Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение гуморальных и клеточных механизмов регуляции пролиферации В-лимфоцитов у больных ревматоидным артритом

АКАДЕМИЯ МЕДОЩСКМ НАУК СССР-

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

КИРИКОВА Светлана Федоровна

ИЗУЧЕНИЕ ГУМОРАЛЬНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ В-ЛИМФОДИТОВ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских нвдк

Новосибирск 1991

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделения АМН СССР

Научный руководитель: доктор медицинских наук В.С.Ширинский

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В.И.Коненков

доктор медицинских наук, дрофе с сор Д.Н.Ыаянский

Ведущая организация.: 2-ой Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится "_"_1991 г.

в _ часов на заседании специализированного совета

К.001.01.01 (Аллергология и иммунология) Института клинической иммунологии СО АЫН СССР по адресу: 630091, Новосибирск, ул.Ядринцовская,14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО АЫН СССР.

Автореферат разослан "_"_1391 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических Еаук

'Щ^ъсг'&С- О.Т.Кудаова

ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛШОСТЬ ПРОЕИШЫ. Высокая частота ревматоидного артрита (РА) среди воспалительных заболеваний суставов,прогрессирующий характер течения,приводящий к ранней инвалвдизацга. больных и неудовлетворительные результаты его лечения обуславливают актуальность изучения механизмов аутоиммунитета и ароничес-кого ревматоидного воспаления.

Среди многообразия иммунных нарушений у больных РА наиболее типичным является избыточная продукция широкого спектра аутоантител (аутоАТ) и высокие уровни различных по составу иммунных комплексов (ИК).Эти'феномены обуславливают развитие и персистенцию воспаления при РА ( Насонов Е.Л.,1984,Сперанский А. И. ,1984).

Присутствие в периферической крови (ПК),синовиальной кидкости (CS) и синовиальной ткани (CT) больных РА избыточного количества аутоАТ и Ж является следствием поликлональной B-клеточной активации.Этот феномен является ключевым в патогенезе РА и лежит в основе многообразия патогенетических механизмов и клинических проявлений заболевания.Так,гиперактивация в большей степени выражена при серопозитивном. варианте РА, с более тяжелым течением и быстрым прогрессированием.

Есть основания предполагать,что активация B-лимфоцитов у больных РА опосредована дисфункцией регуляторных Т-клеток, моноцитов/макрофагов (Мц/Йф),нарушением продукции и рецепции многих медиаторов .контролирующих пролиферацию, дщрференциров-ку и функции лимфоцитов (l/ipsky P.E., 1989,Petersen J.,1983)

Механизмы нарушений контроля пролиферации и дафференци-ровки В-лимфоцитов,их аутореактивных клонов у больных РА практически не изучены.

Исследования этих механизмов^позволят не только глубже понять патогенез хронического воспаления,но и разработать новые подходы эффективной иммуноактивной терапии РА,основанной на коррекции процессов, приводящих к гиперактивации В-лимфоцнтов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования являлось изучение механизмов нарушения пролиферации В-лшлюоцитов у больных с различными клиническими характеристиками РА.

3 соответствии с этим решались следующие задачи:

1.Изучить пролиферативную активность нестимулированных и стимулированных митогеном лаконоса (МЛ) культур мононукле-аров (МНК) периферической крови больных РА с разными циническими характеристиками.

2.Изучить влияние Мц и рада их медааторов на пролиферации культур МНК и культур,обогащенных В-лимфоцитами от больных с разными вариантами заболевания.

3.Изучить влияние факторов синовиального экссудата (СЭ) от серопозитивных и серонегативных больных РА на пролиферацию культур,обогащенных В-лимфоцитами,здоровых людей.

4.Охарактеризовать функции неспецифических Т-супрессоров (Тс).контролирующих пролиферацию В-лимфоцитов больных РА и изучить механизмы ее нарушения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЗДОВАНШ.Впервые проведена комплексная оценка гуморальных и клеточных механизмов, контролирующих пролиферацию В-лимфоцитов больных РА.

Впервые показаны различия цитокш-опосредованной регуляции пролиферации В-лимфоцитов больных серопозитивныг и се-ронегативяым РА,характеризующиеся не только особенностями продукции факторов,контролирующих пролиферацию В-лимфоцитов при этих серологических вариантах болезни,но и изменением чувствительности к ним В-клеток больных.

Полученные данные свидетельствуют о различиях в иммуно-патогенезе серопозитивного и серюнегативногоРА,определяющих своеобразие их клиники и течения,и требуют разработки новнх подходов к избирательной иммунокоррекции,основанной на глубоком понимании механизмов В-клеточной активации.

Выявлено нарушение регуляции пролиферации В-лимфоцитов моноцитами,обусловленное не только гидерпродукцией ш.'!^ и Ш-1,ко и изменением чувствительности к этим цитокинам клеток-мшеней.

Впервые установлено, что культуры В-лимфоцитов больных РА имеют разную чувствительность к действию интерферонов (ИФ) еС и _уЗ ', фактору некроза опухоли^ (ФНО^). В-лимфо-цигы серонегативных больных сохраняют чувствительность к антипролиферативному действию ИФ в сравнении с серопозитивны-ми больными. В-лимфоциты серопозитивных больных высокочувствительны к действию ФНОс^.

Впервые установлено, что СЭ от серопозитивных больных и серонегативных больных различается по способности изменять

пролиферации культур .обогащенных В-лшфоциташ, здоровых ладей. Показано, что образцы СЭ больных с вйсокими титрами ревматоидного фактора (РФ) характеризуются преобладанием активности факторов, стимулирующих МЛ-индуцированную пролиферацию В-лимфоцитов,тогда как в образцах СЭ-больных серонеРатшзнЕЛ РА такого влияния на пролиферацию не выявлено.

Впервые охарактеризована функция- трех типов неспецифических Тс больных РА,шгибирующих МЛ-индуцированную пролпфа-рацию не только в аллогенной.но и в аутологичной тест-системе. Установлено,что снижение активности неспецифическпх Тс обусловлено угнетением продукции ими супрессорннх факторов (СФ) и снижением чувствительности к ним клеток-мишеней.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Обосновывается необходимость изучения "цитокиновой сети",регулирующей пролиферацию В-лимфоцитов больных серопозитивным РА как'одного пз ключевых звеньев патогенеза этого варианта болезни,поиска на этой основе новых подходов к иммуяокоррекцпи.

Примененные в работе методы определения чувствительности культур несепарированннх и сепарированных МНК к действлп цитокинов могут быть апробированы как "нагрузочные" пробы для уточнения показаний к мопо- шш комбинированной терапии синтетическими аналогами цитокинов.

Изменение уровня пролиферации обогащейных В-лшфоцптаии культур здоровых лвдей под действием СЭ больных РА моает быть рекомендовано дая определения интегральной активности факторов ,контролирующих пролиферацию В-лимфоцитов.

Данные,полученные в исследованиях,используются при чтении лекций и проведении практических занятий-на курсе клинической иммунологии Новосибирского мединститута.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИШЕ НА ЗАЩИТУ.

Г. Клинические особенности серопозитивного РА,в отлетнэ от серонегативного,обусловлены своеобразием иммунопатогенеза, связанным,в частности, с нарушением соотношения активности цитокинов-регуляторов пролиферации В-лимфоцитов, приводящим к накоплению и актийации этой популяции клеток,появлению.АТ разной специфичности и ИК разного состава.

2. У больных^РА, чрще в группах с диагностическими титрами РФ, высокой активностью воспалительного процесса обнаруживаются изменения чувствительности В-лимфоцитов к

стимулирующим или ингибирующим влияниям на их пролиферацию таких цитокинов, как Ш1-1, 1ШЕ2. , ИФуз, Ш0</.Значительно снижена активность неспецифических Тс, что связано с угнетением продукции CQ и восприятия их Т-клеткамп-мше-нями. Изменения соотношения активности цитокинов,обеспечивающих стимуляцию или ингибицшо пролиферации 3-лимфоцитов, связаны не только с вариантом болезни, но имеют и индивидуальные различия.

3. В СЭ от больных серопозитнвным РЛ преобладает активность факторов,стимулирующих пролиферацию обогащенной З-ли:.;-фоцитами культуры здоровых людей, тогда как в Со от сероие-гативных больных проявляется оппозитное влияние на п.1:птт;!..' е-рацию В-лимфоцитов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУЕМШДИ. иатериагш диссертации доложены на конференции молодых ученых Урала и Сибири "Актуальные вопросы ревматологии" ( Свердловск,1990),Всесоюзном симпозиуме с мендународнш участием "Патогенез хронического воспаления" ( Новосибирск,1991) и IУ Всесоюзном съезде ревматологов ( Минск,1991). Апробация работы состоялась на семинаре клинического отдела ИКИ СО ЛУИ СССР 3 октября 1991 г.

По теме диссертации опубликовано 8 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ИКИ СО АНН СССР,номер госрегистрации: №1.86.0/019693. Материалы изложены на страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов- исследований в четырех главах и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертация включает 27 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 249 источников, из них 38 работ отечественных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Обследовано 185 здоровых доноров и 166 больных РА,госпитализированных в ревматологическое отделение Городской клинической больницы HI, не получавших в период обследования средств базисной терапии. КлиническшкЬсмотр 6«. 1ыией части больных проведен автором. Использовалась'отечественная классификация РА,.диагноз ко-

торого устанавливался на основании критериев АРА.В группе обследованных больных 68$ были серопозитивными, 32$ - не имели диагностических титров РФ; 36$ обследованных имели I степень активности воспалительного процесса, 64$ - II-III степень активности.

Основным методическим приемом исследований являлось культивирование ШК периферической крови разного клеточного состава. ШК получали из венозной гепаринизированной крови стандартны:.! методом ( Böyum А., 1968). Полученная суспензия МКК состояла из 88+0,9$ лимфоцитов, 9,1+1,2$ Мц и 3+0,47$ граяулоцитов.Еизнеспособность клеток при окраске трипановым синим была не менее 97$.

!.1ц удаляли с помощью фагоцитоза частиц карбонильного железа ( sigma ) ( Lee к.е., 1980).Популяция нефагоцитиру-ющих ШК содержала 0-2$ эстеразоположительных клеток и использовалась дая культур, обедненных 1лц.

Обогащенную B-клетками суспензию лимфоцитов получали из обедненных 1.5ц ШК методом цитолиза субпопуляций Т-клеток с помощью моноклональных AT серий анти-СДЗ,анти-СД7, анти-СД8 (IfflO "Препарат",Горьковский НИИЭЦ), разработанным Б.В. Шшепшым и сотр. (1989). Выход меток составил 11+1,7$ от первоначального количества цельных ШК. Полученная суспензия СДЗ-СД7~СД8-лимфощ1тов практически: не отвечала на ФГА при жизнеспособности клеток не менее 95$. Содержание СД22+ и СДЗ+ плеток составило 59+2,7$ я 2,8+0,7$ соответственно. Эти лимфоциты являлись источником для культур,обогащенных В-клетками.

Культивирование проводами в' 96-луночных планшетах дая иммунологических исследований,куда вносили 10® кл/лунку, в полной культуралыгой среде (ИКС), состоящей из PPMI-I640 (Flow Lab. ).дополненной 10$ детальной сыворотки

коровы (Serva ), Iíepes -буфера (Serva ), 4мМ глюта-мина (Serva ), 40 мкг/мл геятамицина ("Фармахим") и óxl^-5 2-мер:саптоотанола (Serva ).

Для стимуляции пролиферации использован митоген лако-носа (L'IH) (serva либо Sigma ),в оптимальной дозе 10 МКГ/мл, вносимый на весь период культивирования или используемый дая преактивацш-i клеток в течение не менее 24 часов.

В работе использованы: ПГЕ0 (Опытный завод органической го синтеза и биопрепаратов Института химии All СССР,г.Таллинн) в дозах I0~6-I0-cî.î; ипдометация (Merck ), I мкг/шг;

человеческий рекомбинантный ffil-le¿ (Hoffmann La Hoche ) с удельной активностью ЗОхЮ8 ЕД/мл, вносимый в культуры в дозах I и 10 нг/шг.бьл любезно предоставлен ст.u.c. лаборатории нейроиммунологии ,к.б.н. Н.Ю.Громыхияой. Использованы также человеческие рекомбинантные llüUuJi ( Львовский НИЖЖ), с удельной активностью' IOxIO6 ЕД/мл,в дозах I02 и Ю4 ЕД/мл и человеческий рекомбинантный 3?H0«¿, с активностью 2х107ЕД/мл, полученный от В.Г.Коробко ( Институт биоорганической химии АН СССР им.Ы.М.Шемякина) и любезно предоставленный нагл доктором биол.наук В.А.Лавровским. Цптокин вносили в культуры в дозах 50 и 100 ЕД/мл. При оценке жизнеспособности клеток культур с добавлением двух доз ®I0<¿ в сравнении с контрольными существенных различий не выявлено: жизнеспособность клеток после 18 часов инкубации с 100 и 50 ВДДи составила 98,5$ и 98%соответственно против 97$ в контроле, что позволяло исключить цитотоксическое влияние фактора на В-лимфо-.-' циты, стимулированные ¡.'¡Л. Влияние <¡H0<¿ на ШГ-стимулирован-ную пролиферацию оценивали по индексу влияния (ИВ):

ira число импульсов/мин, опыт ; число импульсов/мин,контроль

Для изучения влияния факторов Ci использованы образцы Синовиального экссудата (СЭ) от больныхРА, полученные при асептической пункции коленных суставов, из которых удалялись ИК с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) ( Haskova v. е.а. 1978). Освобовдеяный от Ик й ПЭГ СЭ хранился при -70°С. Перед использованием образцы СЭ размораживали и вносили в конечных разведещих ИКС от 1:2 до 1:16 (Mulero J.е.а. 1989).

Уровень пролиферации оценивался по включению меченного % тимидина, вносимого в культуры по I мкКи на лунку за 18 часов до окончания культивирования. Содержимое лунок с помощью автоматического сборщика меток переносилось на сте-кловолоконные'фильтры (Flow Lab. ). Включение % - метки выражалось в импульсах/минуту (имя/мин), высчитанных как средние значения из триплетов .для всех видов культур.

Для индукции трех типов неспецифических Тс использовали не стимулированные культуры ШК.преинкУбкрованные 24 часа, 72-часовыё культуры,стимулированные ФГА-Р (Sigma ),10мкг/мл, гистамином (Serva ),50 мкг/мл,которые после культивирования обрабатывались митомицином С ( Serva ),50 мкг/мл. Такие клетки,в соотношении 1:1 вносили во вторичные аллоген-ные или аутологичяые культуры 1Ж, стимулированные ЫЛ.

6

%-тимидин добавляляся за 6 часов до окончания культивирования,интенсивность пролиферации оценивали через 72 часа описанным выше методом.Для оценки активности Тс высчитывали индекс супрессии (¡1С): число имп/мид.опыт х 1ш7о ^^ ^ ~ число имп/мин, контроль

Активность растворимых супрессорннх факторов.продуцируемых субпопуляциями Тс,оценивали по способности супернатантов культур ¡«Ж,стимулированных ФГА (СфГА^ и гистамином (Сгист>) изменять пролиферативный ответ вторичных культур МНК здоровых и больных РА, стимулированных МЛ,как описано вше.

Б части исследований к тест-системе ШК больных РА добавлялись аллогенные LMK здоровых людей,обогащенные Т-лимфо-цитами (1:10) и обработанные митомицином С.

Интенсивность пролиферации оценивалась, как описано выше.

Математическая обработка результатов включала составление зариацонных рядов и подсчет средних арифметических величин (¡;i),ошибки средних ( т ),частоты повышения или снижения исследуемого параметра,выраженной в процентах и определяемой с помощью таблиц Генеса (1967).Дня сравнения средних величин использован W -критерий Зклкоксона-Манна-Уитни^в части исследований - параметрический критерий Стьюдента. Достоверность различий эмпирических и ожидаемых частот оценивалась по критерию соответствия X^ Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение пролииераишнок активности цельных и обедненных Мц культур 1»Ж здоровых и больных РА. У бальных РА в CS, CT .и IK присутствуют повышенные количества активированных В-лим-фоцитов (Carter S.D., 1981).поэтому на первом этапе работы целесообразной представлялась оценка уровня нестимулированной и стимулированной К Л пролиферации 3-лим«оцитов в культурах i,üK ПК больных РА с разними клиническими характеристиками РА.

Ыодель пролиферации, стшулированной МЛ,является наиболее приближенной к условиям in vivo (Yen А., 1982 ), поскольку зависима не только от !Лц,но и от Т-клеток,что позволяет изучать регуляторные влияния ¡.1ц и Т-лимфоцитов.

Установлено,что средние значения спонтанней пролиферации культур i.illlv больных вше,чем у здоровых людей и достоверно возрастают с усилением активности Боспалени>1.

Стимулированная МЛ пролиферация,имея тенденцию к увеличению в сравнении с донорами, также достоверно увеличивалась с ростом активности воспалительного процесса.

В подгруппах серопозитивных и серонегативных (Зольных достоверные различил пролиферации показаны с использованием частот отклонения показателей от их нормативных значений. Было установлено,что высокая частота повышения спонтанной пролиферации определяется у серопозитивных больных в 3,5 раза чаще,чем у серонегативных (94 ж 25% соответственно). Ш-индуцированная пролиферация у больных первой подгруппы повышалась почти в 2 раза чаще,чем у серонегативных больных.

Таким образом,уровни спонтанной пролиферации МНК Ж достоверно выше у больных РА в сравнении со здоровыми и возрастает с усилением активности воспаления.Показатели Ш-сти-мулированной пролиферации.также увеличиваясь с•активностью воспаления,наиболее часто были повышены у серопозитивных больных.

При изучении причин,приводящих к усилению пролиферации В-лимфоцитов у больных РА,особого внимания заслуживали Мц, поскольку разнообразные тношшы участвуют и в реализации воспаления,и в регуляции функций лимфоцитов.

Использование культур несепарированных и обедненных Мц позволяло оценить интегральное влияние Мц на спонтанную и индуцированную МЛ пролиферацию.

Было установлено,что спонтанная пролиферация культур, обедненных Мц,достоверно возрастает и у здоровых людей,и у больных РА.Показатели ЫЛ-индуцированной пролиферации имели тенденцию к увеличению,более выраженную у здоровых людей.

Достоверное увеличение спонтанной и Ш-стимулированной пролиферации после элиминации Мц показано в культурах ШК от серопозитивных больных.

Важно отметить,что у больных с высокой активностью воспалительного процесса и при .диагностических титрах РФ прирост пролиферации МНК, обедненных Liq, существенно увеличивается. Это позволяет предполагать,что у больных РА в таких случаях усилено действие монокинов,стимулирующих пролиферацию,что монет быть связано не только с их. гиперпродукцией,но и с изменением 'чувствительности к ним В-лимфоцитов или .других клеток, опосредующих ростстимулирующие влияния.

Регуляторные влияния Мц обеспечиваются растворимыми факторами (Eosenberg,1986),продукция которых при РА в большинстве случаев усилена. Особое значение имеют ПГЕ,, и Ш-1,

8

поскольку их действие на пролиферацию лимфоцитов противоположно (?а1ко£г е., 1983, йетБа б., 1982). Изучение влияния ПГЕ^ на пролиферацию культур МНК.стимулированных ЦП. Для изучения характера влияния ШЕ^ на пролифера-тивпую активность В-лимфоцитов в культурах, стимулированных МЛ,использованы методы,позволяющие менять концентрацию Ш'^ в культурах либо введением индометацина,либо добавлением различных доз ПЕ^ в несепарированные и обедненные Мц и обогащенные В-лимфоцитами культуры.

Внесение ПБ^ в нарастающих концентрациях в культуры МНК до и после обеднения их Мц приводило у дозозависимому угнетению Г/ш-индуцированной пролиферации и у здоровых людей, и у больных РА.Максимальное снижение пролиферации показано в культурах несепарированных МНК больных РА,связанное только со степенью активности воспалительного процесса.

Блокирование простагландшсинтетазы индометацияом в культурах ШК здоровых и больных РА приводило к противоположным результатам (Табл.1).

Таблица I

Влияние индометацина на пролиферацию культур МНК" здоровых людей и больных РА,стимулированных МЛ

группы Уровни пролиферации (M+rrv), имп/лин

обеледо- д ванных без индометацина п с ивдометацином

I Здор.л. 31 21386,4+1512,2 31 21395,6+1009,6

2. Больные

РА 53 22474,1+790,3 42 18051,5+765,Iх*^

С активностью:

I степени 16 18708,1+1133 12 17417,1+1065,6

II-III

степени 37 24102,6+898 30 18305,2+974,9х

Серопозитив-

ным РА 33 22846,2+940,4 25 17646,I+II6IX

Серонегатив-

ным РА 20 21860+1406,4 17 18647,6+787,Iх

X - Р< 0,05 в сравнении'с культура.™ без индометацина хх - Р < 0,05 в сравнении со здоровыми

Как еле,дует из табл.1, индометацин не влиял на МЛ-инду-цированную пролиферацию донорских культур ШК,но привода к достоверному снижению ответа на МЛ культур.больных РА.Следует отметить однотипное угнетение пролиферации в культурах от больных с различными характеристками РА.

Внесение 10-6М ПГЕ2 в культуры,обогащенные В-лимфоцита-ми,такие приводило к различным результатам у здоровых и больных РА (Табл.2).

Таблица 2

Влияние ПГЕ2 на пролиферацию культур СДЗ-СД7-СД8~ лимфоцитов здоровых и больных РА,стимулированных Ш

группы Уровни пролиферации (М+ т, ), имп/мин

ооследо- п ванных без ПГЕ2 с I0-b!.I ПГЕ2

I. Здоров. II 11143,9^1728,3 10023,8*1049,8

люда

2. Больные ij

ра 10 23893,-9*1173,3 25581,4*1233,7х

Серопози-

тивным ра 7 27320,6*1851,8 31374,7±2122,2ХХ

Серонега-

тивным ра 3 15896,I±I52I,I 15397*1705,9

х - Р< 0,05 в сравнении со здоровыми

хх - Р< 0,05 в сравнении с серонегативными больными

Полученнные данные свидетельствуют, что культуры больных РА усиливают пролиферативный ответ на МЛ при культивировании с ili'^. Результаты подтверждают данные о том, В-лиифоциты больных: РА нечувствительны к ингибирующим влияниям ПГЕ^ (Alvarellos А.., Lipaky P.E., 1988).

Важно отметить, что DTEg стимулировал пролиферацию культур, обогащенных В- лимфоцитами от серопозитивных больных, тогда как у серонегативных такого влияния не обнаружено .

Таким образом, угнетение ЫЛ-индуцироваяной пролиферации этим цитокияом, наблюдаемое в культурах ШК больных, очевидно, не связано с прямым ингибирующим его влиянием на пролиферацию B-лимфоцитов, а опосредуется воздействием избытка ПГЁ2 на субпопуляции Т-лимфоцитов, выработку ряда

регуляторкых факторов. В частности,избыток этого цитокйна обуславливает угнетение синтеза Ш1-1, как показано в эксперименте ( Маркова Е.В.,1991 ).

Изучение влияния рекомбинантного на пролиферацию

культур :/ИК.стимулированных И» С использованием ¡культур несепарировакннх и обедненных Мц KHK показан различный эффект рекомбинантного Ш-I^ на 1Л1-индуцированную пролиферацию культур от здоровых людей и больных РА (Рис.1 ).

Как вццно из рисунка, средний уровень пролиферации культур здоровых людей был достоверно вше,чем у больных РА. Прирост пролиферации в культурах с добавлением Ш-1<6 -был наибольшие до удаления Г.щ ( 50$ относительно контроля), а после элиминации их отчетливо отмечалась дозозависшость стимулирующего влияния цитокина.

В культурах !.Ж больных РА наблюдалось достоверное снижение средних уровней Ш-стимулированной пролиферации как в сравнении с культурами без добавления , так и с до-

норскими. Ва;;шо отметить, что в культурах больных после обеднения ! .ц уровни пролиферации несколько повышались.

Полученные результаты могут объясняться с позиций механизма аутопегуляции продукции ИП-1. Так,показано,что введение \Ш-£<£ л культурп JHUC больных РА, где этот цитокин пподуципуется в избытке, монет угнетать продукцию ИП-1

культур (Dinarello С .А. , 1986 ) ,Т100Лв удаления Мц механизм аутопегуляции перестает действовать,а снижение эффекта ИЛ-1 з культурах больных РЛ в сравнении со здоровыми глог.ет бг.ть связано и с уменьшением чувствительности В-лим-фоцмтоз больных РЛ к действию ИЯ-1^ ( Киселев С.В..,1990).

Изучение влияния рекомбинаптннх Ж ,ß ка пролиферацию культур, стимулиповантсг. Г.Ш. Важнейшими регуляторами проли-

.'ративноп активности лимфоцитов, а также функций МцД!ф яг —отся Н<5. Так, угнетает образование lli'Kg и стимулирует выработку IUI—I ( Knop J., 1983).

Введение в культуры I.SffiC здорових людей,стимулированных •Ж, двух доз И<5 Л иß не приводило к существенным изменениям нподиферативного ответа; после обеднения культур моноцитами проявлялся антипролиферативный эффект, особенно выраженный у Шß. При сравнении показателей пролиферации культур

тыс. ШП/мин

30

I нг/мя 10 нг/мл I

I нг/мл 10 нг/мл 2

|—

7

Л

здоровые люда

больные РА

Рис.1 Влияние рекомбинантного на пролиферацию культур несепах-ированных (I) и

обедненных Ыц (2) МНК здороных людей и больных РА,стимулированных Ш

чдоровых людей с соответствующими показателями больных РА показано, что уровни пролиферации культур МНК больных РА оставались выше,чем в донорских культурах. Достоверное снижение пролиферации в культурах больных было показано только при добавлении максимальной дозы Иф^з .

При добавлении обеих доз Ифс£ и 10^ БД/мл ИФ ß показано достоверное ослабление ингибирующего влияния этих цнтокннов на МЛ-индуцированную пролиферацию МНК больных РА с активности) II-III степени в сравнении с активностью воспаления I.

Наиболее наглядные различия влияния ИФ установлены в культурах от серопозитивных и серонегативных больных (Табл.3).

Как еле,дует из таблицы, культуры МНК от серонегативных больных РА, до и после элиминации Мц, достоверно снижали ответ на МЛ при добавлении ИФ ¡1 и ß в прямой зависимости от дозы добавляемого в культуры цитокина. Культуры МНК от больных с высокими титрами РФ недостоверно снижали пролиферацию', за исключением культур с добавлением 10^ ДЦ/мл ИФji> . При этом уровни их пролиферации оставались достоверно выше,чем у серонегативных больных.

В этих подгруппах больных показаны выраженные различия и в частоте снижения показателей пролиферации относительно нормативных значений. В среднем пролиферация культур серонегативных больных РА снижалась под влиянием ИФ в 3 раза чаще в сравнении с серопозитивными больными.

Таким образом, антшролиферативное влияние ИФ «i и ß> на МЛ-стимулированнуга пролиферацию культур ШК больных РА уменьшается с ростом активности воспаления и, особенно, при серо-позитивном варианте РА.Одним из механизмов наблюдаемых различий может быть блокирование активности ИФ аутоантителами, выявленными у серопозитивных больных ( Prümmer о., 1939), а также коррелирующая со степенью активности гиперпродукцвя ПГЕ2 - антагониста ИФ.

Изучение влияния рекомбинантного <ЖОо£ на пролиферацию культур СДЗ~СД7~СД8~лимфрцитов. стимулированных МД. ^Иммуяо-регуляторные свойства ФН0с£ включают активацию МцД1ф, естественных киллеров, модуляцию пролиферации и дифференцировка лимфоцитов ( Недоспасов С.А. ,1987,. Saxne Т., I988,Yocum D., 1938,1939).Однако характер влияния Ш0<£ на функции В-лимфо-цитов больных РА в литературе практически не освещен.

Таблица 3

Влияние рекомбинантяых Ш и на пролиферацию культур несепарированных и обедненных Мц ЫНК больных серопозитивным и серонегативным РА, стимулированных 1ГЛ

Культуры МНК больных:

Уровни пролиферации культур (M+nv) ,имп/мин

с т оС а т ß

га^ВД/мл Ю4вд/мл Ю^ВД/мл 104ЕД/мл

вез Иф

I

£Й

ГО И О

Э

а к

о

о а> о а

Серонега-

тевнырл ра

Серопозитивным РА

7 25072,2+ 1547,2

13 25669+ 2062

20051,5+ 2534,6х

26821,5+ 2637,5**

16085,1+ 15907,6+ 14433,5+1071,9

2408,1А

22771,7+ 2301,Г

1455

23506+ 2ISI,7n

18304,9+1823,3

ш В

со -о о

Серонегативным РА

Серопозитивным РА

6 12

25155+ 152977

26515,4+ 1889

17610,1+ 2589,3*

26102,9+

2324

хх

16360,6+ 14415,6+ 11150,2+702,2

2246,9х 1744,3х

21561,2+ 21288,1+ 18797,1+1832,8:

1683,8" 2043,3х*

х,хх

х - Р< 0,05 в сравнении с культурами без ИФ

хх - Р< 0,05 в сравнении с культурами от серонегативных больных

Изучено влшиие .двух доз (50 ;г 100 ДЦ/мл) человеческого рекомбпначтного фактора некроза опухолл c¿ на пролиферацию обогащенных В-,лимфоцитами культур здоровых и больных РА.

Данные,представленные па рисунке 2,демонстрируют существенные различия- в стимулирующем и ингибирующем влиянии QH0<¿ на пролиферацию культур здоровых и больных РА. Более высокие значения как стимулирующих, так и ингиби-рупцих 113 фактора показаны в' культурах от больных РА. Это,вероятно, связано как со степенью активации В-лям-фоцптов in vivo .которая вьгле у больных PA (Fauci A.S., IS83), так и с присутствием цитокинов-синергистов и/или антагонистов ФИО o¿ .

Следует отметить, что, по данным литературы, присутствие <2-10<¿ в СЬ: и, реке, ь Uli более типично для больных серопозитивньи PA (Saxne Т., 1938, Yocum D.E., 1939). Возможно, поэтому наблюдаемые различия влияния фактора на пролиферации СДЗ~СД?~СД8~лимфоцитов наиболее выражены у серопозптивпых и серонегаишных больных (Рис.2).

Так, стимулирующий индекс влшния у больных с джаг-постическиш титрами РФ был почти в четыре раза выше в сравнении с серояегативпыми больными,а у больных сероне-гатявши РА отсутствовал ингибпрующий ИЗ (при 50 ЕД/мл), либо был невысок: -1,1+0,05 против 4,42+2 у серопозитив-ных больных при концентрации фактора в культуре 100 ЕД/мл.

Данные литературы свидетельствуют, что повышение количества ОНО обычно обнаруживается в СЕ больных РА (Di Giovine D.E. е.а., 1988 ) и очень редко - в циркуляции ( íocum D.E. е.а., 1989 );вероятно,свое основ-uoе действие ч,актор оказывает в полости воспаленного сустава.

Однако, CL" пораженных суставов содержит множество .других факторов, регулирующих и функции лимфоцитов, и воспаление, которое у больных с разными серологическими вариантами РА чаще всего имеэт и разную степень выраженности.

Поэтому интегральны!; эффект влияния продуктов очага зоспалеппя при РА на пролиферацию В.--лимфоцитов заслуживал отдельного рассмотрения.

ИНЩЖС влияния

активация

/ //А

суютссзи

к

т-1-1— I-1 I-1 I-1 I

5 0 5

| | - здоровые люди

- больные РА

- серонегативный РА {\\ч| - серопозитивный РА

Рис.2 Влияние рекомбинантното 'Ш0о£ на пролиферацию СДЗ~СД?~СД8~лим©оцитов здоровых и больных РА, стимулированных Ш1

Изучение влияния факторов СЭ больных РА на пролиферации СДЗ~СД7~СД8~лимфоцитов здоровых люде^. стимулированных МЛ'.

Так как отвечаемость В-лимфодитов больных РА на регу-ляторные факторы изменена,оценка влияния СЭ больных проведена на культурах здоровых людей,обогащенных В-лимфо-цитами,что позволило оценить суммарный- эффект факторов ревматоидного СЭ на МЛ-индуцированную пролифершзпо В-лимфоцитов.

Как следует из таблицы 4, СЭ от больных серопозитив-ным РА во всех случаях оказывал-стимулирующее влияние, а от серонегативных - умеренное ингибируицее влияние на МЛ-индуцированную пролиферацию обогащенных В-лимфоцитами культур.

Результаты позволяют заключить,что СН больных с разными серологическими вариантами РА Существенно различается по спектру и, возможно,по количеству содержащихся в ней цитокинов и других факторов,что обусловливает и различие влияния СЭ на пролиферацию В-лимфоцитой. Можно предполагать, что преобладание ингибируйщих влиядий (или ингибиторов стимулирующих) обусловливает в итоге ингибирующнй эффект СЭ от серонегативных больных на МЛ-стимулированную пролиферацию В-лимфоцйтов.

Изучение активности неспецифических То у больных* РА и механизмов ее угнетения.' Из литературы известен дефект Т-клеточной супрессии у больных РА,но при этом недостаточно сведений о Т-супрессорных влияниях именно на В-клеточную пролиферацию как в аллогенных, так и в ауто-логичных тест-системах; как правило, Отсутствует и комплексная оценка активности различных субпопуляций Тс.

Показано снижение активности трех типов неспецифических Тс у больных РА'при оценке юс способности угнетать М-индуцированную пролиферацию вторичных культур МНК здоровых людей. При этом показатели функции Тс от серопозигивных больных РА характеризовались более выраженным снижением ИС у спонтанных и ФГА-индуцирован-ных То в сравнении с серонегативными больными (Тайл,5). Обращало внимание ЮО^-ное снижение показателей активности Тс, индуцированных■гистамином в сравнении с нормативными значениями.

Таблица 4

Влияние синовиального экссудата больных РА на Ш-индуцированную пролиферацию культур СДЗ~СД7~СД8-лимфоцитов здоровых людей

Индексы влияния на пролиферацию культур СДЗ~СД7 СД8

СЭ больных: п лимфоцитов СЭ от больных РА в разведениях:

1-2 174 ГТё 1716

Х.Серонегатив-

ныРА 3 -1,68+0,4 -1,73+0,2 -1,59+0,17 -1,46+0,11 2.0еропозпт1пз-

ным РА 7 +3,95+1,3х +4,33+1,6х +5,47+2,6х +4,5+0,3х

- Р 0,05 в сравнении с серонегатквньи РА

Таблица 5

Показатели активности неспецифических Т-сущрессоров здоровых людей и болышх РА, иигпбпрущпх ¡Л-стяглулированну» пролиферацию ЦИК

Группы обследованных

Показатели актнзности неспецифических Т-супрессопов (ИС,£)т-

споятанные Тс

х>ГА-11Н,дуцпр. Тс

Гкстамин-индуцир.Тс

I.Здоровые люди

2.Больные РА

3.Больные серо-негативным РА

4.Больные серо-позитивным РА

35,4+1,3 (23) 16,5+2,Зх(20)

19,7+1,3 (9)

и.э+г^Чп)

31,8+2,1 (20) 12,3+1,8Х(25)

17,5+2,3 (9)

9,4+1,9хх(16)

35,8+2,1 (21) 12+1,7х (27)

15,9+2,7 (II)

9,3+2,3 (16)

В сокбках - число наблюдений;

х - Р <. 0,05 в сравнении со здоровыми людьми

хх - Р< 0,05 в сравнении с больными серонегативным РА

Использованная нами тест-система для оценки активности Тс больных РА не исключала аллогенных взаимодействий.Поэтому бшга проведено исследование функции трех типов неспецифических Тс в аутологичной тест-системе больных серопози-тивным РА.

Полученные результаты свидетельствуют не только об отсутствии супрессии MI-индуцированной пролиферации,но и о хелперяом эффекте,который составил от 5 до 26% для спонтанных Тс,от 2 до 18 - для ЕГА-индуцировашшх и от 2,1 до 37% дая гастамин-индуцированных Тс. Лишь у одного больного этой группы сохранялась супреосорная активность при низких ее значениях.

На основании полученных данных мокяо предположить нарушение функций неспецийических Тс,обусловленное или снижением продукции растворимых СФ, или уменьшением чувствительности к ним клеток-мишеней.

При сравнении суцрессиругащих влияний на М-индуциро-ваннуга пролиферацию МНК здоровых людей супернатантов культур МНК, стимулированных ШГА (Сфрд), от здоровых людей и больных РА показано,чТо ИС С^рд больных РА значительно ниже в сравнении с ИС Сфрд от здоровых людей. (Рис.3,А). Вероятно, продукция СФ при индукции ФГА в культурах МНК больных РА снижена.

Если отвечающими клетками ЫЛ-стимулированных культур были ЫНК больных РА, тс обнаруживалась неспособность С(Г)рд от здоровых людей лнгибировать их пролиферацию (Рис.3,Б). Как следует из рисунка,супрессирующее действие проявлялось только после добавления в культуры отвечающих МНК больных РА аллогенных Т-клеток здоровых людей.

По данным литературы, супрессирующее действие неспецифических Тс на Ш-индуцированную пролиферацию В-лимфоцитоз опосредовано влиянием СФ на субпопуляции СД4+ Т-клеток первичных культур (Peters.м. е.а. , 1983). Очевидно, введение в тест-систему обогащенной Т-лимфоцитами суспензии НЕ от здоровых, людей восстанавливало взаимодействие СД4+и СД8+ клеток, что и приводило к увеличению ИС.

Таким образом, угнетение активности неспецифических Тс у больных РА, особенно демонстративное в аутологичной тест-системе, обусловлено снижением продукции СФ и нарушением взаимодействия их с клетками-мишенями. Следует подчеркнуть,

отзкчашй! 1ллет131 дополнительные факторы % супрессии

йо зп 40 50

1лнк здоровых °фга 3д°р03ьк 1--1

°ФГА ШШ Рл у///////////+,-

отвечавши клетки дополнительные факторы % супрессии

10 20 30 4п 50

ынк больных ра сфГА здоровых

сфгаздороз1К+т-кл;зд.

Т-клетки здоровых

Рис.3 Супрессорная активность Сфрд здоровых людей и больных РА в МЛ-стимулированных культурах здоровых- и больных РА

что нарушения активности исследованных субпопуляций Тс наиболее выражены оказались при серопозитивном варианте заболевания.

Вышеизложенное позволяет заключить, что у больных РА нарушена цитокиновая регуляция пролиферации В-лимфоцитов, что обусловлено изменением чувствительности и клеток, опосредующих регуляторные влияния,и прямо взаимодействующих с ними В-лимфоцнтоь.

Вероятно, эти нарушения лежат в основе гиперактивации В—лимфоцитов,определяющей развитие одного из звеньев имму-нопатогенеза РА, связанного с избыточной продукцией АТ разных специфичностей и образованием Ж разного состава., участвующих в реализации ревматоидного воспаления.

Дальнейшее изучение механизмов нарушений пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов у больных РА представляется перспективным, так как открывает новые возможности иммунотерапии, основанные 'на понимании молекуляро-клеточных механизмов активации В-лимфоцитов.

Результаты наших исследований убедительно свидетельствуют о том, что нарушения регуляции пролиферации В-лимфоцитов более виражени у серопозитивных больных РА.

Эти особенности проявляются в разных ответах ¡.¡Л-стиму-лированных культур больных серопозитивным и серонегатпвным РА на регуляторные цитокины ( 11Л-1 , ИФ, Ш0<£ , ПТЕ^), в разной степени выраженности угнетения функций неспецифических Тс, в различиях действия факторов СЭ от серопозитивных и оерояегагивных больных на проллферацшо культур, обогащенных В-лимфоцитами здоровых людей.

Таким образом, две серологичесгде формы РА патогенетически представляются разнородными,что обусловливает и различия их клинических проявлений. Зтот вывод ставит перед ревматологами и клиническими иммунологами новые задачи по разработке комплекса иммунологических методов,позволяющих выявить эти различия в условиях клиники.

На основании этих различий необходим поиск новых подходов к дифференцированной иммунотерашш двух форм РА. Решение таких задач поможет в бу,дущем повысить эффективность лечения этого тяжелого заболевания.

3 ы в о д ы

1. У больных РА установлено нарушение цитокин-опосредовая-ной регуляции пролиферации В-лимфоцитов, более выраженное

у лиц с высокими титрами РФ и максимальной степенью активности воспаления,что обусловливает различия механизмов иммунопатогенеза и клинических проявлений болезни.

2. Установлено нарушение контроля пролиферации В-лимфоцитов моноцитами в культурах от больных РА,обусловленное изменением чувствительности Т- и В-лимфоцитов к действию ИЛ-I и ПГЕ2; у больных серопозитивннм РА, в отличие от серойега-тивного, ПГЕ^ вызывает стимуляцию ответа на Ш в культурах, обогащенных В-лимфоцитами.

3. Выявлено ингибирующее действие ИФ ж. J> на МЛ-иядуцнро-ваяную пролиферацию В-лимфоцитов в культурах МНК ПК, определяемое преимущественно у больных с доброкачественным течением РА: минимальной степенью активности воспаления и низкими титрами РФ.

4. ®0 ^ оказывает как стимулирующее,так и антипролифератив-яое действие в культурах,обогащенных В-лимфоцитами больных РА. Оба эффекта более выражены в культурах от серопозитивных больных в сравнении с серонегативными; одной из причин наблюдаемых различий может быть разная чувствительность В-лимфоцитов серопозитивных и серонегативных больных К действию ФНОс^ .

5. Влияние факторов СЭ от больных серопозитивннм и сероне-гативнш РА на пролиферацию обогащенных В-лимфоцитами культур здоровых людей различно. В первом случае преобладает активность стимулирующих, а во втором — ингибирующих MI-ипдуцированную пролиферацию факторов.

6. Одним из механизмов, обеспечивающих В-клеточную активацию у больных РА, является снижение функций неспецифических То, обусловленное,да субпоиуляций <1ГА-индуцированных Тс, уменьшением продукции супрессорных факторов и снижением чувствительности к ним Т-лштфоцитов мишеней.

Список работ.опубликованных по теме диссертации I. Ширинский B.C.,Кирилова С.Ф. Механизмы нарушения пролиферации З-димфоцитов у больных ревматоидным артритом // Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны:

Тез. докл. научяо-практ.конк. - Красноярск, 1988.- т.1. - 'C.îv.

2. Ширинский B.C..Кирикова С.5. Проблема регуляции .¿улкцп? В-лимфоцигов при ревматоидном артрите // Ревматология.-1989.С.57-64.

3. Кирикова O.S. .Шринский B.C. Механизмы наружная регуатгдп функций З-лиифоцятов при ревматоидном артрите // I Всесоюзный съезд иммунологов,Сочи,15-17 ноября IDCSr. : Тезпеп

до кланов.-¡.1. ,1989.-т.2.-С.62.

4. Кирикова С.Ф. .Шцринский B.C. Наруиеная механизмов регуляции пролиферации В-лимфоцитов у больных ревматоидна артритом // Молодые ученые-медшш - науке к практическому здравоохранению: Тез. докл. конф. молодых ученых СО liZl СССР.- Новосибирск,1989.- т.1.-С.73.

5. Ширинский B.C. .Кирикова С.у. Изучение синтеза и акцепции лимфоцитами больных ревматоидном • артритом супрессоп-ных факторов // Иммунология.- 1990.- iS.- С.57-59.

6. Kirikova S.F., Shirinsky V.S. The role of monocytes in disturbances of lymphoid cells in patients with rheumatoid arthritis // Mononuclear phagocyte system in normal and pathological states.- Novosibirsk, 1990.- P. 179-180.

7. Кирикова С.Э. Нарушения регуляции пролиферации З-лгыфо-цитов в механизмах яерсистенщш зоспшгенкя при ревматоидном артрите //Всесоюзный симпозиум "Патогенез хронического воспаления", Новосибирск, 11-13 сентября 1031г.: Тезисц докл.-С.87.

8. Кирикова C.'i. Нарушение регуляции пролиферации З-лимфо-цитов у больных ревматопднш артритом // 17 ЗсосоэзннГ. съезд ревматологов, 1линск,9-П октябри ISDI?.: Тезисы докл. - С.155.