6±6,3 мг/мл, ^ М 11,1+1,6 мг/мл соответственно. При этом наивысший уровень иммуноглобулина в отмечали в группе животных, иммунизированных вакциной ОКЗ в сочетании с Т-активином. В последующие дни наблюдали достоверное снижение количества иммуноглобулинов обоих классов по отношению к первому дню лактации

При исследовании уровня антител в молозиве первых дней лактации от животных опытных и контрольных групп (табл. 18) были получены данные, превосходящие результаты, полученные при исследовании у тех же животных в сыворотке крови. Наивысший титр антител отмечали в молозиве первого дня лактации , причем досто-

верной разницы между опытными группами не установлено. На второй- третий день наблюдали достоверное снижение уровня антител по отношению к первому дню лактации. Однако у животных, привитых вакциной ОКЗ сохранялся относительно высокий уровень антител ко всем антигенам.

Табл. 18. Динамика титров антител в сыворотке молозива иммунизированных коров

Группы животных Антигены Титр антител (log2)/ Дни исследований после отела Д1 Sd по отношению к фону

1 день 2 день 3 день на 10 день на 20 день

Вакцина ОКЗ E.coli Proteus Klebsiella Salmonella 9,17+0,31 9,50±0,56 9,3310,33 9,3310,61 6,8610,70 7,71+0,64 7,5710,61 7,1410,55 4,0011,07 5,4310,43 6,2810,47 5,7110,36 2,3110,89 1,7910,84 1,3610,82 2,1910,76 5,17+1,26 4,0710,66 3,05 +0,69 3,6210,62

Вакцина ОКЗ+ Т-активин E.coli Proteus Klebsiella Salmonella 8,33+0,49 9,00Ю,26 8,6610,21 8,6610,33 6,14+0,59 7,28+0,52 7,28+0,47 7,0010,65 5,40+0,51 5,8010,58 5,8010,58 5,8010,58 2,19Ю,74 1,72+0,74 1,38+0,69 1,6610,85 2,9310,73 3,20+0,77 2,86Ю,77 2,86+0,77

Контроль E.coli Salmonella 8,20+0,49 8,00+0,45 5,0010,77 4,8010,66 2,6011,17 4,00+0,55 3,2010,99 3,20+0,91 5,60+1,33 4,ООЮ,84

Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что наиболее высокий уровень антител был в молозиве коров, вакцинированных вакциной ОКЗ.

Для оценки уровня колострального иммунитета у новорожденных телят, полученных, от иммунизированных коров-матерей проводили определение титра специфических антител к антигенам ко всем антигенам входящих в состав вакцины и содержания иммуноглобулинов класса в и М. Полученные результаты представлены на рис.5-6.

При изучении динамики иммуноглобулинов в в сыворотке крови телят отмечали высокий уровень ^ в с 1-х по 20-е сутки с незначительной тенденцией к снижению, наиболее высокое содержание отмечали в конце первых суток. Однако следует отметить, более высокий уровень ,1§ в у телят, полученных от коров, иммунизированных вакциной ОКЗ с Т-активином в последующие сроки наблюдения.

Результаты клинических наблюдений свидетельствовали о более низком уровне (10-15%) заболеваемости телят родившихся от коров вакцинированных вакциной ОКЗ и при ее сочетании с Т-активином по сравнению с заболеваемостью телят полученных от корова иммунизированных моновакцинами, у которых заболеваемость достигала 70-90%.(табл. 19)

Табл. 19. Заболеваемость и сохранность новорожденных телят на фоне колост-

рального иммунитета.

Группа телят полученных от иммунизированных животных Количество телят Заболело Пало Сохранность

Гол. Гол. % Гол. % %

Вакцина ОКЗ 88 15 17,04 1 1,13 98,87

Вакцина ОКЗ +Т-активин 277 45 16,24 3 1,08 98,02

Контроль (моновакцины) 62 51 82,25 8 12,9 87,1

Рис.5 Динамика тигра антител в ыворотке крови новорожденных телят, полученных от коров иммунизированных вакциной ОКЗ.

и ^

4 I

Kleb siella

»■—Salm onell

s

Рис.б. Динамика титра ашител в сыворотке крови новорожденных телят полученных от коров иммунизированных вакциной ОКЗ а сочетании с Т-акгивином.

2 3 4 дни исследований

1

5

Таким образом, вакцина ОКЗ обладала высокими антигенными свойствами и при своевременной выпойке молозивом от иммунизированных коров народившего приплода предохраняет от заболевания и обеспечивает их высокую сохранность.

Наряду с изучением защитных свойств вакцин на фоне колострального иммунитета, нами проводились испытания по изучению профилактической активности вакцины на телятах 20-и 60-и дневного возраста. Телят вакцинировали в возрасте 1820 дней вакциной ОКЗ и моновакцинами результаты исследований приведены в таблице 20.

Табл. 20. Результаты сравнительных производственных испытаний вакцины ОКЗ на телятах в возрасте 20-60 дней.

Группы животных Количество телят Заболело Выбыло Сохранность

Гол. Гол. % Гол. % %

Вакцина ОКЗ 3156 387 12,26 21 0,6 99,4

Вакцина ОКЗ +Т-активин 3465 320 9,23 0 0 100

Контроль(моновакцины) 195 102 52,3 25 12,8 87,2

Сравнительная оценка полученных данных указывает на высокую протектив-ную активность вакцинь: ОКЗ как при отдельном, так и совместно применении с Т-активином. Сохранность животных после иммунизированных вакциной ОКЗ была в пределах 100% против 87,2% в контрольной группе.

Разработка и испытание поливалентной сыворотки против колибастерио-за, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят.

Поливалентную сыворотку получали от волов-продуцентов с живой массой 450-500 кг путем их гипериммунизации смесью инактивированных антигенов E.coli 09К99, E.coli 0133К88, E.coli 0U9; Pr. vulgaris, Pr. mirabilis; Kl. pneumonia №201 и 202; S..ty.>ir!iiurium, S. dublin, S. Enteritidis с общей концентрацией 15 млрд.м.кл.мл. Для гипериммуштации были апробированы две схемы (табл.21).

Табл.21. Схема гипериммунизации волов-продуцентов поливалентной сыворотки.

День им- Схема 1 Схема-2

ПН мунизции Способ введения Доза антигена,см3 Способ введения Доза антигена, см3

1 1 1 ГХ'к в область шеи 10 П/к в область шеи 10

7 П/к в область шеи 20 П/к в область шеи 20

з 14 П/к в область коленной складки 20 Л/у. подколенный 40 (по 20 в левый и правый)

4 21 П/к в область коленной складки 20 Л/у. предлопаточ-ные 60(ло 30 в левый и правый)

к 28 П/к в область коленной складки 20 Л/у. подколенные и пред лопаточные 100 (по 25 в левые и правые)

Реактогенность. На 1-е и 2-е введение антигенов по 1-схеме у животных отмечали повышение температуры тела на 0,5-1,5°С, мышечную дрожь, на месте введение отечность (5-7см в диаметре). Указанные симптомы проходили через 24..30 часов. На 3-5-ое введения реакция животных была выражена слабее. Введение животным антягенов по 2-й схеме вызывала аналогичные симптомы. Лимфатические узлы после введения антигенов были увеличены и болезненны.

Пробное взятие крови проводили с 3-го введения антигена для изучения уровня антител. При достижении титров антител в РА и РИГА ко всем антигенам на 1:400 и выше через 7-10 дней проводили производственный забор крови из расчета 13-15 см3/кг массы животного. После 20-30 дневного цикла реабилитации проводили 2-е инъекции антигенов в дозах и интервале аналогичном 4-у и 5-у введению (табл.21).

Результатами серологических исследований опытных серий сыворотки полученной по 1 и 2 схемам установлено достоверно высокие значения при 2-й схеме. Средние титры при 1-й схеме были на уровне 1:400-1:800, по 2-й -1:800-1:3200. В связи с более высокой реактогенкостью 2-й схемы, в производственных целях использовалась 1-я схема совместно с иммуномодуляторами..

Впервые контроль готовой сыворотки проводился по уровню специфических антител против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции.

В табл. 22. приведены результаты применения поливалентной сыворотки в целях профилактики ОКЗ у новорожденных телят. Контрольную группу телят обрабатывали антитоксической сывороткой против колибактериоза.

Табл. 22,Профилактическая эффективность поливалентной сыворотки при диареях телят (суммарные данные).

Группа телят Количество животных Заболеваемость диареей Гибель телят (в возрасте до 20 ДН.) Протективная активность

голов гол % гол % %

Опытная 4500 865 19,2 67 1,5 80,8

Контрольная 980 870 88,7 167 17,0 11,3

Таким образом, разработанная технология производства и контроля гипериммунной поливалентной сыворотки против ОКЗ позволила получить высоко иммунный препарат для пассивной иммунизации молодняка, предохраняющая от кишечных заболеваний вызванных возбудителями колибактериоза, сальмонеплеза, клебсиеллеза и протейной инфекцией и их ассоциациями.

Изучение биологических свойств и протективной активности лактобакте-рина при ОКЗ новорожденных телят.

При электронномикроскипическом исследовании антагонистической активности лактобактерий на энтеробактерии (рис.7-10), установлено, что при совместном культивировании на миллипоровых фильтрах лактобактерий и возбудителей кишечных инфекций происходило резкое угнетение роста протея, клебсиелл и энтеропато-генных эшерихий и потеря ими адгезивных свойств, что было подтверждено в реак-

ции Д-маннозорезистентной гемагтлютинации. До воздействия лактобактерий на поверхности колоний протея, эшерихлй и клебсиелл под электронным микроскопом наблюдали массивные покровы под которыми клетки не дифференцировались. У непатогенных эшерихий таких покровов не обнаруживали, клетки хорошо дифференцировались, их популяция была однородна. В присутствии лактобактерий у патогенных энтеробаетерий происходило сбрасывание покровов с бактерий, потеря адгезив-ности и изменения в структуре клеток, характеризующих Л-трансформацию. У изученных бактерий наблюдали деформацию клеток за счет нарушения структуры клеточной стенки, образование сферопластов, почкующихся элементарных телец, превращение бактерий в мелкие, извилистые палочковидные клетки-ревертины. Кислая реакция среды (результат жизнедеятельности лактобактерий) вызывала изменения в структуре клеточных стенок, подавляла синтез полисахаридов (покров), нарушала ее целостность. Таким образом, этими исследованиями показана достаточная эффективность подавления условно-патогенной микрофлоры, что послужило основанием разработки профилактического и терапевтического препарата из биологически активных штаммов лактобактерий.

Рис.7. Антагонистическая активность лактобактерий в Рис.8.Адгезия Е.соН на слизистой киш-отноллешш клебсиелл, протей и ЕРЕС.

Рис.9..Протей на границе роста с лактобактериями Рис. 10.ЕРЕС на границе роста с лактобакте Покровы отсутствуют. риями Лизис клеток, отсутствие покровов

В трбл.2? ппедртзвпечы резу^т№>1 профрэр^иескргО Действия лакТоёак!1е-рина при диареях телят

Группа Количество Заболеваемость диареей Эффектив-

телят животных ность,

на 2-3 день на 6-8 на 10-15 %

голов гол. % гол о гол %

Лактобактерин 616 89 14,4 26 4,2 5 0,8 80,6

Контрольная 166 162 97,6 82 49,4 12 7,2 -54,2

На основании разработанной технологии производства и контроля на Покровской заводе биопрепаратов было налажено серийное производство препарата лакто-бактерин сухой и лактобактерин в таблетированной форме.

Проведенные испытания в экспериментальных и производственных условиях показали высокую приживляемость в кишечнике лактобактерий и их антагонистическую активность в отношении УПМ кишечника, благоприятное влияние продуктов жизнедеятельности лактобактерий на процессы пищеварения и усвояемости корма. Результаты испытания протективной активности лактобактерина при ОКЗ новорож-деннывх телят приведены в табл.21. Опытным животным с момента рождения вместе с молозивом давали одну дозу лактобактерина (содержит 10 млрд.микр.кл) в каждое очередное кормление в течение 3- дней.

Таким образом, профилактическая эффективность при диареях с использованием одного лактобактерина составляла 80,6%. Рецидивы заболевания отмечали в 18,6% случаев. В целом болезнь протекала в легкой форме. При бактериологическом исследовании кишечного содержимого опытных телят к 10 дню жизни количество бифидо- и лактобактерий достигало Ю8-1010, клебсиеллы и цитробактер отсутствовали, протей составлял 103, эшерихий - Ю8-Ю10. Сальмонеллы и энтеропатогенную кишечную флору не выделяли.

Полученные результаты свидетельствуют о высоком профилактическом действии лактобактерина при диареях телят.

Разработка и практические применение бактериофагов.

В связи с высокой резистентностью энтеробактерий, стафилококков (Staphylococcus aureus), псевдомонад (Pseudomonas aeruginosa), выделяемых от больных диареями молодняка к широкому спектру антибиотиков, использование в лечебно-профилактических целях, является перспективным за счет высокой специфичности и безвредности. Литически активные бактериофага к УПМ, имеющих этиопатогенети-ческое значение при диареях молодняка и маститах коров были выделены из сточных вод животноводческих ферм. Всего было подобрано 29 рас бактериофагов к 20 штаммам наиболее часто выделяемых микробных культур. Литическую активность фагов повышали путем клонирования негативных колоний и обогащающих подсевов

чистых бактериальных культур в логарифмической фазе роста. Для производства лечебных фагов были использованы расы с активностью по Аппельману в Ю'МО"8. При изучении логической активности к различным сероварам эшерихий (изучено 8 сероваров), протеев (9 сероваров) клебсиелл (12) и синегнойной палочки (4), стафилококков (6) было выявлено литическое действия фагов в отношении гетсрологиче-ских сероваров в 20-46% случаева. Адсорбционные свойства фагов на клетках штаммов-хозяев находилось на уровне 56-88%.

Для изготовления экспериментальных серий бактериофагов были выбраны 10 фагов по одному на каждый штамм-хозяин наиболее соответсвующий по скорости репродукции на клетках бактерий, коротким латентным периодом, высокой урожайностью и литической активностью, в том числе, в отношении гетерологических сероваров возбудителей кишечных инфекций. Культивирование бактериофагов проводили раздельно в течение 4-х часов. Полученные фаголизаты прогревали в течение ЗОмин при (=56°С, консервировали хинозолом в конечной концентрации 0,01%.

Лечебная доза определялась по терапевтическому эффекту при испытании на больных кишечными инфекциями телятах, а также при применении в целях профилактики . Диапазон испытуемых доз от 20мл до 100 мл на голову. Эффективная лечебная доза находилась в пределах 50-100мл,1 раз в день. За 10-15 мин до дачи фага теля . и.лаисали 50мл 3% -го бикарбоната натрия для оптимизации рН желудка.

В результате проведенных испытаний бактериофагов при кишечных заболеваниях лечебная эффективность монофагов составила: эшерихиозного -51,1%; протейного -54%: клебсиеллезного -43,5%; стафилококкового -28,6%; псевдомонозного 18%.

Полученные результаты свидетельствуют о полиэтиологичносги кишечных заболеваний у молодняка, что было подтверждено бактериологическими исследованиями больных животных в динамике проведения лечения. Так, уровень обсеменен-ности культурами гомологичным применяемым фагам достоверно снижался, при несущественных изменениях другой микрофлоры. В целях повышения эффективности терапевтических мероприятий нами был подобран состав полифага в следующем соотношении: эшерихиозный -ЮОмл+протейный ЮОмл+стафилококковый 50мл. ьклебсиеллезный 1 ООмл+псевдомонозный 50мл. Лечебная эффективность полифага составила -98,2%. Полифаг готовили непосредственно перед выпаиванием путем смешивания монофагов, выпаивали один раз в день до клинического выздоровления..

Таким образом, монофаги при кишечных инфекциях в условиях ферм недостаточно эффективны в связи с участием множества возбудителей в их возникновении. Полкфаг оказывал высокий терапевтический эффект.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Разработаны и утверждены ГУВ Госагропрома СССР, Департаментом ветеринарии МСХиП РФ нормативные документы на промышленное производство и применение: Т-активина (30.06.89, 19.12.89); В-активина (30.06089, 12.02.90); вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеялеза и протейной инфекции телят, поросят, ягнят и пушных зверей (08.05.98, 05.11.99)); сыворотка поливалентная против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят, ягнят; (17.12.93) лактобактерин (12.05.89, 27.06.91, 13.11.91); бактериофаги коли-протейный 29.01.90, 30.06.90), клебсиеллезный (29.01.90), псевдомонозный(29.01.90),, стафилококковый(29.01.90),, полифаг(29.01.90); питательные среды для глубинного культивирования возбудителей пастереллеза, клебсиеллеза, колибактериоза, сальмонеллеза и протейной инфекции на основе ферментативного и кислотного гидрализатов (15.06.99).

Все иммуномодуляторы и биологические препараты внедрены в серийное производство на ФГУП «Покровский завод биопрепаратов», НИИ микробиологии МО РФ, ФГУП «Краснодарская биофабрика».

2. Разработаны и утверждены Методические рекомендации по выделению и идентификации условно-патогенных энтеробактерий и сальмонелл при острых кишечных заболеваниях ■ молодняка сельскохозяйственных животных. Москва, ВАСХНИЛ, 1990,30с.

3. Рекомендации по профилактике и лечению диарей и респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных. Утверждены Департаментом ветеринарии МСХиП РФ М. 1987, 8с.

4. Материалы работы используются в учебном процессе по курсу «Биотехнология» в сельскохозяйственных вузах по специальности 310800.

РЕКОМЕНДАЦИИ В ПРОИЗВОДСТВО

Иммуномодуляторы и биологические препараты рекомендуются использовать в ветеринарной практике для повышения естественной резистентности организма животных, профилактики и лечения иммунодефицитов и острых кишечных и респираторных болезней молодняка животных.

ВЫВОДЫ

!. Установлена роль условно-патогенных бактерий и вирусов в этжгкагогенезе кишечных и респираторных болезней телят. Патогенез данных заболеваний связан с наличием в организме животных знтеробактерий: преимущественно E.coii 0<>, E.coli Оза, E.coli 0ц9, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Kl. pneuroonia K«. R.î. Pneumoma Ka; S. typhimurium, S. dublin, S. enteritidis; при респираторных ::и5олева..ниях с вирусами ПГ-3, ИРТ, адено, PC и ВД преимущественно в виде смешанных инфекций.

2. Патогенность знтеробактерий обусловлена их концентрацией в содержимом кишечника, адгезивной активностью, биосинтезом токсинов.

3. У новорожденных телят наблюдается иммунодефицит В-сисгемы иммунитета, а у телят в возрасте 20 дней и старше иммунодефицит Т-сисгемы иммунитета

4. С использованием биотехнологических методов, разработаны препараты Т-активин и В-акттпшн, являющиеся иммуномодуляторами гуморальных il клеточных факторов иммунитета и стимуляторами ангитглогенеза.

5 ПримекашеТ-активина и В-активина в установленной дозе и кратности устраняет иммунодефицита у животных улучшает обшее состояние и стимулирует протектпвную активность организма животных против ОКЗ и ОРЗ более чем 70% случаев.

6. Разработана высоко м.шуиогенная ассоциированная иизда ивированная вакцина - вакцина ОКЗ, которая при иммунизации яскцо!обеспечивает выработку широкого спектра антител против пат'..ТЕ;;ггык факторов возбудителей колкбактеркозз, сальмонеллеза, клебс1'.:':.-цен:, я протейной инфекции молодняка животы*.

7. Экспериментально-производственными испытаниями вакцины ОКЗ на глубокостельных короиах установлено, что титры специфических антител к каждому из составляющих антигенных компонентов в сыьороту.е крови и молозива иммунизированных животных накапливаются до уровня, обеспечивающего защиту приплода от инфекционной диареи в первые 10-15 дней жизни. Уровень заболеваемости молодняка полученного от вакцинированных животных снижается в среднем с 82,2 до 17,0%, гибель с 12,5 до 0,6%.

8. Разработана и оптимизирована технология глубинного культивирования знтеробактерий, позволившая повысить урожайность биомассы в 2-3 паза.

9.Использояакие разработанных сухих синтетических ПС для культивирования знтеробактерий, позволяет стандартизировать требования к

питательным основам не снижая урожайность биомассы и активность антигенных компанентов микроорганизмов.

10. Теоретически обоснована схема применения иммуномодуляторов для стимуляции антителогенеза при получении гипериммунных сывороток и для активной иммунизации животных, позволившие повысить выработку специфических антител на антигены и снизить затраты на профилактические мероприятия.

11. Разработана технология получения и применения поливалентной сыворотки против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят и ягнят (сыворотка ОКЗ), которая позволила повысить сохранность иммунизированного молодняка до 98,5%.

12. Электронномикроспическими исследованями установлен механизм антагонистического действия лактобактерина в отношении энтеробактерий проявляющейся в подавлении синтеза полисахаридов, нарушении структуры клеточной стенки, потере адгезивных свойств, угнетении роста.

13. Применение лактобактерина с первого дня после рождения в каждое очередное кормление в течение 3-х дней снижает уровень обсеменности кишечника УПМ, профилактирует желудочно кишечные заболевания, повышает усвояемость корма.

14. Выделено и изучено 10 бактериофагов с высокой литической активностью в отношении гомологичных и геторологичных сероваров эшерихий, протей, клебсиелл, синегнойной палочка и стафилококков.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Девришов Д.А., Воронин Е.С. Т-активин при ОРЗ телят//ГГрименение биотехнологии в животноводстве и вет.медицине. Всесоюз. научно-тсхн. конф. : Тез. докл,-М., 1988. С. 36-37.

2. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Шишков В.П. Иммуностимуляцид В-акгвином при ОРЗ телят.// Всесоюз. научвд-техн. конф. : Тез. докл.- М., 1988. С.21-22.

3. Воронин E.G., Иванов C.B., Девришов Д.А., Опыт использования биол. препаратов при профилактике и лечении диарей телят.// Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапия и спец. Профилактика инфехц. болезней общих для челозека и животных,- М.-1988. С. 34-35.

4. Девришоз Д.А.. Иммунофлуоресцентная диагностика вирусных респираторных инфекций телят.//М. ВДНХ.-1988. С. 27-32.

5. Девришов Д.А., Воронин Е.С. Профилактика и лечение диареи телят полифагом// Межзузовскин сборник./ Инфекционные болезни телят.-Кишинев.-1988. С. 9-12.

Девришов ДА, Воронин Е.С. Профилактика диареи телят лактоО;:''терк)10м//лМежвузоБСКьй сборник./Инфездионные болезни телят.-Кишинев.-1938. С. 2^-25.

"/. Дгьришов Д.А., Ворошш Е.С. Иммунотерапия острых респираторных заболев,элич (ОРЗ) телят.//Сборник пробл. лейкоза и инфекц. заболеваний с.х. животных.-М,-Л--Л. С. 102-103.

8. Белов А.Д., Рогожина Л.В., Девришов Д.А., Ворошш Е.С. Уровень тироидных гормонов и факторов естественной резистентности у телят при 6роихс1шсвмоиии7/Сборник трудов МВА./Вопросы ветер. биологии-М.-1988. С.107-108.

9. Рогожина Л.В., Девришов Д.А., Смирнова М.В., Пыхтина Е.А. Радиологический анализ ■¿пешчесхих нукпеотидов у телят при бронхопневмонии.// Сборник трудов МВЛ./Ропросы ветер. биолопш-М.-1988. С.110-113.

10. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Шишков В.П. Иммуностимуляторы при ОРЗ телет/'Примененка биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине/ Тезисы докладов Всес. научно-технич. конф.-М.-1988. С.44-46.

11. Дегрьтпов Д.А. Применение иммуномодулятсра для лечения бронхопневмонии телят//Респ. конф. молодых ученых и специалистов: Тезисы докл.-Фрунзе,1988. С. 47-49.

Ворошш Е.С., Девришов Д.А., Иванов C.B. Опыт использования биологических пре^аратон при профилактике и лечении диарей телят.// Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапия и спец. профилактика инфекц. болезней общих для чгяыюк il животных,- Львов-1988. С. 25-28.

13. Вороник Е.С, Десришов Д.А., Лопухин Ю.М., Белов А.Д. Способ лечения ресг»_-л.торных болезней телят.//A.C. №1501337 от 10 марта 1988 г.

11. Девришов Д.А., Воронин Е.С. Профилактика диарей телят лактобактерином.// Инфекционные болезни телят.-Кшштев.-1988. С. 19-24.

15. Девришов Д.А., Воронин Е.С. Иммунотерапия острых респираторных заболеваний телят//Проблемы лейкоза и инфекц. заболеваний с/х животных- М.-1988. С.41-42.

15. Девришов Д.А. Дифференциальная диагностика респираторных болезней телят//Межзузовский сб. научн. трудоЕ./Проблемы лейкоза и инфекц. заболеваний с/х

животных.-M.-l 988.

17. Воронин Е.С., Девришов Д.А. Иммунотерапия острых респираторных заболеваний телят.//Проблемы экологии в вет. медицине/Тезисы докл.: Вес. научно-техн. конф.-Воронеж.-1989. С.35.+

18. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Иммуномодуляторы в ветеринарии//Проблемы экологии в ветеринарии/Тезисы докл. Всес. научно-техн. конф.-Воронеж.-1989. С.65.

19. Девришов Д.А. Поилки для новорожденных телят//Животноводство.-Т989.-№7.

С. 31.

20. Девришов Д.А. Этиология и профилактика желудочно-кишечных заболеваний телят//Вестник с/х науки.-1989.-№9. С. 17.

21. Воронин Е.С., Ставцева Л.Я., Девришов Д.А., Сравнительная характеристика условно-патогенных бактерий, выделенных от больных детей и телят.//Современные аспекты профилактики инфекц. болезней молодняка.-Кишинев,-1989. С. 19-24.

22. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Ставцева Л.Я., Шишков В.П., Бедоева З.М. Грязнева Т.Н. Профилактика и лечение диарей телят с использованием неспецифических препаратов и бактериофитов.//Доклады ВАСХНИЛ.-1990.-№11. С.47-50.

23. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Ставцева Л.Я., Бедоева З.М. Экспериментальное воспроизведение диарей у новорожденных телят.//В е стн и к с.х. науки.-1990.-№10. С.5-9.

24. Воронин Е.С., Девришов. Д.А. Лопухин Ю.М. Способ профилактики острых респираторных болезней молодняка животных.//А.с. №1561268 от 03 января 1990г.

25. Voronin E.S., Devrishov D.A., Shishkov V.P. Development and employment of Ecologically pure preparations for treatment and prophyluxis of gastrointestinal calf diseases.// XVI World Buratrics Congr.- Brasil.-1990. p.581-584.

26. Voronin E.S. Devrishov D A Petrov R.V. Immunomodulators in calf respiratory diseases//XVI Word Buiatrics congress.- Brasil.- 1990, p.987-990.

27. Воронин E.C., Девришов Д.А., Ставцева Л.Я., Юнисова Н.Ю. Использование биологического препарата для профилактики диарей у новорожденных телят// Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка с/х животных: тез. докл. научно-произв. конф. 12-13 сентября 1990 г.Витебск.-Минск.-1990. С.45.

28. Романова М.В. Воронин Е.С., Девришов Д.А. Способ получения иммунной сыворотки против рожи свиней.// Ас. N 1608894 от 22 июля 1990г.

29. Романова М.В. Воронин Е.С. Девришов Д.А. Способ получения гипериммунной сыворотки. // A.c. N 1602198 от 22 июня 1990г.

30. Блохина И.Н., Воронин Е.С. Девришов Д.А. и др. Методические рекомендации по выделению и идентификации условно-патогенных энтеробактерий и сальмонелл при острых кишечных заболеваниях молодняка с/х животных.//.Од. ВАСХНИЛ.- М.-1990.

31. Девришов Д.А., Воронин Е.С., Ставцева Л.Я. Бедоева З.М. Острые кишечные инфекции у телят в экспериментальных условиях// Межвуз. сб. науч. тр. МВА./Новое в диагностике, лечении и профилактике болезней молодняка с/х животных.-М.-1991. С.67-69.

32. Девришов Д.А., Воронин Е.С., Ставцева Л.Я., Грязнева Т.Н. Изучение бактериобиоценоза - причины острых желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных.// Вестник с.х. науки.-1991.- № 2. С. 43-46.

33. Девришов Д.А. , Воронин Е.С., Ставценва Л.Я., Юнисова Н.Ю. Антагонистическая активность биологического бактерийного препарата бифилака в отношении патогенных и условно-патогенных энтеробактерий.// Вестник с.х. науки-1991,-№3. С. 22-25.

34. Девришов Д.А., Воронин Е.С., Денисенко В.Н., Печникова Г.Н. и др. Влияние иммуномодуляторов на иммунологический статус телят при экспериментальном

s:

инфекционном ринотрахеиге.//Вегеринария.-1991.-Х28.С. 11-13.

35. Devrishov D.A., Rogozina L.V., Voronin E.S., Belov A.D. Regulatory effect ol immunomodulators Thyroidhormone Secretion// Congr. Internat. Society for Pathohysiology.-Moscow.-1991.p.357.

36. Voronin E..S, Devrishov D.A., Shishkov V.P., Interchangeabl and.immunostimu-lating prophylaxis of gastroenteric and respiratory diseases of calves// Congr. Internat. Society foi Pathohysiology.- Moscow.-1991.p.363.

37. Девришов Д.А., Дадыбаев Ж.М. Иммунотерапевтические свойства Т-активина при вирусных респираторных заболеваниях телят.//Новое в диагностике, лечен, и профил. бол. молодняка с.х. ж-х,- М.- 1991, С. 41-44.

38. Девришов Д.А., Павлов Г.В., Печникова Г.Н. Патоморфологические изменения i лимфоидных органах при стимуляции Б-активином.// Новое в диагностике, лечен, н профил. бол. молодняка с.х. ж-х.- М - 1991, С. 44-45.

39. Девришов Д.А, Печникова Г.Н., Смоленская-Суворова О.О. Воздействие км -.гукэмодуляторов естественного происхождения на организм с/х животных.// Профилактика и лечение болезней молодняка с/х животных.: Тез. докл. Всесоюзн. научно-техн. контр. -Воронеж.-1991. С.166-167.

40. Ставцеза Л.Я., Девришов Д.А., Федорова М., Гизатулина С.С Энтеротоксигенность условно-патогенных энтеробактерий/ЛЗестник с.х Ha^№.AiponpovH3ÄaT.-M.1992-Nä2. С. 31-34.

41. Voronm E.S., Devrishov D.A , Petrov R.V., Belov A.D. Concegit of etiology anc prevention of dianhea and respiratory distases of calves.// XVIII World Buratrics Congr - Italija-1994. P. 234-235/

42. Voronin E.S., Devrishov D.A., Safonóv J.A. Natural immunomodulators EAVPT ЛТ Jnt'emational.// Congr. Edinburg, U.K.-1994. P.112.

43. Воронин E.C., Петров P.B., Девришов Д.А., Шишков В.П. Иммуномодуляторы i njjjS'ifOTHKH при болезнях молодняка - перспективное направление в ветеринарное медицине.// Иммунодефицита с.х. животных: Тез. докл. Всерос. научн. конф. - М.- 1994 С.4-5.

44. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Лавровская В.М. Вакцина ассоциированная rtpoTi.ï диареи телят. // Патент N 2035916, 30 мая 1995.

45 Devrishov D.A., Voronin E.S., Petrov R.V., Belov A.D. Lactobakterin imm modulators, ftorazol - the preparations for prevention of diarrhea and respiratory disease: of calves.// World Veterinary Congr. Jokahama.- 1995.

46. Воронин E.C., Петров P.B., Девришов Д.А., Шишков В.П. Концепция этиолопл и профилактики диарей и респираторных болезней новорожденных телят. // Проблем! инфекционных болезней молодняка с.х. животных: Тез. докл. Всеросс. научн. конф. -М. 1996. С. 22-23.

47. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Шишков В.П. Рекомендации по профилактике i лечению диарей и респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных./ Утв. Департаментом ветеринарии Министерство сельского хозяйства продовольствия РФ. Москва,- 1997.8с.

45. Девришов Д.А., Печникова Г.Н., Смоленская-Суворова О.О. Иммунодефицита» состояние среди молодняка крупного рогатого скота// Сб.научн.трудов МГАВМи! им.К.И.Скрябина./ Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии. -М.-1997. С. 32 35.

49. Девришов Д.А., Воронин Е.С., Бедоева З.М., Шведов В.В. Экспериментально испытание ассоциированной инактивированной вакцины ОКЗ.//Ветерипария - 1998 - №12

М2-14.

50. Мирзаев М.Н., Девришов Д.А., Воронин Е.С., Савченков С.Н. Некоторые :пекты оптимизации культивирования микроорганизмов-продуцентов ветеринарных итибиотиков//Тез.докл. науч. конф.,поев. 100-летию Курской биофабрики.-Курск. -1996. :. 56.

51. Новиков A.B., Юдин Ю.И.. Кучеренко A.C., Шведов В.В. Девришов Д.А., и др. 'оздание гибких технологий аппаратурно-технологических линий для производства гтеринарных препаратов//Тез. докл.. Медукар. Науч. конф., посвящ. 40-летию НИИВВиМ.-Покров-1998. С. 187-188.

52. Бакулин М.К., Кузнецов С.М., Пяткова Н.В., Девришов Д.А. .втоматизированный метод обработки и анализа информации о возбудителях острых ишечных заболеваний на примере сальмонелл.//Тез.докл. Меджунар. Науч. конф., посвящ. D-летию ВНИИВВиМ.-Покров-1998. С.392-393 .

53. Девришов Д.А., Воронин ЕС., Пименов Е.В., Левчук Б.А. и др. кспериментальная оценка иммуногенных свойств ассоциированной инактивированной 1кцины против острых кишечных заболеваний (ОКЗ) сельскохозяйственных ивотных./ЛГез. докл. Меджунар. Науч. конф., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ.-Покров-998. С. 393-395.

54. Девришов Д.А., Воронин Е С., Шведов В.В., Кузнецов С.М. и др. Получение икробных культур сальмонелл в среде минимизированного состава для получения шданных препаратов против сальмонеллеза сельскохозяйственных животньгх.//Тез. докл. 1еджунар. Науч. конф., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ.-Покров-1998. С. 395-396.

55. Воронин Е.С., Шабанов A.M., Девришов Д.А., Печникова Г.Н., Жарова Т.П. [орфофункциональные особенности моноцитов и монограмма крови трансгенных ивотных.//Сб. научн. тр. МВА/Аюуальные проблемы ветеринарной науки: Тез. докл.-М.-399. С.178-180.

56. Воронин Е.С., Тихонов И.В., Девришов Д.А. и др. Биотехнология. Программа и высших сельскохозяйственных заведений по специальности 310800-ггеринария//Утвержд. УМО высших уч. заведений РФ в области ветеринарии и зоотехнии [ротокол №2 от 29.02.2000г.) М.2000.

57. Воронин Е.С., Тихонов И.В., Девришов Д.А., Грязнева Т.Н. Физические основы способы микрофильтрации и ее применение в технологии производства ветеринарных имунобиологических препаратев//Уч. пос. по биотехнологии, утв. УМО высш. уч. сведений РФ в обл. ветеринарии и зоотехнии (прот. №6 от 01.03.2000).М.2000.

58. Воронин Е С., Пименов Е.В., Панин А.Н., Гаврилов В.А., Комоско Г.В., евришов Д.А., и др. Разработка технологии и создание промышленного производства тсих питательных сред из нетрадиционного белкового сырья для обеспечения выпуска юпрепаратов ветеринарного назначения//Тез. докл. Междунар. Конф., посвящ. 80-летию ВА им. К.И. Скрябина.-М,-1999. С.217-218.

59. Воронин Е.С., Шведов В.В., Девришов Д.А., Кузнецов С.М. и др. Использование >еды минимизированного состава в процессе культивирования для получения вакцинных >епаратов против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных.//Тез. докл. Междунар. знф., посвящ. 80-летгао МВА им. К.И. Скрябина.-М.-1999. С.219-220.

60. Девришов Д.А., Воронин Е.С. Протекгивная активность вакцины КЗ.//Ветеринария.-1999.-№4. С.14-17.

Актуальность проблемы. Острые кишечные (ОКЗ) и респираторные заболевания молодняка (ОРЗ) по широте распространения и охвату поголовья занимают ведущее место в патологии сельскохозяйственных животных. Отход молодняка в первые месяцы жизни (падеж, санитарный брак) в зависимости от уровня ведения животноводства достигает в среднем 10-50% и более.

Практически повсеместно регистрируемая заболеваемость молодняка свидетельствует о том, что эти заболевания не случайны и возникают как следствие постоянно присутствующих в среде обитания животных неблагоприятных факторов, закономерно вызывающих патологические изменения в организме.

Основными причинами гибели молодняка в первый месяц после рождения являются -ОКЗ. Устойчивость телят к ОКЗ зависит от уровня факторов естественной резистентности организма новорожденных животных, активности колострального иммунитета, который находится в прямой зависимости от качества молозива и его своевременным получением новорожденным молодняком.

Исследованиями Воронина Е.С. с соавт (1989, 1991) установлено, что молодняк в большинстве случаев, рождается с низкой резистентностью организма. У таких животных понижена неспецифическая защитная реактивность в новых условиях обитания и на фоне высокой обсемененности внешней среды, а зачастую и молозива условно патогенными микроорганизмами (УПМ), в результате чего происходит их инфицирование и опережающее заселение кишечника, УПМ и как следствие возникают диареи, в этиопатогенезе которых активно участвуют энтеробактерии. Имеющиеся и широко используемые в настоящее время моновакцины против колибактериоза и сальмонеллеза, для иммунизации животных не всегда эффективны, поскольку в этиологии диарей в большинстве случаев участвует ассоциация 3-5 а иногда и большего количества возбудителей, преимущественно из семейства энтеробактерий.

Существенную роль в лечении и предупреждении ОКЗ играют препараты способствующие восстановлению нормальной микробной среды в кишечнике, к ним относятся пробиотики (молочнокислые лакто- и бифидобактерии), которые наряду с антагонистическим действием благоприятно влияют на усвояемость корма, участвуют в биосинтезе витаминов группы В, ряда незаменимых аминокислот (Грязнева Т.Н., 1994).

Переболевание в раннем возрасте ОКЗ, содержание в помещении животных с разным иммунобиологическим фоном, воздействие различных стрессов, приводит к развитию иммунодефицитного состояния, способствующего повышенной восприимчивости молодняка к различным ауто- и экзопатогенам, и в итоге к массовым респираторным болезням. В настоящее время известно 10-15 различных вирусных и бактериальных агентов и их ассоциации, способных вызывать респираторные болезни телят (Девришов Д.А.,1987)

Многообразие факторов возникновения ОРЗ снижает эффективность применения специфических препаратов. Кроме того, респираторные болезни возникают с 15-20-дневного возраста и применение вакцин в этом возрасте также неэффективно, т.к. иммунная система у молодняка способна полноценно реагировать на антигены с 1,5-2 месячного возраста. В этой связи существенную роль в профилактике и лечении ОКЗ и ОРЗ играет разработка средств способствующих повышения уровня факторов естественной резистентности организма и устраняющих иммунодефицита у животных. Актуальность проблемы иммунокоррекции связана еще с тем, что, в основе многих болезней лежат вторичные иммунодефицита (Лопухин Ю.М., Петров Р.В.).

В связи с многообразием этиологических факторов ОКЗ и ОРЗ молодняка животных, недостаточной эффективностью применяемых в практике средств их профилактики и лечения, на первое место встает разработка новых ветеринарных иммунобиологических препаратов (ВИБП) и средств повышения резистентности организма животного.

Цель работы. Целью работы являлось изучение этиопатогенетических факторов острых кишечных и респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота и разработка новых ветеринарных иммунобиологических препаратов и методов их применения для профилактики и лечения телят от этих болезней.

Задачи исследований. Для достижении поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить этиопатогенетические факторы ОКЗ и ОРЗ у молодняка животных;

• изучить функциональную активность факторов естестественной резистентности организма молодняка;

• разработать средства иммунокоррекции и изучить их влияние на организм животных и при различных патологических состояниях;

• разработать ассоциированную инактивированную вакцину и поливалентную сыворотку против колибактериоза, сальмонеллезы, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка животных, изучить их биологические свойства и профилактическую эффективность;

• изучить биологические свойства и протективную активность лактобактерина и бактериофагов при острых кишечных заболеваниях молодняка крупного рогатого скота.

Научная новизна. Установлено, что заболеваемость острыми кишечными и респираторными болезнями молодняка зависит от уровня факторов естестественной резистентности организма животных, концентрации УПМ в кишечнике и ее патогенности

Острые кишечные заболевания протекают на фоне иммунодефицита В-лимфоцитов и недостаточности гуморальных факторов, а респираторные при иммунодефиците - Т-лимфоцитов.

Впервые разработайы иммуномодуляторы с высокой биологической активностью -Т-активин и В-активин и изучены их фармакологические свойства.

Впервые выявлена протективная и лечебная активность иммуномодулято-ров Т-активина и В-активина при кишечных и респираторных болезнях телят.

Впервые обосновано применение иммуномодуляторов при профилактике инфекционных болезней животных, а также при производстве иммунных лечебно-профилактических сывороток в целях стимуляции антителогенеза.

Путем эпизоотологического анализа, подбора соответствующих штаммов, условий их культивирования, режима инактивации и сорбции антигенов впервые разработаны технологии изготовления и способы применения ассоциированной инактивированной вакцины и поливалентной сыворотки против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка животных, при иммунизации которой синтезируются антитоксические, антиадгизивные и антигемолитические антитела, позволяющие повысить уровень защитных свойств молозива у привитых коров, тем самым увеличить сохранность молодняка за счет пассивного колострального иммунитета.

Выделены и селекционированы производственные штаммы фагов и разработаны препараты бактериофагов против клебсиеллеза, стафилококковой, протейной и синегнойной инфекции телят.

Изучена антагонистическая активность лактобактерина в отношении энтеробактерий и его профилактическая эффективность при ОКЗ телят.

Практическая значимость. На основании проведенных исследований нами получены 4 авторских свидетельств и патент

Разработаны и утверждены установленным порядком нормативные документы, регламентирующие промышленное производство и применения: технических условий -12; наставлений и инструкций по применению -12; технологических инструкции по производству и контролю -12.

Разработаны и утверждены Методические рекомендации по выделению и идентификации условно-патогенных энтеробактерий и сальмонелл при острых кишечных заболеваниях молодняка сельскохозяйственных животных. Москва, ВАСХНИЛ, 1990.

Рекомендации по профилактике и лечению диарей и респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных. Утверждены Департаментом ветеринарии МСХиП РФ М. 1997.

Материалы работы используются в учебном процессе при изучении курсов «Болезни молодняка» и «Биотехнология» и включены в учебные программы по курсу Биотехнология для студентов сельскохозяйственных вузов по специальности 310800.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на международных (20-и), Всесоюзных (8-и), Всероссийских (3-х), межвузовских (5-и) и др. научных, научно-практических конференциях. Отдельные этапы работы были представлены на публичное обсуждение на ВДНХ СССР и по результатам награждены серебряными медалями (1989; 1990)

Всего опубликовано 100 научных работ, в том числе по теме диссертации - 60.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту:

• изучения этиологических факторов кишечных и респираторных болезней молодняка животных и роли иммунного статуса в их проявлении;

• разработка и изучение свойств иммуномодуляторов Т-активина и В-активина при болезнях молодняка;

• разработка и применения ассоциированной инактивированной вакцины и сыворотки поливалентной против колибактериоза, сальмо-неллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят, ягнят и пушных зверей;

• изучение биологических свойств протективной активности лакто-бактерина и специфических бактериофагов при острых кишечных заболеваниях молодняка крупного рогатого скота. 7

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста. В работе имеются 67 таблицами 62 рисунками и диаграммами. Список использованной литературы включает 436 работ отечественных и зарубежных авторов. В приложении представлены копии документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

Публикация результатов исследований. Материалы диссертации опубликованы в 60 научных статьях.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ

1. Установлена роль условно-патогенных бактерий и вирусов в этиопатогенезе кишечных и респираторных болезней телят. Патогенез данных заболеваний связан с наличием в организме животных энтеробактерий: преимущественно E.coli 09, E.coli 038, E.coli 0ц9, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, К1. pneumonia К18; Kl. Pneumonia К8; S. typhimurium, S. dublin, S. enteritidis; при респираторных заболевапниях с вирусами ПГ-3, ИРТ, адено, PC и ВД преимущественно в виде смешанных инфекций.

2. Патогенность энтеробактерий обусловлена их повышенной концентрацией в содержимом кишечника, адгезивной активностью, биосинтезом токсинов.

3. У новорожденных телят наблюдается иммунодефицит В-системы иммунитета, а у телят в возрасте 20 дней и старше иммунодефицит Т-системы иммунитета.

4. С использованием биотехнологических методов, разработаны препараты Т-активин и В-активин, являющиеся иммуномодуляторами гуморальных и клеточных факторов иммунитета и стимуляторами антителогенеза.

5. ПрименениеТ-активина и В-активина в установленной дозе и кратности устраняет иммунодефицита у животных улучшает обшее состояние и стимулирует протективную активность организма животных против ОКЗ и ОРЗ более чем 70% случаев.

6. Разработана высоко иммуногенная ассоциированная инактивированная вакцина - вакцина ОКЗ, которая при иммунизации животных обеспечивает выработку широкого спектра антител против патогенных факторов возбудителей колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка животных.

7. Экспериментально-производственными испытаниями вакцины ОКЗ на глубокостельных коровах установлено, что титры специфических антител к каждому из составляющих антигенных компонентов в сыворотке крови и молозива иммунизированных животных накапливаются до уровня, обеспечивающего защиту приплода от инфекционной диареи в первые 10-15 дней жизни. Уровень заболеваемости молодняка полученного от вакцинированных животных снижается в среднем с 82,2 до 17,0%, гибель с 12,5 до 0,6%.

8. Разработана и оптимизирована технология глубинного культивирования энтеробактерий, позволившая повысить урожайность биомассы в 2-3 раза.

9.Использование разработанных сухих синтетических ПС для культивирования энтеробактерий, позволяет стандартизировать требования к питательным основам не влияя на урожайность биомассы и активность антигенных комплексов микроорганизмов.

10. Теоретически обоснована схема применения иммуномодуляторов для стимуляции антителогенеза при получении гипериммунных сывороток и для активной иммунизации животных, позволившие повысить выработку специфических антител на антигены и снизить затраты на профилактические мероприятия.

11. Разработана технология получения и применения поливалентной сыворотки против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят и ягнят (сыворотка ОКЗ), которая позволила повысить сохранность иммунизированного молодняка до 98,5%.

12. Электронномикроспическими исследованями установлен механизм антагонистического действия лактобактерина в отношении энтеробактерий проявляющейся в подавлении синтеза полисахаридов, нарушении структуры клеточной стенки, потере адгезивных свойств, угнетении роста.

13. Применение лактобактерина с первого дня после рождения в каждое очередное кормление в течение 3-х дней снижает уровень обсеменности кишечника УПМ, профилактирует желудочно кишечные заболевания, повышает усвояемость корма.

14. Выделено и изучено 10 бактериофагов с высокой литической активностью в отношении гомологичных и геторологичных сероваров эшерихий, протей, клебсиелл, синегнойной палочка и стафилококков и разработана технология их производства.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Разработаны и утверждены ГУВ Госагропрома СССР, Департаментом ветеринарии МСХиП РФ нормативные документы на промышленное производство и применение Т-активина (30.06.89, 19.12.89); В-активина (30.06089, 12.02.90); вакцины против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят, ягнят и пушных зверей (08.05.98, 05.11.99)); сыворотки поливалентной против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят, ягнят (17.12.93); лактобактерина (12.05.89, 27.06.91, 13.11.91); бактериофагов: коли-протейного (29.01.90, 30.06.90), клебсиеллезного (29.01.90), псевдомонозного (29.01.90), стафилококкового (29.01.90), полифага (29.01.90); питательных сред для глубинного культивирования возбудителей пастереллеза, клебсиеллеза, колибактериоза, сальмонеллеза и протейной инфекции на основе ферментативного и кислотного гидрализатов (15.06.99).

Все иммуномодуляторы и биологические препараты внедрены в серийное производство на ФГУП «Покровский завод биопрепаратов», НИИ микробиологии МО РФ, ФГУП «Краснодарская биофабрика».

2. Разработаны и утверждены Методические рекомендации по выделению и идентификации условно-патогенных энтеробактерий и сальмонелл при острых кишечных заболеваниях молодняка сельскохозяйственных животных. Москва, ВАСХНИЛ, 1990,30с.

3. Рекомендации по профилактике и лечению диарей и респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных. Утверждены Департаментом ветеринарии МСХиП РФ М. 1987, 8с.

4. Материалы работы используются в учебном процессе по курсу «Биотехнология» в сельскохозяйственных вузах по специальностям 310800, 310700.

Заключение о

II пептидной природе

Щ активных компонентов В-II активина подтверждается и II данными о возможности щ биосинтетического мечения Щ этих компонентов при §1 инкубации клеток в среде, || содержащей С14

II аминокислоты, а также Щ результатами определения константы плавучей плотности в градиенте хлористого цезия, которая была равна 1,3 г/см, что является характерной величиной для белков и пептидов.

На рис.14 представлен профиль элюции В-активина на катионообменнике (КМ-трисакрил-М). Установлено, что после ионообменной хроматографии нанесенный на колонку материал элюируется раствором стартового буфера в виде 5 различных пиков. Суммарный выход материала

Гшг** Л» после ионообменной хроматографии от нанесенного составил 60%.

Таким образом, полученные результаты по изучению природы иммуностимулирующих компонентов В-активина свидетельствуют о том, что они представляют собой группу гидрофобных, отрицательно заряженных пептидов с молекулярной массой 1000-3000 дальтон, элюируются на колонке с обращенной фазой при 25% -ной концентрации ацетонитрила.

3.2.1. Изучение биологических свойств и иммуномодулирующей активности

В-активина.

Влияние В-активина на антителопродукцию. В-активин обладает способностью увеличивать количество антителопродуцентов в продуктивную фазу иммунного ответа. Этот эффект наблюдали при добавлении В-активина в культуру клеток лимфатических узлов, взятых на пике иммунного ответа, от иммунизированных эритроцитами барана мышей. Количество антителопродуцентов (плазматических клеток) повышалось в 1,5-2 раза. Стимулирующее действие В-активина видимо, связано на его действие непосредственно на предшественников антителопродуцентов, в результате чего клетки утрачивают способность воспринимать регулирующие сигналы Т-супрессоров.

Влияние В-активина на дифференцировку клеток. Изучение влияния В-активина на дифференцировку клеток проводилось путем инкубации в течение 48 часов клеток лейкозной линии Н-60 с препаратом. Установлена четко выраженная дифференцировка моно- и миелобластов по моноцитарному ряду.

Влияние В-активина на пролиферацию клеток. Наряду со способностью переводить клетки в более дифференцированное состояние и, следовательно, снижать интенсивность пролиферации клеток, в некоторых случаях В-активин может стимулировать пролиферативные процессы. Внутривенное введение препарата облученным мышам приводит к увеличению в селезенке в 2-3,5 раза количества эндогенных колоний кроветворных клеток. Максимальным стимулирующим эффектом В-активин обладал в дозе 0,0001 мг/мышь. При этом стимуляция пролиферации начинается на 4 сутки, максимальный эффект достигается на 8 сутки.

Иммунокоррегирующая активность В-активина в эксперименте. Иммунокоррегирующая активность В-активина изучалась при использовании различных моделей иммунодефицитных состояний. Одной из таких моделей является линия мышей МР-1р гомозиготных по гену лимфопролиферации. Наличие этого гена у мышей ведет к развитию аутоиммунных расстройств, протекающих по типу системной красной волчанки. Наряду со спонтанными аутоиммунными расстройствами у опытных мышей отмечали нарушение выработки интерлейкина 2, клеточного иммунитета и крайне низкий гуморальный иммунный ответ. В лимфатических узлах таких мышей на 4-е сутки после вторичной иммунизации эритроцитами барана наблюдается фоновое количество антителопродуцирующих клеток. После введения В-активина количество антителопродуцентов возрастало в 6-8 раз. Систематическое введение мышам этой линии препарата вдвое увеличивало продолжительность жизни опытных животных.

Одним из способов создания иммунодефицита в эксперименте является воздействие на животных неблагоприятными физическими факторами, Установлено, что у мышей при гипоксии, вызванной имитацией подъема на высоту 7000 м в течение 3-5 суток, иммунный ответ на эритроциты барана снижается на 30-50%. Введение животным В-активина приводило к нормализации иммунного ответа.

3.3. Экспериментальное изучение протективной активности В-активина и Тактивина.

В опытах на белых мышах по изучению протективных свойств ИМ при экспериментальных бактериальных инфекциях, как при раздельном введении, так и совместном применении Т-активина и В-активина (табл.5) был

Ill установлен профилактический эффект различной степени выраженности. ИМ вводили за 24 ч до заражения и на 2, 3, 4 и 5-е сутки после заражения.

У мышей, зараженных летальной дозой (2LD50) Salmonella typhimurium, E.coli, Pasterella multocida, Proteus vulgaris и Klebsiella pneumoniea, протективная активность Т-активина на животных, зараженных энтеробактериями, в среднем составляет 70% при выживаемости в контрольной группе 10-15% (колибактериозе и сальмонеллезе) и 100%-ной гибели контрольных животных в группе инфицированных пастереллами, клебсиеллами и протеями. Профилактическое действие В-активина на мышах, инфицированных энтеробактериями в среднем составило 73%. Совместное применение В-активина и Т-активина повышали выживаемость на 5-15% (табл. 5).

У всех животных контрольной группы наблюдали типичные симптомы заболевания и 85-100%-ную гибель вызванную энтеробактериями и пастереллами. В то же время у животных, получавших Т-активин и В-активин, такие симптомы заболевания наблюдали в среднем у 50% мышей опытных групп.

Механизмы протективного действия ИМ при заражении животных бактериями изучены недостаточно. По нашим данным введение Т-активина и В-активина инфицированным животным приводит к увеличению титров противомикробных антител. Активная роль в уничтожении бактерий принадлежит иммунным макрофагам. ИМ усиливают фагоцитарную активность макрофагов и подавляют размножение паразитирующих в них микробных клеток.

Установлено, что наибольшее влияние на функциональную активность макрофагов оказывает В-активин. Он повышал интенсивность фагоцитоза бактерий; по фагоцитарному индексу - в 1,5-3,0 раза, по фагоцитарному числу - в 2-6 раза. В то же время подвижность клеточной мембраны перитониальных макрофагов под его влиянием увеличивалось в 1,5-6,5 раз, а цитопатогенное действие бактерий снижалось в 2-7 раз. При изучении

112 бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови было обнаружено, что введение В-активина мышам за 24 ч до заражения и в течение 3-4-х дней после заражения летальной дозой энтеробактерий и пастерел, повышает их активность в 3-4 раза.

Также отмечено, что применение ИМ увеличивало титры агглютинирующих антител приблизительно в 2,6 раза по сравнению с данными у контрольных животных. Особенно выраженный антителостимулирующий эффект наблюдали при применении В-активина и в сочетании его с Т-активином. Уровень специфических антител определяли на 16 сутки после заражения.

Представленные выше данные свидетельствуют о том, что входящие в состав Т-активина и В-активина низкомолекулярные пептиды обеспечивают выраженную протективную активность препаратов, их способность стимулировать антителообразование и усиливать некоторые клеточные иммунные реакции, а также проявлять антиинфекционную активность.