Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакологическая активность производных бензимидазола, содержащих пространственно-затрудненные фенольные заместители, и их аналогов, проявляющих антиоксидантные и антирадикальные свойства

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВА АННА АЛЕКСЕЕВНА

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА, СОДЕРЖАЩИХ ПРОСТРАНСТВЕННО-ЗАТРУДНЕННЫЕ ФЕНОЛЬНЫЕ ЗАМЕСТИТЕЛИ, И ИХ АНАЛОГОВ, ПРОЯВЛЯЮЩИХ АНТИОКСИДАНТНЫЕ И АНТИРАДИКАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

14 00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЯТИГОРСК 2007

003061397

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель Член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель

науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Спасов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты: Тюренков Иван Николаевич - доктор медицинских

наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета

Давыдов Владимир Сергеевич - кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакологии Пятигорской государственной фармацевтической академии

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им И М Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится « 1А » сентября 2007 г в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 208.069 01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357533, г Пятигорск, пр Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «/4» июля 2007 г Ученый секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В организме человека существует сбалансированная антиоксидантная система, состоящая из водо- и жирорасторимого пула перехватчиков первичных и вторичных радикалов, хелаторов ионов металлов переменной валентности Сбой в активности системы эндогенных, антиоксидантов (АО) на фоне усиления продукции радикаловинициаторов приводит к возникновению и развитию «свободнорадикальных патологий» (Wolf D , 2002, Панкин В 3 и др , 2004, Hailiwell В et al , 2005, Choudhari S R. et al , 2007). К таким состояниям относятся заболевания, сопровождающиеся дефицитом кислорода (гипоксия, ишемия) (!аг"- ко М В и др , 1988, Плотников МБ и др , 2005, Мирзоян Р С., 2003, Atehso Е et al., 2007), интоксикации химическими агентами (Лужников Е А и др , 1999, Сейдахметова 3 Ж , 2005), заболевания печени (Warner D S et al, 2004, Ярошенко И Ф , Каланчина Т Ю., 2006), сахарный диабет и его осложнения (Дедов И И , и др , 1995, Балаболкин МИ и др , 2005), процессы биологического старения (Анисимов В Н. и др , 1997, 2007, Harman D, 1992, 2006, Гусев В А , 1997) итд

Антиоксиданты приобрели важное значение в медицине в связи с их способностью ингибировать перекисное окисление липидов мембран, стабилизировать структуру и функции мембран клеток и тем самым создавать оптимальные условия для гомеостаза организма при самых разнообразных чрезвычайных воздействиях патогенных факторов на организм (Рюбен К , 1998, Guttegdge J М С , Hailiwell В , 2000, Арзамасцева Н Б, 2006) Поэтому они широко применяются для профилактики заболеваний и лечения больных с чрезмерной пероксидацией (Сторожок Н М , 2002, Меньшикова Б Б и др , 2006, Pryor WA et al, 2006)

В настоящее время большинство препаратов для подавления свободно-радикального окисления имеют недостаточно выраженную силу антиоксидантной активности и проявляют рад побочных эффектов Кроме того, большинство антиоксидантных средств в определенных условиях может иметь прооксидантные свойства Известно, что а1т1оксвда1ш1ь1мишо11ствахтобл;ц1акггж11рораст1юримь1е,водорасппворимыефедсгва, тиоловые препараты, соединения с опосредованным механизмом действия, анти-оксидантные ферменты и их активаторы (Воскресенский О.Н , 1982, Бобырев В Н , 1994, Владимиров Ю А , 2000, Зайцев В Г., Островский О,В , 2003, Keyser J D et al, 1999, Loguercio C, 2003) ^

Известно, что конденсированные гетероциклические соединения со сложной я-электронноизбыточной системой, содержащие имидазольный цикл, как правило, обладают антиоксидантными свойствами (Анисимова В.А и др , 1973, Спасов АЛ. и др , 1983, 2001; Островский О В , 1996, Косолапой В А , 2005,) Особый интерес представляет введение в структуру таких веществ экранированной фенольной группы для усиления антиоксидантных свойств соединения (Харфуф М и др , 1990, Rice-Evans С А , Diplock А Т , 1993, 1998, Силин М А , 2005) Описанные факторы дают основание для поиска антиоксидантных веществ с я-избыточностью, содержащих в структуре пространственно-затрудненный фенольный заместитель.

Выше перечисленное делает актуальным поиск и изучение антиоксидантных свойств новых веществ в ряду конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола, содержащих в структуре экранированный фенол

Свазь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования И разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ государственной регистрации 01200116045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидантные свойства» (№ государственной регистрации 01200609434), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета Тема работы утверждена на заседании Ученого Совета ВолГМУ (протокол №9 от 31 10 2003 г)

Цель исследования. Целью настоящего исследования являегсл поиск и изучение действия экранированных фенолов производных бензимидазола на процессы пероксидации, выбор наиболее активных соединений и доклиническое изучение их специфической активности на моделях, сопровождающихся активацией свободнорадикальных процессов

Задачи исследования.

1 Изучить антиоксидантные и антирадикальные свойства производных бензимидазола, содержащих в структуре пространственно-затрудненные фенольные заместители, их аналогов и препаратов сравнения на моделях in vitro

2 Установить острую токсичность наиболее активных соединений, рассчитать для них терапевтический индекс и выбрать наиболее эффективные

вещества для доклинического изучения их специфической активности

3 Определить зависимость действия изучаемых соединений на свободнора-дикальные процессы от их химических структур и физико-химических свойств

4 Исследовать фармакологические свойства наиболее активных анти-оксидантных веществ и препаратов сравнения на различных патологических моделях с активацией процессов пероксидации (радиационные поражения, острая гипоксия, ишемические состояния, системная пероксидация, вызванная интоксикацией аллоксаном, синдромом повышенной вязкости крови).

5 Изучить влияние наиболее активных соединений и препаратов сравнения на перекисное окисление липидов у крыс с аллоксановой интоксикацией

Научная поп: -ша. Впервые были получены данные о влиянии оригинальных производных бензимидазола, содержащих в структуре пространственно-затрудненный фенол и ряда их аналогов, на свободнорадикальные процессы Впервые была установлена взаимосвязь между структурой новых соединений и их анти-оксидантной активностью Впервые установлено, что соединения, содержащие в структуре экранированный фенольный заместитель, активно перехватывают липопероксильный и гидроксильный радикал, обрывая цепи свободнорадикальных реакций

Установлено, что анитиоксидантная и антирадикальная активность изученных соединений зависит от их физико-химических свойств Было выведено уравнение Хенча, на основании которого определено, что антиоксндантная активность производных бензимидазола, в основном, определяется липофильными и электронными параметрами молекулы, а антирадикальная активность — также и стеричес-кими характеристиками

Впервые были получены данные о влиянии соединений бензимидазола, содержащих экранированный фенол, и препаратов сравнения на процессы пероксидации и реологические параметры крови при аллоксановой интоксикации

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности поиска ингибиторов перекисного окисления липидов, проявляющих антиоксидантные и антирадикальные свойства, среди производных конденсированных бензимидазольных систем, содержащих в структуре экранированную фенольную группу

На основании выведенного уравнения Хенча с высокой степенью достоверности

можно прогнозировать антиоксидантную и антирадикальную активность новых веществ Отработана методология поиска и изучения новых антиоксидантных веществ с использованием современных методов исследования, даны рекомендации по направленному синтезу гетероциклических соединений

Были получены данные о наличии у соединения РУ-1249 противогипокси-ческих, противоишемических, радиопротекторных свойств, а также обнаружена способность улучшать гемореологический статус крови снижать образование продуктов перекисного окисления липидов и повышать активность антиоксидантных ферментов крови при интоксикации аллоксаном

Выявленные эффекты соединения РУ-1249, превосходящие по величине активности препараты сравнения, определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований данного вещества с целью создания на его основе нового лекарственного препарата, обладающего антиоксидантными свойствами

Реализация результатов исследования. Выявленные закономерности между химической структурой и способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов у конденсированных производных бензимидазола учитываются при синтезе новых веществ в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, в экспериментальной работе лаборатории фармакологии антиоксидантных веществ НИИ фармакологии ВолГМУ Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, на кафедре фармакологии Кубанского государственного медицинского университета

Основные положения, выносимые на защиту.

1 №-замещенные имидазо[1,2-а]бензимидазоты - наиболее перспективный класс соединении в плане поиска новых веществ, способных ингибировать процессы перекисного окисления липидов

2 Наиболее выраженную антиоксидангную и антирадикальную активность среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола проявили вещества, содержащие в структуре пространственно-затрудненную фе-нольную группу, в частности вещество под лабораторным шифром РУ-1249, которое превосходило по активности все исследуемые препараты сравнения

3 Соединение РУ-1249 по эффективности при острой гипобарической гипоксии, двухсосудистой ишемии головного мозга, радиационных поражениях органов и при интоксикации аллоксаном превосходит препараты сравнения дибу-нол, мексидол и мексамин, что является предпосылкой для дальнейших расширенных фармакологических исследований данного вещества

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на X и XI Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области, (Волгоград, 2004 - 2005гг), Всероссийской конференции молодых ученых «Вчеш майнбутнего» (Одесса, 2004), 63-й и 64-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета, (Волгоград, 2005 - 2006гг), Всероссийской научной конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006г)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ (из них 2 в центральной печати)

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 194 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 рисунками, 36 таблицами Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2 - 4), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 130 отечественных и 115 зарубежных источника и приложения

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы Объектами исследования являлись соединения, синтезированные в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета1 В работе исследовались 36 соединений, под лабораторным шифром РУ, из них 12 относятся к N'-замещенным дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазолам, 16 - к N9-замещенным тетрагидропиримидо[1,2-ос] бензимидазолам, 1 - к №-замещенным тетрагидропиримидо[1,2-а] диметилбензимидазолам и 7 - к производным бензимидазола В качестве препаратов сравнения были выбраны тролокс (Fluka,

1 Выражаем искреннюю благодарность к х н , ведущему научному сотруднику В А

Анисимовон за синтез и предоставчение субстанции веществ

Швейцария), мексидол (НИИ фармакологии РАМН, Россия), мексамин (Olían Farm, Латвия), бутилированный гидрокситолуол (дибунол) (Merck, Германия)

Исследования проводились на 79 половозрелых нелинейных белых крысах обоего пола, массой 170-300 г и 192 белых неинбредных мышах обоего пола, массой 18-28 г Все животные содержались в условиях вивария на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92) с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000 3-96 и 1000 4-96), а также правил и Международных рекомендации Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997) Исследование острой токсичности соединений проводилось в соответствии с требованиями и инструкциями Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (Хабриев Р У , 2005)

Методы исследования

Методы изучения перекисного окисления липидов Скрининг антиоксидантных свойств новых веществ проводили на модели аскорбат-иидуцируемого ПОЛ по методу В 3 Панкина и др (1975) Скорость ПОЛ определяли по накоплению продуктов ПОЛ в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Fluka, Швейцария) Антирадикальная активность (АРА) изучалась по способности веществ инактивировать свободный стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрил-гидразилом (ДФПГ») (Sigma, США) по методу D Glavmd (1963) Измерение хемилюминесценции проводилось на Хемилюминомере «ХЛ-003» (Уфа, Россия) Фиксировался суммарный показатель светимости, который выражался в условных единицах Для изучения антиоксидантной активности (АОА) веществ использовали метод Fe2+-ивдуцированной хемилюминесценции желточных липопротеидов (Фархутдинов Р Р , Лиховских В А , 1995) Для исследования антирадикальной активности изучаемых веществ использовался метод люминол-зависимой хемилюминесценции (Семешко С Г , Фархутдинов Р Р , 2002) Малоновый днальдегид (МДА) в органах определяли в реакции с ТБК с использованием бутанольных экстрактов (Гаврилов В Б и др , 1987)

Определение активности антиоксидантных ферментов Активность супер-оксиддисмутазы (СОД) определяли по реакции окисления кверцетина (Sigma, США) по методу В А Костюка и др , 1990 Глутатионпероксидазу (ГПО) определяли по методу В М Моина (1986) с использованием дитионитробензойной кислоты

(реактив Эллмана) (МР Biochemedicals, США)

Измерение оптической плотности проводилось на спектрофотометре СФ-46 (Ломо, Россия) в кварцевых кюветах с длинои оптического пути 10 мм

Острую токсичность соединений изучали на мышах при внутрибрюшинном введении Показатель LD^n рассчитывали по методу Личфилда-Вшжоксона Для расчета показателя условной широты терапевтического действия выводили условный терапевтический индекс

Острая гипобарическая гипоксия моделировалась в барокамере проточного типа Животные помещались в условия, соответствующие подъему на «высоту» 11500 метров над уровнем моря Оценивали время жизни «на высоте» до появления признаков терминальной стадии (Лукьянова Л Д , 1990) ЕД50 (доза, в которой вещество повышает время жизни животных на 50%) рассчитывали методом регрессионных уравнений

Ишемию головного мозга моделировали под наркозом кетамином (80 мг/кг, в/ бр) наложением лигатур на общие сонные артерии (Мирзоян PC и др , 2000)

Через 24 часа после окклюзии изучали неврологический статус, локомоторную активность, поведенческие реакции крыс в тесте «открытое поле» При оценке неврологического статуса у крыс оценивалось сохранение рефлексов (Бурещ Я , Бурешова О , 1991) Показатели локомоторной активности регистрировали с помощью актометра («Ugo Basile», Италия) в течение 5 мин и выражали в условных единицах

Радиационные поражения мышей моделировали, облучая животных на установке «АГАТ-РI»2 (5 Грей), что вызывало тяжелую форму лучевой болезни III степени (Бесядовскии РА и др , 1978) Регистрировались выживаемость животных и количество лейкоцитов в периферической крови (Камышников В С , 2004) на 4 и 10 дни с момента облучения

Аллоксановую интоксикацию вызывали у крыс внутрибрюшинным введением 5° о водного раствора аллоксана тригидратавдозе 150 мг/кг (Овакимян С С , 2005) После развития устойчивой гипергликемии животным вводился инсулин актрапид (Ново Нордиск, Дания) п/к 2 раза в день в дозе 6 ЕД/кг Уровень глюкозы определяли с помощью набора «Глюкоза-ФКД» (Россия) Через 7 дней после развития

2 Выражаем искреннюю б мгодарность главном) врачу областно! о онкологического

диспансера В Ф Патрину за содействие в проведении иссчедований

интоксикации животные забивались под эфирным наркозом с забором крови из брюшной аорты В крови и органах (мозге, печени, почках, мышцах, поджелудочной железе) оценивали процессы ПОЛ по накоплению МДА, изучали активность антиоксидантных ферментов, измеряли гемореологические показатели (вязкость крови и агрегацию тромбоцитов, индуцированную 5 мкМ АДФ)

Методы изучения гемореологических показателей крови Измерение вязкости крови проводилось на анализаторе крови реологическом АКР-2 (МП «Комед» и НИИ физико-химической медицины, Россия) Вязкость крови изучалась при скоростях сдвига 300, 200, 100, 50, 10 (с"1) моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах (Добровольский Н А , 1998) Влияние веществ не агрегацию тромбоцитов исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA) (НПФ «Биола», Россия) по методу G. Born (1962) в модификации 3 А Габбасова (1989) Исследования проводили на богатой тромбоцитами плазме по способу, описанному В А Люсовым Ю Б Белоусовым (1971)

Изучение зависимости антиоксидантной активности от Физико-химических свойств веществ Для расчета физико-химических свойств конденсированных и неконденсироваш,„т\ рроизводных бензимидазола использовали квантово-химические методы Рассчитывались липофильные (Vellarkad N V et al , 1989), стерические (Arup К G , Gordon M С , 1987) и электронные (Кларк Т , 1990) показатели изучаемых соединений с помощью программ Microsoft® Excell 1998, (Microsoft, США) и Statistica 6 0 (StatSoft, Inc , США) для построения классической регрессионной модели Хэнча (Голендер В Е , Розенблит А Б , 1978)

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6,0 (StatSoft, США) и Excel 1998 (MS Office 2000, США) с применением парного критерия Стьюдента (i) и метода Фишера

Результаты экспериментов и их обсуждение В результате проведенного скрининга 36 веществ производных бензимидазола (Таблица 1) установлено, что наибольшее количество веществ с выраженной антиоксидантной активностью (44%) выявлено среди производных №-тетрагидропирими-до[1,2-а] бензимидазола, в меньшей степени -в ряду №-Дигидроимидазо[1,2-а] бен-зимидазолов (33%) В ряду 1<Р-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазолов найдено наибольшее количество активных антирадикальных соединений (50%), несколько

меньший процент - среди производных №-тетрагидропиримидо[1,2-а] бензимидазола (25%) Наименьшее количество активных антиоксидантных и антирадикальных соединений найдено среди производных бензимидазола (29 и 14% соответственно) Следует отметить, что наиболее выраженной антиоксидантной активностью обладали соединения, содержащие в структуре экранированную фенольную группу (ЭФ) (в дозе 10 мкмоль/л АОА ~ 82%) Антирадикальная активность у соединении с ЭФ оказалась умеренно выраженной (в дозе 10 мкмоль/л АРА ~ 52,4%)

При исследовании механизмов действия наиболее активных веществ, в тесте аскорбат-индуцированного ПОЛ и при взаимодействии с ДФПГ, было установлено, что изученные соединения оказывают неодинаковую АОА и АРА при использовании различных гетерогенных систем окисления, что связано с особенностями молекулярных механизмов их действия, которые подлежали дальнейшему изучению По-видимому, соединения содержащие в структуре экранированный фенольный заместитель активно перехватывают липопероксильный радикал, как было показано на модели хемилюминесценции желточных липопротеинов (~72%), и гидроксильный радикал, ингибируя люминол-зависимую хемилюминесценцию (~49,4%) Антиоксиданты со стерически затрудненной фенольной группой обладают наибольшей эффективностью в отношении перокси- и алкоксирадикалов

Табчица 1 - Частота всгречаемости соединений, проявипощнх высокую антноксидаитную и ангирадикальтю активность среди иссдедовапных групп производных бензимидазола

Название ряда Количество активных антиоксидантных веществ*, % Количество веществ с выра-женнои антирадикальной активностью*, %

Н'-гетрагидропиримидо-[1,2-а]бешимпдазоды 44(16) 25(16)

М'-дигидроичидазо-[1,2-<х]бешттдазоты 33(12) 50(12)

Беизимидазоды 29 (7) 14(7)

Примечание * - в скобках указано количество изученных на антиоксидантную активность вещее I в

При изучении зависимости антиоксидантной и антирадикальной активностей от физико-химических свойств веществ было выведено два регрессионных уравнения Хенча по антиоксидантнои (1) и антирадикальной активности (2), с помощью которых можно прогнозировать тот или иной вид активности

1§(ИК50) = - 0,259 + 0,57Х(У:|ОК1,|)2 - 0,859(Е|(?К1|)г + 0,959(1^,,)' + 5,57318РШ -

3,30 2 82 3,82 3 87

-0,742(18РЕт)г-5,46118Ро (1)

3 59 3 84

Я = 0,894 8 = 0633,Г= 19,31,р = 6,28*10'

18(ИК,0) = - 0,493 - 3,428В0К1| + 3,730Е|ОК1,| + 0,3641-д1>оч - 0,0001 (МКо)\ (2)

3,44 3,91 ЗД9 3,09

К = 0 511, Э =0,651, Р =8,10, р= 1,36*104

где ИК,0 - концентрация, в которой вещество ингибирует реакцию свободно-радикального окисления на 50%, 21(2^1 - суушарныи заряд радикала у 9 агома азота без углеводородного мостика, 2|(2К1,| - суммарный заряд радиката у 9 атома азота, (2|(2К11|)2 -квадрат суммарного заря га радиката \ 9-го атома азота, (2|<Зм1)2~кваДРатс^ммаР!10ГО заряда радикала V 9-го атома азота без углеводородного мостика, 1§Р03 - липофнтыюстъ молекулы вещества в виде соти, ^Р - липофи 1ыюсть мо теку лы вещества в виде основания, (^РК11)2 -квадратлипофильности радикала у 9-го атома азота, (^РН1К)2-квадрат липофилыюсти радика т у 9-ю атома азота, протонированното солевым остатком, (МЯо)3 - молекулярная рефракция молекулы вещества в виде основания

Было установлено, что для прогнозирования антиоксидантной активности важное значение имеют липофильные и электронные параметры молекулы вещества, а стерические характеристики имеет второстепенное значение Для прогнозирования антирадикальной активности следует также учитывать и стерические параметры молекулы соединения, что свидетельствует о том, что молекулы, содержащие в структуре пространственно-затрудненный фенол имеет существенно большие размеры и вступают в реакции значительно медленнее

Для подтверждения эффективности расчетов АОА и АРА с помощью полученных уравнений Хенча была определены данные виды активности для всех изучаемых соединений Было доказано, что 81° о веществ с АОА и 44% соединений с АРА подчиняются закономерностям выведенной регрессии При этом среди высокоактивных антиоксидантных и ан гирадикальных соединений с ИК <106 моль/ л регрессии подчиняются 6 из 7 соединений (86° о) и 5 из 9 веществ (56%) соответственно, при этом данные являются статистически значимыми Это обстоятельство позволяет использовать данную зависимость для поиска высокоактивных веществ

В результате проведенного многостадийного скрининга, учитывая высокие показатели АОА и АРА, а также относительно низкую токсичность были отобраны три соединения РУ-891 (ЬОЧ1= 1260,4 мг/кг), содержащее в структуре диоксифена

цильный заместитель, РУ-1249 (ЬО^=138.8 мг/кг) и РУ-1250 (Ш}0=353,2 мг/кг), имеющие в структуре ЭФ.

При изучении нрогивпгипокснческнх эффектов изучаемых антиоксидантых веществ РУ-891, РУ-1249, РУ-1250 и препарата сравнения мексидола в изоанти-оксидантных дозах было выявлено, что соединения РУ-1249 (0,134 мг/кг) и РУ-1250 (0.322 мг/кг) повышали продолжительность жизни на 18,2% и 22%, соответственно, лишь незначительно уступая поданному показателю мексидолу (122,4 мг/ кг) (Рис I). В то время как вещество РУ-891 (0.897 мг/кг) оказалось неэффективным.

При десяти- и стократном увеличении дозы веществ, их влияние на продолжительность Жизни значительно возрастало, что, вероятно, связано с особенностями фармакокинетики изучаемых соединений.

Изученные вещества по величине ЕДИ превосходили препарат сравнения мекеидол, Причем наиболее выраженными противогипоксическими свойствами обладают соединения РУ-1249 и РУ-1250, содержащие в структуре ЭФ. По снижению противогипокс и ческой активности все вешества можно выстроить в определенной последовательности: РУ-1249 (ЕДМ = 4,7 мг/кг) > РУ-1250 (ЕДМ = 4,9 мг/ кг) > РУ-891 (ЕДМ = 6,1 мг/кг) > Мекеидол (ЕДу> 122,4мг/кг).

£ £ * £ A z

V *

í §

■

210 -160 150 120

SO

во

30 о •30

pfl

35 6

.pm.i Щ

0.ВВ7 S97 ae.í

FV-891

Q.1M i л

РУ-1249

о.эгг 3,i2 зг.г РУ-1250

122,4 Мексадол

* данные статистически значим],i (i) по отношению к контрольной группе животных (р <0,05) Рисунок I Етияние веществ РУ-89], РУ-1249, РУ-1250 и мексидола (при однократном внутрибрюшинно введении на временя жизни мышей по отношению к контролю при острой !Ипобарической гипоксии (М+т)

При исследовании протн вон теми чески х свойств веществ было установлено, что соединение РУ-891 способствовало недостоверному увеличению выживаемости по сравнению с контрольными ишемизированными животными через 12 и 24 часа, однако уже через 48 часов защитный эффект вещества исчезал (Рис. 2) Вещество РУ-1249 достоверно повышало выживаемость животных на протяжении всего времени эксперимента (защитное действие сохранялось до 72 часов). Соединение РУ-1250 увеличивало выживаемость через 12 (р <0,05), 24 и 48 часов, но через 3-ое

суток все животные погибли, При сравнении эффективности противоишемического действия изучаемых веществ с препаратом сравнения стало известно, что через 12 часов соединение РУ-1250 превосходило мексидол, вещества РУ-891 и РУ-1249 несколько уступали по данному показателю, а чорез 24 часа все изучаемые соединения оказались более эффективными, чем препарат сравнения мексидол (Рис 2). Через 4К часов вещества РУ-1249 и РУ-1250 превосходили по противоИшемической активности мексидол, а соединение РУ-891 оказалось соизмеримо с препаратом сравнения. И уже через 72 часа было отмечено, что выжившими остались животные лишь в группе, которой вводилось соединение РУ-1 249.

В ходе исследований было установлено, что не шест во РУ-1249, содержащее в структуре ЭФ, оказалось наиболее эффективным из изученных веществ п плане развитие долгосрочных протйвойшемических свойств. Эю свойство соединения является достаточно весомым, так как известно, что истощение антиоксидантййх систем и активное накопление продуктов ПОЛ происходит при длительной ишемии.

дчзщШШне Н |2ч

ИдВИЩ Иикиня-РУ-891 Ишемия "РУ-1249 Ишемия-РУ-1Ишвыкл+мексндйл

* данные статистически значимы (точный метод Фишера) по отношению к контрольной г руппе животных (р<0,05); + - данные статистически значимы (точный метод Фишера) по

отношению к гр\ пйе животных с ишемией (р <0.0' 1 пбель животных Рисунок 2 Влияние веществ РУ-89!. РУ-1249, РУ-1250 и мексидола в эффективных дозах на выживаемость крыс при двусторонней окклюзии обших сонных артерий

При опенке показатели неврологического статуса и локомоторной активности в раннем послеоперационном периоде было выявлено, что вещество РУ-891 не влияло на двигательную активность, несколько улучшая неврологический статус (Таблица 2). Вещество РУ-1250 не увеличивало двигательную активность, но несколько компенсировало неврологический дефицит у крыс, превосходя препарат сравнения мексидол по второму параметру. Вещество РУ-1249 эффективно повышало двигателыгую активность и неврологичеекмй статус (р <0,65), превосходя по

этим показателям мексидол.

Таблица 2 — Влияние веществ РУ-891, РУ-1249, РУ-1250 имексидолав эффективных дозах на двигательную активность п неврологический статус крыс в раннем восстановительном периоде после двусторонней оккшозии общих сонных артерий (М+т)

Группа Двигательная активность, условные единицы Неврологический статус, баллы

Ко1гтроль (ложнооперированные) 62,17±4ДЗ 1,83±0,09

Ишемия 32,67±7,13* 0,46±0,14*

Ишемия + РУ-891 27,67±8,25* 0,56+0,24*

Ишемия + РУ-1249 56,50±5,50 0,92±0,08*+

Ишемия + РУ-1250 20Д5±б,49* 0,63±0,18*

Ишемия + Мексид ' I 28,50±6,50* 0,58±0,25

Примечание * - данные статистически значимы (0 по отношению к контрольной группе животных (р <0,'"^,+-дапныес1атисшческизначимы фпо сггношениюхгруппе животных с ишемией (р <0,05)

У ншемизированных крыс в тесте «открытое поле» вещество РУ-1249 повышало горизонтальную (р <0,05), вертикальную активности, латентное время и показатель груминга, превосходя препарат сравнения мексидол Соединения РУ-891 и РУ-1250 уступали мексидолу по этим показателям Вещества РУ-891 и РУ-1249 повышали поисковую активность и превосходили мексидол, но данные оказались статистически незначимыми

Таким образом, можно полагать, что вещество РУ-1249 улучшает важнейшие поведенческие показатели, превосходя остальные вещества и препарат сравнения мексидол

При изучении радиопротекторных свойств соединение РУ-891 вызывало выраженное радиозащитное действие при облучении и увеличивало выживаемость через 4 и 10 (р <0,05) дней, и даже через месяц (р <0,05) все животные в данной группе остались живы, превосходя уже через 2 дня после облучения все препараты сравнения (Рис 3) Соединение РУ-1249 после облучения также статистически незначимо повышало выживаемость мышей на протяжении всего времени наблюдения, и через месяц после облучения было выявлено, что вещество РУ-1249 проявило большую активность, чем мексидол и дибунол, и оказалось сопоставимо по эффективности с препаратом сравнения мексамином (Рис 3)

выживиие живот лыс, % 100

21 31

сутки поспе облучония

* ; ииньКсТатасгически значимы (Точный метод Фишера) по он ю шеи ту к Контрольной группе Животных (р <0,05); данные статист чески значили (точный метод Фишера) по о ¡ношению к контрольна^ облученной i рун не животных (р <0,05); ! данные статистически значимы (точный метод Фишера) по отношению К облученной группе животных^ подучивших мексидол (Р <0,05); - данные статистически значимы (точный метод Фишера) по отношению к облученной группе жнвошых, получавших дибунол (р <0,05)

Рисунок 3 Влияние веществРУ-891, РУ-1249.мехсамина,мекешола пдибунола (при курсовом десятидневном внугрибрюшинном введении в эффективных дозах) па выживаемость мышей при однократном облучен!Ш гамма-лучами в,юзе 5 Грей

Количество лейкоцитов уже через 4 дня после облучения составило в контрольных интакткой и облученной группах 9,38* 10'7л ± 0,22 и 3.63*107л ± 0,06 (р <0.05) соответственно, что свидетельствовало о развитии тяжелой формы лейкопении у облученных животных. Изучаемые веществ:! стабилизировали количество лейкоцитов, и соединение статистически значимо превос-

ходило по эффективности все препараты сравнения, а вещеетпо РУ-891 оказалось более активным, чем дибунол, уступая препаратам сравнения мексамину и мексидолу (Рис. 4). Через 10 дней после облучения вещество РУ-1249 по сипе радиопротекторной активности превосходило препараты сравнении мексидол и мексам$Ц а вешество РУ-891 оказалось активнее мексидол а и несколько уступало препарату сравнения мексамину.

Лейкоциты. ЧО^л

1!

10

□ КОНГрОПЬ .инта^нуй) КСбгт^ чеи^е

□ РУ-КН 9 РУ-1249

! ■ Мей <>V.'-

□ МИСИЦОЛ

□ ИОЛ

10

дим

* данные статистически значимы (1) по о i потешно к йштролъной ipMtne животных (р <0,05);

данные статистически значимы (I) по отношению к контрольной облученной группе животных (р <0.05); *** i ибель животных

Рисунок 4 Влияние веществ РУ-891. РУ-1249, мсксамппа. мексидола и дибунола (при курсовом семидневном впуфпбрюшппном введении) па количество лейкоцитов в крови мышей на 4-ые и 10-ые сутки при однократном облучении гамма-лучами в дозе 5 Грен

(М±т)

Соединение РУ-891 обеспечивает выживаемость большинства животных в период острого радиационного поражения, а вещество РУ-1249 повышает выживаемость, компенсируя лейкопению на более поздних сроках облучения.

R ходе исследований влияния вещества РУ-1249 на гсмореолш ическне свойства крови ii ПОЛ при аллок'сановой интоксикации было установлено, что соединение РУ-1249 повышало выживаемость животных с интоксикацией, уже на 3 день превосходя по данному показателю препарат сравнения мексидол, и стабилизировало важнейшие гемореологические показатели (вязкость крови и функциональную активность тромбоцитов). Так, в группе животных с аллоксановой интоксикацией показатели вязкости крови в диапазоне скоростей сдвига 300 - 10 с! оказались достаточно высокими и превышали показатели контрольной группы на ] 3.8-34,8"о. На фоне этих нарушений соединение РУ-1249 снижало вязкость крови и оказалось более эффективным, чем препарат сравнения мексидол, как при высоких скоростях сдвига (р <0,05), так и при низких, что свидетельствует о нормализации гемореологического статуса как в крупных артериях и артериолах, так и в посскат-.лпярны* венуяярных отделах микроцирк^:шторного русла (Рис. S).

fill □КОНТРОЛЬ

J0C НО LüD $0 1С с1

* данные статистически значимы (t) по отношению к контрольной ipynne животных (р <0,05); * данные статиспгчески значимы (t) поошошеншо к группе животных с аллоксановой интоксикаций (р <0,05) Рисунок 5 Влияние вещества РУ-124У (6,7 мг/кг) и мексидол а (122,4 мг/кг) (при курсо-вом десятидневном вмуфнбрюшпнпом введении в пзоаптиокендантных дозах) па вяз-кость крови крыс при интоксикации аллоксаном (М±т)

Синдром повышенной вязкости у экспфиментальных крыс сопровождался усилением функциональной активности тромбоцитов, о чем свидетельствовало повышение максимального значения агрегации тромбоцитов у крыс с интоксикацией аллоксаном (7,53±0,85) по отношению к контролю (5,08±0,65). Для оценки ант и а грегационого действия соединений рассчитывали индекс агрегации тромбоцитов (ИДТ) как отношение максимального уровня агрегации тромбоцитов плазмы к исходному значению агрегации. ИАТ повышался на 48,3% у крыс с введением аллоксана по отношению к контрольным. Соединение РУ-1249 ингибировало агрегацию тромбоцитов на 25,5"и, а препарат сравнения мексидол

снижал агрегацию тромбоцитов на ! 8,4" о, однако данные оказались статистически незначимыми.

Согласно полученным результатам, антиоксидантное вещество РУ- ] 249 следует считать эффективным для снижения риска развития отдаленных последствий, связанных с активацией СРР при аллоксановой интоксикации, осложненном нарушениями гемореологической картины крови.

При оценке влияния вещества РУ-1249 на процессы ПОЛ. соединение РУ-1249 снижало количество малонового диальдегида в почках (р <0.05), поджелудочной железе, мышцах (р <0,05) и печени животных с аллоксановой интоксикацией, превосходя по первым трем параметрам препарат сравнения мехсидол (Рис. Ь).

СП

□ контроль. нмоле/г

ШаГиХ:КСакОЕап 11НТ ОVИ К-] ЦЯЯ м

вмекеидол ^

20 10 О

печень почки поджелудочная келеэа

* данные статистически значимы (!) по отношению к контрольной 1рулпс животных (р <0,(15);" данные статистически значимы (!) по отношению к группе животных с аллоксановой интоксикацией (р <0,05)

Рисунок 6 Влияние веществе РУ-1249 (ЬЛ мг/кг) и мексидола (122 не/кг) (при курсовом десятидневном внутрибргоппшиом введении в изоантнокендантиых дозах) на накопле-нпе малоновою диальдегида в различных ор! анзх крыс с аллоксановой интоксикацией (М±т)

При изучении активности антиоксидантных ферментов, в частности супер-оксиддисмутазы, установлено, что соединение РУ-1249 статистически незначимо повышало активность фермента во всех исследуемых органах и тканях (мышцах, печени, мозге, почках, поджелудочной железе и плазме) животных с агоюксановой интоксикацией н превосходило препарат сравнения мексидол по интенсивности защитного действия в мышцах, почках и мозге (Рис. 7).

При исследовании активности фермента глутатнонперокевдазы (ГПО) в печени. мышцаХ и почках крыс с интоксикацией аплоксаяом выявлено, что соединение РУ-1249 достоверно повышало активность ГПО во всех исследуемых органах, превосходя по активности препарат сравнения мексидол в печени и почках аллокеановых крыс, уступая мексидолу по данному показателю в мышцах (Рис 8).

% чнгибирования □ контроль

ЛГ1Г, ■] аллоксэно в а я интокс ция

. E3FV-1249

60 у т • El мексцдол

SO

40

20

О :

плазма мышцы печень почхи поджелудочная мозг

железа

* данные статистически значимы (t) по отношению к контрольной группе животных (р <0.05); п количество животных в группе па момент измерения

Рисунок 7 Влияние вещества РУ-1249 (6,7 мг/кг) и мсксидола (122 мг/кг) (при курсовом десятидневном впутрнбрюшинном введении в изоантиоксидантных дозах) на активность суперо-ксиддисмутазы (в" о) в различных органах крыс при аллоксановой интоксикации

(М±т)

усл.ед □ конт

300 200 100 о

печень мышцы почки

* данные статистически значимы (I) по отношению к контрольной группе животных (р <0,05); данные статистически значимы (I) ПО отношению к 1руппс животных с аллоксановой шпоксикацией(р<0,05);! данные статистически значимы (0 по отношению К группе животных с аллокса новой интоксикацией, получавших мекендол (р <0,05)

Рисунок 8 Влияние вещества РУ-1249 {6,7 мг/кг) и мсксидола (122 мг/кг) (при курсовом десятидневном внутриОрЮЦШНном введении в нзоан тиоксидантных дозах) на активность I лутатионперок енда зы в различных органах крыс при аллоксановой интоксикации (М±ш)

Приведенные результаты оценки активности основных звеньев АОС в разных органах и тканях являются основанием для поиска ингибиторов СРО липидов направленного дейстния для профилактики свободнорадикальной патологии определенной локализации, в связи со специфичностью АОС разных тканей и органов.

Таким образом, на основании проведенного скрининга было установлено, что соединения, содержащие в структуре бензимидазолыюго никла пространственно-затрудненную фенольную группу, обладают выраженными антиоксидантными и антирадикальными свойствами, перехватывают АФК, в частности липоперо-ксильный радикал и гид роке ильный радикал. При исследовании фармакологического действия изучаемых веществ под шифрами РУ-891, РУ-1249 и РУ-1250 установлено, что соединение РУ-891, содержащее диоженфенац ильный заместитель оказывает умеренное проти ноги гюкси чес кое действие, при этом у веществ с ЭФ в

Иаллоксановая интоксикация □ РУ-1249 ED мексидол

структуре (РУ-1249 и РУ-1250) данный показатель оказался более чем в 10 раз выше При исследовании противоишемических эффектов была отмечено, что вещество РУ-891 оказывало выраженное, но при этом непродолжительное действие, а соединения РУ-1249 и РУ-1250 оказались более активными в плане формирования долговременных эффектов При этом соединение РУ-1249 имело более выраженное защитное действие при ишемии головного мозга, нормализуя неврологический статус, локомоторную активность и важнейшие поведенческие показатели Такая же тенденция была отмечена при изучении радиопротекторного действия; на модели радиационного поражения вещество РУ-1249 проявило себя как наиболее активное при исследовании отдаленных последствий радиационного облучения органов и тканей, стабилизируя количество лейкоцитов при лейкопечли и повышая выживаемость животных Изучение защитного действия соединения РУ-1249 при интоксикации аллоксаном показало, что данное вещество повышает продолжительность жизни, улучшает гемореологический профиль у крыс, снижает количество продуктов ПОЛ, а также повышает активность антиоксидантных ферментов

Учитывая высокую эффективность вещества РУ-1249 при различных патологических состояниях, можно считать перспективным дальнейшее изучение у данного соединения фармакологических и токсикологических свойств.

Выводы

1 Среди 36 изученных конденсированных и неконденсированных производ-ных бензимидазола было найдено 14 соединений с высокой антиоксидантной активностью и 11 веществ с антирадикальной активностью, превосходящей препараты сравнения дибунол, тролокс и мексндол Наиболее выраженной антиоксидантной и атирадикальной активностью обладали вещества с экранированной фенольной группой

2 Соединения РУ-871, РУ-873, РУ-887, РУ-891, РУ-1249 и РУ-1250 оказывают наиболее высокие антиоксидантные и антирадикальные свойства, и по уровню токсичности их можно отнести к классу умеренно токсичных веществ Вещества под шифрами РУ-891, РУ-1249 и РУ-1250 с условным терапевтическим индексом 1405,1, 1033,1 и 1096,7, превосходящим препарат сравнения мекеидол

3 Антиоксидантная активность соединений в рядах производных М'-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола, №-тетрагидрониримидо[1,2-а] бензи-

мидазола и бензимидазола усиливается с введением в структуру пространственно-затрудненной фенольной группы Антиоксидантная активность, в основном, определяется липофильными и электронными параметрами молекулы, а антираднкальная активность - также и стерическими параметрами. Экспериментальная проверка выведенного уравнения Хенча показала, что 81% веществ с антиоксидантной активностью и 44% соединений с антирадикальной активностью подчиняются закономерностям выведенной регрессии

4 По величине противогипоксической активности вещества РУ-1249 (ЕД50=4,7 мг/кг) и РУ-1250 (БД 50=4,9 мг/кг), оказались активнее, чем вещество РУ-891 (ЕД S0=6,1 мг/кг) и препарат сравнения мексидол (ЕД50> 122,4 мг/кг) Соединение РУ-1249 превосходило по противоишемической эффективности вещества РУ-891, РУ-1250 и препарат сравнения мексидол, повышая выживаемость и нормализуя неврологический статус животных У мышей с радиационными поражениями вещества РУ-891 и РУ-1249 повышали выживаемость и стабилизировали лейкопению, превосходя препараты сравнения дибунол, мексидол и мексамин Вещество РУ-1249 повышало выживаемость животных на модели аллоксановой интоксикации, нормализуя нарушенные гемореологические показатели вязкости крови и агрегации тромбоцитов

5 У крыс с аллоксановой интоксикацией уровень малонового диальдегида преимущественно нарастал в поджелудочной железе, печени, мышцах и почках на 41, 34, 31 и 30%, соответственно, и активность антиокеидантного фермента глутатионпероксидазы снижалась в печени, мышцах и почках на 63, 57 и 28%, соответственно Вещество РУ-1249 у крыс с интоксикацией аллоксаном снижало образование малонового диальдегида в почках и мышцах на 21 и 33%, увеличивало активность супероксиддисмутазы в печени на 15% и глутатионпероксидазы в печени, мышцах и почках на 32, 42 и 17%, соответственно, превосходя препарат сравнения мексидол

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Антиоксидантная активность фенольных прошводшлх бензимидазола в тесте аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов // Материалы 62-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» - Волгоград - 2004 - С 103-104

2. Антиоксидантная и антирадикальная активность фенольных производных бензимидазола // Сборник тезисов международной конференции молодых учёных Одесского государственного медицинского университета «Вчеш майбутнього» -Одесса - 2004 - С 38

3. Изучение фармакологической активности экранированных фенолов производных М'-дигидроимидазобензимидазола, проявляющих антиоксидантные и антирадикальные свойства / Материалы 63-ой открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ, посвященной 70-летию ВолГМУ (с международным участием) «Актуальные проблемы экспериментальной и Клинической медицины» - Волгоград - 2005 - С 103-104 (соавт Смусева В В , Беленгасина С А )

4. Влияние новых соединений производных бензимидазола, проявляющих антиоксидантные свойства на устойчивость мышей к острой гипобарической гипоксии // Доклады и тезисы Всероссийской конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» - Москва - 2006- С 187-188

5. Изучение действия новых производных имидазобензимидазола при ишемии головного мозга, воспроизведенной путем окклюзии общих сонных артерий у крыс // Материалы 64-й ч-.р1 _юй итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» - Волгоград,- 2006 - С 137

6. Защитный эффект новых производных бензимидазола, проявляющих антиоксидантные свойства при острой гипобарической гипоксии // Труды международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию кафедры фармакологии ДГМА и 70-летию ггроф Ш М Омарсыл «Фармакология и фармакотерапия, достижения и перспективы» - Махачкала - 2006- С 221-223.

7. Антиоксидантные свойства нового соединения РУ-1249, содержащего в структуре экранированную фенольную группировку // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета - Волгоград - 2007 - №1 - С 67-69 (соавт Косолапов В А )

8. Ситез и фармакологическая активность ароилметилзамещенных трицикли-ческнх бензимидазольных систем, содержащих пвдроксигруппы в ароильном радикале// Хим -фарм. журнал - 2007 - Т 41, №3 - С. 107-111 (соавт. Анисимова В А , Толпыгин И Б , Спасов АЛ , Косолапов В А , Степанов А В , Науменко Л В )

АЛЕКСЕЕВА АННА АЛЕКСЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭКРАНИРОВАННЫХ ФЕНОЛОВ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА, ПРОЯВЛЯЮЩИХ АНТИОКСИДАНТНЫЕ И АНТИРАДИКАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 03 07 2007 г Бумага офсетная 60x84 1/16.

Усл.печ л. 1,1 Тираж 150 экз. Заказ № 207

Волгоградский государственный медицинский университет

Изготовлено, отпечатано и сверстано ООО «Полиграф-Сервис» тел.(8442) 93-03-00 ps91 l@yandex ru