Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Изучение фармакологической активности производных пирроло[1,2-[А]]бензимидазола, проявляющих антиоксидантные и антирадиккальные свойства

На правах рукописи

ЕЛЬЦОВ А ЛАРИСА ВИТАЛЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРРОЛО[1,2-а]БЕНЗИМИДАЗОЛА, ПРОЯВЛЯЮЩИХ АНТИОКСИДАНТНЫЕ И АНТИРАДИКАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВОЛГОГРАД-2010

(А

004601030

Работа выполнена в НИИ фармакологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент

Косолапое Вадим Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Хоронько Владимир Владиленович; доктор биологических наук Перфилова Валентина Николаевна

Ведущая организация: ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Защита диссертации состоится «2.2.» апреля 2010 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.008.02 по защитам диссертаций при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава». Автореферат разослан «2-0» марта 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор

А.Р. Бабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Свободно-радикальное окисление является необходимым процессом для нормального функционирования клеток, но вместе с тем это и один из универсальных механизмов их повреждения [Владимиров, 2000; Клебанов, 2006; Меньшикова, 2006, 2008]. Неконтролируемая генерация активных форм кислорода, кислородных метаболитов и сбой в функционировании антиоксидантной системы вызывают окислительное повреждение биомолекул, что приводит к дисфункции клеток и тканей организма [Шанин, 2003; Halliwell, 2005]. Окислительный стресс играет ключевую роль в патогенезе многих патологических состояний: ги-поксических и ишемических повреждениях органов [Лукьянова, 2000; Гусев, 2001; Мирзоян, 2003; Atahan, 2007]; интоксикациях химическими агентами [Сейдахмето-ва, 2005] и заболеваниях печени [Warner 2004; Fukai, 2005]; сахарном диабете и его осложнениях [Балаболкин, 2005; Дедов, 2006]; при интенсивных физических и психоэмоциональных нагрузках, переутомлении, старении [Гусев, 1997; Анисимов, 2007; Harman, 2006]. Важную роль в клинической практике играют антиоксидант-ные средства, способные стабилизировать структуру и функции клеточных мембран и поддерживать структурный гомеостаз организма в условиях патологии [Gutterjdge, 2000; Арзамасцева, 2006]. Антиоксидантныс препараты применяются как для профилактики, так и для лечения свободно-радикальных патологий [Сторожок, 2002; Ргуог, 2006].

Однако, несмотря на широкий спектр веществ с антиоксидантным и антирадикальным действием в эксперименте, эффективных лекарственных средств, внедренных в клиническую практику, - незначительное количество. Кроме того, существующие препараты имеют ряд недостатков, связанных с особенностями биологического эффекта и его величиной, либо с токсичностью [Шанин, 2003; Бурлакова, 2006]. Поэтому поиск новых высокоэффективных антиоксидантных средств остается актуальным. Перспективным является поиск и разработка новых высокоэффективных антиоксидантных средств в ряду производных бензимидазола [Панченко,

1990; Островский, 1995; Анисимова, 2002; Косолапое, 2007]. Молекулу бензимида-зола можно отнести к так называемым «привилегированным химическим структурам» [DeSimone, 2004]. Конденсированные производные бензимидазола - пирро-ло[1,2-а]бензимидазолы - соединения со сложной я-электронноизбыточной системой, обладающие более высоким антиоксидантным потенциалом действия [Анисимова, 1996; Спасов, 2001]. Все вышеперечисленное делает актуальным поиск и изучение высокоактивных веществ с антиоксидантным и антирадикальным спектром действия среди производных ряда пирроло[1,2-а]бензимидазолов.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ государственной регистрации 01200116045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиок-сидантные свойства» (№ государственной регистрации 01200609434), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета.

Цель исследования. Поиск и исследование механизмов действия на процессы пероксидации новых высокоэффективных антиоксидантных веществ среди производных пирроло[1,2-а]бензимидазола; выбор наиболее активных соединений и доклиническое изучение их специфической активности на экспериментальных моделях свободно-радикальных патологий.

Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от 31.10.2003 г.).

Задачи исследования

1. Изучить антиоксидантные и антирадикальные свойства новых производных пирроло[1,2-а]бензимидазола и препаратов сравнения на моделях in vitro.

2. Исследовать показатели острой токсичности наиболее активных соединений, рассчитать их терапевтический индекс и выбрать наиболее эффективные вещества для доклинического изучения специфической фармакологической активности.

3. Определить зависимость действия изучаемых соединений на свободно-радикальные процессы от их химических структур и физико-химических свойств.

4. Изучить защитные свойства наиболее активных антиоксидантов и препаратов сравнения на различных моделях с активацией процессов пероксидации при гипок-сических и ишемичсских повреждениях головного мозга.

5. Исследовать влияние соединений, проявляющих наибольшую антиоксидант-ную и антирадикальную активность, на показатели перскисного окисления, поведенческую активность и неврологический статус у крыс при двухсосудистой ишемии головного мозга.

6. Изучить действия веществ с высокими антиоксидантными и антирадикальными свойствами на процессы перекисного окисления липидов у крыс при тотальном ишемическом повреждении головного мозга с реперфузией.

7. Исследовать влияние веществ с наибольшими антиоксидантной и антирадикальной активностью на показатели процессов пероксидации, биохимические процессы, реологические параметры крови и основные функциональные характеристики печени у крыс с токсическим тетрахлорметановым гепатитом.

Научная новизна. Впервые были получены данные о влиянии 25 оригинальных производных пирроло[1,2-а]бензимидазола на свободно-радикальные процессы (СРП). Впервые была установлена взаимосвязь между структурой новых соединений и их антиоксидантной активностью (AOA). Были изучены механизмы действия наиболее активных веществ 8,9-дифенил-Ы1-диэтиламиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазола, 8-метокси-9-фенил-Ы'-морфолиноэтил-пирроло[1,2-а]бенз-

имидазола и 8-фенил-9-(3,5-ди-метокси-фенил)-М'-морфолиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазола на различные звенья СРП in vitro и in vivo. Установлено, что анти-оксидантная и антирадикальная активности (АРА) изученных соединений определяются физико-химическими свойствами их молекулы, показано, что АОА определяется стерическими параметрами молекулы, а АРА - также электронными и лигю-фильными характеристиками молекулы. Получены данные о влиянии соединений пирроло[1,2-а]бензимидазола на процессы пероксидации при гипоксических со-

стояниях, ишемических поражениях мозга, токсическом повреждении печени.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности поиска ингибиторов ПОЛ, проявляющих антиоксидант-ные и антирадикальные свойства, среди производных пирроло[1,2-а]бензимидазола. На основании выявленной зависимости АОА и АРА соединений от их структуры была выведена математическая зависимость, описываемые двумя регрессионными уравнениями, с помощью которых можно прогнозировать с высокой степенью достоверности тот или иной тип активности у новых соединений. Отработана методология поиска и изучения новых АО веществ с использованием современных методов исследования, даны рекомендации по направленному синтезу гетероциклических соединений. Получены данные о наличии у соединения РУ-792 противогипоксиче-ских, противоишсмических свойств, а также выявлена способность повышать деток-сицирующую функцию печени, снижать образование продуктов перекисного окисления липидов крови и тканей печени на фоне тетрахлорметанового гепатита. Выявленные антиоксидантные и антирадикальные эффекты вещества РУ-792, превосходившего по активности препарат сравнения, определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований соединения с целью создания на его основе нового антиоксидантного средства.

Реализация результатов исследования. Выявленные закономерности между химической структурой и способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов у замещенных производных пирроло[1,2-а]бензимидазола учитываются при синтезе новых веществ в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, в экспериментальной работе лаборатории органического синтеза НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Пирроло[1,2-а]бензимидазолы - перспективный класс соединений для поиска

новых веществ, способных ингибировать процессы перскисного окисления липидов.

2. Наиболее выраженные антиоксидантные и антирадикальные свойства выявлены для вещества под лабораторным шифром РУ-792, влияющего преимущественно на активность липопероксильного радикала и АВТ8-радикала.

3. Соединение РУ-792 по эффективности при острой гипобарической гипоксии, двухсосудистой ишемии головного мозга, тотальной ишемии-реперфузии головного мозга, а также при остром поражении печени четыреххлористым углеродом превосходит препарат сравнения мексидол.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались: на IX - XIII Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2004 - 2008 гг.); 62 - 66-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2004 - 2009 гг.); Международной научно-практической конференции молодых ученых «Вчеш майнбутнего» (Одесса, 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ (из них две в журналах, рецензируемых ВАК).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 2 5Рстраницах машинописного текста, иллюстрирована 44 рисунками и 47 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2 - 4), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего^?^ отечественных и¿<3зарубежных источника, и приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования Материалы. Объектами исследования являлись соединения, синтезированные в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета1. В работе исследовались 34 соединения, под лабораторным шифром «РУ», из них 25 относятся к »'-замещенным пирроло[1,2-а]бензимидазолам (ПБ) и 9 - к N9-замещенным имидазо[1,2-а]бензимидазолам (ИМБИ). В качестве препаратов сравнения были выбраны: тролокс (Fluka, Швейцария), бутилированный гидрокситолуол (дибунол) (Merck, Германия), мексидол (НИИ фармакологии РАМН, Россия).

Исследования проводились на 152 половозрелых нелинейных белых крысах обоего пола, массой 250-400 г. и 87 белых неинбредных мышах обоего пола массой 18-32 г., содержавшихся в условиях вивария на стандартной диете (ГОСТ Р 50258— 92) с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997).

Методы исследования. Методы изучения перекисного окисления липидов и механизмов антиоксидантного и антирадикалъного действия веществ. Скрининг антиоксидантных свойств новых веществ проводили на модели аскорбат-индуцируемого перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Панкин, 1975]. Скорость перекисных процессов оценивали по накоплению продуктов ПОЛ в реакции с тио-барбитуровой кислотой (ТБК) (Fluka, Швейцария). Аитирадикальная активность изучалась по способности веществ инактивировать свободный стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрил-гидразил (ДФПГ-) (Sigma, США) [Glavind, 1963]. Измерение хемилюминесценции проводилось на хемилюминомере «ХЛ-003» (Уфа, Россия). Фиксировался суммарный показатель светимости, который выражался в условных

1 Выражаем искреннюю благодарность к.х.н., ведущему научному сотруднику Вере Алексеевне Анисимовой за синтез и предоставление субстанции веществ.

8

единицах. Для изучения АОА веществ использовали метод Рег"-индуиированной хемилюминесценции желточных липопротеидов (ЖЛП) [Фархутдинов, 1995]. Для исследования АРА соединений применялся метод люминол-зависимой хемилюминесценции [Ссмешко, 2002], а также модель окисления 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолинУб-сульфоновой кислоты (ABTS-) [Rice-Evans, 1994]. Диеновые конъюгаты (ДК) в тканях органов оценивали спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-46 («Ломо», Россия) в тесте [Камышников, 2004]. Малоновый диальде-гид (МДА) в крови и органах определяли в реакции с ТБК с использованием бута-нольных экстрактов [Гаврилов, 1987; Андреева, 1988].

Определение активности антиоксидантиых ферментов. Активность супер-оксиддисмутазы (СОД) определяли по реакции окисления кверцетина (Sigma, США) [Костюк, 1990]. Глутатионпероксидазу (ГП) определяли по методу В.М. Моина (1986) с использованием дитионитробензойной кислоты (реактив Эллмана) (MP Biochemedicals, США).

Методы изучения гемореологических показателей крови. Измерение вязкости крови проводилось на анализаторе крови реологическом АКР-2 (МП «Комед» и НИИ физико-химической медицины, Россия). Вязкость крови изучалась при скоростях сдвига 300, 200,100,50,10 (с1), моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах [Добровольский, 1998]. Влияние веществ на агрегацию эритроцитов [Дегтярев, 2001] и агрегацию тромбоцитов [Born, 1962; Габбасова, 1989] исследовали на двухканалыюм лазерном анализаторе агрегации (модель 220 LA) (НПФ «Биола», Россия).

Острая гипобарическая гипоксия моделировалась в барокамере проточного тина. Животные помещались в условия, соответствующие подъему на «высоту» 11 тыс. м над уровнем моря. Оценивали время жизни «на высоте» до появления признаков терминальной стадии [Лукьянова, 1990], Ишемию головного мозга моделировали [Мирзоян, 2000] лигированием общих сонных артерий (наркоз кетамин, 80 мг/кг, в/бр). На 1, 2 и 3-й сутки после окклюзии регистрировали выживаемость животных, изучали неврологический статус, локомоторную активность, характер пове-

дения крыс в тесте «открытое поле». При оценке неврологического статуса у крыс оценивалось сохранение рефлексов [Буреш, 1991]. Показатели локомоторной активности регистрировали с помощью актометра («Ugo Basile», Италия). Через трое суток в крови и тканях мозга крыс определяли содержание МДА и ДК, активность ГП. Тотальную ишемию головного мозга с реперфузией создавали путем наложения окк-люзоров на общие сонные артерии в течение 30 минут (наркоз хлоралгидрат, 400 мг/кг, в/бр) с последующей 30-минутной реперфузией путем снятия лигатур; операция проводилась под контролем артериального давления (80/60 мм. рт. ст.) [Мирзо-ян, 2006]. Через 0,5 и 24 часа регистрировали выживаемость животных, в крови и тканях мозга определяли концентрацию МДА, активность СОД и ГП. Острый токсический гепатит моделировали однократным введением 50% масляного раствора тетрахлорметана (ТХМ) (0,5 мл/кг, в/бр) [Хабриев, 2005]. Спустя 24 часа у животных исследовали детоксицирующую (тест «гексеналового сна») и поглотительно-выделительную функции печени по бромсульфалеиновой пробе [Хабриев, 2005]. Оценивали активность основных печеночных ферментов - аланинаминотрансфера-зы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактат-дегидрогеназы (ЛДГ), белково-образовательную функцию печени по содержанию общего белка сыворотки крови и липидный профиль сыворотки крови. Изучали уровень ПОЛ по концентрации МДА и состояние антиоксидантного статуса, определяя активность СОД и ГП; измеряли гемореологические показатели (вязкость крови и АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и алциан-индуцированную агрегацию эритроцитов).

Изучение зависимости антиоксидантной активности от физико-химических свойств веществ. Для расчета физико-химических свойств производных бензими-дазола использовали квантово-химические методы2. Рассчитывались липофильные [Vellarkad, 1989], стерические [Arup, 1987] и электронные [Кларк, 1990] показатели

2 Выражаем глубокую признательность докторанту кафедры фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета к. б. н. Павлу Михайловичу Васильеву за содействие при исполнении данной работы.

изучаемых соединений и с помощью программ Microsoft® Excell 2007 и Statistica 6.0 использовались для построения классической регрессионной модели [Голендер, 1978].

Острую токсичность соединений изучали на мышах при внутрибрюшинном введении. Показатель LD50 рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона. Для расчета показателя условной широты терапевтического действия выводили условный терапевтический индекс (УТИ).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6,0 (StatSoft, США) и Excel 2007 (MS Office 2007, США) с применением парного критерия Стыодента (/) и точного метода Фишера.

Результаты экспериментов я их обсуждение

В результате проведенного скрининга 34 соединений производных бензимида-зола было установлено, что наибольшее количество веществ с высокой АОА (56%) обнаружено в ряду производных ПБ, тогда как в ряду производных ИМБИ активных веществ оказалось меньше - 22%. Также среди замещенных ПБ найдено 36% соединений с выраженными антирадикальными свойствами, тогда как среди ИМБИ таковых веществ было лишь 11%. Т.е. присутствие сопряженного пиррольного кольца в структуре молекулы вещества обуславливало наличие у последних более высоких как антиоксидантных (АО), так и антирадикальных (АР) свойств. Следует отметить, что наибольшие АО и АР эффекты проявили соединения, содержащие в структуре фенильные заместители. Возможно, это объясняется увеличением донорно-акцепторных свойств веществ и некоторой стабилизацией термодинамических и кинетических характеристик молекулы за счет введения замещенного фенилыюго фрагмента.

При изучении зависимости антиоксидантной и антирадикальной активностей от основных физико-химических свойств веществ было выведено два регрессионных уравнения: по антиоксидантной (1) и антирадикальной активности (2), с помощью которых можно прогнозировать тот или иной вид активности новых соедине-

ний в ряду пирроло[1,2-а]бензимидазолов.

Lg(mCso) = 4,925 + 7,766*10 4 MRr1j + 3,588*1 (Г3 МКщ, (1)

0,0025 0,0368

R = 0,810, S = 0,0563, F(2,12) -1,42, р = 0,00167,

AA„d(10"6) = - 2686,3 + 3,426 log2P0 + 1918,8 S/E/c+ri - 22,83МВС - (2)

0,000015 0,00616 0,00224

- 12,23 log2Pc- 11,46 log2PRJ + 0,2062 MRC2-12,91 log2PR3-

0,000404 0,000745 0,003442 0,000899

- 276,1(1: /E/c+ri f + 28,28 S/E/R3,

0,00145 0,0269

R = 0,866, S = II ,27, F(9,17) = 5,64, p = 0,00112,

где ИК» - концентрация, в которой вещество ингибирует реакцию перекисного окисления липидов на 50%; Да™j( 10"°) — процент ингибирования свободно-радикальной реакции веществом в концентрации 1 мкмоль/л; MR„,J - квадрат молекулярной рефракции радикала Rj у 1-го атома азота; MRrj - молекулярная рефракция радикала R., у 8-го атома углерода; log2P(l - показатель липофильности молекулы в виде основания; log2Pe -показатель липофильности цикла молекулы; log2PR2 - квадрат показателя липофильности радикала R2; log2Pnj - квадрат показателя липофильности радикала R?; £/E/cwl - сумма положительных зарядов цикла и радикала у первого или девятого атомов азота; (£ /Е/c+ri)2 - квадрат суммы положительных зарядов цикла и радикала у первого или девятого атомов азота; S/E/ю - сумма положительных зарядов радикала R3; MRC -молекулярная рефракция цикла молекулы; MRc2 - квадрат молекулярной рефракции цикла молекулы; R -коэффициент множественной корреляции; S - стандартная ошибка; F - значимость уравнения по точному критерию Фишера; р - статистическая значимость данного уравнения по t-критерию Стьюдекта; под каждой переменной указана статистическая значимость этого параметра.

Было обнаружено, что наиболее значимыми показателями для адекватного прогнозирования антиоксидантной активности являются стерические характеристики, а показатели липофильности и заряда на радикалах и молекуле в целом для прогнозирования данного вида активности будут второстепенны. При выведении зависимостей между антирадикальной активностью и физико-химическими свойствами было установлено, что следует учитывать влияние всех расчетных параметров - электронных, липофильных показателей и стерических характеристик молекулы вещества. С помощью полученных зависимостей, на основании структурной формулы, можно производить приблизительную расчетную оценку уровня как антирадикальной, так и антиоксидантной активностей новых, а также только планируемых к синтезу производных пирроло[1,2-а]бензимидазолов с целью оптимизации поиска высокоактивных веществ в этом ряду.

В результате проведенного скрининга, учитывая совокупность показателей АОА и АРА, а также острой токсичности и условного терапевтического индекса (УТИ), были отобраны для дальнейшего исследования три соединения, относящиеся к производным ПБ: РУ-756, РУ-757 и РУ-792 (таблица 1).

12

Шифр вещества LDiu, мг/кг АОА, ИК50, мкмоль/л УТИ по АОА АРА, ИК50, мкмоль/л УТИ по АРА

РУ-792 794 1,14 1198,4 2,17 153,3

РУ-757 775 1,12 1126,8 1,70 583,4

РУ-756 ,475 1,32 715,3 8,93 554,9

РУ-791 390 1,05 610,9 11,20 57,11

РУ-543 265 0,82 868,2

Дибунол 400 3,60 572,2 5,05 572,8

Мексидол 475 480,00 4,1 20,94 59,4

* - для соединения РУ-543 показатель УТИ не рассчитывался в связи с его низкой АРА.

Изучая возможные молекулярные механизмы действия отобранных веществ на свободно-радикальные процессы, было установлено, что вещества оказывают неодинаковую АОА и АРА на моделях с различным генезом свободно-радикальных реакций. Так, соединения, содержащие в структуре морфолиноэтильную группировку, были более активны в отношении гидроксильного радикала (РУ-757), влияя на люминол-зависимую хемилюминесценцию; или радикала ABTS« (РУ-792) - в методе окисления ABTS-, тогда как вещество, имеющее в структуре диэтиламиноэтиль-ный заместитель (РУ-756), обладало наибольшей эффективностью в отношении ли-попероксильного радикала LOO», подавляя хемилюминесценцию ЖЛП (рис. 1).

А Б В

Рисунок 1 - Активности изучаемых веществ РУ-756 (А), РУ-757 (Б) и РУ-792 (В) (% ингибирования) на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств; * - статистическая значимость относительно контроля, р<0,05

При изучении антигипоксических свойств исследуемых веществ на модели острой гипобарической гипоксии установлено, что соединение РУ-792 показало

наиболее выраженный противогипоксический эффект, увеличивая продолжительность жизни мышей при гипобарии на 127% в изоантиоксидантной дозе 8,2 мг/кг, и повышая данный показатель в 1,3 1,4 и 1,9 раза при двух-, пяти- и десятикратном увеличении дозы соответственно. Препарат сравнения мексидол оказался не столь эффективным - 71%, как и другие изучаемые соединения (рис. 2).

400 -

122.4 5,4 И 50 9.8 20 50 98 5.,2 16,4 41 52

ГИПОКСИЯ ДМД, т/НГ

+Мексццол

Рисунок 2 - Влияние веществ РУ-756, РУ-757, РУ-792 и мексидола на время жизни мышей относительно контроля при острой гипобарической гипоксии, * данные статистически значимы (/) по отношению к контрольной группе животных, р<0,05

При изучении противоишемических свойств веществ на модели билатеральной окклюзии сонных артерий было установлено, что исследуемые вещества имели тенденцию к продлению жизни животных при ишемическом повреждении мозга; однако соединение РУ-792 проявило наиболее выраженный антиишемический эффект, увеличивая выживаемость животных через 12, 24, 48 и 72 часа после операции, и продемонстрировало наиболее позитивные характеристики, статистически значимо повышая количество выживших животных на 33% через 72 часа. При сравнении эффективности противоишемического действия изучаемых веществ с мекси-долом, все вещества превосходили препарат сравнения по данному показателю на всех временных точках (рис. 3). Таким образом, в ходе исследований было показано, что вещество РУ-792 оказалось наиболее эффективным из изученных субстанций в плане развития долгосрочных противоишемических эффектов. Это свойство данного соединения является достаточно важным, так как известно, что истощение анти-оксидантных систем и активное накопление продуктов перекисного окисления ли-пидов происходит при длительной ишемии мозга.

Имеют Ишемия ^Мекшдал Ишемия -РУ-756 Пш«;ия-РУ-75? Ишелим-РУ-792

Рисунок 3 - Влияние веществ РУ-756, РУ-757, РУ-792 и мексидола в изоантиоксидантных дозах на выживаемость крыс при двухсосудистой ишемии; * - данные статистически значимы по отношению к контрольной группе животных; # - данные статистически значимы по отношению к группе животных с ишемией,

(точный метод Фишера, р<0,05)

При оценке показателей неврологического статуса и локомоторной активности в позднем послеоперационном периоде было выявлено, что все изучаемые соединения способствовагш улучшению данных показателей (таблица 2). Наиболее значимо на эти характеристики влияло вещество РУ-792, нормализуя двигательную активность животных к третьим суткам полностью, не уступая контрольной ложно-оперированной группе и даже превосходя ее на 11% (р<0,05), а также превышая группу с мексидолом. При анализе показателей неврологического статуса в послеоперационном периоде было установлено, что соединение РУ-792 практически полностью восстанавливало неврологические повреждения у животных с ишемией до 10,5 баллов на третьи сутки (р<0,05), в то время как вещества РУ-756, РУ-757 и мек-сидол проявляли это в меньшей степени, неврологический дефицит был более выраженным и нарастал во времени (7,5, 9 и 6,5 баллов (р<0,05) соответственно).

Таблица 2 - Влияние веществ РУ-756, РУ-757, РУ-792 и мексидола в изоантиоксидантных дозах на двигательную активность и неврологический статус крыс в восстановительном периоде после двусторонней окклюзии общих сонных артерий (М^т)______

Группа Двигательная активность, условные единицы Неврологический статус, баллы

Контроль 68.8±)4,6 10,8±0,7

Ишемия 13,2±3,3* 5,2±0,7*

Ишемия + РУ-756 66,3*21,4 7,5±0,3*в

Ишемия + РУ-757 38,7±14.4 9,0±0,6*

Ишемия + РУ-792 76,7±6,0* 10,5±0,3*

Ишемия + Мексидол 32,8±17,9 6,5±0,6*

Примечание: * - данные статистически значимы (Ц по отношению к контрольной группе животных (р<0,05)," - данные статистически значимы (1) по отношению к группе животных с ишемией (р£0,05)

Исследование у экспериментальных животных поведения в тесте «открытое поле» показало, что все соединения достоверно увеличивали у животных с ишемией относительно группы контроль-ишемия уровни горизонтальной и вертикальной активности и норкового рефлекса, уменьшая латентное время нахождения в центральном квадрате, и превосходили по данным показателям препарат мексидол.

О состоянии процессов липопероксидации у ишемизированных крыс судили по содержанию в крови и гомогенатах тканей головного мозга МДА, а также ДК. Вещества неоднозначно влияли на данные показатели. Вещество РУ-792 проявило более выраженные антиоксидантные свойства, подавляя образование МДА, и тем самым, уменьшая перекисные процессы у крыс с экспериментальной ишемией головного мозга, в сыворотке - на 37% (р<0,05) и мозге - на 40%, концентрация ДК уменьшилась на 44% (р<0,05). Следует отметить, что все изучаемые вещества превосходи по выраженности эффектов препарат сравнения.

Рисунок 4 - Влияние веществ РУ-756, РУ-757, РУ-792 и мексидола (в изоантиоксидантных дозах) на содержание МДА и ДК в сыворотке крови и тканях мозга при двухсосудистой ишемии головного мозга (дельта % к контролю); * - данные статистически значимы (I) относительно группы контроля;* - данные статистически значимы (/) относительно труппы ишемизированных животных, р<0,05

Нарастание перекисного окисления липидов при ишемии головного мозга также сопровождалось значимым подавлением активности одного из ангиоксидант-ных ферментов - ГП. Изучаемые вещества имели тенденцию к увеличению активности фермента в сыворотке крови по сравнению с группой ишемизированных животных, РУ-756 в 1,9 раза, соединение РУ-792 - в 4 раз (р<0,05), практически полностью восстанавливалась активность глутатионпероксидазы под влиянием РУ-757. Препарат сравнения действовал менее эффективно - активность фермента возрастала в 2 раза.

80 к Г-1,

ШИшекняЧййКСИдеи аЯшем|Н<-РУ-756

I 40

О

Установлено, что соединение РУ-792 имело тенденцию к увеличению выживаемости крыс с тотальной ишемией при 30-ти минутной реперфузии на 23%, через 24 часа после реперфузии данный показатель был чуть ниже - 20%, и но данным показателям вещество немного превосходило препарат сравнения. Мексидол способствовал повышению количества выживших животных через 30 минут после реперфузии на 14%, через сутки - на 10%.

У крыс, которые получали исследуемое соединение РУ-792, концентрация МДА статистически значимо снижалась по отношению к ишемизированным животным в сыворотке крови и в мозге при 30-ти минутной реперфузии и через 24 часа, однако препарат сравнения мексидол был более активен (рис. 5).

400 ЗС€< 200 1СЮ

о -100

II30 минут после реперфузии Ш4 часа после репе|>$<узии

+1.Г«-7*

-3.9* *™ ' -52,5»

— | II . ----- -------—

:ид*л Ишемия

10 !<•

-45.4« 1шекия -Мексидол

Рисунок 5 - Влияние вещества РУ-792 и мексидола на концентрацию МДА в сыворотке крови и мозге при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс (дельта % к контролю); * - данные статистически значимы (*) относительно группы контроля;" - данные статистически значимы (/) относительно группы ишемизиро-

ванных животных. р<0,05

У крыс с ишемией, которым вводили соединение РУ-792, активность фермента ГП повышалась по сравнению с ишемизированным контролем как в сыворотке на 144 и 86%, так и в мозге на 170 и 41 % соответственно через полчаса и 24 часа после реперфузии (р<0,05). Тогда как мексидол действовал лишь на ГП в мозге крыс, увеличивая ее активность на 59 и 28% в те же временные интервалы.

Изучаемое антиоксидантное вещество РУ-792 при профилактическом введении оказывало нормализующее действие на показатели ПОЛ в крови и тканях мозга в постишемический период и стабилизировало активность ГП, в большей степени влияя на данный фермент в крови.

В ходе исследования влияния соединения РУ-792 при остром тетрахлормета-

новом поражении печеии было установлено, что соединение приводило к повыше-

17

нию угнетенной при токсическом поражении печени дстоксикационной функции гепатоцитов. Соединение РУ-792 в тесте гексеналового, сна достоверно снижало длительность как первой фазы сна (на 44%), так и общую продолжительность сна (на 38%) сравнительно с контрольными крысами с гепатитом, однако уступало по данному параметру препарачу сравнения мексидолу, проявившему активность -43 и 50% соответственно (таблица 3).

Таблица 3 - Влияние вещества РУ-792 и мексидола (в изоантиоксидантных дозах) при остром тетрахлорме-тановом гепатите на длительность гексеналового сна (мин) (М±т)___

Группа животных Латентный период, мин Первая фаза сна, мин Общая длительность сна, мин

Контроль 2,80±0,457 40,98±6,47 84,28±!0,33

Гепатит |,95±0,12 70,82+10,88* 177,18±26,80*

Г'епатит+РУ-792 2,38±0,09" 39,76±2,70е !09,64±7,37f

Гепатит+ ме ксидол 2,77±0,38" 40,64±4,44' 89,35.-И2,12s

Примечание: * - данные статистически значимы (г) относительно группы контрольных животных; я - данные статистически значимы (<) относительно группы животных с гепатитом, р<0,05.

Вещество РУ-792 снижало клиренс БСФ на 45 минуте в 1,3 раза по сравнению с контрольными животными с гепатитом, не получавшими препарат (р<0,05) и было сопоставимо по эффекту с мексидолом (1,38 раз), тем самым, соединения улучшали поглотительно-выделительную функцию печени. Повышение в крови активности АлАТ, АсА'Г и ЛДГ - ферментов, специфичных для гепатоцита - рассматривается как проявление цитолитического синдрома. Соединение РУ-792 и мексидол несколько уменьшали гиперферментемию - имея тенденцию к снижению активности АлАТ и АсАТ. Однако, ни изучаемое соединение РУ-792, ни препарат сравнения мексидол не оказывали значимого действия на активность данных ферментов в сыворотке крови. У животных при гепатите изменялась активность ЩФ, возраставшая на 78% (р<0,05), что свидетельствовало о нарастании холестаза у контрольных животных с гепатитом. При этом РУ-792 вызывай уменьшение холестаза на 36%, сравнимое с эффектом мексидола (35%).

Развитие гепатита сопровождалось у крыс достоверным уменьшением общего белка в крови на 18%. Под влиянием вещества РУ-792 белок плазмы практически

18

нормализовался, возрастая на 20% (р<0,05), в то же время мексидол влиял на этот показатель менее выражено (10%) (р<0,05).

Установленное в ходе исследований увеличение массового коэффициента печени при гепатите (на 25%) свидетельствовало о гемодинамических нарушениях в этом органе, и, следовательно, развитии отека. Соединение РУ-792 тормозило развитие отека по сравнению с крысами контрольной группы с гепатитом на 10% (р<0,05), тогда как мексидол снижал этот показатель менее выражено (6%) (р<0,05).

У крыс с экспериментальным гепатитом наблюдалась выраженная активация ПОЛ. Отмечалось повышенное накопление конечного продукта - МДА как в печени, так и в крови, а также снижении активности СОД в тканях печени и плазме. У крыс с гепатитом, получавшим соединение РУ-792, уровень МДА снизился в 1,9 раз в печени и практически полностью нормализовался в плазме крови (р<0,05). Мексидол по данному параметру уступал изучаемому соединению (рис. 6). Так же действие вещества РУ-792 приводило к восстановлению активности фермента плазме (на 43%), в печени эффект был менее выражен (24%) сравнительно животных, не получавших лечение, эффект был сопоставим показателям мексидола.

200 - 1153,5"

150

й а т

Г1-

«ч ¥ гг.

77,0-

42,И

__

Гепатит Гаиапгг*Р^792

Рисунок 6 - Влияние вещества РУ-792 и мексидола (в изоантиоксидантных дозах) на содержание МДА в крови и печени при остром тетрахлорметановом гепатите (дельта % к контролю); * - данные статистически значимы (/) относительно группы контроля;* - данные статистически значимы (/) относительно группы

животных с гепатитом, р<0,05

Изучение защитного действия соединения РУ-792 при интоксикации ТХМ показало, что данное вещество повышает продолжительность жизни, улучшает в основном показатели детоксицирующей функции и имеет тенденцию по влиянию на выделительно-поглотительную функцию гепатоцитов. Уменьшает холестатические, подавляя активность ЩФ, и мезенхимально-воспалительные процессы, уменьшая отек печени, но мало влияет на проявления цитолитического синдрома, т.е. на гипе-

рактивность ферментов АсАТ, АлАТ и ЛДГ, а также проявляет незначительный эффект на гемореологические параметры крови. Достоверно снижает количество продуктов свободно-радикальных процессов, а также имеет тенденцию к увеличению активности антиоксидантных ферментов (рис. 7).

Рисунок 7 - Влияние соединения РУ-792 и мексидола на основные функциональные, биохимические и реологические показатели, на выраженность перекисных процессов при остром токсическом поражении печени (баллы) (каждому эффекту, исходя из его выраженности, присваивались баллы - от 0 до 3); * - данные статистически значимы (/) относительно группы контрольных животных, р<0,05

Таким образом, на основании проведенного скрининга было установлено, что J соединения, содержащие в структуре сопряженный электроно-избыточный пирро-лобензимидазольный цикл, обладают ярко выраженными антиоксидантными и ан-

I

тирадикальными свойствами, способны к перехвату активных форм кислорода, в частности липопероксильный радикал и гидроксильный радикал, а также радикалы ДФПГ и ABTS. При исследовании фармакологического действия изучаемых веществ 8,9-дифенил-Ы|-диэтиламиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазола (РУ-756), 8-метокси-9-фенил-Ы'-морфолиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазола (РУ-757) и 8-фенил-9-(3,5-ди-метокси-фекил)-Ы'-морфолиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазола (РУ-792) было установлено, что соединение РУ-792, содержащее замещенные фе-

L

нильные радикалы в структуре, оказывает достаточное противогипоксическое действие, превышая показатели других изучаемых веществ, в том числе и препарата сравнения мексидола. Та же закономерность отмечалась и при изучении противо-ишемических свойств на моделях ишемических и реперфузионных поражениях моз- |

га. При этом соединение РУ-792 имело более эффективное защитное действие при ишемии головного мозга, нормализуя неврологический статус, локомоторную активность и поведенческие показатели, а также уменьшая выраженность процессов ПОЛ. Изучение защитного действия соединения РУ-792 при токсическом поражении печени тетрахлормстаном показало, что данное вещество улучшает детоксика-ционную функцию пораженной печени, способствует уменьшению проявления хо-лестатического повреждения, подавляя активность ЩФ, снижает количество продуктов ПОЛ - МДА - как в тканях поврежденной печени, так и крови, а также повышает активность СОД в печени и сыворотке крови.

Учитывая высокую эффективность вещества РУ-792 при различных патологических состояниях, можно считать перспективным дальнейшее изучение у данного соединения фармакологических и токсикологических свойств.

Выводы

1. В результате проведенного скрининга 34 конденсированных производных бензимидазола было обнаружено 16. (56%) соединений с высокой антиоксидантной и 9 (36%) веществ - с высокой антирадикальной активностью среди производных пирроло[1,2-а]бензимидазола, превосходящими таковые у дибунола, тролокса и мексидола.

2. Наибольшую АОА и АРА проявили соединения ряда пирроло[1,2-а]бензимидазолов, имеющие в качестве заместителей фенильные, метокси- и диме-токсифенильные радикалы, и по уровню токсичности их можно отнести к классу умеренно токсичных веществ. Вещества 8,9-дифенил-М'-диэтиламиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазол (РУ-756), В-метокси^-фенил-Ы'-морфолиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазол (РУ-757) и 8-фенил-9-(3,5-ди-метокси-фенил)-Кт!-морфолиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазол (РУ-792)с условным терапевтическим индексом 715,3, 1126,8 и 1198,4 соответственно превосходили по данному параметру препараты сравнения дибунол и мексидол.

3. Наличие в структуре изучаемых веществ пиррольного кольца, сопряженного

с молекулой бензимидазола, обуславливает у изучаемых соединений высокие анти-оксидантные и антирадикальные свойства. АОА в основном, определяется стериче-скими характеристиками молекулы, а АРА - также электронными и липофильными параметрами соединения.

4. Вещества РУ-756 и РУ-792 при гипоксическом повреждении головного мозга (в изоактиоксидантных дозах 5,4 и 8,2 мг/кг соответственно) оказывали противоги-поксическое действие, увеличивая время жизни животных (75 и 127% соответственно), превосходя по активности мексидол (122,4 мг/кг) - 71%.

5. Соединение РУ-792 (8,2 мг/кг) повышало выживаемость животных при билатеральной окклюзии сонных артерий на 33%, превосходя по противоишемическому эффекту вещества РУ-756 и РУ-757 и препарат сравнения мексидол. Вещество РУ-792 улучшало поведенческие характеристики в тесте «открытое поле» и актометре, значимо сокращая неврологический дефицит у животных; снижало выраженность процессов ПОЛ, статистически значимо уменьшало концентрацию МДА как в сыворотке крови, так и в мозге - на 37 й 40% соответственно - и ДК в мозге на 44%.

6. У животных при тотальной ишемии-реперфузии мозга соединение РУ-792 (8,2 мг/кг) повышало выживаемость животных на 20%, мексидол (122,4 мг/кг) -на 10%. Вещество РУ-792 нормализовало показатели перекисных процессов, снижая концентрацию МДА при отдаленных сроках реперфузионного повреждения в сыворотке (на 33%) и в мозге (на 32%); восстанавливало активность ГП в крови (на 86%) и мозге (на 41%).

7. Вещество РУ-792 (доза 8,2 мг/кг) уменьшало токсическое действие ССЦ на печень. Оно улучшало детоксикационную функцию печени, укорачивая длительность «гексеналового сна» на 38%, уменьшало процессы холестаза, снижая активность ЩФ на 36%, тормозило мезенхималыю-воспалительные реакции, сокращая отек печени на 10%, нормализовало белковый обмен и было сопоставимо с эффектами мексидола. Вещество РУ-792 снижало концентрацию МДА в сыворотке крови до нормы и в тканях печени в 1,9 раза, тем самым, уменьшая процессы пероксида-ции в поврежденном органе.

список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ельцова, JI.B. Изучение антиоксидантной активности производных гшрроло11,2-а]бензимидазола на модели аскорбат-зависимого нерекисного окисления липидов // Актуальные проблемы экспериментально)! и клинической медицины: материалы 62-й итоговой научной конференции молодых ученых и студентов / Под общей ред. акад. В.И. Петрова. - Волг оград: Изд-во ВолГМУ, 2004 - С. 96-97;

2. Ельцовя, Л.В. Антиоксидантная и антирадикальиая активность новых производных в ряду пирроло[1,2-а]бензимдазола // МЬкнародна науково-практична конферешця молодих вчених «Вчеш майбутнього». Тези доповщей. 14-16 жовтня 2004 року - Одеса: Одеський державний медичшш укшверситет, 2004. - С. 30-31;

3. Ельцовя, л.в. Скрининг в ряду веществ, производных пирроло[1,2-а]бснзимидазола, проявляющих ацтиоксидантиую и антирадикальную активность на моделях m vilo // Материалы IX региональной конференции молодых исследователей Волгоградской обл., 9-12 ноября 2004 года - Волгоград, 2005 - С. 39-41 ;

4. Анисимова, В.А. Синтез и биологическая активность 9-диалкиламиноэтил-2-окси(диокси)фенилимидазоло-[1,2а]бензимидазола / A.A. Спасов, В.А. Косолапое, М.В. Черников, АЛО. Стуковина, л.в. Ельцова, Н.П. Ларионов, P.E. Либинзон, O.G. Ватолкипа // Хи.м.-фарм. журнал. - 2006 -Т.40, №10. - С. 3-10;

5. Ельцова, Л.в. Изучение агггигилоксического действия новых производных пирролобензими-дазола / Л.В. Ельцова, В.А. Косолапов II Материалы 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». 13-16 марта 2006 г. д/о «Подмосковье». Москьа: ГУ НИИ фармакологии им. B.D. Закусова РАМН. 2006 -С. 28 [русский], С. 98 [английский];

6. Ельцова, Л.в. Изучение антнгипоксическнх свойств новых производных пирроло[1,2-а]бензимидазола//Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 64-й открытой итоговой научной конференции молодых ученых и студентов / Под общей ред. акад. В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2006 - С. 134;

7. Ельцова, Л.в. Изучение антигипоксической активности новых производных пирролобензими-дазола // Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты: Всероссийская конференция молодых ученых и II школа им. академика Эммануэля. Доклады и тезисы. - М.: Изд-во РУДН, 2006-С. 168-170;

8. Ельцова, Л.в. Изучение нового производного пирролобензимидазола на модели тотальной ишемии головного мозга крыс / Л.В. Ельцова, A.A. Орлова // Материалы XI региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 8-10 ноября 2006 года - Волгоград, 2006-С. 10-11;

9. Ельцова, Л.в. Изучение зависимости «структура-активность» в ряду производных пирроло[1, 2-а]бензимидазола I Л.В. Ельцова, М.С. Срослов // Материалы XI региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 8-10 ноября 2006 года. - Волгоград, 2006 -С. 33;.

10.Ельцова, Л.в. Противоишемические свойства новых производных пирроло[1,2-а]бензимидазола, проявляющих высокую аятиоксидантную активность И Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 65-й открытой итоговой научной

конференции молодых ученых и студентов / Под общей ред. акад. В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2007. - С. 148;

П.Васильев, П.М. Экспериментальная проверка точности компьютерного прогноза антиокси-дантной активности новых гетероциклических соединений / П.М. Васильев, В.А. Косолапой, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова, A.A. Орлова, В.А. Анисимова // Фармакология - практическому здравоохранению: Материалы III съезда фармакологов России / Психофармакол. биол. наркол. - 2007 -Т. 7, спец. вып. (сентябрь). - Ч. 1. - С. 1743;

12.Косолапое, В.А. Антиоксиданты как средства коррекции ишемических нарушений головного мозга / В.А. Косолапое, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова, В.А. Анисимова // Фармакология -практическому здравоохранению: Материалы III съезда фармакологов России / Психофармакол. биол. наркол. -2007-Т. 7, спец. вып. (сентябрь). - Ч. 1. -С. 1743-1744;

13.Косолапов, В.А. Антиоксидантные вещества - как основа для создания средств коррекции ишемии головного мозга / В.А. Косолапое, A.A. Сиасов, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова, В.А. Анисимова // Лекарственные средства и биологически активные соединения: Материалы конф. / Международная научная конференция, посвященная 40-летию НПЦ «Институт фармакологии и биохимии HAH Беларуси». Гродно, 2007. - С. 82-83;

14.Ельцова, Л.В. Гепатопротекторные свойства нового производного бензимидазола РУ-792 при токсическом поражении печени у крыс // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы бб-й открытой итоговой научной конференции молодых ученых и студентов / Под общей ред. акад. В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2008. - С. 158159;

15.Ельцова, Л.В. Противогипоксическая активность некоторых производных пирроло[1,2-а]бензимидазола с высокой антиоксидантной активностью / Л.В. Ельцова, В.А. Косолапое, A.A. Спасов // Пятая Российская конференция «Гипоксия: Механизмы, адаптация, коррекция» / Патогенез. - 2008. - Т. 6, № 3 - С. 59;

16. Ельцова, Л.В. Гепатопротекторная активность нового производного бензимидазола РУ-792 при токсическом поражении печении у крыс // Материалы XIII региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 11-14 ноября 2008 года. - Волгоград, 2008 -С. 15-21;

17. Косолапов, В.А. Поиск новых веществ с антиоксидантными и церебропротекторными свойствами среди привилегированных молекул / В.А. Косолапов, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова,

A.A. Спасов, В.А. Анисимова // Сборник научных трудов «Современная инновационная медицина - населению Волгоградской области» / Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ,2008.-С. 147-148;

18. Косолапов, В.А. Отбор антиоксидантных веществ с церебропротектор-ными свойствами среди привилегированных молекул / В.А. Косолапов, A.A. Спасов, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова,

B.А. Анисимова // Тезисы докладов V международной Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». - Судак, Крым, Украина, 21-30 сентября 2009. — С. 33;

19. Анисимова, В.А. Синтез и фармакологическая активность дигидрохло-ридов 3-(2,2,2-трихлор-1-гидроксиэтил)имидазо[1,2-а]бензимидазола / В.А. Анисимова, A.A. Спасов, В.А. Косолапов, И.Е. Толпыгин, В.И. Поротиков, А.Ф. Кучерявенко, В.А. Сысоева, Е.В. Тибирькова, Л.В. Ельцова // Химико-фармацевтический журнал. - 2009. - Т. 43, № 9. - С. 9-12.

ельцовл лариса витальевна

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРРОЛО[1,2-я]БЕНЗИМИДАЗОЛА, ПРОЯВЛЯЮЩИХ АНТИОКСИДАНТНЫЕ И АНТИРАДИКАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать_. Формат 60x84/16. Печать офсетная.

Бумага офсетная. Усл. печ.л. 1,1. Уч.-изд. 1,2. Тираж 150 экз. Заказ №_.

Волгоградский государственный медицинский университет 400131, Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1.

Актуальность проблемы. Свободно-радикальное окисление является необходимым процессом для нормального функционирования клеток, но вместе с тем это и один из универсальных механизмов их повреждения [Владимиров Ю.А., 2000; Бульон В.В. и др., 2006; Меныцикова Е.Б. и др., 2006, 2008]. Неконтролируемая генерация активных форм кислорода, кислородных метаболитов и сбой в функционировании антиоксидантной системы вызывают окислительное повреждение биомолекул, что приводит к дисфункции клеток и тканей организма [Шанин Ю.Н. и др., 2003; Halliwell et al., 2005]. Окислительный стресс играет ключевую роль в патогенезе многих патологических состояний: гипоксических и ишемических повреждениях органов [Лукьянова Л.Д., 2000; Гусев Е.И., 2001; Мирзоян Р.С., 2003; Atahan, 2007]; интоксикациях химическими агентами [Сейдахметова З.Ж., 2005] и заболеваниях печени [Девяткина Т.А. и др., 2003; Warner et al., 2004]; сахарном диабете и его осложнениях [Дедов И.И., 2003; Балаболкин М.И. и др., 2005; Vincent A.M. et al., 2004]; при интенсивных физических и психоэмоциональных нагрузках, переутомлении, старении [Гусев В.А., Панченко Л.Ф., 1997; Анисимов В.Н., 1997; Harman, 2006]. Важную роль в клинической практике играют антиоксидантные средства, способные стабилизировать структуру и функции клеточных мембран и поддерживать структурный гомеостаз организма в условиях патологии [Gutterjdge, Halliwell, 2000; Арзамасцева Н.Е., 2006]. Антиоксидантные препараты применяются как для профилактики, так и для лечения свободно-радикальных патологий [Сторожок Н.М., 2002; 2003; Pryor et al., 2006].

Однако, несмотря на широкий спектр веществ с антиоксидантным и антирадикальным действием в эксперименте, эффективных лекарственных средств, внедренных в клиническую практику, - незначительное количество. Кроме того, существующие препараты имеют ряд недостатков, связанных с особенностями биологического эффекта и его величиной, либо с токсичностью. При этом синтетические препараты нередко уступают по антиоксидантной активности эндогенным антиоксидантам [Шанин Ю.Н. и др., 2003; Бурла-коваЕ.Б., 2006; Лукк М.В. и др., 2008]. Поэтому поиск новых высокоэффективных антиоксидантных средств остается актуальным. Перспективным является поиск и разработка новых высокоэффективных антиоксидантных средств в ряду производных бензимидазола [Панченко Т.И., 1990; Островский О.В., 1996; Анисимова В.А., 1973; Спасов А.А. и др., 1999, 2001; Косолапов В.А. и др., 2003]. Молекулу бензимидазола можно отнести к так называемым привилегированным химическим структурам, т. е. к тем химическим веществам, которые проявляют различные виды биологической активности [DeSimone et al., 2004], и в частности, интересующие нас антиоксидантные и антирадикальные свойства. Конденсированные производные бензимидазола - пирроло[1,2-а]бензимидазолы - соединения, со сложной я-электронноизбыточной системой, обладающие более высоким антиоксидантным потенциалом действия^ [Анисимова В.А. и др., 1996]. Все выше перечисленное делает актуальным поиск и изучение высокоактивных веществ с антиоксидантным и антирадикальным спектром действия среди производных ряда пирроло[1,2-а]бензимидазолов.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы. «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ государственной регистрации 01200116045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидантные свойства» (№ государственной регистрации 01200609434), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от 31.10.2003 г.).

Цель исследования. Поиск и исследование механизмов действия на процессы пероксидации новых высокоэффективных антиоксидантных веществ среди производных пирроло[1,2-а]бензимидазола; выбор наиболее активных 7 соединений и доклиническое изучение их специфической активности на экспериментальных моделях свободно-радикальных патологий.

Для достижения указанной цели представляется необходимым решение следующих задач:

1. Изучить антиоксидантные и антирадикальные свойства новых производных пирроло[1,2-а]бензимидазола и препаратов сравнения на моделях in vitro;

2. Исследовать показатели острой токсичности наиболее активных соединений, рассчитать их терапевтический индекс и выбрать наиболее эффективные вещества для доклинического изучения специфической фармакологической активности;

3. Определить зависимость действия изучаемых соединений на свободно-радикальные процессы от их химических структур и физико-химических свойств;

4. Изучить защитные свойства наиболее активных антиоксидантов и препаратов сравнения на различных моделях с активацией процессов пероксидации при гипоксических и ишемических повреждениях головного мозга.

5. Исследовать влияние соединений, проявляющих наибольшую антиоксидантную и антирадикальную активность, на показатели перекисного окисления, поведенческую активность и неврологический статус у крыс при двухсосуди-стой ишемии головного мозга;

6. Изучить действия веществ с высокими антиоксидантными и антирадикальными свойствами на процессы перекисного окисления липидов у крыс при тотальном ишемическом повреждении головного мозга с реперфузией;

7. Исследовать влияние веществ с наибольшими антиоксидантной и антирадикальной активностью на показатели процессов пероксидации, биохимические процессы, реологические параметры крови и основные функциональные характеристики печени у крыс с токсическим тетрахлорметановым гепатитом.

Научная новизна. Впервые были получены данные о влиянии 25 оригинальных производных пирроло[1,2-а]бензимидазола на свободно-радикальные процессы. Впервые была установлена взаимосвязь между структурой новых со8 единений и их антиоксидантной активностью. Были изучены механизмы действия наиболее активных веществ 8,9-дифенил-Н1-диэтиламиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазола, 8-метокси-9-фенил-М'-морфолиноэтил-пирроло[1,2а]бензимидазола и 8-фенил-9-(3,5-диметокси-фенил)^1-морфолиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазола на различные звенья СРП in vitro и in vivo. Установлено, что антиоксидантная и антирадикальная активности изученных соединений определяются физико-химическими свойствами их молекулы, показано, что антиоксидантная активность определяется стерическими параметрами молекулы, а антирадикальная активность - также электронными и липофильными характеристиками молекулы. Получены данные о влиянии соединений пирро-ло[1,2-а]бензимидазола на процессы пероксидации при гипоксических состояниях, ишемических поражениях мозга, токсическом повреждении печени.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности поиска ингибиторов ПОЛ, проявляющих анти-оксидантные и антирадикальные свойства, среди производных пирроло[1,2-а]бензимидазола. На основании выявленной зависимости антиоксидантного и антирадикального видов активности соединений от их структуры была выведена математическая зависимость, описываемые двумя регрессионными уравнениями, с помощью которых можно прогнозировать с высокой степенью достоверности тот или иной тип активности у новых соединений. Отработана методология поиска и изучения новых антиоксидантных веществ с использованием современных методов исследования, даны рекомендации по направленному синтезу гетероциклических соединений. Получены данные о наличии у соединения РУ-792 противогипоксических, противоишемических свойств, а также выявлена способность повышать детоксицирующую функцию печени, снижать образование продуктов перекисного окисления липидов крови и тканей печени на фоне тетрахлорметанового гепатита. Выявленные антиоксидантные и антирадикальные эффекты вещества РУ-792, превосходившего по активности препарат сравнения, определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований соединения с целью создания 9 на его основе нового антиоксидантного средства.

Реализация результатов исследования. Выявленные закономерности между химической структурой и способностью ингибировать процессы пере-кисного окисления липидов у замещенных производных пирроло[1,2-а]бензимидазола учитываются при синтезе новых веществ в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, в экспериментальной работе лаборатории органического синтеза НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пирроло[1,2-а]бензимидазолы - перспективный класс соединений для поиска новых веществ, способных ингибировать процессы перекисного окисления липидов;

2. Наиболее выраженные антиоксидантные и антирадикальные свойства выявлены для вещества под лабораторным шифром РУ-792, влияющего преимущественно на активность липопероксильного радикала и ABTS-радикала;

3. Соединение РУ-792 по эффективности при острой гипобарической гипоксии, двухсосудистой ишемии головного мозга, тотальной ишемии-реперфузии головного мозга, а также при остром поражении печени четыреххлористым углеродом превосходит препарат сравнения мексидол;

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались: на IX - XIII Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области, (Волгоград, 2004 - 2009 гг.); 62 - 66-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета, (Волгоград, 2004 - 2008 гг.); Всероссийской конференции молодых ученых «Вчеш майнбутнего» (Одесса, 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ (из них две -в журналах, рекомендуемых ВАК).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 рисунками и 47 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2 - 4), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 175 отечественных и 59 зарубежных источников, и приложений.

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ

1. В результате проведенного скрининга 34 конденсированных производных бензимидазола было обнаружено 16 (56%) соединений с высокой антиоксидантной и 9 (36%) веществ - с высокой антирадикальной активностью среди производных пирроло[1,2-а]бензимидазола, превосходящими таковые у дибунола, тролокса и мексидола.

2. Наибольшую АОА и АРА проявили соединения ряда пирроло[1,2-а]бензимидазолов, имеющие в качестве заместителей фенильные, метокси- и диметоксифенильные радикалы, и по уровню токсичности их можно отнести к классу умеренно токсичных веществ. Вещества Б^-дифенил-К1-диэтиламиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазол (РУ-756), 8-метокси-9-фенил-1Ч'-морфолиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазол (РУ-757) и 8-фенил-9-(3,5-ди-метокси-фенил)-Н1-морфолиноэтил-пирроло[1,2-а]бензимидазол (РУ-792) с условным терапевтическим индексом 715,3, 1126,8 и 1198,4 соответственно превосходили по данному параметру препараты сравнения дибунол и мексидол.

3. Наличие в структуре изучаемых веществ пиррольного кольца, сопряженного с молекулой бензимидазола, обуславливает у изучаемых соединений высокие антиоксидантные и антирадикальные свойства. АОА в основном, определяется стерическими характеристиками молекулы, а АРА -также электронными и липофильными параметрами соединения.

4. Вещества РУ-756 и РУ-792 при гипоксическом повреждении головного мозга (в изоантиоксидантных дозах 5,4 и 8,2 мг/кг соответственно) оказывали противогипоксическое действие, увеличивая время жизни животных (75 и 127% соответственно), превосходя по активности мексидол (122,4 мг/кг) - 71%.

5. Соединение РУ-792 (8,2 мг/кг) повышало выживаемость животных при билатеральной окклюзии сонных артерий на 33%, превосходя по противоишемическому эффекту вещества РУ-756 и РУ-757 и препарат сравнения мексидол. Вещество РУ-792 улучшало поведенческие характеристики в тесте «открытое поле» и актометре, значимо сокращая неврологический дефицит у животных; снижало выраженность процессов ПОЛ, статистически значимо уменьшало концентрацию МДА как в сыворотке крови, так и в мозге — на 37 и 40% соответственно — и ДК в мозге на 44%.

6. У животных при тотальной ишемии-реперфузии мозга соединение РУ-792 (8,2 мг/кг) повышало выживаемость животных на 20%, мексидол (122,4 мг/кг) - на 10%. Вещество РУ-792 нормализовало показатели перекисных процессов, снижая концентрацию МДА при отдаленных сроках реперфузионного повреждения в сыворотке (на 33%) и в мозге (на 32%); восстанавливало активность ГП в крови (на 86%) и мозге (на 41%).

7. Вещество РУ-792 (доза 8,2 мг/кг) уменьшало токсическое действие CCI4 на печень. Оно улучшало детоксикационную функцию печени, укорачивая длительность «гексеналового сна» на 38%, уменьшало процессы холестаза, снижая активность ЩФ на 36%, тормозило мезенхимально-воспалительные реакции, сокращая отек печени на 10%, нормализовало белковый обмен и было сопоставимо с эффектами мексидола. Вещество РУ-792 снижало концентрацию МДА в сыворотке крови до нормы и в тканях печени в 1,9 раза, тем самым, уменьшая процессы пероксидации в поврежденном органе.

4.4. Заключение

При исследовании фармакологического действия изучаемых веществ под шифрами РУ-756, РУ-757 и РУ-792 установлено, что соединение РУ-756, оказывает умеренное противогипоксическое действие, при этом у соединений РУ-756 и РУ-792 данный показатель оказался выше.

При изучении противоишемических эффектов была отмечено, что вещество РУ-757 оказывало более выраженные эффекты на процессы пероксидации, в то время как РУ-756 в большей степени влияло на неврологические и поведенческие проявления ишемического повреждения. При этом соединение РУ-792 имело более выраженное защитное действие при ишемии головного мозга - нормализовало неврологический статус, локомоторную активность и важнейшие поведенческие показатели, а также уменьшало перекисные процессы в тканях мозга и крови.

Исследование противоишемических эффектов вещества РУ-792 при ишемически-реперфузионных повреждения головного мозга показало, что соединение способствовало увеличению выживаемости животных как при ранних так при более поздних поражениях головного мозга. РУ-792 уменьшал проявления перекисных процессов, снижая концентрацию МДА как в крови, так и тканях мозга практически до нормальных показателей во все временные отрезки эксперимента. Соединение РУ-792 увеличивало активность фермента ГП как в крови, так и тканях мозга при ранних и более отдаленных реперфузионных поражениях мозга, и также повышало активность СОД при отдаленных последствиях ишемического повреждения головного мозга.

Изучение защитного действия соединения РУ-792 при интоксикации тетрахлорметаном показало, что данное вещество улучшает детоксикационную функцию печени, проявляя эффекты сопоставимые препарату сравнения мексидолу. Вещество РУ-792 способствовало уменьшению холестаза, но слабо влияло на цитолитическое повреждение гепатоцитов, тем самым проявляя сходные эффекты с мексидолом. Однако РУ-792 более активно, чем мексидол оказывало влияние на мезенхимально-воспалительные процессы в печени, и проявило схожие эффекты по влиянию на восстановление функциональной активности клеток печени. Соединение РУ-792 эффективно снижало количество МДА в тканях печени и крови, статистически значимо повышало активность СОД, имело тенденцию к увеличению активности ГП как в тканях печени, так и крови. Данные эффекты были сопоставимы по выраженности с таковыми препарата сравнения мексидола.