Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Тест-системы для иммунологического мониторинга и прогнозирования острых кишечных инфекций животных и усовершенствование средств специфической профилактики

На правах рукописи

БЕДОЕВА Залихан Михайловна

ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЖИВОТНЫХ И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ)

Научные консультанты: доктор биологических наук,

профессор, академик РАСХН Воронин Евгений Сергеевич; доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН Девришов Давудай Абдулсемедович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Тихонов Игорь Владимирович; доктор ветеринарных наук, профессор Белоусов Василий Иванович; доктор ветеринарных наук Пирожков Михаил Константинович.

Ведущая организация: государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический . институт биологической промышленности».

Защита диссертации состоится «¿/£у »/¿^см/и^' 2006 г. в «/7 » часов на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23. тел. (495) 377-9383.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан « м » гроб г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актуальной проблемой остаются заболевания желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных, проявляющиеся диареей. ОКЗ регистрируются во всех странах и устойчиво занимают ведущее место среди всех инфекционных заболеваний. Совокупный экономический ущерб, наносимый животноводству в зависимости от уровня развития может достигать до 50% и более.

Отечественными и зарубежными исследователями установлено, что массовые диареи, как патология у молодняка сельскохозяйственных животных, вызываются комплексом причин, в котором ключевой основой является инфекционная природа (Воронин Е.С. с соавт. 1989, 1996; Девришов Д.А., 2000; Moon H.W. et al., 1976; Raska H., 1980. Smith H.W., 1995). Микроорганизмы, вызывающие синдром острого кишечного заболевания (ОКЗ), являются в основном сателитными для макроорганизма и внешней среды. Их патогенное действие, прежде всего, проявляется при пониженной естественной резистентности организма, воздействии стресс факторов (технологические нарушения в кормлении, содержании и воздействии неблагоприятных факторов внешней среды).

Рекомендуемые профилактические мероприятия - обеспечение полноценного кормления и надлежащих условий содержания коров, поддержание на должном уровне ветеринарно-санитарного состояния ферм и родильных отделений, своевременное выпаивание телят молозивом, не в полной мере дают ожидаемый результат, так как не учитывают инфекционный фактор развития диарей.

Многообразие факторов возникновения ОКЗ снижает эффективность профилактических и терапевтических мероприятий и требует проведения широкого спеюра диагностических исследований в большинстве случаев результаты, которых имеют ретроспективное значение.

В этой связи вопросы разработки средств для эпизоотологического мониторинга и оперативной, и ретроспективной диагностики ОКЗ являются весьма актуальными для своевременного проведения лечебно-профилактических и ветеринарно-санитарных мероприятий.

Наиболее приемлемой среди известных диагностических тестов для широкого практического применения является реакция непрямой ге-магглютинации (РНГА) с применением антигенных диагностикумов,

которая характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью и методически доступна для ветеринарных лабораторий.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось проведение эпизоотологического мониторинга и лабораторно-диагностических исследований по выделению и идентификации микроорганизмов, являющихся основными этиологическими факторами возникновения острых кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных; разработка тест-систем для диагностики, иммунологического мониторинга и прогнозирования инфекционного процесса, а также усовершенствование средств специфической профилактики ОКЗ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести эпизоотологический мониторинг и установить роль микроорганизмов семейства Enterobacteriacae в этиологии ОКЗ.

2. Идентифицировать и изучить иммунобиологические свойства штаммов микроорганизмов основных возбудителей ОКЗ.

3. Разработать биотехнологические параметры получения и очистки бактериальных антигенов, и создания эритроцитарных тест-систем для диагностики эшерихиоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции.

4. Провести исследования по оптимизации методов получения, стабилизации и сенсибилизации эритроцитов.

5. Разработать схемы гипериммунизации кроликов для получения высоко-специфических иммунных сывороток к штаммам E.coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus.

6. Компоновка диагностических эритроцитарных антигенных РНГА-наборов к энтеробактериям и их экспериментальные и производственные испытания.

7. Провести исследования по мониторингу иммунного фона у животных с использованием РИГА.

. 8. С учетом данных эпизоотических и иммунологических исследований усовершенствовать антигенный состав вакцины против ОКЗ, а также технологические параметры ее производства и применения.

Научная новизна. Впервые проведен эпизоотологический мониторинг распространения энтеробактерий - возбудителей желудочно-кишечных болезней сельскохозяйственных животных в различных регионах России.

Выделены и охарактеризованы по антигенному составу и факторам патогенности микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae, являющиеся основными возбудителями ОКЗ.

Усовершенствованы методы получения антигенов, обработки и сенсибилизации эритроцитов для изготовления эритроцитарных диагно-стикумов.

Впервые разработаны антигенные эритроцитарные тест-системы для диагностики, иммунологического мониторинга и прогнозирования бактериальных инфекций у животных, вызываемых микроорганизмами родов E.coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus.

Усовершенствована технология производства и применения вакцины ассоциированной инактивированной против колибактериоза, саль-монеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят, ягнят и пушных зверей (вакцина ОКЗ).

Научная новизна результатов исследований подтверждена 9 патентами на изобретение:

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2218395 «Штамм бактерий Proteus vulgaris № 25, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 10.12.2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2217494 «Штамм бактерий Proteus mirabiliis № 26, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 27.11.2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2218176 «Штамм бактерий Salmonella dublin № 19, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов» от 10.12.2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2218177 «Штамм бактерий Salmonella enteritidis № 22, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов» от 10.12. 2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2216350 «Штамм бактерий Salmonella typhimurium № 14, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов» от 20.11.2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2222591. «Штамм бактерий E.coli 09:К99 № 28, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 27.01.2004.,

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2222592. «Штамм бактерий E.coli 0138:К88 № 27, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 27.01.2004.

- Патент Российской Федерации на изобретете № 2221864. «Штамм бактерий К. pneumoniae № 23, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 20.01.2004.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2224019. «Штамм бактерий К. pneumoniae № 24, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 20.01.2004.

Практическая значимость. Разработаны и утверждены в установленном порядке 4 набора нормативных документов, регламентирующих промышленное производство, контроль и применение антигенных эритроцитарных диагностикумов для диагностики, иммунологического мониторинга и прогнозирования бактериальных инфекций у животных, вызываемых возбудителями семейства Enterobacteriacae утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ РФ в 2004 г.

Разработаны методические рекомендации: Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу эшерихиозов у сельскохозяйственных животных; Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу сальмонеллезов у сельскохозяйственных животных; Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу протейной инфекции у сельскохозяйственных животных; Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу клебсиеллезной инфекции у сельскохозяйственных животных (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, протокол №2 от 25 апреля 2006 г).

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертационной работы изложены в отчетах НИР ФГОУ ВПО МГАВМиБ им.К.И.Скрябина за 1997-2005гг и 36 печатных работах. Материалы диссертации доложены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов ФГОУ ВПО МГАВМиБ (1997-2002 гг.); международных научных и научно-практически х конференциях (Щелково, 2001г, Киров, 2001, Самарканд, 2003, 2006, Москва, 2005,2006).

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Результаты эпизоотологического мониторинга и клинико-диагностических исследований при ОКЗ молодняка крупного рогатого скота.

2. Этиопатогснетические факторы и возбудители ОКЗ молодняка животных и их иммунобиохимическая характеристика.

3. Биотехнологические и методические основы получения и конъюгации антигенных комплексов E.coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus и pe-ференс-сывороток к ним для РИГА.

4. Результаты экспериментальных и производственных испытаний разработанных РНГА тест-систем;

5. Результаты исследований по усовершенствованию вакцины ОКЗ.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 36 работ, в том числе 14 статей в научных журналах, 8 - в сборниках научно-практических конференций, 5 методических рекомендаций, 9 патентов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 302 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы (246 отечественных и 130 иностранных авторов), приложений. Работа содержит 41 таблицу и 38 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 1988 по 2005 гг. в ФГОУ ВПО МГАВМиБ, ФГУП (ОАО) «Покровский завод биопрепаратов», ООО «Агровет» и в животноводческих хозяйствах и фермах различных регионов России (Московская область, Тульская область, Ставропольский, Краснодарский края и др.), а также в некоторых животноводческих хозяйствах стран СНГ (Казахстан, Кыргызстан).

Объектом исследования служили 854 теленка в возрасте от 1-го до 120 дней и 1248 стельных коров.

Различными методами было исследовано 1658 проб крови, патологического материала (кусочки паренхиматозных органов, кровь из сердца, содержимое отделов кишечника и желудка), содержимого прямой кишки от больных и здоровых телят, а также 289 проб смывов с объектов внешней среды (поилки, подстилка и предметы ухода за телятами).

Бактериологические исследования проводили современными методами выделения и идентификации бактериальной микрофлоры, а также с использованием СИБ (системы индикаторные бумажные), ПБДЭ (пластины бактериологические дифференциальные энтеробактерий). Результаты идентификации выделенных изолятов оценивали по определителю микроорганизмов Берджи (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1997). Первичную идентификацию проводили с использованием простых и селективно-дифференциальных сред (МПА, МПБ, среда Эндо, агар Плоскирева, висмут-сульфит агар, селенитовая среда, среда Минка, среда Ворфеля — Фергюсона, среда Олькеницкого и жел-точно-солевой агар Чистовича) и микроскопированием мазков окрашенных по Граму.

Количественный подсчет микробных клеток в единице содержимого кишечника и патологическом материале проводили в модификации НИЛИПиБ (Е.С. Воронин, Д.А. Девришов и др., 2004).

Лнтибиотикочувствителыюсть определяли с помощью стандартных дисков.

Отбор штаммов для разработки диагностикумов проводили с учетом данных эпизоотологического и иммунологического мониторинга, патогенных и вирулентных свойств.

Изучение продукции экзо- и энтеротоксинов штаммами энтеробак-терий проводили биологическими (метод лигированной кишки кролика, и на животных) и иммунологическими методами (реакция двойной диффузии в геле, РНГА и ИФА).

Гематологические исследования проводили общепринятыми методами, а также с использованиям автоматических гемоцитометров марки Picoscel и Abacus junior VET.

Растворимые антигены к этиологический значимым штаммам энте-робактерий получали различными методами: экстрагирование антигенов трихлоруксусной кислотой по Буавену, водно-фенольной экстракцией по Вестфалю, водно-солевой экстракцией, водной экстракцией, аутолизом, экстрагированием солянокислым гидроксиламином.

У полученных различными методами антигенов изучали физические (рН, оптическая плотность), биохимические (содержание белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот) свойства с использованием общепринятых методов (по Lowry, реакции с фенол-серной кислотой, по Bobo и Eaqon, по А. Спирину), а также на современном аналитическом оборудовании высокой чувствительности - автоматический биохимический анализатор Stat Fax 1904 Plus, цифровой спекгрофотометр Apel PD-303U, автоматический имуноэлекторофорез.

Получение гипериммунных сывороток проводили на здоровых ин-тактных кроликах породы шиншилла обоего пола массой 2,5-3,0 кг, путем иммунизации их соответствующими антигенами (растворимые и корпускулярные инактивированные и живые антигены).

Антигенные свойства и иммуногенную активность полученных антигенов и контрольных гипериммунных сывороток изучали в РА, РНГА с гетерологичными и гомологичными антигенами и в реакции иммуно-диффузии в агаровом геле по Оухтерлони (РИД).

В качестве носителей гемосенситинов использовали эритроциты барана, стабилизированные формалином по методу Вайнбаха (1958) в модификации НИЛИПиБ.

Чувствительность и специфичность разработанных эритроцитарных диагностикумов определяли с референс-сыворотками в РНГА и реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА). Постановку РНГА проводили микрометодом в планшетах для иммунологических реакций

с и-образными лунками в объеме 50 мкл. Предварительные результаты реакции оценивали через 3-4 часа, окончательные - через 18 - 24 часа. РТНГА ставили в полистироловых планшетах в объеме 1000 мкл. Начальное разведение антигена составляло 100 мкг в мл, из которого готовили двукратные разведения антигена от 1:20 до 1:40960. Доза сыворотки составляла величину от 2 до 4 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ). Учет реакции проводили через 18-20 часов.

Статистическую обработку данных проводили по методу Ашмарина И.П., Воробьева А.А., (1962), Пушкарева Н.В., Соболева А.Д., (1983) и использовали статистические программы (Ехзе1 и др.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эпизоотологический мониторинг и клинико-диагностические

исследования

В результате эпизоотологического мониторинга, проведенного в животноводческих хозяйствах различных регионов страны, установлено, что острые кишечные заболевания у молодняка начинаются в 1—3 дня после рождения и проявляются поносом с быстро начинающимся обезвоживанием. В зависимости от физиологического развития животного, условий содержания и ухода, воздействия стресс-факторов, уровня об-семененности внешней среды условно-патогенными микроорганизмами болезнь протекала в сверхострой, острой и легкой формах.

Сверхострая форма характеризовалась повышением температуры тела, угнетением и быстрой гибелью животных в первые сутки после рождения без выраженных признаков диареи.

При острой форме на 2 — 3 сутки развивалась диарея (часто с примесью крови), развивалось обезвоживание (запавшие глазные яблоки, сухое носовое зеркальце, редкое или полное отсутствие диуреза, слабый тургор кожной складки). Температура понижалась до 36° - 37°С с последующей гибелью через 2-3 дня после появления симптомов.

Легкая форма характеризовалась кратковременной диареей. При этом общее клиническое состояние было удовлетворительным. Своевременное применение этиотропных и симптоматических средств способствовало выздоровлению.

При вскрытии 350 трупов павших животных с признаками острых кишечных заболеваний, отмечали характерную картину - содержимое кишечника жидкое с пузырьками газа, иногда с примесью крови, на слизистой оболочке кишечника отмечали множественные кровоизлияния и катарально-геморрагический гастроэнтероколит. Под эпикардом и

на эпикарде по ходу сосудов наблюдали кровоизлияния. Увеличение селезенки и застойные явления.

У телят из благополучной и неблагополучной по ОКЗ ферм изучали динамику заселения пищеварительного тракта микрофлорой в раннем постнатальном периоде и определяли ее количественный и качественный состав. Результаты исследования представлены в табл. 1.

1. Динамика заселения желудочно-кишечного тракта телят

Исследуемые животные Концентрация бактерий кишечного содержимого в различные сроки исследования

1 сутки 3-4 сутки 7-14 сутки

Телята из благополучной фермы E.coli — 1Сг бифидобактерии- 105 лактобациллы - 106 Бифидо- и лактобактерии -107 E.coli - 10 , Proteus, Staphylococcus - 103 Бифидо- и лактобактерии -10s-10ш, E.coli-104 Staphylococcus-103

Телята из неблагополучной фермы бифидобактерии 10J лактобациллы -104 E.coli — 106-107, Proteus -105, Staphylococcus 103104 Бифидо- и лактобактерии -103-104, E.coli - 105-106 Proteus -105, Staphylococcus 103-104 Бифидо- и лактобактерии-106-107 Exoli- 105-106 Proteus 105, Staphylococcus -105-106

Как видно из данных таблицы, контаминация условно-патогенными микроорганизмами отмечалась с первых часов после рождения.

У телят из благополучной фермы в первые сутки после рождения при бактериологическом исследовании вьвделяли эшерихий, протей, энтерококки - 103 и бифидо- и лактобактерии 105-106. На 3 - 4 сутки после рождения бифидобактерии и лактобициллы выделялись 10б - 108, число эшерихий возросло, выделяли протей, стафилококки в — 103.

К 7—14-дневному возрасту телят, при количественном подсчете микробных клеток, установлено, что бифидобактерии и лактобациллы содержались почти в равных соотношениях в концентрации Ю8-1010, число эшерихий более 100 млн, а популяций стафилококков и протея было в 2 раза меньше, что характеризует нормобиоз кишечника животных.

Развивающиеся под влиянием различных факторов нарушения в микробиоценозе чаще всего выражались в дефиците бифидобактерий и лактобацилл, увеличении популяционного уровня различных видов условно-патогенных микроорганизмов.

У телят из неблагополучной фермы концентрация условно-патогенной микрофлоры была достоверно высокой 10б — 107 по сравнению с данными, полученными от здоровых животных. В содержимом кишеч-

ника больных телят бифидобактерии и лактобациллы отсутствовали или находились в незначительных количествах (102-103).

Гематологические исследования крови у телят, благополучных по ОКЗ, существенных сдвигов в гемограмме не выявляли (табл. 2.).

2. Гематологические показатели телят периода новорожденности в совхозе «Ямской» Московской области

Возраст телят, дн. Гемоглобин, г/л Эритроциты, 10'"/л Лейкоциты, 10Ч/л

1 133±4,5 8,52±0,19 9,2±0,34

4 125±2,2 6,80±0,25 6,9±0,12

7 120±2,0 6,71 ±0,14 6,9+0,11

14 116±1,7 7,85±0,15 5,8±0,15

В первые 4 дня жизни в лейкоцитарной формуле преобладали клетки нейтрофильного ряда. Количество сегментоядерных нейтрофилов составляет до кормления 66,4±0,5%, а после первой выпойки молозива -61,0±1,5%. С 4-дневного возраста происходило явное преобладание лимфоцитов. К 14-дневному возрасту относительное количество лимфоцитов повысилось на 33,3% при снижении нейтрофилов на 52,2%. Гранулоциты базофильного ряда у новорожденных телят не обнаруживались. Со стороны моноцитов и эозинофилов заметных количественных изменений не установлено. Результаты исследования представлены в табл. 3.

3. Лейкоцитарная формула крови телят периода новорожденности в совхозе «Ямской» Московской области

Возраст телят, дн. Базо- филы, % Эозино-филы, % Нейтрофилы Лимфоциты, % Моноциты, %

юные, % палочко-ядерные, % сегменто-ядерные, %

1 - 1„9Ю,1 0,6±0,1 11,8±0,18 61,01:14 29,0±0,1 1,б±ао5

5 - 1,01=0,1 0,4Ю,05 5,9±0,05 39,01:14 58,(Ш)Д 1ДЬ0,05

10 - 1ДН),4 03±0,05 4,9±Д25 34,0£1,7 бз,шдз 1ДЩ08

14 - 1,7=Ю,08 - 4,&±0Д) 30,0±03 65ДЮД 1,1±0,05

У больных животных в первый день заболевания в крови отмечали снижение содержания гемоглобина (133 г/л - у здоровых и 98 г/л - у больных) и эритроцитов (7,5-8,52 млн./мкл — у здоровых и 6,9 млн/мкл — у больных). Это, видимо, связано с различной скоростью оседания эритроцитов, изменением их формы под действием токсинов энтеробак-терий. Количество лейкоцитов снизилось почти в 5 раз по сравнению со здоровыми телятами того же возраста и в среднем составило 1,9 тыс/мм3 крови. Также происходило снижение содержание гемоглобина, увеличивалось процентное содержание лимфоцитов, эозинофилов и умень-

шалось содержание сегментоядерных нейтрофилов. Количество моноцитов составило 2,5%, а палочкоядерных 6%. Результаты исследования представлены на рис. 1.

6% 3%

6%

0 Лимфоциты ■ Палочкоядерные нейтрофилы

□ Сегментоядерные нейтрофилы пЭозинофилы ■ Моноциты

1. Диаграмма белой крови у телят больных ОКЗ

В сыворотке крови больных телят отмечено значительное снижение общего белка.

При расчете коэффициента корреляции выявлена высокая положительная связь изученных показателей с патологическим состоянием у животных.

При бактериологическом исследовании фекальных проб от больных и патологического материала от павших животных (толстый и тонкий отделы кишечника, мезентериальные лимфоузлы, сердце, почки, селезенка), костный мозг, а также смывов из объектов внешней среды было выделено и идентифицировано большое количество микроорганизмов из семейства Еп1егоЬас1епасеае. Часто из одного и того же хозяйства от животных выделялись 3-4 вида патогенных бактерий, что свидетельствует об ассоциированном течении болезни. Такая форма течения болезни у животных указывает на высокую степень вирулентности, а также устойчивости и приспособляемости энтеробактерий к факторам внутренней среды организма животных.

Микробиологическими исследованиями было идентифицировано 1260 культур. При изучении тинкториальных, морфологических, куль-туральных и ферментативных свойств было установлено, что изучаемые культуры хорошо росли на обычных и дифференциально-диагностических средах. В мазках, окрашенных по Граму, наблюдали в основном грамотрицательную микрофлору. Результаты исследования представлены на рис. 2.

13

3%2% 4%

15%

21%

19%

□ Ecoli. ЕРВ2)

□ Salmonella

■ Biterococcus

■ Ffoteus

■ Citrobacter

□ Staphylococcus aureus

О K.pneumonlae a Pseudomonas

2. Видовой спектр выделенных изолятов

Анализ видового спектра изучаемых культур показал, что наибольшие количества выделенных изолятов из всех объектов относились к патогенным и энтеротоксигенным сероварам E.coli (28,1 %), Proteus (21,2%), Klebsiella pneumoniae (19,1%), Salmonella (15,3%), Citrobacter (8,2%), Staphylococcus (4%), Pseudomonas (3,1%), Enterococcus (2,1%). При серологической идентификации выделенных 1260 изолятов установлено, что среди отдельных родов наиболее часто в большинстве обсследованных регионах страны выделяли E.coli 09 (35,2 %); E.coli 0138 (28,4%); E.coli 0119 (18,7%); Klebsiella pneumoniae (78%); Salmonella dublin (25%); Salmonella enteritidis (31%); Salmonella typhimurium (29%); Proteus miurabilis (29%); Proteus vulgaris (53%).

Все выделенные изоляты энтеробактерий от больных и павших животных характеризовались высокой резистентностью к антибиотикам (гентамицину, сизомицину, бензилпенициллину, пефлоксацину, пиперациллину, кларитромицину, рокситромицину, эритромицину, офлоксацину, цефезолину, полимиксину, стрептомицину, тетрациклину, левомицетину).

Штаммы, у которых была доказана этиологическая роль в возникновении заболевания и ее исходе, а также с учетом их частоты регистрации в большинстве регионов были отобраны для дальнейших исследований. Всего было отобрано 30 культур у которых были изучены адгезивные, энтеротоксигенные, гемолитические и вирулентные свойства как основные факторы, определяющие их патогенность для животных.

Все штаммы E.coli, Salmonella, Klebsiella pneumoniae, Proteus обладали адгезивным антигенами (агглютинировали с антиадгезивными сыворотками К99, К88 и в ДМРГА).

При изучении токсигенных свойств было установлено, что E.coli 09, E.coli 0138, все штаммы Salmonella и Proteus продуцировали энтеротоксины и обладали гемолитической активностью. Штаммы Klebsiella pneumoniae характеризовались капсулообразованием, свидетельствующим о их патогенности.

Таким образом, отобранные штаммы характеризовались широкой распространенностью и наличием основных факторов патогенности, что было подтверждено при экспериментальном заражении лабораторных животных-гибель наступала через 24-72 часа.

В связи с тем, что в хозяйствах ОКЗ у молодняка преимущественно вызываются ассоциациями возбудителей, нами были проведены опыты по изучению патогенного действия различных сочетаний отобранных штаммов на здоровых лабораторных моделях. При заражении ассоциациями эшерихий сальмонелл и клебсиелл животные погибали в течение 10-12 часов; протеи сальмонеллы и эшерихии вызывали гибель через 7-8 часов после заражения.

В результате проведенных исследований установлено, что при смешанном инфицировании происходит усиление патогенных свойств, вызывая синегридный эффект.

Из 30 наиболее значимых в этиопатогенезе штаммов энтероба-ктерий для биотехнологических целей были отобраны 10 штаммов, обладающие более выраженной патогенностью, адгезивной и гемолитической активностью. Основные биологические характеристики штаммов представлены в табл. 4.

4. Биологические свойства производственных штаммов энтеробактерий

Штаммы Антигенные свойства Адгезивные свойства Вирулентные свойства

E.coli 09 К99 1,2x108

E.coli 0138 К88 4,6x107

E.coli Ol 19 - 2,8x10'

К. pneumoniae K8 ДМРГА + 3,1x10s

К, pneumoniae К2 ДМРГА + 1,3x10'

S. dublin 09 (I и 5 комплекс) H-p.g ДМРГА + 5,8x10s

S.enteritidis 09 (1 и 5 комплекс) H-g.m ДМРГА + 1,6x10'

S.typhimurium 04 (1 и 2 комплекс) и H-I ДМРГА + <3,2x10"

Pr. vulgaris 016 и Н6 ДМРГА + <2,4x106

Pr. mirabilis 013 и Н2 ДМРГА + <1,7x106

Для производственных штаммов важным является наличие признаков, обеспечивающих индикационную характеристику. Нами были проведены исследование по выработке маркировочных признаков путем

клонирования на селективных средах с добавлением антибиотиков. По результатам длительных селективных пассажей были выработаны генетически устойчивые признаки у всех отобранных штаммов — анти-биотикорезистетность, не изменяющаяся при длительном пассировании, как на питательных средах, так и при пассировании на лабораторных животных. Также были проведены исследования по изучению нуклеотидного состава. Результаты исследований представлены в табл. 5.

5. Результаты генетической идентнфнкации

Штаммы энтеробактерий Нуютеогидный состав Антибиотикорезистентность

Е.соН 09:К99 ДНК (%ГЦ) - 62, плаз, м.в. 84 МД стрептомицин, пефлоксацин, поли- МИКСИ11

E.coli 0138:К88 ДНК (%ГЦ) - 59,2 плаз, м.в. 76 МД эритромицин, сизомицин, рокситро-мицин

Е.соН 0119 ДНК (%ГЦ)- 58,1 плаз, м.в. 73 МД. цефезолин, левомицетин, рокситро-минин, сизомицин

К. pneumoniae ДНК (%ГЦ) - 56,8, плаз, м.в. 60МД бензилпенициллин, эритромицин,стрептомицин

К. pneumoniae ДНК (%ГЦ) - 57,9, плаз, м.в. 60МД и 2МД. эритромицин, левомицетин, стрептомицин

S. dublin ДНК(%ГЦ) — 52, плаз, м.в. 63 МД стрептомицин, роксотромицин, юго-ритромицин

S.enteritidis ДНК (%ГЦ)-53,1 плаз, м.в. 60 МД. бензилпенициллин, стрептомицин,

S.typhimurium ДНК (%ГЦ)- 53,1 содержит плаз. м.в. 64 МД, бензилпенициллин, эритромицин, стрептомицин,

Pr. vulgaris ДНК (%ГЦ) - 55,2 плаз, м.в. 64 МД. левомицитин, гентамицин, эритромицин

Pr. mirabilis ДНК (%ГЦ) - 54,0 плаз, м.в. 64 МД тетрациклин, пенициллин, стрептомицин, полимиксин

Полученные данные были использованы как генетические маркеры штаммов. Все 10 штаммов депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве под следующими номерами: Е.соН 0138:К88 №27; Е.соН 09:К99 №28; К.рпешпошае №23; К.рпеитошае №24; Р.уи^апБ №25; Р.тйаЬШБ №26; Б.ёиЫт №19; З.еШегШсИэ №22; Б^урЫтипит №14, предназначенных для изготовления иммунологических и диагностических препаратов. На все штаммы получены патенты на изобретение.

Таким образом, выделенные и идентифицированные по биологическим и иммуногенным свойствам штаммы энтеробактерий являются основными возбудителями кишечных инфекций, характеризуются

высокой вирулентностью и генетически устойчивыми признаками, позволяющими их дифференцировать от эпизоотологичееких изолятов, и могут быть использованы при производстве иммуннобиологических препаратов (диагностикумов и вакцин против эшерихиозов, сальмонел-лезов, клебсиеллезов и протейной инфекции).

Разработка антигенных эритроцитарных диагностикумов

Разработка эритроцитарных диагностикумов предусматривает ряд биотехнологичесих последовательностей: выбор метода и получение антигенов из производственных штаммов; получение референс-сыворо-ток к антигенам; подбор антигеноносителя и его стабилизация; оптимизация условий сенсибилизации эритроцитов; компоновка компонентов диагностического набора; разработка методов контроля и инструкции по применению; экспериментальные и производственные испытания и внедрение в ветеринарную практику новых тест-систем для диагностики и иммунологического мониторинга и прогнозирова-ния острых кишечных инфекций.

Выбор метода получения антигенов из производственных

штаммов

При разработке эритроцитарных диагностикумов первостепенное значение имеет получение растворимых антигенов, содержащих наиболее важные компоненты бактериальной клетки, необходимые для диагностических целей.

Для этих исследований было отработано несколько методов: экстрагирование антигенов трихлоруксусной кислотой по Буавену, водно-фенольная экстракция по Вестфалю, экстрагирование солянокислым гидроксиламином, водно-солевая экстракция и аутолиз. Проведенными исследованиями было установлено, что наиболее оптимальным и универсальным для всех штаммов методом получения растворимых антигенов с достаточной иммуногенностью является метод экстрагирования солянокислым гидроксиламином (ЭСГ) в нашей модификации, заключающийся в сокращении сроков инкубации за счет использования более ранней генерации (10-12 часового роста) культур энтеробактерий, выращенных на синтетической питательной среде, и оптимизации параметров отмывания и центрифугирования, а также подбора концентрации (48-50х109микр.кл./мл), установления расчетного количества гидроксиламина (0,05 мг на 109 микр.кл.), времени инкубации при 56° (48 часов) и перемешивания только в первые сутки

(2-4 раза в течение 10-15 минут). В результате оптимизации предварительных этапов нам удалось также сократить сроки диализа на 2-3 суток и повысить выход специфических антигенов в 3-3,5 раза.

Биохимический состав антигенов полученных, различными методами представлен в табл. 6.

6. Биохимический состав антигенов энтеробактерий, полученных ___ различными методами_

Метод Химический состав, % Штаммы

Е.соК 8а1топе11а К.рпситогмае РпЛеив

Солянокислый гидрокси-ламин Белок 46,0 -49,0 45,0-50,0 10,5-11,3 48,0-51,0

Углеводы 37,0-38,0 25,0-30,0 53,9-57,5 33,5-34,7

Лилиды 13,1-15,0 12,0-14,0 2,2-2,4 13,5-14,7

Нуклеиновые кислоты 4,3-4,6 2,0-3,0 3,5-3,7 4,5-5,0

% выхода 11-14% 12-15 10-15 12-15

По Буа-всну (ТХУ-ки-слота) Белок 28,0-30,0 18,0-20,0 - 29,5-31,1

Углеводы 51,0-53,0 35,0-45,0 - 52,8-54,0

Липиды 11,0-13,0 8,0-8,5 - 14,0-15,1

Нуклеиновые кислоты 0,45-0,62 1,5-2,0 - 0,53-0,68

% выхода 4,1-4,3 4,0-4,5 - 4,2-4,5

Водно-солевая экстракция Белок - 50,0-55,0 - -

Углеводы - 27,0-30,0 - -

Липиды - - - -

Нуклеиновые кислоты - 5,0-7,0 - -

% выхода - 3,0-5,0 - -

По Вест-фалю (вода-фенол) Белок 10,0-11,0 - - 9,8-10,4

Углеводы 35,5-37,0 - - 34,2-35,8

Липиды 8,0-9,0 - - 8,1-9,0

Нуклеиновые кислоты 9,6-10,1 - - 10,5-10,9

% выхода 4,6-4,9 - - 4,5-4,8

Водная экстракция Белок - - 21,5-23,1 -

Углеводы - - 51,4-56,2 -

Липиды - - 1,7-1,9 -

Нуклеиновые кислоты - - 1,5-1,8 -

% выхода - - 3-5 -

Ауголиз Белок - - 11,6-12,4 -

Углеводы - - 43,0-46,8 -

Липиды - - 1,8-2,0 -

Нуклеиновые кислоты - - 2,1-2,5 -

% выхода - - 4-6 -

По содержанию белков и суммы углеводов и липидов можно косвенно судить о наличии в растворимом препарате основных антигенов клеточной стенки: О- и Н — антигенов эшерихий, сальмонелл и протеев, а высокое содержание углеводов в клебсиеллезном антигене вероятнее всего свидетельствует о присутствии кислых капсульных полисахаридов.

Из данных таблицы видно, что наиболее оптимальным методом получения растворимых антигенов является усовершенствованный метод дезинтеграции клеток солянокислым гидроксиламином. Этот метод не только позволяет получать препараты с наилучшими соотношениями антигенов клеточной стенки, но и является наиболее экономичным и технологичным, обеспечивает более высокий выход чистого антигена.

Получение референс-сывороток к антигенам энтеробактерий

Одним из важных компонентов тест-системы являются положительные сыворотки (референс-сыворотка), предназначенные для контроля чувствительности и специфичности эритроцитарных диагнос-тикумов. Было испытано несколько схем иммунизации, при которых в качестве антигенных препаратов использовали как растворимые антигены, стимулирующие первичный иммунный ответ (ГА-антигены), так и корпускулярные препараты, полученные путем тепловой обработки или инактивированных мертиолятом взвеси суточных агаровых культур штаммов, а также живые культуры. Для разных видов микроорганизмов схемы иммунизации были различными, в зависимости от степени патогенности их для иммунизируемых животных, а также иммуногенности конкретных штаммов. Инактивированные антигены эшерихий оказались менее иммуногенными, в связи с чем для иммунизации были использованы живые культуры. Для получения гипериммунных сальмонеллезных сывороток не применяли корпускулярные антигены, ввиду высокой вирулентностью и использовали растворимые антигены сальмонелл.

По результатам проведенных исследований нами были разработаны методы иммунизации кроликов, обеспечивающие получение высокоактивных и специфичных референс-сывороток с титрами антител 1:5120 и выше у 100% иммунизированных кроликов Схемы иммунизации представлены в табл. 7.

7. Схемы получения гипериммунных сывороток к энтеробактериям

Штаммы Вид и доза антигена по срокам иммунизации

1 день 7 день 11 день 15 день 22 день 26 день 30 день

E.coli ГА 50 мга- ГА 50 мкг ЖК ЖК ЖК ЖК ЖК

1,0x10' 1,5x10' 3,5x10' 2,0 х10' 4,0 х10'

Proteus ГА 30 мкг ГК 0,5x10' ГК 1,0x10' ГК 2,0x10' - - -

К. pneu- ГА ГК ГК ГК ГК ГК ГК

monac 30 мкг 0,5x10' 1,0x10' 2,0x10' 1,5x10' 3,0x10' 5,0x10'

S. dublin и ГА 30 мга- ГАЗО ми- ГАЗО мга- ГА 100 мга- ГА 100 ГА 100 мга- ГА 200

S.enteritidis мкг мга-

S. typhi- ГА 20 мкг ГА 20 мкг ГА 20 мкг ГА 50 мкг ГА 50 мкг ГА 150 мкг ГА 150

murium мкг

Примечание: ГА - растворимый антиген, полученный путем дезинтеграции гидроксаламином; ГК — корпускулярный антиген; ЖК — живая культура.

Специфичность гипериммунных сывороток проверяли в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с гомологичными и гетерологич-ными антигенами.

В результате проведенных исследований было установлено, что клебсиллезные сыворотки давали перекрестные реакции с культурами Salmonella в титре 1:160 - 1:1280 и Е. coli 09:К99 в титре 1:320, а также наблюдали внутривидовые перекрестные реакции между двумя штаммами К. pneumoniae при этом титры были достаточно высокими 1:1280 -1:2560.

Гипериммунные сыворотки Pr. vulgaris и Рг. mirabilis давали перекрестные реакции с двумя штаммами К. pneumoniae в титре 1:160 1:1280, S.dublin и S.enteritidis 1:160-1:320, E.coli 0119 в титре 1:640.

Кроме того, отмечены перекрестные реакции между двумя видами Proteus, в титре 1: 5120.

У сальмонеллезных гипериммунных сывороток также отмечали выраженную реакцию между штаммами S. dublin, S. enteritidis и S. typhimurium в титрах 1:640 - 1:2560, а также они давали перекрестные реакции с гетерологичными культурами Е. coli 0138:К88 в титре 1:160.

Более специфичными были эшерихиозные гипериммунные сыворотки, которые не давали внутривидовых перекрестных реакций. Существенных различий в титрах антител между нативными сыворотками и инактивированными в течение 1 часа при 56° С не было отмечено.

Для получения строго специфических сывороток нами были проведены исследования по адсорбции — удаление гетерологичных антител из сыворотки с помощью специфических антигенов-адсорбентов. В качестве адсорбентов использовали суточные культуры гетероло-

гичных штаммов энтеробакгерий и растворимые антигены.

Насыщение сыворотки проводили взвесью нескольких интенсивно реагировавших штаммов, что приводило к снятию агглютининов к остальным гетерологичным штаммам. Полноту адсорбции проверяли в РА с гипериммунными сыворотками. После пятого этапа адсорбции нам удалось убрать межвидовые перекресты и получить строго специфические сыворотки. Однако внутривидовые перекрестные реакции между сероварами штаммов KLpneumoniae, Salmonella, Рг.vulgaris и Pr.mirabilis сохранялись в титрах 1:160 и выше.

Таким образом, нами были получены специфические референс-сыворотки: поливалентные сальмонеллезные сыворотки с титром 1:20480; поливалентные клебсиеллезные референс-сыворотки с титром 1:10240; поливалентные протейные референс-сыворотки с титром 1:20480 и моновалентные эшерихозные референс-сыворотки к серова-рам: Е. coli Ol 19 с титром 1:10240; Е. coli 09:К99 с титром 1:5120; Е. coli 0138:К88 с титром 1:10240.

Одной из основных характеристик антигенов, используемых в качестве гемосенситинов, является их антигенный состав. Проведенные исследования методом иммунодиффузии в агаровом геле по Оухтерлони позволили установить антигенный состав растворимых антигенов энтеробактерий.

Результаты представлены на рис. 3.

1. К. pneumoniae 23 (кр.4)

2. К. pneumoniae 24 (кр. 1)

3. К. pneumoniae 23 (кр.5)

4. К. pneumoniae 24 (кр.2)

5. К. pneumoniae 23 (кр.б)

6. К. pneumoniae 24 (кр.З)

5. К. pneumoniae 23 (кр.б)

6. Е. coli Ol 19

1. К. pneumoniae 23 (кр.4)

2. Е. coli К88

3. К. pneumoniae23 (кр.5)

4. Е. coli К99

Рис. 3. Специфичность антигена К. pneumoniae 23 в РИД

(антиген К. pneumoniae 23 - в центре)

1. К. pneumoniae 23 (кр.4)

2. К. pneumoniae 24 (кр. 1)

3. К. pneumoniae 23 (кр.5)

4. К. pneumoniae 24 (кр.2)

5. К. pneumoniae 23 (кр.6)

6. К. pneumoniae 24 (кр.З)

1. E.coli К88

2. K.pneumoniae 24 (кр. 1)

3. E.coli К99

4. K.pneumoniae 24 (кр. 2)

5. E.coli Ol 19

6. K.pneumoniae 24 (кр. 3)

Рве. 4. Специфичность антигена К. pneumoniae 24 в РИД

(антиген К. pneumoniae 24 - в центре)

В результате проведенных исследований было установлено, что антигены эшерихий образовывали линии преципитации, соответствующие О- и Н — антигенам эшерихий только с гомологичными сыворотками, т.е. обладали строгой специфичностью. Антигены Рг. vulgaris и Pr.mirabilis не образовывали линии преципитации с гетерологичными сыворотками, гипериммунные кроличьи сыворотки, полученные нами, давали с гомологичными антигенами по две линии преципитации. Наблюдались перекресты и между различными штаммами Salmonella, по-видимому это связано с наличием в их антигенной формуле родственных О- и Н - антигенов. Антигены К. pnemoniae образовывали линии преципитации как с гомологичными клебсиеллезными сыворотками, так и с сыворотками ко второму штамму К. pneumoniae, причем, если с гомологичной сывороткой антигены образовывали по 2 линии преципитации (K-антиген и, вероятно, общая для обоих штаммов нейтральная фракция полисахарида), то с гетерологичным клебсиеллезным антигеном образовывалась только одна линия преципитации, причем концы линий преципитации у гомологичных и гетерологичных препаратов сливались, что указывает на идентичность антигенов.

Важным этапом при разработке РНГА тест-систем является носитель антигенов. В широкой практике чаще всего для этих целей используют эритроциты барана. Они являются наиболее пригодными корпускулярными носителями и успешно конкурируют с искусствеи-

Подбор антигеноносителя и его стабилизация

ными частицами (полистирол, поликриламид и т.д.) за счет наличия биологически активных эпитопов.

С целью выбора оптимального метода стабилизации эритроцитов было проведено сравнительное изучение четырех методов формалини-зации: Фили (1958), П.И.-Шмугера М.Ф. (1969), Вайнбаха (1958), Вайнбаха в модификации НИЛИПиБ. Наиболее приемлемым для нас оказался метод Вайнбаха в нашей модификации (2006), которая заключалась в том, что формалинизацию эритроцитов проводили в течение 17 час, вместо 20 и встряхивали их первые 2 часа и последний час через каждые 15 мин, вместо постоянного перемешивания на магнитной мешалке. В модифицированном методе соотношение формалина и эритроцитов было 1:4 (у Вайнбаха — 1:3). Для консервации формалинизированных эритроцитов использовали 1% -ный формалин, вместо рекомендуемого раствора мертиолята 1:10000. Результаты исследования представлены в табл. 8.

8. Влияние различных методов формалинизацин эритроцитов на чувствительность РНГА

Гемосенситин Метод формалинизацин

По Меньшову-Шмутеру По Фили По Вайнбаху Модификации НИЛИПиБ

Е. coli 0138:К88 1:1280 <1:1280 1:5120 1:10240

Е. coli 09:К99 1:640 >1:640 1:2560 1:5120

Е. coli Ol 19 1:1280 1:1280 1:5120 1:10240

K.pneumoniae №23 1:640 1:640 1:1280 1:1280

K.pneumoniae №24 1:1280 <1:1280 1:5120 1:10240

S. typhimurium 1:1280 1:5120 >1:10240 1:10240

S. enteritidis . 1:640 1:1280 1:2560 1:5120

S. dublin 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240

Pr. mirabilis 1:1280 1:640 1:1280 1:5120

Pr. vulgaris 1:5120 1:2560 1:5120 1:10240

Из данных таблицы видно, что эритроциты, стабилизированные по методу Вайнбаха в модификации НИЛИПиБ, являются наиболее активными.

Формалинизированные эритроциты хранили в холодильнике при температуре (5±3) °С в течение 3—5 лег. В течение указанного срока наблюдения не было отмечено изменения каких-либо свойств эритроцитов.

Оптимизация условий сенсибилизации эритроцитов

Процесс сенсибилизации эритроцитов включает в себя нагрузку

формалинизированных эритроцитов антигенами.

Для приготовления эритроцитарных диагностикумов нет рациональных методов и режимов, и в каждом конкретном случае подбираются они индивидуально.

При сенсибилизации эритроцитов учитывали такие факторы, как доза сенситина, температура, рН растворов и концентрацию эритроцитов.

Избыточная, как и недостаточная доза антигена, может привести к неспецифической агглютинации эритроцитов, а недостаточная, кроме того, не обеспечивает максимальной активности препарата. Для выбора сенсибилизирующей дозы в применении к конкретным антигенам энтеробактерий отрабатывали сенсибилизацию эритроцитов различными дозами: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 мг на 10 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов. Критерием оценки эффективности методов сенсибилизации служили чувствительность, величина ОСД и расход сенситина.

Для отработки оптимальной концентрации взвеси формалинизированных эритроцитов при нагрузке их антигенами испытаны концентрации: 5%; 10%; 15%; 20% эритроцитов барана. Наилучшие результаты удалось получить при использовании 5%-ной концентрации. С увеличением дозы антигена происходило нарастание титра РНГА (повышалось количество прочно связанного антигена) до определенной пороговой концентрации антигена, которая в нашем опыте равна 1,0 мг на 10 мл 2,5%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов. При увеличении сенсибилизирующей дозы активность диагностикумов не только не возрастала более, но и в некоторых случаях даже снижалась. Такое снижение происходило, вероятно, от того, что избыточный, а потому непрочно связанный с носителем, антиген связывался с антителами сыворотки, но при этом не образовывался прочный комплекс «носитель — аниген — антитело», а потому не возникало визуальной агглютинации. Следовательно, увеличение количества антигена разумно до определенного предела, переход за который не приводило к увеличению чувствительности РНГА.

Для изучения роли температурного фактора на сенсибилизацию эритроцитов антигенами исследованы следующие параметры: 24°С, 37°С, 45°С и 55°С. Результаты представлены на рис. 5.

ГС

5. Влияние температуры на степень сенсибилизации эритроцитов

Из данного рисунка видно, что температура 37°С является наиболее оптимальной для проведении сенсибилизации эритроцитов.

Влияние рН среды на процесс сенсибилизации эритроцитов значение рН было изучено в диапазоне: 4,0; 5,0; 6,0; 7,2. Полученные результаты приведены на рис. 6.

Из данных рисунка видно, что оптимальное значение рН находится в пределах 6,0-7,2 ед.

6000

-Титры

6. Зависимость уровня сенсибилизации от рН среды

Для различных антигенов методы сенсибилизации носителя могут существенно отличаться и от продолжительности сенсибилизации, которая может варьировать в достаточно широких пределах.

В своих исследованиях нами была изучена зависимость взаимодействия антигенов энтеробактерий с формалинизированными эритроцитами при экспозиции 60, 90,120 и 180 минут.

При отработке оптимального времени сенсибилизации эритроцитов за рабочую дозу антигена принимали дозу, равную 1,0 мг на 10 мл 2,5%-ной эритроцитарной взвеси. Взаимосвязь чувствительности РИГА и длительности сенсибилизации формапинизированных эритроцитов представлена на рис. 7

Время, мин

I ♦ ■ Ecoti 0119 —■—EeoliK99 ■ * " Е coti К8В |

7. Зависимость чувствительности РНГА от длительности сенсибилизации формалиниэированных эритроцитов антигенами E.col¡.

Как видно из приведенных графиков, активность полученных диаг-ностикумов практически не менялась в интервале времени от 0 до 60 минут, затем возрастала с увеличением времени сеансибилизации в интервале от 60 до 120 минут, после чего активность полученных препаратов практически не менялась. Аналогичные результаты были получены нами и для остальных испытанных антигенов энтеробактерий.

Таким образом, время сенсибилизации эритроцитов целесообразно ограничить двумя часами.

На основе разработанных технологических параметров получения отдельных компонентов антигенных эритроцитарных диагностикумов были изготовлены экспериментальные серии эритроцитарных диагнос-тикумов: эшерихиозные к сероварам Е. coli 09:К99; Е. coli 0138:К88; E.coli 0119; S.dublin; S.enteritidis; S.typhimurium; K.pneumoniae №23; K.pneumoniae №24; Pr.vulgaris; Pr.mirabilis. Контроль чувствительности и специфичности наработанных диагностических наборов проводили в

РНГА с гипериммунными сыворотками ко всем изученным штаммам. Результаты представлены в табл. 9.

9. Титры антител гипернммунных сывороток в РНГА с гомологичными и гетерологичнымн диагностикумами

Сыворотки Диагностикумы

P.mi-rabilis P. vulgaris E.coli 09:K9î E.coli 3138:K 88 E.coli 0119 S. dublin S.typh S.ent K.pn. №23 K.pn. №24

Pr.mirabilis 20480 2560 80 40 80 80 40 40 40 40

Pr. vulgaris 2560 10240 20 20 160 20 20 20 160 80

S.dublin <20 <20 20 20 20 20480 1280 5120 20 20

S.typhim. <20 <20 <20 <20 <20 80 10240 5120 <20 <20

S.enter. <20 20 <20 20 <20 5120 320 10240 <20 20

E.coli 09:K99 20 20 5120 40 40 20 40 40 <20 <20

E.coli 0138:K88 20 20 20 10240 20 20 40 20 <20 <20

E.coli 0119 <20 <20 20 20 10240 20 <20 20 <20 <20

K.pneum №23 80 80 20 40 40 40 40 20 5120 640

K.pneum №24 160 80 160 40 160 20 40 <20 2560 10240

Из данных таблицы видно, что титры антител к гомологичным штаммам E.coli составляли 1:5120 и выше, в то время как к гетеро-логичным антигенам были не выше 1:160, т.е. эшерихиозные диагно-стикумы являются чувствительными и высокоспецифичными препаратами. В то же время диагностикумы, сенсибилизированные двумя клебсиеллезными антигенами, давали перекрестные реакции в достаточно высоких титрах (до 1:2560-1:5120), что может быть следствием наличия перекрестов между нейтральными фракциями кислых полисахаридов обоих штаммов клебсиелл, присутствующих в гидроокси-ламиновых препаратов антигенов. Значительные внутривидовые перекресты выявлены также между различными видами сальмонелл. Вероятно, это обусловлено тем, что согласно современной классификации все три вида сальмонелл, используемые нами в работе, принадлежать одному виду сальмонелл: Salmonella choleraesuis. Существенные перекресты обнаружены также между сыворотками и антигенами Pr. vulgaris и Рг. mirabilis.

С целью дальнейшего изучения иммунологических свойств, полученные антигены и сыворотки были испытаны в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА). Результаты представлены в табл. 10.

10. Минимальные нейтрализующие дозы антигенов знтеробактерий (мкг) в РТНГА с гипериммунными сыворотками

Антигены Сыв-ки Pr.vulg Pr.mir. S.dublin S.typh S.enter E.coli K99 E.coli K88 E.coli 0119 K.pn. №23 K. pn. №.24

Pr.vulgar. l:10r' >50 >50 >50 >50 25 >50 >50 >50 >50

Prjnirab. >50 8x10"' >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 50

S.dublin >50 >50 2x10"' 3,12 5x10"' >50 >50 12,5 1,6 1,6

S.typhimur. >50 >50 >50 5x10" 12,5 >50 >50 >50 12,5 >50

S.entcrit >50 >50 12,5 >50 1x10"' >50 >50 >50 12,5 25

E.coli K.99 >50 >50 >50 >50 >50 8x10"' >50 >50 >50 >50

E.coli K88 >50 3,12 >50 >50 >50 >50 8x10"' >50 12,5 >50

E.coli 0119 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 8x10"' >50 >50

K-pneum. №23 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 8x10"' 3,12

K..pneum. №24 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 >50 4x10'' 1x10"'

Полученные результаты в РТНГА свидетельствуют о высокой специфичности полученных эшерихиозных сывороток и антигенов. Антигены обоих штаммов протея также реагировали только с гомологичными сыворотками; в то время как минимальные нейтрализующие дозы (МНД) антигенов с гетерологичными сыворотками составляли 2550 мкг и более, МНД протейных антигенов с гомологичными сыворотками составляла 1-8 хЮ1.

Антигены обоих штаммов клебсиелл реагировали не только с гомологичными сыворотками, но и с сыворотками к другим штаммам K.pneumoniae, что подтверждает наличие общих антигенов, выделяемых при помощи солянокислого гидроксиламина. Результаты РТНГА с гипериммунными сыворотками к другим энтеробактериям укладываются в пределы ошибки метода (1-2 разведения). Аналогичные данные получены и при испытании сальмонедлезных сывороток и антигенов.

Обнаруженные перекресты в РНГА, РТНГА и результаты, полученные после адсорбции гипериммунных контрольных сывороток, обусловили необходимость объединения антигенов и изготовление поливалентных диагностикумов к бактериям родов Proteus, Salmonella и виду Klebsiella pneumoniae и моновалентных эшерихиозных диагностикумов к сероварам E.coli К99, E.coli К88, E.coli 0119.

Таким образом, на основании разработанных технологических параметров были наработаны экспериментальные серии моновалентных диагностикумов к трем сероварам эшерихий и поливалентные эритро-цитарные сальмонеллезные, клебсиеллезньте и протейные диагности-

кумы (всего 6 наборов).

Экспериментальные серии эритроцитарных диагностикумов к энтеробактериям были подвергнуты государственным испытаниям в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории и межобластных ветеринарных лабораториях (приказ Департамента ветеринарии МСХ РФ №30 от 20.11.2002г). По результатам испытаний все наборы были рекомендованы применения в ветеринарной практике для диагностики, иммунологического мониторинга и эпизоотологи-ческого прогнозирования ОКЗ у молодняка животных производственных испытаний

Производственные испытания

Наборы экспериментальных серии эритроцитарных диагностикумов к энтеробактериям были испытаны при изучении иммунного фона у животных (коров и свиней), иммунизированных вакциной ассоциированной инактивированной против колибактериоза, сальмонеллеза, клеб-сиеллеза и протейной инфекций молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей (вакцина ОКЗ), неимуннизированных коров и свиней, а также 3-6- месячных телят.

Одновременно диагностикумы испытывали со стандартными гипериммунными сыворотками (листериозные, паратуберкулезные и бруцеллезные), используемыми в качестве контроля. Результаты исследования представлены в таб. 11.

11. Специфическая активность эритроцитарных диагностикумов в РНГА с различными сыворотками в сравнения с пуллорным эрнтроцнтарпым

антигеном

Пробы сыворотки крови Титры в РНГА с эритроцитарными диагностикумами

РкЯсиз ККрпсиш Е.соН 0119 Е. соИ 0138: К88 Е. соН 09: К99 5а1то-пеЦа Пушкрный эршроци-тарный

1 2 3 4 5 6 7 8

От вакцинированных коров 1:640 1:640 1:640 1:1280 1:1280 1:1280 1:160

От интактных коров 1:160 1:80 1:40 1:80 1:40 1320 1320

От телят 3-6 месяцев 1:10 1:40 1:10 1:40 1:10 1:10 120

От вакцинированных свиней 1:320 1:640 1:640 1:1280 1:640 1:1280 1:160

Диагностическая листери-озная <1:10 1:10 <1:10 1:10 1:10 <1:10 <1:10

Диагностическая бруцеллезная 1:80 1:80 1:40 1:160 1:20 1:10 1:40

1 2 3 4 5 6 7 8

Диагностическая парату-беркулезная 1:80 1:80 1:80 1:320 1:20 1:640 1:40

Контроль с эритроцитами оарана отр. отр. отр. отр. отр. oip сир

Из данных таблицы видно, что эритроцитарные диагностикумы выявляют в сыворотках крови вакцинированных животных антитела в достаточно высоких титрах от 1:320 до 1:1280, в сыворотках крови неиммунизированных животных титры были на уровне 1:40-1:160, в сыворотках крови неимуннизированных телят титры антител выявлялись на уровне 1:20—1:40.

Контроль со стандартными сыворотками и эритроцитарными диаг-ностикумами давал фоновый уровень антител, что свидетельствует о необходимости более тщательного подхода при подборе доноров для референс-сывороток.

Таким образом, разработанные антигенные эритроцитарные диагностикумы к трем сероварам Е. coli 09:К99, Е. coli 138 К88, Е. coli 0119, K.pneumoniae, Proteus, Salmonella характеризуются высокой активностью и специфичностью и могут быть использованы для диагностики, эпизоотологического мониторинга и прогнозирования кишечных инфекций, вызываемых энтеробактериями.

Одним из основных моментов при профилактике острых кишечных инфекций является оценка эффективности применяемых вакцинных препаратов, а также оценка уровня защитного иммунного фона у животных, знание которых позволяет прогнозировать эпизоотологи-ческую ситуацию в конкретном хозяйстве и своевременно проводить соответствующие ветеринарные мероприятий. В этой связи были проведены исследования по определению иммунного фона у глубокостельных коров, вакцинированных за 40-60 дней до отела вакциной ОКЗ и у новорожденных телят. Результаты исследования представлены в табл. 12.

12. Титры антител к энтеробактериям в сыворотках крови вакцинированных коров в динамике

Диагностикумы Средние титры у коров Титр AT молозиве Титр AT у нов. телят (Здень)

фон 14 день 21 день

1 2 3 4 5 6

Proteus 105,1±5,2 258,8±7,3 921,2±8,6 718,4±6,2 612,3±6,8

E.coli 09:К99 55,9±3,8 100,6±6,9 195,0±5,6 162,9±5,9 137,6±5,8

E.coli0138:K88 152,9±6,1 649,4±8,3 1581,2±12,7 839,2±7,5 615,2±7,1

1 2 3 4 5 6

E.coli 0119 97,6±5,3 147,1 ±7,1 202,3±8.3 171,3±3,7 132,3±5,8

K.pneumoniae 155,3±6,5 917,6±7,9 1307,4±11,8 936,8±6,9 691,1±9,7

Salmonella 150,0±6,2 397,3±6,1 526,5±11,1 405,ftt9,l 241,2±5,4

Представленные данные свидетельствуют о высокой иммуногенной активности вакцины ОКЗ. У всех вакцинированных животных установлено достоверное нарастание уровня антител ко всем штаммам, входящим в состав вакцины (р<0,05). Уровень накопления антител в молозиве был также достаточно высоким (исследование молозива 1-го дня). У новорожденных телят, получавших молозиво от вакцинированных животных, уровень AT был существенно ниже. Это свидетельствует о преимущественном участии энтеробактерий в местной защите путем адгезии на рецепторах эпителиальных клеток слизистой кишечника.

Таким образом, РИГА - диагностикумы позволяют проводить оценку иммунного фона у животных, что позволяет оценить эпизоотическое состояние и своевременно организовать проведение общих и специальных ветеринарных мероприятий.

Сравнительные исследования бактериологической диагностики ОКЗ и результатов серологических исследований (РИГА) по уровню титров антител показали возможность использования РНГА теста для ранней и ретроспективной диагностики кишечных инфекций.

Исследования проводили на больных и здоровых телятах старше 5 — дневного возраста, полученных от невакцинированных коров. Сыворотки крови исследовали в сроки: 2 — 4; 7 — 8; 15 — 16и30 — 31 дни болезни (далее — 1, 2, 3 и 4 сроки взятия крови). В опыт отбирали телят в возрасте 5-12 дней. Результаты исследования представлены на рис. 8.

1400 1200 _ 1000 а. 800 s 600 " 400 200 0

E.coli —■—Salmonella —6—К. pneum. —М—Proteus

дни

8. Титры антител в сыворотках крови от больных телят в динамике

Из данных графика видно, у телят, от которых были выделены патогенные культуры энтеробактерий (бактериологический диагноз считали положительным при выделении патогенных культур из фекалий не менее 106 микр. кл/г), титры антител к гомологичным штаммам существенно повышались (до 1:320 - 1:640) на 12-14 день.

При мониторинге иммунного фона у неиммунизированных коров (рис. 9) кривые распределения титров антител в сыворотках крови были на уровне нормальных величин (1:80-1:160), что подтверждает возможность широкого использования предложенных нами РНГА-тестов для проведения иммунологического мониторинга. Аналогичные результаты были получены и при испытании других диагностикумов.

40 -

i 35 -

5 зо- ---

В/^у.

о 50 100 150 200 250 300 350

обратные титры антител

[ > ЭЛурЫпц^ит И —5с1иЬЛп ■ А З.еШепВсИз |

9. Распределение титров антител к сальмонеллам у здоровых невакцинированных коров

При массовых исследованиях по выявлению защитного иммунного фона (стадного иммунитета) у животных, а также оценки эффективности иммунобиологических препаратов против О КЗ определяют средний титр антител к антигенам. Для исследований необходимо брать пробы сывороток крови от не менее 10% животных данного хозяйства или региона.

В результате проведенных массовых исследований нами определены средние значения титров антител, характеризующие эпизоотологичес-кое состояние в хозяйстве (регионе). Средний уровень титров антител у животных равный 1:160 и ниже, является фоновым, не обеспечивающим защиту от возникновения кишечных заболеваний инфекционной природы. Титр 1:320 и выше является достаточным для защиты от

инфекций, вызываемых энтеробактериями.

При постановке диагноза на острые кишечные инфекции по результатам исследований сывороток крови в РНГА — титры испытуемой сыворотки 1:320 и выше следует считать как положительный результат, свидетельствующий о роли энтеробактерий в заболеваемости животных, титр 1:160 как сомнительный результат, а титр 1:80 и менее оцениваются как отрицательный результат. В хозяйствах с массовыми респираторно-кишечными заболеваниями рекомендуется у животных с титром антител менее 1:320 исследовать парные пробы сывороток, полученные с интервалом 10-15 дней и при нарастании титра антител в 3 и более раз результаты оценивать как положительные на эшерихиоз, сальмонеллез, клебсиеллез или протейную инфекцию.

Усовершенствование средств специфической профилактики

В связи с изменением эпизоотической роли некоторых штаммов энтеробактерий в этиопатогенезе ОКЗ, а также установлением отдельных случаев осложнений у животных на фоне применения вакцины ассоциированной инактивированной против колибактериоза, сальмо-неллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей (вакцина ОКЗ) в хозяйствах неблагополучных по острым кишечным инфекциям, нами были проведены исследования по изучению причины реактогенности вакцины и методы их устранения.

Исследования были направлены на изучение как самой вакцины, так и всех компонентов, входящих в ее состав, путем дефракцианирования на составляющие. Каждую полученную фракцию испытывали на лабораторных животных, глубокостельных коровах и телятах.

Эпизоотологическими данными и анализом антигенного состава вакцины ОКЗ установлено изменение структуры эпизоотологически значимых штаммов в этиопатогенезе кишечных заболеваний. Из числа 9 штаммов, входящих в состав вакцины, установлено, что сальмонеллы и клебсиеллы не в полной мере обеспечивают защиту от патогенных эпизоотических изолятов, выделенных от больных животных. С учетом данных эпизоотического мониторинга нами были наработаны экспериментальные серии вакцины с заменой всех трех штаммов сальмонелл и одного штамма клебсиелл на новые штаммы. В состав вакцины были введены штаммы: Б. ёиЪИп №19, Б. еШегШсЦэ №22, Б. 1урЫтипит №14 и штамм К.рпешпошае №24, играющие существенную роль в патологии молодняка животных, обладающие более выраженными иммуноген-

ными свойствами и чаще выделяемые во всех обследованных нами регионах РФ.

Также были проведены исследования по оптимизации антигенной нагрузки на вакцинированных животных, не снижая протективной активности вакцины. Установлено, что при введении в состав вакцины новых штаммов дозы 5 мл для коров; 1,0 мл для телят с общей концентрацией 13,5 млрд. вместо ранее рекомендуемых доз 7 мл и 1,5 мл с концентрацией 17 млрд микробных клеток в 1мл, обеспечивают выработку иммунных антител, достаточных для защиты от возникновения заболевания.

Результаты сравнительных экспериментальных исследований вакцин ОКЗ представлены в табл. 13.

13. Результаты экспериментальных исследований усовершенствованной вакцины ОКЗ на лабораторных моделях (белые мыши)

Испытуемые вакцины Содержание млрд. мк. клУмл в вакцине Доза вакцины Заражение вирулентны Е.<Н-8.+КЬ+ Рг ча ми культурами рез 14 дней Средний титр антител

голов выжило пало

абс. % абс. %

Ватина ОКЗ (ТУ-1988) 17 0,7 мл 20 19 95 1 5 800

13,5 0,7 мл 20 17 85 3 15 400

Контроль плацебо 0,7 мл 20 1 5 19 95 -

Вакцина ОКЗ (ТУ-1999) 17 0,5 мл 20 20 100 - - 800

13,5 0,5 мл 20 19 90 1 5 800

Контроль плацебо 0,5 мл 20 0 - 20 100 -

Полученные результаты свидетельствуют, что усовершенствованная вакцина с новым антигенным набором обладала более высокой протективной активностью при инфицировании контрольными вирулентными культурами. Установлено, что после контрольного заражения смесью вирулентных штаммов э нтероб актер и й в дозе 250 млн. мк кл, (в равных соотношениях каждого штамма) в объеме 0,25 мл внутри-брюшинно протективная активность усовершенствованной вакцины была более высокой, обеспечивая 90-100%-ную сохранность среди вакцинированных животных. Проведенные иммунологические исследования поствакцинального иммунитета также свидетельствовали о достаточно высоком уровне титров антител ко всем антигенам, входящим в состав вакцины ОКЗ (на 20-й день после вакцинации).

Сравнительные испытания вакцины ОКЗ проводили и в производственных условиях хозяйств Московской области неблагополучных по острым кишечным заболеваниям. Установлено, что усовершенствованная вакцина не вызывала побочных реакций (была безвредна).

В то же время вакцина ОКЗ (ТУ-9384-022-00008064-98) при иммунизации в неблагополучных хозяйствах у отдельных животных (13%) вызывала реактогенность с симптомами аллергии (замедленного типа). У животных после введения вакцины через 30-40 минут наблюдается учащенное дыхание, судороги задних конечностей, слюнотечение и т.д.

Установлено, что реактогенность на вакцину ОКЗ связана с сенсибилизацией животных продуктами жизнедеятельности, а также на антигенные компоненты бактериальных клеток.

Для более глубокого изучения нами были проведены исследования на наличие в вакцине токсинов и энтеротоксинов (типов А и В, термолабильные и термостабильные) кишечной палочки, сальмонелл, протей.

Для выявления токсической субстанции вакцина была дефракцио-нирована на фракции по молекулярной массе с использованием фильтра РМ-10 Амикон. Вакцину центрифугировали для отделения фракции содержащей гидроокись алюминия и сорбированные на ней антигенные субстанции и была обозначена как фракция №3. Осветленную фракцию, не содержащую гидроокись алюминия, пропускали через милипоров-ский фильтр РМ-10 фирмы Амикон.

В результате нами были получены две фракции: низкомолекулярная с молекулярной массой меньше 10 000 дальтон, она была обозначена как фракция №1, и крупномолекулярная фракция, которая не проходила через фильтр РМ-10 Амикон и была обозначена как фракция № 2. Все три полученные фракции вводили телятам 1-1,5 месячного возраста в дозах, рекомендуемых для вакцины ОКЗ. Ни одна из полученных фракций не обладала токсической активностью. Только при введении телятам фракции № 2 отмечали болезненную реакцию на месте введения и учащение дыхания. Указанные симптомы исчезали через 3040 минут без видимых осложнений. Таким образом, низкомолекулярная фракция вакцины не обладает токсичностью.

Наличие термолабильного энтеротоксина энтеробактерий в полученных фракциях вакцины определяли на лигированной кишке кролика по методу Ре БЛ^. Результаты исследования представлены в табл. 14.

14. Исследование токсичности вакцины О КЗ различными биологическими и иммунологическими методами

№пп Исследуемый энтеро токсин Биологический метод Реакция непрямой гемаггаютинации (РНГА) Иммунофермент-ный анализ (ИФА)

1 Стафилококковый энте-ротоксин типа А Не определяли Не обнаружен Не обнаружен

2 Стафилококковый энтеротоксин типа В Не определяли Не обнаружен Не обнаружен

3 Термолабильный энтеротоксин кишечной палочки Не обнаружен Не обнаружен Не обнаружен

4 Термолабильный энтеротоксин сальмонелл Не обнаружен Не обнаружен Не обнаружен

5 Термолабильный энтеротоксин P. vulgaris Не обнаружен Не обнаружен Не обнаружен

Из данных таблицы видно, что вакцина не содержит термолабильных энтеротоксинов.

15. Биологическая активность вакцины ОКЗ на легированной

кишке кролика

№ п/п Исследуемые препараты Кол-во вводимого препарата Длина кишки в см Объем жидкости в мл Индекс дилата-ции (отношение объема к длине кишки

1 Культуральный фильтрат штамма Bacillus cereus 1312 (контроль) 2,0 7,0 10,0 1,4

2 Вакцина ОКЗ нативная 2,0 10,1 1,0 0,09

3 Вакцина ОКЗ 1 фракция РМ-10 Амикон 2,5 10,3 1,0 0,097

4 Вакцина ОКЗ 2 фракция РМ-10 Амикон 2,5 10,2 1Д 0,107

5 Вакцина ОКЗ 3 фракция РМ-10 Амикон 2,5 10,2 0,9 0,088

Таким образом, нами установлено, что вакцина, ассоциированная инактивированная против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиллеза и протейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей (по ТУ 9384-022-00008064-98 и ТУ 9384-047-0000806499), не содержит термолабильного холероподобного энтеротоксина Е. coli сальмонелл и термолабильного энтеротоксина Р.vulgaris и термостабильных энтеротоксинов энтеробакгерий.

Вероятно, аллергическая реакция, проявляемая у отдельных животных на введение вакцины ОКЗ, связана сенсибилизацией животных к аналогичным антигенам или эндотоксинам циркулирующих штаммов в хозяйствах, на суперантигены входящие в состав вакцины.

Введение в состав вакцины ОКЗ новых штаммов, а также снижение дозы вакцины, позволили существенно снизить токсическую реактивность вакцины до 0,5-1,0%, сохраняя высокую ее протективную активность. Результаты представлены в таб. 16.

16 . Результаты изучения иммуногенных свойств вакцин ОКЗ

№ п/п Вакцина Группа животных Кол-во голов Поствакцинальная реакция Средний титр Заболело ОКЗ* Эффе-тив-ность, %

гол % гол %

I ОКЗ-1 Коровы 250 3 ¡,2 378±12,7 0 0 100

2 Геля та** 600 12 2,0 315±18,6 75 12,5 87,5

3 Свиноматки 350 0 0 286±24,9 0 0 100

4 Поросята*** 2500 0 0 420±56,2 200 8,0 92,0

5 ОКЗ-2 Коровы 400 0 0 358±30,3 0 0 100

6 Телята 1500 0 0 320±45,1 121 8,1 91,9

7 Свиноматки 270 0 0 301 ±26,2 0 0 100

8 Поросята 3000 0 0 480±60,4 250 8,3 91,7

ции жидкими калом не менее 4 раз в течение светового дня.

♦♦Возраст телят - 2,5 мес.

*** Возрост поросят - 4 мес.

Таким образом, протективная и иммуногенная активности усовершенствованной вакцины ОКЗ существенно не отличаются от вакцины ОКЗ, изготовленной по ТУ 9384-022-00008064-98, но за счет снижения антигенной нагрузки на организм у вакцинированных животных не отмечается каких-либо побочных реакций. Экономическая эффективность производства повышается на 20%.

ВЫВОДЫ

1. Установлены клинико-эпизоотологические параметры и этиопато-генетические факторы возникновения и распространения ОКЗ. В структуре болезней молодняка раннего возраста удельный вес ОКЗ составляет более 90%. В структуре экономических потерь (падеж, вынужденный убой, санитарный брак, снижение продуктивности и генетического потенциала, недополученной продукции и др. ущерба) болезни раннего возраста составляют около 70% от всего наносимого ущерба.

2. С использованием современных методов идентификации и изучения иммунобиологических свойств определены и охарактеризованы основные микроорганизмы семейства Entcrobacteriacae (Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella pneumoniae и Proteus), являющиеся основными возбудителями острых кишечных заболеваний телят раннего постна-тального развития.

3. Отработанные методы подбора и селекции штаммов энтеробакте-рий позволили установить наиболее эпизоотологически значимые для биотехнологических целей штаммы Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella pneumoniae и Proteus для разработки диагностических и профилактических препаратов против кишечных инфекций у телят.

4. Усовершенствованный метод дезинтеграции бактериальных клеток энтеробактерий солянокислым гидроксиламином является наиболее эффективным (выход чистого антигена в 3-3,5 раза выше по сравнению с другими методами) для получения растворимых антигенов с наилучшим соотношением липополисахаридных и белковых компонентов для разработки диагностических препаратов.

5. Наиболее оптимальной сенсибилизирующей дозой при получении эритроцитарных диагностикумов является нагрузка 1,0 мг антигена на 10 мл 2,5% - ной взвеси формалинизированных эритроцитов при времени сенсибилизации в течение 2-х часов.

6. Разработанные схемы гипериммунизации кроликов позволяют получать специфические референс-сыворотки активностью 1:5120 -1:20480.

7. В реакции иммунодиффузии со специфическими референс-сыво-ротками и с коммерческими сыворотками к О- и Н — антигенам энтеробактерий установлено, что полученные усовершенствованным методом антигены эшерихий, сальмонеллы и протея содержат как соматический О-антиген (липополисахарид), так и жгутиковый Н-антиген (белок), а клебсиеллезный антиген содержит капсульный кислый полисахарид (К-антиген) и соматический О-антиген.

8. Эритроцитарные диагностикумы и референс-сыворотки сохраняют активность не менее 2-х лет со дня изготовления, при температуре хранения 2-4 °С.

9. Разработанные антигенные диагностические РНГА тест-системы могут быть использованы для иммунологического мониторинга животных и эпизоотологического прогноза ОКЗ, экспресс и ретроспективной диагностики острых кишечных инфекций, а также оценки эффективности иммунобиологических препаратов против кишечных инфекций.

10. При диагностике ОКЗ положительным результатом в РНГА следует считать титр испытуемой сыворотки 1:320 и выше (у невакциниро-ванных животных). При титре 1:160 необходимо исследование парных проб. Титры 1:80 и менее оцениваются как отрицательные реакции.

11. При оценке иммунного фона средний уровень титра антител равный 1:160 и выше свидетельствует о достаточном уровне иммунитета для обеспечения защиты от Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella pneumoniae и Proteus, а при титре антител ниже 1:160 — о недостаточности механизме специфической защиты используемых вакцинных препаратов и необходимости проведения специальных и ветеринарно-сани-тарных мероприятий против ОКЗ.

12. В вакцине ОКЗ не содержатся остаточные количества бактериальных токсинов энтеробактерий (термостабильных и термолабильных). Реакция у отдельных животных в неблагополучных по ОКЗ хозяйств при введении вакцины ОКЗ индуцирована антигенной нагрузкой на фоне сенсибилизации и усилением токсичности эндотоксинов организма суперантигенами вакцины.

13. Введение в состав вакцины ОКЗ новых штаммов, а также снижение дозы вакцины позволили в два и более раз (до 0,5-1%) снизить все побочные эффекты вакцины ОКЗ, при некотором повышении ее про-тективной и иммуногенной активности.

14. Использование усовершенствованной вакцины ОКЗ снижает производственные затраты на 20%.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты научных исследований внедрены в практику ветеринарной медицины. В установленном порядке на эритроцитарные диагно-стикумы и вакцину утверждены Департаментом Ветеринарии МСХ РФ нормативные документы, регламентирующие их производство и применение.

1. ТУ 938830-023-46392258-04 «Набор диагностический эритроци-тарный эшерихиозный (для РИГА)». Наставление по применению, регистрационный № 13-5-02/0938, 02.02.04 г.

2. ТУ 938830-025-46392258-04 «Набор диагностический эритроци-тарный сальмонеллезный (для РНГА)». Наставление по применению, регистрационный № 13-5-02/0905, 02.02.04 г.

3. ТУ 938830-024-46392258-04 Набор диагностический эритроцитар-ный клебсиеллезный (для РНГА)». Наставление по применению, регистрационный № 13-5-02/0903, 02.02.04 г;

4. ТУ 938830-026-46392258-04 «Набор диагностический эритроци-тарный протейный (для РНГА)». Наставление по применению, регистрационный № 15-05-02/0904, 02.02.04 г.

5. ТУ 9384-047-00008064-99 «Вакцина ассоциированная инактиви-рованная против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиллеза и протейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей (вакцина ОКЗ)»

6. Результаты исследований по разработке антигенных эритоцитар-ных диагностикумов используются в учебном процессе при изучении курсов «Болезни молодняка», «Биотехнология», «Иммунологии» и «Эпизоотология», включены в учебные программы по курсу Иммунология для студентов сельскохозяйственных вузов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Ветеринарным врачам хозяйств и ветеринарным диагностическим лабораториям необходимо проводить постоянный (не реже 1-го раза в квартал) иммунологический мониторинг для обеспечения эпизо-отологического надзора и прогнозирования ОКЗ у молодняка животных.

2. При проведении диагностических исследований руководствоваться методическими рекомендациями: «Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу эшерихиозов у сельскохозяйственных животных»; «Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу сальмонеллезов у сельскохозяйственных животных»; «Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу клебсиеллезов у сельскохозяйственных животных»; «Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу протейной инфекции у сельскохозяйственных животных».

3. Разработанная нормативная документация на производство, контроль и применению наборов диагностических эритроцитарных к энте-робактериям (для РНГА) рекомендуется для использования на предприятиях биологической промышленности и ветеринарных лабораториях.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ставцева Л.Я. Биологические препараты для профилактики диарей телят, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. /Л.Я. Ставцева, Т.Н. Грязнева, Л.С. Блажева, З.М. Бедоева //Межвуз. сб. науч.

тр. «Современные аспекты профилактики инфекционных болезней молодняка». Кишинев. - 1989. - С. 27-31.

2. Бедоева З.М. Индикация зшерихий с адгезивным антигеном К99 в фекальных пробах телят, больных кишечной формой колибактериоза /З.М. Бедоева, В.М. Подкопаев //Методические рекомендации. - М.: МВА.- 1989.-11 с.

J 3. Бедоева З.М. Идентификация энтеротоксигенных эшерихий с адгезивным К99 в РИГА и непрямом варианте РИФ /З.М. Бедоева //Вете-шнария.- РЖ. - 1990. - № 2. - С. 28-30.

V 4. Воронин Е.С. Профилактика и лечение диарей телят с использованием неспецифических препаратов и бактериофагов /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, ЛЛ. Ставцева, В.П. Шишков, З.М. Бедоева, Т.Н. Гряз-нева //Доклады ВАСХНИЛ. - 1990. - № 11. - С. 47-50.

5. Воронин Е.С. Экспериментальное воспроизведение диарей у новорожденных /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, Л.Я. Ставцева, З.М. Бедоева //Вестник с.-х. науки. — 1990. — № 10. — С. 5-9.

6. Воронин Е.С Острые кишечные инфекции у телят в экспериментальных условиях /Воронин Е.С., Девришов Д.А., Л.Я. Ставцева, З.М. Бедоева //Межвуз. сб. науч. тр. МВА «Новое в диагностике, лечении и профилактике болезней молодняка с.-х. животных». — М.: МВА. — 1991. -С. 67-69.

7. Девришов Д.А. Рекицена — РД профилактический препарат против желудочно-кишечных заболеваний поросят / Д.А. Девришов, Г.Н.Печникова, З.М.Бедоева, A.A. Бурдов, Т.И.Мельницкая // Сб. науч. тр. МВА

8. Девришов Д.А. Применения Рекицена - РД для профилактики и лечения диарей телят и поросят /Д.А. Девришов, М.А. Исмаилов, Г.Н. Печникова, Т.П. Жарова, З.М. Бедоева, Е.С. Воронин //Межвуз. сб. науч. тр. МВА «Новое в диагностике лечении и профилактике болезней животных». - М.: МВА. - 1996.- С. 23-27.

9. Девришов Д-А. Биоспорин как терапевтическое средство против желудочно-кишечных заболеваний поросят /Д-А. Девришов, Г.Н. Печникова, З.М. Бедоева, A.A. Бурдов //Межвуз. Сб. науч. тр. МВА «Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных». -М.: МВА. - 1995.- С. 81-84.

10. Девришов Д.А. Испытания фторазола при лечении диареи сельскохозяйственных животных /Д.А. Девришов, Е.С. Воронин, З.М. Бедоева, Г.Н. Печникова, Т.П. Жарова //Тез. докл. Всерос. науч. конф. «Инфекционные болезни с.-х. животных». — М.: МВА. — 1996. - С. 2223.

11. Девришов Д.А. Профилактическое и терапевтическое действия биоспорина-В при диареях телят и поросят /Д.А. Девришов, М.А. Ис-маилов, З.М. Бедоева, Г.Н. Печникова, Т.П. Жарова //Сб. науч. тр. МГАВМиБ им. К.И. Скрябина. В кн.: Вопросы физико-химической биологии. - М.: МВА. - 1991.- С. 19-21. \J 12. Воронин Б.С. Экспериментальное испытание ассоциированной инактивированной вакцины ОКЗ /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, В.В. Шведов //Ветеринария. - 1998. - №12 - С. 12 - 14.

13. Девришов Д.А. Протективная активность вакцины ОКЗ /Д.А. Девришов, Е.С. Воронин, З.М. Бедоева //Ветеринария. - 1999. — № 4. —

14. Девришов Д.А. Экспериментальные данные по получению гипериммунных сывороток для диагностики инфекционных, болезней вызываемых энтеробактериями /Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Зайцева //Сб. матер, науч. конф. «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и преспективы». - Киров: НИИМ МО РФ.- 2001. - С. 17 - 18.

15. Девришов Д.А. Изучение динамики титров антител у крупного рогатого скота при колибактериозе /Д.А. Девришов, В.И. Каиси, З.М. Бедоева, Е.В. Зайцева // Сб. докл. междунар. конф. молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». - Щелково: НИТИБП. -2001. - С. 1 32-135

16. Девришов Д.А. Экспериментальные данные, полученные при испытании диагностических систем к родам сальмонелл /Д.А. Девришов, В.Х. Каиси, З.М. Бедоева, Е.В. Зайцева //Сб. докл. междунар. конф. молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». —Щелково: НИТИБП. -2001. — С. 135 - 139.

17. Девришов Д.А. Сравнительная оценка серологических тестов на иммунизированных животных /Д.А. Девришов, В.И. Каиси, З.М. Бедоева, Е.В. Зайцева //Ветеринарная медицина. — 2002, — №1 — С. 7-8

18. Девришов Д.А Разработка эритроцитарных диагностикумов для определения антител к бактериям рода Proteus: выбор метода извлечения антигенов и получения гипериммунных контрольных сывороток /Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Зайцева //Ветеринарная медицина. — 2002,-№2.-С. 18-20.

19. Воронин Е.С. Штамм бактерий Proteus vulgaris № 25, используемый для изготовления иммунных препаратов /Воронин Е.С., Девришов Д.А., Бедоева З.М., Е.В. Пименов, С.М. Кузнецов, В.В. Шведов //Описание изобретения к патенту РФ № 2218395. — 2003. ( 20. Воронин Е.С. Штамм бактерий Proteus mirabiliis № 26, используемый для изготовления иммунных препаратов /Е.С. Воронин, Д.А.

С. 14-17.

Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Пименов, С.М. Кузнецов, В.В. Шведов //Описание изобретения к патенту РФ № 2217494. - 2003.

ч/ 21. Воронин Е.С. Штамм бактерий Salmonella dublin № 19, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Пименов, С.М. Кузнецов, В.В. Шведов //Описание изобретения к патенту РФ № 2218176. — 2003. ч/ 22. Воронин Е.С. Штамм бактерий Salmonella enteritidis № 22, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Пименов, С.М. Кузнецов, В.В. Шведов //Описание изобретения к патенту РФ № 2218177. -2003.

\f 23. Воронин Е.С. Штамм бактерий Salmonella typhimurium № 14, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Пименов, С.М. Кузнецов, В.В. Шведов //Описание изобретения к патенту РФ № 2216350. -2003.

J 24. Воронин Е.С. Штамм бактерий E.coli 09:К99 № 28, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Пименов, С.М. Кузнецов, В.В. Шведов //Описание изобретения к патенту РФ № 2222591. - 2004.

\J 25. Воронин Е.С. Штамм бактерий E.coli 0138:К88 № 27, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов /Е.С. Воронин, Д.А Девришов., З.М. Бедоева, Е.В. Пименов, С.М. Кузнецов, В.В. Шведов //Описание изобретения к патенту РФ № 2222592. - 2004.

Vi 26. Воронин Е.С. Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae, депонированный в ВГНКИ под № 23 МГАВМиБ-Деп, для производства вакцины против клебсиеллеза молодняка сельскохозяйственных животных /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Пименов, С.М. Кузнецов, В.В. Шведов //Описание изобретения к патенту РФ № 2221864. - 2004. ^J 27. Воронин Е.С. Klebsiella pneumoniae, депонированный в ВГНКИ под № 24 МГАВМиБ-Деп, для производства вакцины против клебсиеллеза молодняка сельскохозяйственных животных /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Пименов, С.М. Кузнецов, В.В. Шведов //Описание изобретения к патенту РФ № 2224019. - 2004. yj 28. Бедоева З.М. Разработка средств иммунологического мониторинга и прогнозирования острых кишечных инфекций бактериальной этиологии: I. Получение эшерихиозных и сальмонеллезных диагностических антигенов /З.М. Бедоева, Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, Е.В. Зайцева //Вестник РАСХН. - 2006. - № 3. - С. 63 - 65.

29. Бедоева З.М. Роль Klebsiella pneumoniae и бактерий рода Proteus в кишечной патологии животных и особенности получение чистых антигенов для диагностических целей /З.М. Бедоева, Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, Е.В. Зайцева //Вестник РАСХН. - 2006. - № 3. - С. 65 - 67.

30. Бедоева З.М. Получение контрольных гипериммунных сывороток, для диагностических тест-систем энтеробакгерий /З.М. Бедоева, Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, Е.В. Зайцева //Вестник РАСХН. - 2006. -№ 3. - С. 67 - 69.

31. Бедоева З.М. Оптимизация параметров сенсибилизации эритроцитов специфическими антигенами /З.М. Бедоева, Е.С. Воронин, ДА. Девришов, Е.В. Зайцева //Вестник РАСХН. - 2006. - № 3. - С. 69 - 71.

32. Бедоева З.М. Результаты производственных испытаний антигенных эритроцитарных диагностикумов энтеробактерий /З.М. Бедоева, Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, Е.В. Зайцева // Вестник РАСХН.- 2006. -№3.-С. 72-73.

33. Воронин Е.С. Диагностика и иммунологический мониторинг протейной инфекции у сельскохозяйственных животных /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В.Зайцева // Методические рекомендации,- М.: РАСХН. - 2006. - 11 с.

34. Воронин Е.С. Диагностика и иммунологический мониторинг эшерихиозов у сельскохозяйственных животных /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В.Зайцева // Методические рекомендации. -М.: РАСХН. - 2006. - 12 с.

35. Воронин Е.С. Диагностика и иммунологический мониторинг сальмонелезов у сельскохозяйственных животных /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Зайцева //Методические рекомендации.-М.: РАСХН.-2006.-11 с.

36. Воронин Е.С. Диагностика и иммунологический мониторинг клебсиеялезной инфекции у сельскохозяйственных животных /Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, З.М. Бедоева, Е.В. Зайцева //Методические рекомендации.- М.: РАСХН. - 2006. - 11 с.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 10.10.06 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,69 Печать авторефератов (095) 730-47-74,778-45-60

Актуальность проблемы. Актуальной проблемой остаются заболевания желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных, проявляющиеся с синдромом диареи и устойчиво занимают ведущее место среди всех инфекционных заболеваний. ОКЗ регистрируются во всех странах и по экономическому ущербу, наносимому животноводству занимают второе место в мире. В зависимости от уровня развития животноводства потери при воспроизводстве поголовья могут достигать от 10% до 50% и более.

Отечественными и зарубежными исследователями установлено, что массовые диареи, как патология у молодняка сельскохозяйственных животных, вызываются комплексом причин, в котором ключевой основой является инфекционная природа (42, 61, 69, 202, 321, 324, 354). Микроорганизмы, вызывающие синдром острого кишечного заболевания (ОКЗ), являются в основном сателлитными для макроорганизма и внешней среды. Их патогенное действие, прежде всего, проявляется при пониженной естественной резистентности макроорганизма, связанное с нарушениями в технологии кормления, содержания и различными стрессовыми ситуациями в результате воздействия неблагоприятных факторов внешней среды.

Проведенными исследованиями ряда авторов (41, 67, 129), также установлена пониженная иммунобиологическая ценность молозива у новотельных коров, в результате чего у большинства (до 90%) народившегося молодняка отмечается низкий уровень факторов гуморального и клеточного иммунитета и отсутствие колострального иммунитета, что приводит к возникновению массовых дисбактериозов и диарейных заболеваний.

Рекомендуемые профилактические мероприятия, которые включают обеспечение полноценного кормления и надлежащих условий содержания коров, поддержание на должном уровне ветеринарно-санитарного состояния ферм и родильных отделений, своевременная выпойка телят молозивом, не в полной мере дают ожидаемый результат, так как не учитывают инфекционный фактор развития диареи.

Многообразие факторов возникновения ОКЗ также снижает эффективность применения специфических препаратов и требует разработки широкого спектра диагностических и профилактических препаратов.

В связи с тем, что в большинстве случаев ОКЗ вызываются комплексом факторов при ведущей роли того или иного инфекционного агента, важным является проведение диагностических исследований, направленных на выявление или исключение инфекционного начала.

Широкое применение в животноводстве химиотерапевтических препаратов и антибиотиков в последние десятилетия привело к изменению микробного пейзажа возбудителей. В патологическом процессе при острых кишечных инфекциях сельскохозяйственных животных участвуют, как правило, ассоциации бактерий и вирусов, среди которых немалую роль в этиопато-генезе играют такие представители условно-патогенной микрофлоры как протеи и клебсиеллы (18, 29, 202, 244).

В этой связи вопросы эпизоотологического мониторинга и оперативно и ретроспективной диагностики ОКЗ у животных являются весьма актуальными для своевременного проведения лечебно-профилактических и ветеринарно-санитарных мероприятий против наиболее значимых в этиопатогенезе возбудителей.

Одним из важных моментов в оценке эффективности ветеринарных мероприятий является и иммунологический мониторинг по определению уровня защитных антител у привитых животных.

В настоящее время для проведения массовых иммунологических исследований на практике не имеются диагностические тесты с достаточно высокой специфичностью, пригодные для использования, как в специализированных лабораториях, так и в полевых условиях.

В связи с этим создание тест-систем, предназначенных для контроля эффективности вакцин, а также для иммунологического мониторинга животных, является весьма актуальной задачей, решение которой позволит прогнозировать эпизоотическую ситуацию острых кишечных заболеваний и своевременно проводить соответствующие профилактические мероприятия.

Бактериологический метод, используемый в настоящее время для проведения диагностических исследований, трудоемкий и дорогой; широко применяемая реакция агглютинации недостаточно чувствительна и специфична.

Наиболее приемлемым среди известных диагностических тестов для широкого практического применения является реакция непрямой агглютинации (РНГА) с применением антигенных диагностикумов, которая характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью и методически доступна для ветеринарных лабораторий.

В ветеринарной практике давно используют РНГА-диагностикумы для ретроспективной диагностики вирусных инфекций - наборы эритроцитарные для серодиагностики инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, пара-гриппа-3, аденоинфекций и респираторно-сенситиальной инфекции. Применение антигенных эритроцитарных диагностикумов к энтеробактериям позволит проводить серологическую диагностику острых кишечных заболеваний и оценку иммунного ответа на фоне применяемых ассоциированных и моновалентных вакцин против желудочно-кишечных заболеваний.

Кроме того, дополнительным методом диагностики ОКЗ могло бы стать обнаружение аномально высоких титров антител к эшерихиям, сальмонеллам, клебсиеллам и протею, либо нарастания их в процессе заболевания при использовании РНГА тест-систем к энтеробактериям.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось проведение эпизоотологического мониторинга и лабораторно-диагностических исследований по выделению и идентификации микроорганизмов, являющихся основными этиологическими факторами возникновения острых кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных; разработка тест-систем для диагностики, иммунологического мониторинга и прогнозирования инфекционного процесса, а также усовершенствование средств специфической профилактики ОКЗ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести эпизоотологический мониторинг и установить роль микроорганизмов семейства Enterobacteriacae в этиологии ОКЗ.

2. Идентифицировать и изучить иммунобиологические свойства штаммов микроорганизмов основных возбудителей ОКЗ.

3. Разработать биотехнологические параметры получения и очистки бактериальных антигенов и создания эритроцитарных тест-систем для диагностики эшерихиоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции;

4. Провести исследования по оптимизации методов получения, стабилизации и сенсибилизации эритроцитов;

5. Разработать схемы гипериммунизации кроликов для получения высокоспецифических иммунных сывороток к штаммам E.coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus;

6. Компоновка диагностических эритроцитарных антигенных РНГА-наборов к энтеробактериям и их экспериментальные и производственные испытания;

7. Провести исследования по мониторингу иммунного фона у животных с использованием РИГА;

8. С учетом данных эпизоотических и иммунологических исследований усовершенствовать антигенный состав вакцины против ОКЗ, а также технологические параметры ее производства и применения.

Научная новизна. Впервые проведен эпизоотологический мониторинг распространения энтеробактерий - возбудителей желудочно-кишечных болезней сельскохозяйственных животных в различных регионах России.

Выделены и охарактеризованы по антигенному составу и факторам па-тогенности микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae являющиеся основными возбудителями ОКЗ.

Усовершенствованы методы получения антигенов, обработки и сенсибилизации эритроцитов для изготовления эритроцитарных диагностикумов.

Впервые разработаны антигенные эритроцитарные тест-системы для диагностики, иммунологического мониторинга и прогнозирования бактериальных инфекций у животных, вызываемых микроорганизмами родов E.coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus.

Усовершенствована технология производства и применения вакцины ассоциированной инактивированной вакцины против колибактериоза, саль-монеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции телят, поросят, ягнят и пушных зверей (вакцина ОКЗ).

Научная новизна результатов исследований подтверждена 9 патентами на изобретение:

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2218395 «Штамм бактерий Proteus vulgaris № 25, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 10.12.2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2217494 «Штамм бактерий Proteus mirabiliis № 26, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 27.11.2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2218176 «Штамм бактерий Salmonella dublin № 19, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов» от 10.12.2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2218177 «Штамм бактерий Salmonella enteritidis № 22, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов» от 10.12.2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2216350 «Штамм бактерий Salmonella typhimurium № 14, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов» от 20.11.2003.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2222591. «Штамм бактерий E.coli 09:К99 № 28, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 27.01.2004.,

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2222592. «Штамм бактерий E.coli 0138:К88 № 27, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 27.01.2004.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2221864. «Штамм бактерий К. pneumoniae № 23, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 20.01.2004.

- Патент Российской Федерации на изобретение № 2224019. «Штамм бактерий К. pneumoniae № 24, используемый для изготовления иммунных препаратов» от 20.01.2004.

Практическая значимость. Разработаны и утверждены в установленном порядке 4 набора нормативных документов, регламентирующих промышленное производство, контроль и применение антигенных эритроцитар-ных диагностикумов для диагностики, иммунологического мониторинга и прогнозирования бактериальных инфекций у животных, вызываемых возбудителями семейства Enterobacteriacae утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ РФ в 2004 г.

Разработаны методические рекомендации:

Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу эшерихиозов у сельскохозяйственных животных;

Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу сальмонеллезов у сельскохозяйственных животных;

Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу протейной инфекции у сельскохозяйственных животных;

Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу клебсиеллезной инфекции у сельскохозяйственных животных (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, протокол № 2 от 25 апреля 2006 г).

Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертационной работы изложены в отчетах НИР ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина за 1997-2005гг и 36 печатных работах. Материалы диссертации доложены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов ФГОУ ВПО МГАВМиБ (1997-2002 гг.); международных научных и научно-практических конференциях (Щелково, 2001 г, Киров, 2001, Самарканд, 2003,2006, Москва, 2005,2006).

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Результаты эпизоотологического мониторинга и клинико-диагностических исследований при ОКЗ молодняка крупного рогатого скота.

2. Этиопатогенетические факторы и возбудители ОКЗ молодняка животных и их иммунобиохимическая характеристика.

3. Биотехнологические и методические основы получения и конъюгации антигенных комплексов E.coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus и референс-сывороток к ним для РИГА.

4. Результаты экспериментальных и производственных испытаний разработанных РИГА тест-систем;

5. Результаты исследований по усовершенствованию вакцины ОКЗ.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано

36 работ, в том числе 14 статей в научных журналах, 8 - в сборниках научно-практических конференций, 5 методических рекомендаций, 9 патентов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 302 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы (246 отечественных и 130 иностранных авторов), приложений. Работа содержит 41 таблицу и 38 рисунков.

4. ВЫВОДЫ

1. Установлены клинико-эпизоотологические параметры и этиопатогене-тическне факторы возникновения и распространения ОКЗ. В структуре болезней молодняка раннего возраста удельный вес ОКЗ составляет более 90%. В структуре экономических потерь (падеж, вынужденный убой, санитарный брак, снижение продуктивности и генетического потенциала, недополученной продукции и др. ущерба) болезни раннего возраста составляют около 70%> от всего наносимого ущерба.

2. С использованием современных методов идентификации и изучения иммунобиологических свойств определены и охарактеризованы основные микроорганизмы семейства Enterobacteriacae (Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella pneumoniae и Proteus), являющиеся основными возбудителями острых кишечных заболеваний телят раннего постнатального развития.

3. Отработанные методы подбора и селекции штаммов энтеробактерий позволили установить наиболее эпизоотологически значимые для биотехнологических целей штаммы Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella pneumoniae и Proteus для разработки диагностических и профилактических препаратов против кишечных инфекций у телят.

4. Усовершенствованный метод дезинтеграции бактериальных клеток энтеробактерий солянокислым гидроксиламином является наиболее эффективным (выход чистого антигена в 3-3,5 раза выше по сравнению с другими методами) для получения растворимых антигенов с наилучшим соотношением липополисахаридных и белковых компонентов для разработки диагностических препаратов.

5. Наиболее оптимальной сенсибилизирующей дозой при получении эритроцитарных диагностикумов является нагрузка 1,0 мг антигена на 10 мл

2,5% - ной взвеси формалинизированных эритроцитов при времени сенсибилизации в течение 2-х часов.

6. Разработанные схемы гипериммунизации кроликов позволяют получать референс-сыворотки с высокой специфической активностью: 1:5120 -1:20480.

7. В реакции иммунодиффузии со специфическими референс-сыворотками и с коммерческими сыворотками к О- и Н-антигенам энтеробактерий установлено, что полученные усовершенствованным методом антигены эшерихий, сальмонеллы и протея содержат как соматический О-антиген (липополисахарид), так и жгутиковый Н-антиген (белок), а клебсиеллезный антиген содержит капсульный кислый полисахарид (K-антиген) и соматический О-антиген.

8. Эритроцитарные диагностикумы и референс-сыворотки сохраняют активность не менее 2-х лет со дня изготовления, при температуре хранения 2-4°С.

9. Разработанные антигенные диагностические РНГА тест-системы могут быть использованы для иммунологического мониторинга животных и эпизо-отологического прогноза ОКЗ, экспресс и ретроспективной диагностики острых кишечных инфекций, а также для оценки эффективности иммунобиологических препаратов против кишечных инфекций.

10. При диагностике ОКЗ положительным результатом в РНГА следует считать титр испытуемой сыворотки 1:320 и выше (у невакцинированных животных). При титре 1:160 необходимо исследование парных проб. Титры 1:80 и менее оцениваются как отрицательные реакции.

И. При оценке иммунного фона средний уровень титра антител равный 1:160 и выше, свидетельствует о достаточном уровне иммунитета для обеспечения защиты от Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella pneumoniae и Proteus, а при титре антител ниже 1:160 - о недостаточности механизма специфической защиты используемых вакцинных препаратов и необходимости проведения специальных и ветеринарно-санитарных мероприятий против ОКЗ.

12. В вакцине ОКЗ не содержатся остаточные количества бактериальных токсинов энтеробактерий (термостабильных и термолабильных). Реакция у отдельных животных в неблагополучных по ОКЗ хозяйств при введении вакцины ОКЗ индуцирована антигенной нагрузкой на фоне сенсибилизации и усилением токсичности эндотоксинов организма суперантигенами вакцины.

13. Введение в состав вакцины ОКЗ новых штаммов, а также снижение дозы вакцины позволило в два и более раз (до 0,5-1%) снизить все побочные эффекты вакцины ОКЗ при некотором повышении ее протективной и имму-ногенной активности.

14. Использование усовершенствованной вакцины ОКЗ снижает производственные затраты на 20%.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ

НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты научных исследований внедрены в практику ветеринарной медицины. В установленном порядке на эритроцитарные диагностикумы и вакцину утверждены Департаментом Ветеринарии МСХ РФ нормативные документы, регламентирующие их производство и применение."

1. ТУ 938830-023-46392258-04 «Набор диагностический эритроцитарный эшерихиозный (для РИГА)».

2. Наставление по применению, регистрационный № 13-5-02/0938, 02.02.04 г.

3. ТУ 938830-025-46392258-04 «Набор диагностический эритроцитарный сальмонеллезный (для РНГА)».

4. Наставление по применению, регистрационный № 13-5-02/0905, 02.02.04 г.

5. ТУ 938830-024-46392258-04 Набор диагностический эритроцитарный клебсиеллезный (для РИГА)».

6. Наставление по применению, регстрационный № 13-5-02/0903, 02.02.04 г;

7. ТУ 938830-026-46392258-04 «Набор диагностический эритроцитарный протейный (для РНГА)».

8. Наставление по применению, регистрационный № 15-05-02/0904, 02.02.04 г.

9. ТУ 9384-047-00008064-99 «Вакцина ассоциированная инактивированная против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиллеза и протейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей (вакцина ОКЗ)»

10. Результаты исследований по разработке антигенных эритоцитарных диагностикумов используются в учебном процессе при изучении курсов «Болезни молодняка», «Биотехнология», «Иммунологии» и «Эпизоотология», включены в учебные программы по курсу «Иммунология» для студентов сельскохозяйственных вузов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Ветеринарным врачам хозяйств и ветеринарным диагностическим лабораториям необходимо проводить постоянный (не реже 1-го раза в квартал) иммунологический мониторинг для обеспечения эпизоотологического надзора и прогнозирования ОКЗ у молодняка животных.

2. При проведении диагностических исследований руководствоваться методическими рекомендациями: «Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу эшерихиозов у сельскохозяйственных животных»; «Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу сальмонеллезов у сельскохозяйственных животных»; «Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу клебсиеллезов у сельскохозяйственных животных»; «Методические рекомендации по диагностике и иммунологическому мониторингу протейной инфекции у сельскохозяйственных животных».

3. Разработанная нормативная документация на производство, контроль и применению наборов диагностических эритроцитарных к энтеробактериям (для РНГА) рекомендуется для использования на предприятиях биологической промышленности и ветеринарных лабораториях.