Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Противодиабетическая активность производных бензимидазола

РГБ ОД

На правах рукописи 2 9 ЯЬ'З 2С02 «Для служебного пользования» Экз. №

Дудченко Галина Петровна

ПРОТИВОДИАБЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА

14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Волгоград 2001

Работа выполнена в Волгоградской медицинской академии Министерства здравоохранения РФ

Научные консультанты - Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор A.A. Спасов

Академик МАИ, доктор медицинских наук, профессор М.И. Балаболкин

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

НИИ фармакологии РАМН, г.Москва

Защита состоится « 19 » сентября 2001 года в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 208. 008. 02 при Волгоградской медицинской академии (400066, Волгоград, пл. Павших борцов, 1). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии. Автореферат разослан « S » (Я/ 2001 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор медицинских наук А.Р. Бабаева.

Л.Н. Сернов Ю.С. Макляков П.А. Бакумов

pwf. Ъ о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Диабет и его сосудистые осложнения являются одной из центральных проблем современной медицины. Около 4% населения страдают этим заболеванием, которое приводит к значительному ухудшению качества жизни, ранней инвалидизации и смерти (Балаболкин М.И., 1998; Дедов И.И., 1998; Amos A.F., 1997).

Основной задачей терапии сахарного диабета является достижение длительной и стойкой компенсации углеводного обмена, которая обеспечи-. вает профилактику развития осложнений. Поэтому, медикаментозное лечение направлено в первую очередь на основные патогенетические звенья ин-сулиннезависимого сахарного диабета: на дисфункцию (3-клеток поджелудочной железы и на резистентность периферических тканей к действию инсулина. Тем не менее, комплексная терапия данного заболевания не обходится без использования препаратов, задерживающих развитие и прогрессиро-вание диабетических осложнений. Однако, одновременное применения большого количества препаратов у больного, зачастую приводит к возникновению ряда проблем, в том числе и взаимодействия лекарственных средств. Поэтому предпочтение отдается препаратам с комбинированным действием, способным противодействовать осложнениям диабета. Выбор которых, не столь велик: это производные сульфонилмочевины (гликлазид, амарил) (Akanuma Y. et al., 1991; Ozaki Y., 1992), бигуаниды (метформин) (Jansen M. et al., 1991) и производные тиазолидиндиона (троглитазон, розиглитазон) (Samraj G.P. et al., 2000). Кроме того, ряд недостатков этих препаратов ограничивает их использования в клинической практике. Для производных сульфонилмочевины это связано с развитием вторичной резистентности к ним у 5- 10% больных сахарным диабетом II типа (Анциферов М.Б., 2000). Ограничения использования бигуанидов определяются возможностью развития лак-тоацидоза (Wiholm В.Е., 1993), а производных тиазолидиндиона, выявленной гепатотоксичностью (Forman L.M. et al., 2000). Несомненно, все перечисленные факторы делают очевидным необходимость создания новых высокоэффективных, безопасных противодиабетических препаратов. Поскольку, только расширение спектра пероральных антидиабетических средств позволит обеспечить максимальную компенсацию сахарного диабета с учетом индивидуальных особенностей каждого больного. Будущее принадлежит препаратам, способным воздействовать на патогенетические звенья заболевания, и обеспечивающим профилактику и лечение сосудистых осложнений за счет специфического воздействия на патогенетические звенья диабетических осложнений. Перспективным химическим классом для подобных изысканий могут явиться конденсированные производные бензимидазола. По данным литературы (Brotner A. et al., 1977; Howell S.L. et al., 1982; Caprio S. et al., 1984; Amstutz I. et al., 1997; Suzuki T. et al., 2000) и результатам проведенных ранее исследований (Спасов А.А., 1983; Дудченко Г.П., 1989; Островский О.В., 1995; Турчаева А.Ф., 1995; Косолапов В.А., 1995), соединения этого химического ряда проявляют гипогликемические, антиоксидантные, антиаг-

регантные свойства и стимулируют фибринолиз. Поэтому поиск потенциальных противодиабетических препаратов с комбинированным действием среди производных бензимидазола является достаточно обоснованным и целесообразным.

Диссертационная работа выполнена в рамках государственной научно-технической программы «Борьба с наиболее распространенными болезнями» по теме «Сахарный диабет», Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения», научно-исследовательской программы «Фармакологическое изучение конденсированных гетероциклических производных бензимидазола, краун-эфиров и других структур с целью выявления потенциальных лекарственных средств». Тема включена в план НИР Волгоградской медицинской академии. Утверждена на заседании Ученого Совета академии (протокол № 6 от 10 января 2001г.).

Целью исследования явилось экспериментальное обоснование целесообразности поиска антидиабетических веществ в ряду конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола и создание эффективного противодиабетического средства с комбинированным действием, влияющего на патогенетические звенья диабета и его сосудистых осложнений. Основные задачи исследования:

1. Проведение скрининговых исследований в ряду производных бензимидазола с целью выявления гипогликемических, антиагрегантных, анти-оксидантных веществ, а также соединений с комбинированным механизмом действия.

2. Анализ связи биологической активности исследуемых соединений с их химическим строением. Разработка рекомендаций для целенаправленного синтеза новых соединений данного химического ряда веществ, проявляющих гипогликемические свойства и влияющих на патогенетические звенья сосудистых осложнений диабета.

3. Исследование антидиабетического влияния производных бензимидазола с комбинированным действием (гемобиологическими и антиокислительными свойствами) на экспериментальных моделях сахарного диабета, отражающих различные патогенетические стороны клинических типов диабета.

4. Изучение механизма сахароснижающего действия производных бензимидазола с антиагрегантными и антиоксидантными свойствами и оптимизация системы поиска антидиабетических веществ среди производных бензимидазола.

5. Исследование влияния антидиабетических соединений с антиагрегантными свойствами на гемореологические показатели крови.

6. Изучение влияния противодиабетического вещества с антиоксидантными свойствами на процессы перекисного окисления липидов.

7. Проведение всесторонней доклинической оценки эффективности и безопасности наиболее активного соединения и создание на его основе

нового противодиабетического препарата с комбинированным действием.

Научная новизна. Проведено исследование фармакологической (гипогликемической, антиагрегантной, антиоксидантной) активности 336 конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола. При этом установлено, что наиболее перспективными химическими рядами для поиска сахароснижающих веществ являются N9 замещенные (1,2а) бензимидазола, N9 замещенные 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола, 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазолы. На основании анализа «биологическая активность - химическая структура» установлено, что 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазолы являются оптимальным химическим рядом производных бензимидазола для выявления веществ, сочетающих гипогликемические и антиоксидантные свойства. Выявление соединений с комбинированным сахароснижающим и антиагре-•гантным действием вероятно среди производных всех трех химических рядов, перспективных для поиска гипогликемических веществ. В результате скрининговых исследований обнаружены соединения с бифункциональной фармакологической активностью: вещество РУ-254 (гипогликемические и антиагрегантные эффекты), соединение РУ-871 (сахаросни-жающие и антиоксидантные свойства).

В ходе работы показана перспективность и возможность разработки эффективных безопасных препаратов с комбинированным механизмом действия на основе производных бензимидазола. Экспериментально обоснована при различных вариантах течения диабета (дисфункция Р-клеток, инсулинрезистентность) возможность применения для лечения инсулин-независимого диабета веществ РУ-254 и РУ-871. Изучен механизм их ан-тидиабетогенного действия. По результатам исследования установлено, что он связан с панкреотропными и экстрапанкреатическими эффектами соединений. Выявленное влияние антидиабетических веществ с антиагре-гантными свойствами (РУ-254) на гемореологические показатели крови и с антиоксидантными эффектами (РУ-871) на процессы перекисного окисления липидов, позволяет рассматривать возможность их использования для лечения диабета и его сосудистых осложнений.

Отработана методология поиска антидиабетических веществ в ряду производных бензимидазола, разработаны новые подходы к оценке механизма действия потенциальных противодиабетических препаратов.

Научно-практическая ценность. На основании полученных данных показана целесообразность поиска антидиабетических веществ, влияющих на патогенетические звенья сосудистых осложнений среди конденсированных бензимидазольных систем. В результате выявленных закономерностей между гипогликемической, антиоксидантной, антиагрегантной активностью производных бензимидазола и их химической структурой разработаны рекомендации для целенаправленного синтеза антидиабетических веществ, влияющих на патогенетические звенья са-

харного диабета и его сосудистых осложнений. На примере изучения ан-тидиабетогенных свойств соединений РУ-254 и РУ-871 с использованием различных патогенетических вариантов течения сахарного диабета и исследования механизма их гипогликемического действия разработана методология поиска антидиабетических веществ в ряду производных бензи-мидазола. Предложенная схема скрининга оптимизирует поиск и стандартизирует подходы при создании противодиабетических веществ на основе производных бензимидазола.

Выраженные антидиабетические свойства соединения РУ-254, основанные на его панкреотропных и экстрапанкреатических эффектах, его нормализующее влияние на гемореологические свойства крови, а'также доказанная в ходе проведенного исследования безопасность его применения - послужили основанием для создания на основе вещества РУ-254 пе-рорального противодиабетического препарата, получившего название диабенол. Материалы представлены в Фармакологический комитет. Получено разрешение на проведение клинических испытаний.

Противодиабетическое действие соединения РУ-871 в сочетании с его влиянием на процессы перекисного окисления липидов позволяет предполагать перспективность разработки на его основе фармакологического препарата для компенсации инсулиннезависимого сахарного диабета, осложненного ангиопатиями.

. - Реализация результатов исследования. Выявленная зависимость активность-структура (гипогликемическая, гипогликемическая-антиоксидантная, гипогликемическая-антиагрегантная) используются при синтезе новых веществ в НИИ физической и органической химии Ростовского университета. Результаты работы включены в лекционные курсы на кафедрах фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ BMA, на кафедрах фармакологии Кубанской медицинской академии, Саратовского и Ростовского медицинских университетов.

■ Основные положения, выносимые на защиту.

1. Конденсированные производные бензимидазола - новый класс противодиабетических соединений, сочетающих гипогликемическую активность с антиоксидантными и антиагрегантными свойствами.

2. Соединение РУ-254 оказывает выраженное противодиабетическое действие на экспериментальных моделях, связанных с дисфункцией ß-клеток и синдромом инсулинрезистентности, за счет улучшения секреции инсулина и потенцирования его эффектов.

3. Вещество РУ-254 с антиагрегантным действием, оказывает при экспериментальном диабете положительное влияние на гемореологию.

4. Антидиабетическое действие соединения РУ-871 связано с его саха-роснижающим действиям при различных экспериментальных патогенетических вариантах сахарного диабета (нарушение секреции инсулина, резистентность периферических тканей к действию гормона) и влиянием на процессы перекисного окисления липидов.

5. Механизм гипогликемического действия соединений РУ-254 и РУ-871 определяется их панкреотропными и экстрапанкреатическими эффектами.

6. Вещества РУ-254 и РУ-871 являются основой для создания перораль-ных противодиабетических препаратов, компенсирующих сахарный диабет и влияющих на развитие и прогрессирование его сосудистых осложнений.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на IX - XIII конференциях молодых ученых, Волгоград, 1989-1993; на 44-Й-55-Й научных сессиях Волгоградской медицинской академии, 19902000; на VI съезде фармакологов, Ташкент, 1988; на Межреспубликанской научно-практической конференции «Синтез, фармакология психотропных и сердечно-сосудистых веществ», Волгоград, 1989; на Российской научной конференции «Создание лекарственных средств», Купавна, 1992; на I съезда Российского общества фармакологов «Фундаментальные исследования, как основа создания лекарственных средств», Волгоград, 1995; на V Международной научно-практической конференции создание и апробация лекарственных препаратов «Лекарства-человеку», Каунас, 1997; на научно-практической конференции «Проблемы диагностики и лечения сердечнососудистых заболеваний», Саратов, 1997; на VI научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств «Лекарства-человеку», Харьков, 1998; на IX научно-практической конференции по созданию и апробации новых лекарственных средств «Лекарства-человеку», Минск, 1999; на II, IV, VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1995, 1997, 1999; на научно-практической конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии», Санкт-Петербург, 1999.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 работ, в том числе два патента и два авторских свидетельства.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 333 страницах машинописного текста, иллюстрирована 69 таблицами, 24 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (глава I), экспериментальной части (главы II-VIII), обсуждения результатов, выводов и приложения. Список литературы включает 105 отечественных и 272 иностранных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 2293 белых нелинейных крысах обоего пола массой 170-450г, 1200 белых нелинейных мышах обоего пола массой 16-22г, 130 морских свинках, 29 кроликах, 17 кошках и 32 собаках.

В работе изучены неконденсированные производные бензимидазола (38 соединений), Ирзамещенные имидазо (1,2а) бензимидазола (72 соединения), ^-замещенные имидазо (1,2а) бензимидазола (142 соединения), N9-замещенные 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола (41 соединение),

2,3,4,10 тетрагйдропиримидо (1,2а) бензимидазола (3 Г соединений), пиразо-ло (1,5а) бензимидазола (12 соединений), синтезированные в НИИ ФОХ Ростовского государственного университета!.

Поиск гипогликемических веществ проведен на нормогликемических крысах (Holland G.,1961). Динамику изменений уровня глюкозы в крови выражали в Д % относительно исходного уровня и в баллах активности по градации, приведенной ниже. При этом за 1 балл принимали изменения уровня глюкозы на 5-10%, за 2 балла - на 10-20%, за 3 балла на 20-30% и т.д. Отрицательные значения величины активности в баллах отражали гипогликемическое действие, положительные - гипергликемическое действие соединений. Умеренно активными считали вещества, снижающие уровень глюкозы в пределах 1 балла, активными - 2 балла, высоко активными - 3 балла.

Скрининг антиоксидантных веществ проведен на модели аскорбат-индуцируемого перекисного окисления липидов гомогенатов печени мышей (Панкин В.З., 1975). Антиоксидантная активность оценивалась в баллах, равных модулю десятичного логарифма минимальной концентрации, вызывающей антиоксидантный эффект. Высокоэффективными являлись вещества, ин-гибирующие ПОЛ в концентрациях ниже эффективными - дейст-

вующие в диапазоне концентраций 1Х10"6М - 1*10'5М, малоактивными - инги-бирующие ПОЛ в концентрации

неактивными - не проявляющие тормозящего действия в концентрации 1*1 О^М.

Выявление антиагрегантных соединений проведено по методу (Born G.V.P.,1962) в модификации З.А. Габбасова на двухканальном лазерном анализаторе агрегации (модель 220LA) научно-производственной фирмы «Биола» (Россия). Для определения агрегации тромбоцитов в изучаемом образце крови использовали богатую тромбоцитами плазму (Люсов В.А. и др., 1971), Индукцию агрегации тромбоцитов проводили АДФ (Reanal, Венгрия) в концентрации 5мкМ. Степень агрегации тромбоцитов оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы. Антиагрегантную активность веществ сравнивали, используя рассчитанную графически величину ЭК50 (эффективная концентрация, снижающая агрегацию тромбоцитов на 50%) и баллы (логарифм обратной величины ЭК50). Активными считали вещества подавляющие агрегацию тромбоцитов в концентрации

ПО"4 М/л

больше, чем на 30%.

Оценка взаимосвязи выявленная активность-структура проводилась двумя способами: эмпирическим и методом компьютерного прогноза гипог-ликемической активности структурно разнородных органических соединений с использованием рисковой стратегии прогноза, реализованной в программном комплексе «Микрокосм».

Противодиабетическую активность перспективных производных бен-

1 Выражаем искреннюю признательность к.х.н. в.н.с. В.А. Анисимовой за предоставленные соединения. 8

зимидазола (соединений РУ-254 и РУ-871) исследовали на моделях, отражающих основные звенья патогенеза диабета: дисфункцию ß-клегок поджелудочной железы (латентная форма стрептозотоцинового диабета) (Баранов В.Г., 1983) и синдром инсулинрезистентности: ожирение на старых крысах (Kahn C.R., 1993), экзогенную гиперинсулинемия (Гордиенко O.E., 1973). Постпрандиальную гликемию моделировали, используя пероральный нагрузочный тест глюкозой (Колесник Ю.М. и др., 1993) с целью стандартизации процесса приема пищи у подопытных животных. Для оценки чувствительности тканей к инсулину использовали пробу Химсворда (Цюхно З.И., и др., 1981). Препаратами сравнения были выбраны производные сульфонилмоче-вины: гликлазид (субстанция гликлазида, Сервье, Франция), глибенкламид (Манинил-5, Германия) и производное ароматических сульфонов и карбоно-вых кислот: глидифен (субстанция глидифена, ВНЦ БАВ, Старая Купавна).

При изучении механизмов противодиабетического действия соединений РУ-254 и РУ-871, оценивали их влияние на базальную и индуцированную глюкозой секрецию инсулина. Концентрацию гормона в крови наркотизированных кошек определяли спектрофотометрическим иммунофермент-ным методом (Boehringer, Германия). Способность усиливать поглощение глюкозы изолированной диафрагмой крыс в присутствии инсулина в инкубационной среде и без его участия исследовали по методу В.П. Котегова (1997). В качестве препаратов сравнения использовали гликлазид и глидифен. Влияние веществ на гипогликемические свойства инсулина проверяли на панкреа-тэктомированных собаках по схеме В. A. Houssay (Галлер Г. и др., 1973) и крысах с некомпенсированным стрептозотоциновым диабетом (Баранов В.Г., 1983). В экспериментах использовали инсулин Актрапид MC (Ново-Нордикс, Дания). Влияние исследуемых соединений на активность кишечных олигоса-харидаз изучали методом углеводных нагрузок по типу сахарных кривых (Домбровская М.П. и др., 1969), сравнивая их эффективность с акарбозой (Байер, Германия). В качестве субстрата применяли крахмал (ГОСТ-Ю1163-62) и сахарозу (Реахим, Россия). Об интенсивности расщепления углеводов в кишечнике судили по уровню глюкозы крови, содержание которой во всех сериях экспериментов определяли спектрофотометрическим глюкозоокси-дазным методом, используя наборы Био-ла-тест (Лахема диагностика, Чехия).

Исследование гемореологических свойств соединения РУ-254 проводили на стрептозотоциновых животных с синдромом гипервязкости. Агрегации эритроцитов изучали по методу O'Brien (1996). В качестве индуктора использовали алциановый голубой (Sigma, США). Вязкость крови определяли на реологическом анализаторе крови АКР-2 (Россия) при семи скоростях сдвига (Добровольский H.A. и др., 1998). Для оценки изменения деформабельности эритроцитов применялся метод О.М. Моисеевой (1990). На гемокоагулометре «SOLAR» (Белоруссия) с использованием тест-наборов (НПО Ренам, Россия) исследовали показатели тромбинового, протромбино-вого времени, активированного парциального тромбопластинового времени (Баркагян З.С., 1999). В качестве препарата сравнения использовали пенток-

9

сифиллин (Хехст, Германия). При исследовании механизмов ингибирования соединением РУ-254 склеивания кровяных пластинок, изучали его воздействие на агрегацию тромбоцитов, вызванную различными индукторами, влияние на антиагрегационную активность сосудистой стенки и синтез тромбок-сана Aj;. В качестве индукторов агрегации тромбоцитов использовали АДФ в конечной концентрации 5*10"6М (Serva, Германия), адреналин в концентрации 5х 10~6М (Sigma, США), арахидоновую кислоту в концентрации 50 мкМ (Sigma, США), фактор активации тромбоцитов в концентрации 1Х10"8М (Sigma, США), коллаген в концентрации 4 мкг/мл (Sigma, США) и ристоце-тин в концентрации 1,2 мкг/мл (Sigma, США). Моделирование и степень внутрисосудистой агрегации тромбоцитов проводили и оценивали по методу, описанному J. F. Pinon (1984). Антиагрегационную активность сосудистой стенки исследовали по методу D. Е. Maclntyre (1978), в модификации В.П. Балуды (1980). Изучение воздействия соединения РУ-254 синтез тромбоксана Аг- проводили по методу J.B. Smith (1976). О содержании тромбоксана А2 косвенно судили по количеству определяемого малонового диальдегида в тромбоцитах. В качестве индуктора для выполнения данной методики использовали тромбин (Sigma, США). Определение малонового диальдегида, образующегося в процессе агрегации тромбоцитов, индуцированной тромбином, проводили с помощью тиобарбитуровой кислоты (Гаврилов В.Б.,1987).

Исследование антиоксидантной активности вещества РУ-871 проводили, используя определение супероксидцисмутазоподобной активности по методу Костюка В.А. и соавт. (1990). В исследовании использовался кверце-тин (Sigma, США). Антирадикальной активности по методу Glevind (1963). В экспериментах использовался спиртовой раствор а-дифенил-ß-" пикрилгидразила (Sigma, США). Аскорбат-зависимого ПОЛ по методу A.A. Кубатиева и С.В. Андреева (1981), Субстратом ПОЛ являлись микросомы печени, полученные по методу Kamath et al. (1971). Реакцию инициировали добавлением аскорбиновой кислоты (Chemapol, Чехия). Скорость ПОЛ определяли по накоплению ТБК-позитивных продуктов в реакции с тиобарбитуровой кислотой. Влияние веществ на НАДФ-зависимое ПОЛ проводилось по тому же методу и с использованием тех же субстратов, что и аскорбат-зависимое ПОЛ. В исследовании использовали реактивы: АТФ, НАДФ-натриевая соль, глюкозо-6-фосфат (Reanal, Венгрия), глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Fluka A.G., Швейцария). В качестве препаратов сравнения использовали субстанции отечественных комерческих препаратов дибунола, мексидола, пробукол был произведен фирмой (Servier, Франция); а-токоферол -фирмой (Serva, Германия), аскорбиновая кислота - (Chemapol, Чехия). Эффективность антиоксидантного действия (ЭАД) вещества РУ-871 изучали также в модельной системе окисления липосом, описанной В.Г Зайцевым., В.И. Закревским (2000). Липосомы готовили инжекционным способом (Batzri S., Korn E.D., 1973). Уровень перекисного окисления липосом в суспензии липосом оценивали по концентрации карбонильных соединений.

Изучение фармакокинетики проведено в соответствии с методическими

указаниями по проведению доклинических исследований фармакокинетики фармакологических веществ и лекарственых средств (Фирсов A.A. и др., 2000). Полученные экспериментальные данные проанализированы модельно-независимым методом (Gibaldi М., Perrier D., 1982). Площадь под фармако-кинетической кривой (AUC) рассчитана с помощью смешанного линейно-логарифмического метода статистических моментов (Пиотровский В.К., 1986):

Изучение безвредности проведено в соответствии с требованиями Фармакологического Комитета МЗ РФ (Фисенко В.П., 2000) и включало исследование общетоксикологических свойств препарата: изучение острой токсичности, кумулятивных свойств и хронической токсичности (Арзамасцев Е.В., 2000), а так же исследование специфической токсичности препарата: аллергизирующих свойств (Любимов Б.И., 2000), репродуктивной токсичности (Любимов Б.И., 2000), иммунотоксического действия (Хаитов P.M.). Среднесмертельную дозу (ЛД50) субстанции и лекарственной формы определяли по В.Б. Прозоровскому (1962)._Возможность накопления вещества в организме подопытных животных (кумуляцию) изучали по методу Ю.С.Кагана и В.В.Станкевича (1964).

Обработка результатов выполнялась на компьютере IBM PC / AT в программе Microsoft Excel 2000 с использованием t- критерия Стьюдента и парного критерия Т. Вилкоксона (А.И. Венчиков, В.А. Венчиков, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выявление веществ, проявляющих гипогликемические, антиагрегантные и антиоксидантные свойства

1.1. Исследование гипогликемической активности

Из 116 производных бензимидазола, изученных на наличие гипоглике-мических свойств, 59% соединений (69 веществ) снижали уровень глюкозы в крови интактных животных в пределах 1-3 баллов. Не активными оказался 21% всех протестированных веществ. Гипергликемические свойства обнаружены у 20% соединений. Наибольшее количество гипогликемических веществ (69,4% ) относительно общего массива производных бензимидазола с сахаропонижающими свойствами было выявлено среди производных N9 2,3-дигидроимидазо-(28,6%), 2,3,4,10-тетрагидропиримидо-(30%) и N,, имидазо (1,2а) бензимидазола (17,1%). Тогда как на долю N9 замещенных имидазо (1,2а) бензимидазола, Ng-пиразоло (1,5а) бензимидазола и неконденсирован-ных производных бензимидазола приходилось 11,4%, 1,4%, 11,4% соединений, соответствено. Вещества, проявившие выраженную гипогликемическую активность РУ-254, РУ- 283, РУ-284, Ру-854, РУ-870, сопоставимую с сахаропонижающим действием гликлазида, также относятся к указанным химическим рядам (табл. 1).

Таблица 1

Влияние наиболее активных производных бензимидазола и глик-лазида (50 мг/кг перорально) на содержание глюкозы в крови интакт-

ных крыс (М±т)

Шифр соединения Изменения содержания глюкозы после введения веществ в А % к исходному уровню

через 2 часа через 4 часа

^-замещенные 2,3-дигидроимидазобензимидазола

РУ-254 -24,9 ±4,4* -26,8 ± 2,8*

РУ-283 -22,0 ± 3,9* -23,1 ±4,1*

РУ-284 -21,3 ±5.1* -23,1 ±3,8*

производные 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазола

РУ-854 -28,2 ±5,2* -7,0 ±3,2

РУ-870 -26,0 ± 6,7* -26,2 ± 5,4*

препараты сравнения

Гликлазид | -28,4 ± 7,8* -30,0 ±5,8*

* -изменения достоверны по сравнению с контрольными данными (Р<0,05)

1.2. Исследование антиагрегантной активности

Антиагрегантные свойства (активность в пределах 4 баллов, что соответствует ингибированию склеивания кровяных пластинок исследуемыми соединениями в концентрации 1Х10"*М) обнаружены у 70% производных бензимидазола; из 90 соединений, протестированных на антиагрегантную актив- * ность. Наиболее часто встречались вещества, препятствующие агрегации тромбоцитов среди N9 производные имидазо (1,2а) бензимидазола (72%), N9 производных 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола (71%) и производными 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазола (71%). У немногочисленных соединений, представляющих производные пиразоло (1,5а) бензимидазола и неконденсированные производные бензимидазола антиагрегантные свойства не были обнаружены. Среди N1 замещенных имидазо (1,2а) бензимидазола активные соединения встречались в 2 раза реже (35%) по сравнению с N9 замещенными имидазо (1,2а) бензимидазола, N9 производными 2,3 -дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола и производными 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазола. Для которых было характерно равное распределением активных соединений внутри каждого отдельно взятого химического ряда веществ. Из 16 высоко активных антиагрегантных соединений (3X50^,0х 10"4М), обнаруженных среди N9 производные имидазо (1,2а) бензимидазола, N9 производных 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола, 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазола, наиболее активным оказалось вещество РУ-254, которое по эффективности ингибирования склеивания кровяных пластинок в 1,4 раза превосходило гликлазид -

противодиабетический препарат с антиагрегантными свойствами (табл.2).

Таблица 2

Уровень антиагрегантной активности, производных бензимидазола,

Шифр соединения эк50

N9 производных имидазо( 1,2а)бензимидазола

РУ-397 3,8'ч10"4

РУ-185 з,зхкг4

РУ-186 3,8Х10'4

РУ-187 3, 9х 10"4

РУ-188 3,3Х10"4

РУ-458 3, 8х 10"4

РУ-614 3,1х10'4

N9 производных 2,3-дигидроимидазо( 1,2а)бензимидазола

РУ-254 2,6Х104

РУ-660 3,8Х10'4

РУ-662 3,0Х10"4

РУ-664 3,2Х10"4

РУ-667 3,5*10"4

производные 2,3,4,10-тетрагидропиримидо(1,2а) бензимидазола

РУ-553 3,9х 10

РУ-670 3,2 х10"4

РУ-673 3,0Х10"4

РУ-674 3,5К10'4

препараты сравнения

Гликлазид 3,7*10"1

1.3. Исследование антиоксидантной активности

Антиокислительные свойства изучены у 273 производных бензимидазола. Из них у 53 веществ обнаружена способность ингибировать окисление липидов. Среди N1, N9 имидазо (1,2а) бензимидазола, N9 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола, 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазола и неконденсированных производных бензимидазола антиоксидантная активность отмечена у 4%, 28%, 9%, 18% и 21% (от числа всех соединений в каждой группе веществ) соответственно. 42 соединения ингибировали перекис-ное окисление липидов в сопоставимых концентрациях с дибунолом. 11 вы-:око активных веществ значительно превосходили по уровню активности цибунол, и были сопоставимы по эффективности с а-токоферолом (табл.3). Только одно соединение с выраженными антиоксидантными свойствами 1роявляло также и умеренную гипогликемическую активность. Это было зещество РУ-871.

Таблица 3

Уровень антиоксидантной активности, производных бензимидазола, оказывающих выраженное антиоксидантное действие (in vitro)

Шифр МЭК

соединения (мкМ)

неконденсированные производные бензимидазола

РУ-785 0,89

РУ-596 0,32

производные N9 имидазо( 1,2а)бензимидазола

РУ-185 0,39

РУ-615 0,40

РУ-689 0,40

РУ-688 0,41

РУ-687 0,41

РУ-628 0,58

РУ-627 0,63

РУ-620 0,63

производные тетрагидропиримидино (1,2-а) бензимидазола

РУ-871 0,56

препараты сравнения

Дибунол 3,0

а-токоферол 1,0

В результате проведенного поиска и исследования взаимосвязи гипог-ликемическая-антиоксидантная, гипогликемическая-антиагрегантная активность среди производных бензимидазола для дальнейшего углубленного изучения были выбраны два соединения под лабораторными шифрами РУ-254 и РУ-871.

2НС1 Соединение РУ254 дигидрохлорид 9-(5гДиэтиламиноэтил 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазол

НВг

Соединение РУ-871 гидробромид 9-дитретбутил оксифенил карбоксиметил 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2 а) бензимидазол

Указанный выбор был обусловлен сочетанием у вещества РУ-254 высокой гипогликемической активности с выраженной антиоксидантной активностью. Указанное соединение по своим эффектам не уступало или даже превосходило гликлазид, Вещество РУ-871 с умеренной гипогликемической активностью привлекло наше внимание из-за высокой антиоксидантной активности, сопоставимой с а-токоферолом.

1.4. Взаимосвязь фармакологическая активность - химического строения производных бензимидазола.2

Анализ «активность-структура», проведенный методом компьютерного прогнозирования гипогликемической активности производных бензимидазола с использованием рисковой стратегии прогноза подтвердил оригинальность химической структуры данного класса соединений, принимающих участие в регулировании углеводного обмена. Установлено, что направленность эффекта определяется преобладанием гипогликемических (гипергликемиче-ских) фрагментов в образе конкретного соединения. Все дескрипторы у препаратов мирового ассортимента отличаются от дескрипторов производных бензимидазола. Их обобщенный образ не похож на образ производных бензимидазола, в то время как часть дескрипторов производных бензимидазола все-таки имеет сходство с некоторыми представителями препаратов мирового ассортимента. Высокая точность прогноза выборки, очевидно, свидетельствует о сильных структурных различиях этих двух классов, что, скорее всего, позволяет сделать вывод об оригинальности класса производных бензимидазола как потенциальных гипогликемических веществ. Наиболее важные дескрипторы гипогликемической активности приведены в таблице 4. К фар-макофорам гипогликемической активности практически отсутствующим у гипергликемических веществ надо отнести 1-12 дескрипторы:

\ N-СНг

/ 4=

\

2

\

-с—сц

пл

V

аг

7 8 9 10 11 12

Результаты эмпирического анализа подтверждают зависимость активности от взаимного влияния ядерных структур и отдельных заместителей. И позволяет дать конкретные рекомендации для целенаправленного синтеза

6

4

5

3

2 Выражаем искреннюю благодарность к.б.н., с.н.с. НПЦ «Сплайн» П.М. Васильеву за оказанную помощь при выполнении исследований.

веществ с комбинированным действием. Перспективными химическими рядами снижающих уровень глюкозы и ингибирующих агрегацию тромбоцитов следует рассматривать N9 производные имидазо (1,2а) бензимидазола, N9 производные 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола и производные 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидаола. При синтезе новых N9 производных имидазо (1,2а) бензимидазола предпочтение следует отдавать соединениям, имеющим в Я) положении диэтиламиноэтильный и пипериди-ноэтильный радикалы,- избегая сочетания диэтиламиноэтильного заместителя с тиенильным радикалом в положении, а используя в качестве заместителя в этом положении водород. В положение возможно введени различных по химическому строению радикалов, поскольку они мало влияют на фармакологическую (гипогликемическую и антиагрегантную) активность соединений. Присутствие пиперидиноэтильного радикала в качестве заместителя в И.] положении возможно при исключении из положения фенильного заместителя и его модификаций, и наличии в Я3 положении водорода, а еще лучше тиенильного радикала, обеспечивающего выраженную гипогликемическую активность и антиагрегантные свойства веществ. В ряду N9 производных 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола, соединения, имеющие этилгидроксифенильный радикал, а в ряду производных 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазола, - диэтиламиноэтильный и окси-фенильные заместители, следует считать наиболее приемлемыми вариантами для создания гипогликемических веществ, препятствующих склеиванию кровяных пластинок.

По результатам эмпирического анализа наиболее перспективными структурами, из исследованных химических рядов производных бензимидазола, для синтеза соединений, сочетающих гипогликемические и антиоксидантные свойства, следует считать производные 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазола. Так как среди активных веществ по двум направлениям фармакологического воздействия (снижающих уровень глюкозвы крови и ингибирующих окисление липидов), встречаются соединения, содержащие фенольные замещения, то использование диэтиламиноэтильного, пиперидиноэтильного, а также тиенильного радикалов в комбинации с фенольными замещениями в различных положениях, позволит синтезировать вещества, сочетающие гипоглике-мическое действие с антиоксидантными свойствами. По солеобразующему остатку, предпочтение, по-видимому, следует отдавать бромистоводородным соединениям. Второй структурой, достаточно перспективной для этих целей, может стать группа веществ - производных N9 имидазо (1,2а) бензимидазола, содержащих в II, положении диэтиламиноэтильный радикал, сочетание которого, с оксифенильным, метоксифенильным, бензимидазолильным, тиенильным, либо диоксифенильным радикалами в положении и водородом в Ыз положении может привести к созданию гипогликемических веществ с антиоксидантными свойствами. Вновь синтезируемые соединения, должны производными, что более предпочтительно для проявления

производными, что более предпочтительно для проявления антиоксидантных свойств веществ.

Таблица 4

Высокодостоверные признаки гипогликемической активности конденсированных производных бензимидазола (результаты по 32 гипогликемическим веществам с активностью -2 и -3 балла) __

№ Структур- Дескриптор Структур- Деск- Б-2,3 Р-2,3

. ный деск- длины цепи ный деск- риптор

риптор 1 в связях риптор 2 связи

1. -М< 2 >С= 0 7 3,84Е-03

2. 3 =о р о 7 3,84Е-03

3. -ж 6 >СН(Аг) АО 8 4,32Е-03

4. 1 Сус05 аО 3 1,92Е-03

5. -он 5..... >СН(Аг) АО 3 1,92Е-03

6. =0 2 >СН2 р о 8 4,32Е-03

7. =0 2 СусАг05 Р 1 3 1.92Е-03

8. >с= 1 >СН2 0 8 4,32Е-03

9. >СН2 3 >СН2 0 5 2,88Е-03

10. >СН2 4 >СН2 0 4 2,40Е-03

11. >СН2 5 >СН(Аг) АО 8 4,32Е-03

12. Сус05 -2 СусАг05 аО 3 1.92Е-03

Б - Число дескрипторов в классе актиных или неактивных соединений

Р - Баесовская вероятность встречаемости дескриптора в классе актиных или

неактивных

2. Противо диабетическая активность соединений РУ-254. РУ-871.

2.1 .Влияние веществ на постпрандиальный уровень глюкозы. В пробах крови, взятых у животных перед введением глюкозы, отмечалось достоверное снижение ее концентрации после введения глибенкламида, гликлазида и соединения РУ-254 на 48,8%, 33,0% и 20,4% соответственно. В группе крыс, получавших вещество РУ-871 изменения хотя и отличались от контрольных в 2 раза, однако не имели достоверного характера. В условия экзогенной гипергликемии оба вещества проявляли аитигипергликемическое действие. Профили кинетических кривых глюкозы, введенной после приема вещества РУ-254 и препаратов сравнения гликлазида и глибенкламида практически совпадают. Достоверное снижение глюкозы наблюдается после первого часа нагрузки углеводом. В то время как для вещества РУ-871 максимальный эффект приходится на первый час наблюдения. Что принципиально отличает данное соединение от других исследуемых веществ и позволяет рассчитывать на его способность снижать постпрандиальный уровень глюкозы (рис.1).

Глюкоза (Зг/кг)

Глюкоза + Гликлазид (50мг/кг) Глюкоза + РУ-871 (ЗОмг/кг)

90 120

Т (мин)

Глюкоза + Глибенкламид (50мг/кг) Глюкоза + РУ-254 (25мг/кг)

Рис. 1. Влияние веществ на уровень глюкозы в крови интактных крыс после перо. ральной нагрузки глюкозой

-120 -90 -60 -30

—»— Интактные

1иабет+Гликлазид (50мг/кг) 4иабет+РУ-254 (25мг/кг)

30

60

90 120 Т (мин)

Диабет

Диабет+Глидифен (50мг/кг) Диабет+РУ-о7Т (ЗОмг/кг)

Рис. 2. Влияние веществ на уровень глюкозы в крови крыс со стрептозотоциновым диабетом после пероральной нагрузки глюкозой

2.2. Влияние соединений на утилизацию глюкозы у животных со стреп-тозотоциновым диабетом. Антигипергликемическое действия, оказываемое веществами РУ-254 и РУ-871 на модели латентного стрептозотоцинового диабета связано с восстановлением физиологического профиля секреции инсулина. Поскольку в патофизиологической основе данной модели лежит снижение или полное отсутствие первой фазы выделения гормона, вызывающее нарушение утилизации глюкозы периферическими тканями (ОиЬаик

1982), которое обнаруживается у стрептозотоциновых животных по сравнению с интактными.

Профили утилизации глюкозы под влиянием вещества РУ-254 и препарата сравнения гликлазида, для которого установлена способность восстанавливать первую фазу секреции инсулина, совпадают. Отличие кинетической кривой глюкозы, введенной на фоне соединения РУ-871 объясняется его способностью влиять на постпрандиальный уровень глюкозы. В то время как у глидифена, препарата сравнения преимущественно с периферическим механизмом действия и отсутствием бета-цитотропного влияния, на данной модели антигипергликемический эффект не выявлен (рис.2).

2.3. Влияние веществ на утилизацию глюкозы при синдроме инсулинрезистентности. Нормализующее воздействие соединений РУ-254 и РУ-871 на периферическую утилизацию глюкозы при использовании моделей инсулинрезистентности (экзогенной гиперинсулинемии и ожирении у старых животных, сопровождающихся повышенным содержанием гормона в организме), в первую очередь, может быть связано с улучшением чувствительности тканей к инсулину. Исследование противодиабетической эффективности соединений при синдроме инсулинрезистентности различного генеза выявило отличия в их экстрапанкреатических механизмах.

Оба соединения улучшали утилизацию глюкозы на модели ожирения у старых животных. Незначительное и не имеющее статистической значимости повышение концентрации глюкозы после углеводной нагрузки в пределах 10% в крови подопытных животных, было достоверно сниженным на протяжении всего эксперимента относительно контрольной группы крыс, через полтора часа достигая исходных значений (рис.3). В основе данной модели ожирения лежит снижение чувствительности к инсулину транспортных систем глюкозы. Стимулирующее действие веществ РУ-254, РУ-871 на процесс поглощения глюкозы периферическими тканями, по всей вероятности, связано с ускорением или поддержанием под их влиянием рециклирования белков-транспортеров, осуществляющих транспорт глюкозы через мембрану клетки.

При экзогенной гиперинсулинемии выраженный антигипергликемический эффект выявлен только у вещества РУ-254. Увеличение поглощения глюкозы под влиянием вещества РУ-254, начиная с 60 минуты углеводной нагрузки достоверно увеличилось в среднем в 4 раза по сравнению с контрольными животными (рис.4). Соединение РУ-871 не улучшало утилизацию глюкозы периферическими тканями, что возможно связано с отсутствием эффекта на рецепторное звено действия гормона, поскольку считается, что при гиперинсулинемии любой этиологии существенно снижается количество рецепторов в жировой ткани, печени, лимфоцитах и мышцах.

—Контроль -в- Ожирение Т (мин)

-А-Ожирение+РУ-254 (25мг/кг) -х- Ожирение+РУ-871 (ЗОмг/кг)

Рис. 3 . Влияние веществ на уровень глюкозы в крови старых крыс с ожирением после пероральной нагрузки глюкозой

-120 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 —^-Контроль -в-Инсулин ТГмин)

-А-Инсулин+РУ-254 (25мг/кг) -*-Инсулин+РУ-871 (ЗОмг/кг) 1 1

Рис. 4. Влияние веществ на уровень глюкозы в крови крыс после пероральной нагрузки глюкозой на фоне экзогенной гиперинсулинемии

3. Исследование механизмов гипогликемического действия соединений РУ-254 и РУ-871

3.1. Панкреатическое действие веществ.

О панкреотропных эффектах веществ судили по их влиянию на базаль-ную и индуцированную глюкозой секрецию инсулина.

В результате проведенных исследований было установлено, что оба соединения усиливают секрецию сахаропонижающего гормона. Однако, по характеру стимулирующего действия они различаются между собой. Так вещество РУ-254 более чем в 4 раза (Р<0,05) увеличивает концентрацию инсулина в портальной вене животных по сравнению с его базальным уровнем, в то время как соединение РУ-871 практически не влияет на выделение гормона. Кинетическая кривая инсулина, секретируемого под влиянием соединения РУ-254 имеет двухфазный характер. Первый короткий по продолжительности пик секреции гормона сменяется более выраженным и более протяженным во времени пиком выделения инсулина. Снижение уровня глюкозы в крови под влиянием соединения РУ-254 является отражением изменений секреции гормона (рис.5). При введении исследуемых веществ на фоне глюкозы - физиологического стимулятора выделения инсулина, отмечалось значительное увеличение концентрации инсулина как относительно базального его содержания, так и относительно стимулируемого глюкозой. Однако, следует заметить, что выделение гормона из (3-клеток поджелудочной железы под действием соединения РУ-254 не является глюкозозависимым процессом, поскольку максимальный уровень инсулина в крови (110 мкЕД/мл) в ответ на его введенное отдельно и в комбинации с глюкозой практически не меняется. Вещество РУ-871 оказывает стимулирующее действие на секрецию инсулина только в присутствии глюкозы. По профилю кривых выделения сахаропонижающего гормона под действием исследуемых соединений установлено, что максимальный прирост концентрации инсулина приходится на первую фазу его выделения. Что позволяет предполагать нормализацию его физиологического профиля, за счет возможного влияния исследуемых соединений на кинетику секреции гормона, нарушенную при инсулиннезави-симом сахарном диабете (рис.6).

3.2 Экстрапанкреатические эффекты соединений РУ-254. РУ-871. В экспериментах на изолированной диафрагме крыс вещества РУ-254, РУ-871 дозозависимо увеличивают поглощение глюкозы мышечной тканью из инкубационной среды в присутствии инсулина. Коэффициент поглощения глюкозы в концентрации 1х10'4 для вещества РУ-~54 был равен 15,6 мг глюкозы/г диафрагмы, для соединения РУ-871- 'о,2 мг/глюкозы/г диафрагмы, в то время как для гликлазида он состава 20,3 мг глюкозы/г диафрагмы. Экстрапанкреатические эффекты на данной модели более выражены у соединения РУ-871. В минимальной исследуемой концентрации (ПО"5) снижение глюкозы в инкубацоной среде веществом РУ-254 составило 10,1% от контроля, соединением РУ-871 и гликлазидом 29,3% и 38,8% соответственно

Т (мин)

-♦—Контроль -»-Глюкоза 1

-*— РУ-254 —•—РУ-871 |

6

го

(О

о 2

•Контроль

■РУ-254

-РУ-871

.Рис.5. Влияние соединений РУ-254 (10мг/кг), РУ-871 (10мг/кг) при внутривенном введении на уровень инсулина (А) и глюкозы (Б) в крови кошек

0 30 60 90 120 150 180

Т (мин)

: —»—Контроль -»-Глюкоза

1 —РУ-254+Глюкоза РУ-871+Глюкоза

14

га

п о s£

£ с

4 4

30

60

—I—

90

120 150 Т (мин)

■ Глюкоза -■- Глюкоза+РУ-254 Глюкоза+РУ-871

Рис.6. Влияние соединений РУ-254 (10мг/кг), РУ-871 (10мг/кг), введенных внутривенно совместно с глюкозой (1г/кг) на уровень инсулина (А) и глюкозы

(Б) в крови кошек

Антидиабетические производные бензимидазола не казывают инсули-ноподобного действия, поскольку в отличие от глидифена, перорального противодиабетического средства с выраженными экстрапанкреатическими эффектами достоверно не изменяют содержание глюкозы в инкубационной среде без добавления инсулина. Полученные данные свидетельствуют, что экстрапанкреатическое действие веществ скорее всего связано с потенцированием эффектов инсулина на молекулярные механизмы транспорта глюкозы периферическими тканями., что выражаются в усилении транслокации глю-козного транспортера 4 типа, содержащего в мышечной ткани.

В условиях дефицита инсулина у панкреатэктомированных собак вещество РУ-254 в дозе 10 мг/кг при внутривенном введении в комплексе с инсулином в 2,7 раза усиливает и на 3 часа пролонгирует гипогликемический эффект, который отмечался при введении одного инсулина (рис.7).

Рис. 7. Влияние инсулина (0,4 ЕД/кг в течение 3-х часов внутривенно), соединения РУ-254 (10 мг/кг внутривенно) при его комбинированном применении с инсулином (0,4 ЕД/кг в течение 3-х часов внутривенно) на уровень глюкозы в крови панкреатэктомированных собак

8

01 23456789 10

Т (часы)

Соединение РУ-871 в дозе 30 мг/кг при пероральном введении у животных с некомпенсированным стрептозотоциновым диабетом, после внутримышечной инъекции инсулина, потенцирует действие гормона, что выражается в достоверном уменьшении уровня глюкозы на 3-5 часу эксперимента в пределах 12% по сравнению с контрольной группой животных. Потенцирование сахароснижающего действия инсулина под влиянием изучаемых веществ, по-видимому, может быть связано с их действием на процессы инактивации и связывания гормона с белками плазмы (рис.8)

Т (часы)

Рис.8. Влияние инсулина (0,4 ЕД/кг в течение 3-х часов внутривенно), соединения РУ-871 (10 мг/кг внутривенно) при его комбинированном применении с инсулином (0,4 ЕД/кг в течение 3-х часов внутривенно) на уровень глюкозы в крови крыс со стрептозотоциновым диабетом

При исследовании способности веществ задерживать всасывание полисахаридов в кишечнике животных, достоверное и стабильное снижение содержание глюкозы в крови крыс, наблюдалось только при совместном введении крахмала и сахарозы с акарбозой. Вещество РУ-871 так же статистически значимо уменьшало в первый час эксперимента уровень глюкозы в крови животных, получавших углеводную нагрузку. Однако, сахаропонижающий эффект под его влиянием был нестабильным и слабо выраженным по сравнению с препаратом сравнения акарбозой. Достоверное снижение наблюдалось на 15 и 60 минутах эксперимента, в то время как на 30 минуте не имело

достоверных различий по сравнению с контролем. Соединение РУ-254 не влияло на всасывание сахарозы в кишечнике крыс. Полученные результаты не дают основания предполагать у соединений РУ-254, РУ-871, в используемых при проведении эксперимента дозах, влияния на процессы всасывание поли- и дисахаридов у интактных животных.

4. Гемобиологические свойства соединения РУ-254

4.1 .Влияние вещества РУ-254 на гемореологические показатели крови.3 Комплексную оценку воздействия антидиабетического вещества с анти-агрегантными свойствами на реологические показатели, приводящие к развитию и прогрессированию сосудистых осложнений диабета, проводили в условиях приближенных к реальной патологии. - на стрептозотоциновых крысах с «синдромом гипервязкости крови». В условиях выраженных гемореоло-гических растройств при сахарном диабете под влиянием соединение РУ-254 улучшались такие показатели как вязкость крови, агрегация и деформабель-ность эритроцитов, агрегация тромбоцитов.

Достоверное снижение вязкости крови при низкосдвиговых скоростях соответствовало препарату сравнения пентоксифиллину. Так, при скорости Юс"1 и 20с"1 вещество РУ-254 снижало вязкость на 22,4% и 19,8%, а препарат сравнения пентоксифиллин на 18,4% и 16,3%, (Р<0,05) соответственно. При увеличении скоростей сдвига коррегирующее воздействие исследуемых веществ на данный реологический показатель сохранялось, что свидетельствует об их способности оказывать влияние на агрегационный и деформационный компонент показателя. Оба вещества: РУ-254 и пентоксифиллин- в равной степени снижали агрегацию эритроцитов и улучшали их деформабель-ность По эффективности ингибирующего влияния на агрегацию тромбоцитов соединение РУ-254 в 1,2 раза превосходило пентоксифиллин. Нормализующее влияние вещества РУ-254 на коагуляционный статус проявлялось возвращением в границы нормы продолжительности тромбинового времени, увеличением протромбинового и активированного парциального тромбопла-стинового времени. Коррекция гемореологических нарушений веществом РУ-254 наряду с такими механизмами: как улучшение пластических свойств мембран эритроцитов, увеличение их электроотрицательности, и улучшение, функционирования мембраносвязанных ферментов в значительной степени определяется его ингибирующим влиянием на склеивание кровяных пластинок. В основе которого, как показали проведенные исследования лежит ин-гибирование синтеза тромбоксана А2. Соединение РУ-254, добавленное в пробу с активированными тромбином тромбоцитами, приводило к снижению на 79% уровня малонового альдегида относительно контрольных измерений, что свидетельствует об ингибирующем действии исследуемого вещества на

3 Исследования выполнены совместно с ассистентом кафедры фаракологии к.м.н. А.Н. Дегтяревым, эа что выражаем ему искреннюю благодарность.

синтез тромбоксана Аг.

4.2.Влияние соединения РУ-254 на внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов.

Изучаемое соединение оказывало достоверное дозозависимое ингиби-рующее действие на внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов. ЭК50 вещества РУ-254 составила 15,4 мг/кг. Препарат сравнения гликлазид, введенный в дозе 10 мг/кг снизил уровень агрегации по сравнению с контрольными данными на 52,7% (Р<0,05). Ацетилсалициловая кислота в исследуемых дозах оказалась неэффективной для предупреждения внутрисосудистой агрегации кровяных пластинок, индуцированной АДФ. В дозе, соответствующей пятикратному увеличению максимальной дозы веществ, применяемой в данном исследовании, ацетилсалициловая кислота блокировала агрегацию тромбоцитов на 38,7% (Р<0,05).

4.3.Влияние вещества РУ-254 на простапиклин-генерирующую активность сосудистой стенки

Исследование влияния соединения РУ-254 на простациклин-генерирующую активность сосудистой стенки представляло определенный интерес, потому что позволяло воспроизвести полную картину воздействия изучаемого соединения на оба звена системы простациклин-тромбоксан А2, выполняющей важную роль в регуляции функциональной активности тромбоцитов, тем более что фармакологические средства с антиагрегантными свойствами (пентоксифиллин, ацетилсалициловая кислота и др.) могут раз-. нонаправленно влиять на образование, выделение и эффекты простациклина - мощного антиагрегационного фактора, содержащегося в эндотелии сосудов и препятствующего отложению тромбоцитов на стенке сосудов и тромбооб-разованию. При исследовании антиагрегационной способности сосудистой стенки в экспериментах с использованием стенки аорты интактных крыс установлено снижение в 2,8 раза агрегации тромбоцитов при ее инкубации в обогащенной тромбоцитами плазме крови подопытных животных. Соединение РУ-254 не вызывало статистически достоверных изменений антиагрегационной функции сосудистой стенки. Оно не повышало, но и не угнетало ан-тиагрегационную активность стенки аорты интактных крыс. Однако, исследуемое вещество восстанавливало антиагрегационный потенциал стенки аорты крыс, сниженный введением адреналина, и помимо этого, предупреждало его снижение.

5. Влияние соединения РУ-871 на перекисное окисление ли-пидов4

В результате исследования антиокислительных свойств вещества РУ-871 установлено, что оно имеет достаточно широкий спектр инактивации

4 Исследования выполнены совместно со с.н.с. лаборатории фармакологии антиок-сидантных веществ, к.м.н. В.А.Косолаповым. Выражаем ему искреннюю благодарность за помощь в проведении исследований

свободных радикалов что чрезвычайно важно для реализации защитных эффектов в условиях оксидантного стресса при диабете. Соединение подавляет как активные формы кислорода об этом косвенно свидетельствует его высокая эффективность при аскорбат и НАДФ Н индуцируемом ПОЛ и взаимодействие с супероксидным радикалом в реакции окисления кверцитйна, так и напрямую инактивирует органические свободные радикалы, проявлением последнего является обесцвечивание свободного радикала а-дифенил-пикрилгидразила.

При индукции автоокисления липосом, индуцируемом Си2+/3+ соединение РУ-871 проявляло дозозависимое антиоксидантное действие, практически не уступая дибунолу. Эффективность исселедуемого вещества на данной модели позволяет предполагать, зависимость антиоксидантного действия соединения РУ-871 от его способности хелатировать катионы металлов переходной валентности.

6. Изучение фармакокинентики'

В результате проведенного исследования было установлено, что лекарственная форма вещества РУ-254 (диабенол) биоэквивалентна его субстанции, а абсолютная биодоступность субстанции соответствует 63%.6 Препарат хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта, максимальная концентрация после перорального приема однократной дозы, равной ЕД30 приходится на первый час эксперимента. При попадании в кровь не исключается возможность его связывания с форменными элементами крови. Высокие значения показателей кажущегося объема распределения (У<1=2,48 мл ), периода полураспределения (Т1/2а=2,68 час) при внутривенном введении исследуемого соединения, свидетельствуют об интенсивном и быстром распределении препарата во внутренние органы и ткани. Анализ распределения диабенола в органах и тканях, позволяет сделать вывод, что концентрация препарата в тканях превышает его содержание в плазме крови в несколько раз. При этом отмечается четкая зависимость между содержанием препарата и уровнем органного кровотока: наибольшие количества определяются в органах с сильной васкуляризацией -легких, селезенке, сердце. Также высокие концентрации отмечаются в печени и почках, что свидетельствует об интенсивных процессах элиминации препарата. Преобладание внепочечного клиренса (С1ш=0,5мл/час) над почечным (С1я=' 0,135мл/час), выделение незначительного количества неизмененного препарата с мочой (21% от общего количества введенноговещества) и калом (суммарная экскреция неизмененной субстанции составила менее 1% от вве-

Исследования выполнены совместно с к.б.н., с.н.с. лаборатории фармакологии антиоксидантных веществ Л.А. Смирновой и с аспирантом кафедры фармакологии A.B. Степановым, за что выражаем им искреннюю признательность.

6 Выражаем искреннюю признательность, д.ф.н., проф. кафедры технологии лекарственных средств Пермской фарм. академии Г.П. Вдовиной за предоставленные образцы лекарственной формы препарата диабенол.

денной дозы) позволяют предположить, что в элиминации вещества РУ-254 из организма большую роль играют процессы его метаболизма происходящие в печени, которые преобладают над процессами экскрецйи неизмененного соединения с мочой и калом. Это предположение подтверждается тем, что на хроматограммах были обнаружены дополнительные пики, которые возможно являются продуктами метаболизмаизучаемого вещества.

7. Исследование лекарственной безопасности7

По результатам исследования острой токсичности соединения РУ-254 и РУ-871 можно отнести к малотоксичным веществам (табл. 6). При исследовании способности к кумуляции соединения РУ-254 в токсических дозах обнаружено нарастание токсических эффектов, что может быть связано с кумулятивными свойствами препарата.

При длительном (в течение 6 месяцев) введении вещества РУ-254 (субстанции диабенола) крысам не было отмечено каких-либо очевидных тенденций в изменении лабораторных параметров, при его применении в терапевтических дозах.

Таблица 6

Показатели острой токсичности веществ РУ-254, РУ-871_

Название препаратов Среднесмертельная доза (ЛД50) мг/кг

Самки Самцы

Вещество РУ-254 (субстанция) 2321,0(1646,27-3273,01) 2740,91 (2017,54-3723,62)

Вещество РУ-254 (лекарственная форма) 3569,46 (2730,59-666,05) 3554,45 (2320,17-5445,33)

Вещество РУ-871 (субстанция) > 2000,0 > 2000,0

.В результате макро- и микроскопических исследований внутренних органов крыс были выявлены основные "органы-мишени", подвергающиеся изменениям под воздействием исследуемого препарата: поджелудочная железа, почки, печень. Однако, в этом случае следует дифференцировать его влияние, связанное со специфической активностью и токсическим воздействием.

Различное состояние поджелудочной железы в зависимости от применяемых доз, по-видимому, связано с панкреотропным действием вещества. После введения препарата в терапевтических дозах - отмечалась гипертрофия секреторного аппарата, а его длительное применение в токсической дозе приводило к атрофии островковых клеток поджелудочной железы.

Токсическое действие диабенола в больших дозах на печень проявля-

7 Исследования выполнялись совместно с коллективом лаборатории лекарственной безопасности НИИ фармакологии Волгоградской медицинской академии (зав. лабораторией к.б.я., с.н.с. Л.И.Бугаева), за что выражаем им искреннюю признательность.

проявлялось в виде ухудшения дезинтаксикационной функции печенк (удлинение гексеналового сна и замедление скорости выведенш бромсульфолеина) и изменений гистологического строения печеночное ткани (дисхромия ядер и гипертрофия большинства гепатоцитов) Отмечаемые незначительные изменения со стороны канальцев I и II порядкг (набухание выстилающего эпителия I и II порядка, с явлениями мелкозернистой дистрофии) при употреблении токсических доз диабенола V эпизодические повышения мочевины, позволяет предположит! неблагоприятное его влияние и на почки. И хотя, проявление гепато- и неф-ротоксического действия диабенола в терапевтических дозах в проводимы? исследованиях не доказано, существующая вероятность токсического воздействия препарата на печень и почки требует осторожности его примененш у больных, страдающих заболеваниями этих органов. При исследовании специфической токсичности диабенола не было получено ни каких доказа тельств, что препарат в терапевтических дозах и изучаемых концентрация) может оказывать эмбриотоксическое, гонадотропное, аллергенное, иммуно супрессивное и мутагенное действие. Тем не менее употребление диабенол; в больших дозах приводило к постимплантационной гибели плодов, что мо жет служить основанием для противопоказания его применения беременны ми женщинами. По результатам проведенных исследований диабенол можнс считать безопасным препаратом для лечения диабета, сопровождающего^ сосудистыми осложениями.

Таким образом, обобщая полученный материал можно заключить, чтс производные бензимидазола являются новым оригинальным по химическо! ~ '"' структуре классом противодиабетических соединений, среди которых воз " можно выявление, а на основе проведенного анализа активность-структура 'целенаправленный синтез веществ, сочетающих гипогликемическую актив ность с антиоксидантными и антиагрегантными свойствами.

- • .На примере обнаруженных соединений с комбинированным действие* среди веществ данной химической структуры установлено, что антидиабети — чёскос/действие производных бензимидазола связано с их влиянием на про цессы секреции инсулина. Внепанреагические эффекты, проявляющиес. ■^улучшением утилизации глюкозы периферическими тканями, в первую оче . редь, определяются потенцированием эффектов сахаропонижающего гормо , на.,.Не-исющ>чено их влияние на процессы деградации и связывания инсули на с белками плазмы крови. Учитывая выраженные гемобиологические свой лства антидиабетического вещества с антиагрегантными свойствами (РУ-254" и широкий спектр антиоксидантной активности у соединения с антиокисли тельными свойствами, оказывающего антигипергликемическое действие н . моделях, связанных с дисфункцией Р-клеток и синдромом инсулинрези стентности (РУ-871), данные соединения являются основой для создания не роральных противодиабетических препаратов, компенсирующих сахарны диабет и влияющих на развитие и прогрессирование его сосудистых ослож нений.

Выводы

1. Производные бензимидазола являются новым химическим классом веществ перспективным для создания противодиабетических препаратов с со-четанным действием на различные патогенетические звенья сахарного диабета и его осложнений.

2. В результате анализа зависимости «фармакологические свойства -строение» изученных веществ установлено, что наибольшая вероятность выявления соединений, сочетающих гипогликемическое действие с антиагре-гантыми свойствами возможна среди производных N9. N9 2,3-дигидроимидазо и 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазола. Наиболее перспективной структурой, из исследованных химических рядов производных бензимидазола, для синтеза соединений, сочетающих гипоглике-мические и антиоксидантные свойства, следует считать производные 2,3,4,10-тетрагидропиримидо (1,2а) бензимидазола.

3. В результате проведенного исследования выявлены соединения с комбинированным действием. Вещество РУ-254 по выраженности гипогликеми-ческой активности сопоставимо, а по ингибирующему АДФ индуцируемую агрегацию тромбоцитов действию в 1,4 раза эффективнее гликлазида - про-тиводиабетического препарата с антиагрегантными свойствами. Антиокси-дантное действие сахароснижающего вещества РУ-871 сопоставимо с инги-бирующим эффектом а-токоферола на процессы перекисного окисления ли-пидов, иницируемые аскорбиновой кислотой.

4. Механизмы гипогликемического действия вещества РУ-254 и РУ-871 связаны с их влиянием на процессы секреции инсулина, Панкреотропные эффекты соединения РУ-871 носят глюкозозависимый характер. Антиги-пергликемическое действия, оказываемое веществами РУ-254 и РУ-871 на модели латентного стрептозотоцинового определяется восстановлением физиологического профиля секреции сахаропонижающего гормона.

5. Внепанкреатическое действие соединений РУ-254 и РУ-871 связано с улучшением утилизации глюкозы периферическими тканями. В экспериментах на изолированной диафрагме крыс оба вещества дозозависимо усиливают поглощение глюкозы из инкубационной среды в присутствии инсулина. В условиях инсулинрезистентности вещество РУ-254 улучшением утилизации глюкозы периферическими тканями на моделях ожирения и экзогенной ги-перинсулинемии Соединение РУ-871 способствует усвоению глюкозы периферическими тканями только у инсулинрезистентных крыс с ожирением. Вещество РУ-254 введенное в комплексе с инсулином в условиях дефицита инсулина у панкреатэктомированных собак в 2,7 раза усиливает и на 3 часа пролонгирует гипогликемический эффект, который отмечался при введении одного инсулина. Соединение РУ-871 у животных с некомпенсированным стрептозотоциновым диабетом, после совместного введения с сахаропонижающим гормоном, потенцирует его действие гормона, достоверно уменьшая уровень глюкозы на 3-5 часу эксперимента по сравнению с контрольными животными.

6. Соединение РУ-254 на модели стрептозотоцинового сахарного диабета в условиях "синдрома повышенной вязкости крови" снижает вязкость крови, агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, увеличивает деформабельность эритроцитов, нормализует показатели свертывания крови.

7. Вещество РУ-254 в экспериментах in vitro ингибирует агрегацию тромбоцитов, вызванную различными индукторами (АДФ, коллагеном, арахидо-новой кислотой, адреналином, ристоцетином, фактором активации тромбоцитов). Антиагрегантные свойства исследуемого соединения связаны с инги-бированием синтеза тромбоксана А2. Исследуемое соединение оказывает достоверное дозоависимое ингибирующее действие на внутрисосудистую агрегацию тромбоцитов. Вещество РУ-254 не влияет на антиагрегацилнную активность сосудистой стенки аорты интактных животных. В опытах с использованием экспериментальной модели снижения антиагрегационной активности стенки сосудов, изучаемое соединение предотвращает и устраняет угнетение антиагрегационной реакции стенки сосудов.

В. Соединение РУ-871 реагирует с пероксильными радикалами липидов на стадии обрыва цепи об этом косвенно свидетельствует его высокая эффективность при аскорбат и НАДФ Н индуцируемом ПОЛ, а так же прямо инак-тивирует радикалы RO», 02*", которые инициируют окисление биологических • молекул. По выраженности действия ингибирующий эффект РУ-871 сопоставим с а-токоферолом, дибунолом, которые также в химической структуре имеют экранированные фенолы.

9. _ С9единение РУ-254 по показателям острой интоксикации и способности к кумуляции относится к малотоксичным, слабо кумулирующим веществам. При хроническом введении в терапевтических дозах безопасен. Не оказывает эмбриотоксического, гонадотропного, аллергизирующего, иммуносу-прессивного и мутагенного действия, в изучаемых концентрациях и при применении тарапевтических доз. Доклиническое изучение его лекарственой безвредности не выявило проявлений, препятствующих проведению клинических испытаний лекарственной формы вещества РУ-254 - препарата диа-бенол.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. «Дигидрогалогенидо-9замещенных 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензими-дазола, обладающие гипогликемической активностью» // Авторское свидетельство № 1269474 (приоритет изобретения 13 марта 1985г) (соавт. В.А. Анисимо-Bá, A.A. Спасов, Г.В. Ковалев и др.).

2. Поиск гипогликемических веществ среди новых азотсодержащих гетероциклических соединений // Тез. докл. VIII обл. конф. Молодых ученых медиков и врачей «Актуальные вопросы экспериментальной, клинической и профилактической медицины», Волгоград, 1986, С.16.

3. Синтез и фармакологическая активность некоторых 2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола и промежуточных продуктов их синтеза // Химико-фармацевтический журнал, 1987, С. 21-27 (соавт. В.А. Анисимова, М.В. Левченко, Г.В. Ковалев, A.A. Спасов).

4. Гетероциклические соединения как предполагаемые средства для лечения диабетических ангиопатий // Тез. докл. VI Всесоюзного съезда фармакологов « Фармакология и научно-технический прогресс», Ташкент, 1988, С.28 (со-авт. С.Г. Ковалев, .Т.В. Сон).

5. Синтез и фармакологическая активность М-замещенных-1-аминоэтил-2,3-дигидроимидазо (1,2а) бензимидазола // Химико-фармацевтический журнал, 1988, С. 16-21 (соавт. В.А. Анисимова, М.В. Левченко, Г.В. Ковалев, A.A. Спасов).

6. «Дигидрохлориды 2-алкин-4диалкиламиноалкил-1,2,4-триазоло 1,5-бензимидазола, обладающие гипогликемической активностью» // Авторское свидетельство №1438179 (приоритет изобретения 15.июля 1988 г.) (соавт. В.А. Анисимова, A.A. Спасов и др.).

7. Изучение механизма действия нового гипогликемического вещества, влияющего на агрегацию тромбоцитов // Тез.докл. Межреспубликанской научно-практической конференции «Синтез, фармакология психотропных и сердечно-сосудистых веществ», Волгоград, 1989, С.25.

8. «Средство, обладающее антиагрегацинной активностю» // Патент РФ №2061481 (приоритет изобретения 17 мая 1991г) (В.А. Анисимова, A.A. Спасов и др.).

9. Некоторые аспекты механизма гипогликемического действия нового соединения АКС-254 // Тез. Докл. Росс, научной конф. «Создание лекарственных средств», Купавна, 1992 С.19 (соавт. A.A. Спасов,В.Б. Писарев).

10. Общеевропейский патент Nouveaux derives du benzimidazole, leur procede de preparation et les composition pharmaceutiques qui les contiennent // №93401204.8 (приоритет 14 июля 1993 (соавт. В.А. Анисимова, A.A. Спасов).

11. Изучение фармакокинетики нового гипогликемического вещества // Тез. докл 49-й научной сессии «Актуальные вопросы медицины», Волгоград, 1994 С. 45 (соавт. Е.С. Гаврилова, Л.А. Смирнова).

12. Токсикологические особенности новых потенциальных лекарственных препаратов - производных бензимидазола //Тез. докл. 49-й научной сессии «Актуальные вопросы медицины», Волгоград, 1994 С. 27 (соавт. .И. Бугаева, Н.В. Серединцева, Л.С. Мазанова).

13. Биодоступность нового гипогликемического перорального препарата диабенол // Тез. Докл. 1 съезда Росс, научи. Общ. фарм. «Фундаментальные, исследования, как основа создания, лек.средств». Волгоград, 1995 С. 15 (соавт. Е.С. Гаврилова, Л.А. Смирнова).

14. Экспериментальное изучение фармакотоксикологических свойств нового гипогликемического вещества диабенол // Тез. I съезда Российского общества фармакологов «Фундаментальные исследования, как основа создания лекарственных средств», Волгоград, 1995 С.23-28 (соавт. A.A. Спасов, В.Н.Зиновьева, Е.С. Гаврилова).

15. Перспективы создания антиагрегантных и гипогликемических средств на основе конденсированных производных бензимидазола // Тез. Докл. 1 съезда Росс, научн. Общ. фарм. «Фундаментальные, исследования, как основа создания. лек.средств» Волгоград, 1995, С.. 421 (соавт. А.А.Спасов, В.А.Анисимова, Г.П.Вдовина ).

16. Конденсированные производные бензимидазола - ингибиторы агрегации тромбоцитов // II Росс. нац. Конгр. «Человек и лекарство.»,М., 1995, С. 216 (со-авт. А.А.Спасов, А.Ф. Турчаева, С.Г. Ковалев).

17. Антиагрегантные свойства гипогликемического соединения диабенол // II Росс. нац. конгресс «Человек и лекарство», Москва, 1995 С. (соавт. А-Ф- Турчаева, Е'.С. Гаврилова).

18. Влияние новых конденсированных производных бензимидазола на продукцию тромбоксана А2 // Сб. науч., ст., т.51, вып.2 «Новые материалы и методы в медицине», Волгоград, 1995 С.21 (соавт. А.Ф. Турчаева).

19. Изучение аллергенных свойств нового гипогликемического препарата диабенол // Тезисы 1-го Российского общества фамакологов «Фундаментальные исследования как основа создания лек. средств», Волгоград, 1995 С. 15 (соавт. В.А. Лиходеева, Е.С. Гаврилова).

20. Перспективы поиска антиагрегантных и гипогликемических веществ среди конденсированных производных бензимидазолов U Вестник Волгоградской медицинской академии №1, Волгоград, 1995 С.33-36 (соавт. A.A. Спасов, А.Ф. Турчаева).

21. Синтез и фармакологическая активность солей 4-диалкиламино-этилпирроло [1,2-а] бензимидазолов // Химико-фармацевтический журнал. 1996. № 1. С.34-37 (соавт.,А.А.Спасов, О.В. Островский,В.А.Анисимова).

22. Создание гипогликемических препаратов с антиагрегантными свойствами на основе конденсированных производных бензимидазола // Вестник. Волгоградской. медицинской. Академии №1. Волгоград, 1995. С. 33-36.(соавт.

A.А.Спасов, А.Ф. Турчаева, С.Г. Ковалев).

23. Изучение влияния нового гипогликемического препарата диабенол на некоторые показатели системы гемостаза // IV Росс. нац. конгресс. «Человек и лекарство» Москва, 1997, С.43 (соавт. A.A. Спасов,В.В. Новочадов).

24. Диабенол-новое противодиабетическое вещество с гемобиологическими свойствами // Вестник. Волгоградской, медицинской академии №3, Волгоград, 1997 .С. 47-51.(соавт. A.A. Спасов, Е.С. Гаврилова).

25. Влияние гипогликемического препарата диабенол на функциональную активность тромбоцитов и свертывающую систему крови // Тезисы научно-практической конференции «Проблемы диагностики и лечения сердечнососудистых заболеваний», Саратов, 1997 С.12 (соавт. А.Ф. Кучерявенко, Е.С. Гаврилова, В.В. Новочадов, И.В. Ивахненко).

26. Перспективы создания препаратов на основе конденсированных производных бензимидазола для лечения сахарного диабета, осложненного ангиопа-тиями // Вестник Волгоградскоймедицинской. академии №3, 1997 С.32-38 (соавт. A.A. Спасов, В.А. Анисимова, А.Ф. Турчаева, Е.С. Гаврилова, О.В. Островский).

27. Изучение гипогликемических свойств конденсированных производных бензимидазола //II Всероссийская научная конференция «от Materia medica к современным медицинским технологиям», Санкт-Петербург, 1998, С.68 (соавт.

B.А. Анисимова, Т.А. Калякина).

28. Новые подходы к скринингу антидиабетических соединений // V Международная научно-практическая конф. «Создание и апробация лекарственных

репаратов», Каунас, 1997 С.24-26 (соавт. A.A. Спасов, Т.А. Калякина). 9. Поиск веществ, проявляющих антидиабетическое действие среди произ-эдных бензимидазола // Международный сборник научн. трудов VI научно-рактической конф.по созданию и апробации новых лекарственных средств Лекарства-человеку», Харьков, 1998 С.79-85 (соавт. A.A. Спасов, В.А. Аниси-ова, Т.А. Калякина)

0. Синтез и антиоксидантная активность ХЫ-дизамещенных 3-амино-1Н-,2-диазофеналенов // Химико-фармацевтический журнал, 1998, №1, с. 15-16 ;оавт. В.В. Межерецкий, A.JI. Пикус, A.A. Спасов, О.В. Островский, В.А. Ко-элапов).

1. Зависимость спазмолитического и гастропротективного и гипогликеми-еского эффектов бензимидазола от их антикальмодулинового действия Химико.-фармацевтический журнал, 1998 № 10, С. 17-21 (соавт. A.A. Спасов, [.П. Ларионов, Т.Б. Сибирякова, В.Е. Веровский, В.А. Анисимова, Г.Н. Балден-ов, М.Ю. Меньшиков).

2. Некоторые аспекты механизма действия новых гипогликемических ве-1еств // Тез.докл. научно-практической конф. «Актуальные проблемы экспери-ентальной и клинической фармакологии», Санкт-Петербург, 1999, С. 12-17 (cost. А.А.Спасов, Т.А. Калякина).

3. Выбор экспериментальных моделей сахарного диабета для поиска новых гшогликемических средств // VI Росс. нац. конгресс «Человек и лекарство», Тосква, 1999 С.69 (соавт. А.А.Спасов, Т.А. Санькова, М.И. Балаболкин).

4. Использование нагрузочного теста глюкозой для скрининга противодиа-етических соединений // Межд. сб. научн. трудов IX научно-практ. конф. по эзданию и апробации новых лекарственых средств «Лекарства-человеку», 1инск,1999, С.27 (соавт. A.A. Спасов, Т.А. Санькова, В.А. Анисимова).

5. Влияние препарата диабенол на секрецию инсулина // Вестник олгоградской медицинской академии, №6, 2000, С.46-49 (соавт. A.A. Спасов, [.А. Гурова).

6. Синтез и фармакологическая активность 1-й lO-N-замещенных (10), ,3.4-тетргидропиимдо [1,2-а]-бензимидазола // Химико-фармацевтический :урнал, 2001 (соавт.В.А. Анисимова, М.М. Осипова, A.A. Спасов. А.Ф. Турчае-а, Н.П. Ларионов. С.Г. Ковалев).