Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Поиск и изучение 5-НТ2 антисеротониновой активности в ряду конденсированных производных бензимидазола

На правах рукописи

ГОРЯГИН ИВАН ИВАНОВИЧ

UUJ44GÜ7 У

ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ 5-НТ2 АНТИСЕРОТОНИНОВОЙ АКТИВНОСТИ В РЯДУ КОНДЕНСИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

3 О СЕН 2008

ПЯТИГОРСК - 2008

003446977

Работа выполнена в Государственном учреждении «Волгоградский научный центр Российской академии медицинских наук и Администрации Волгоградской области», Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель Член-корреспондент РАМН, заслуженный

деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Спасов Александр Алексеевич

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Гаевой Михаил Дмитриевич

Кандидат фармацевтических наук Кожевников Сергей Александрович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская медицинская

академия им И М Сеченова Росздрава»

Защита диссертации состоится октября 2008 г. в /'/часов на заседании диссертационного совета по защитам диссертаций при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава

по адресу 357533, г Пятигорск, пр Калинина, 11

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава

Автореферат разослан <<,$ » 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор фармацевтических наук, профессор (7/' Е В Компанцева

Ч

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Известно, что 5-НТ2-рецепторы могут модулировать функции центральной нервной, сердечно-сосудистой, дыхательной, выделительной и других систем организма (Воронина Т А, 2003, Петров В И , 2002, Сергеев П В и соавт , 1999, Мирзоян Р С , 2001) В ЦНС 5-ШУрецепторы участвуют в регуляции нейротрансмиссии, процессов восприятия, поведенческих актов (Wolf-Dieter Н et al, 2006, O'Mahony S et al, 2006, Bagdy G et al, 2007, Jordan К et al, 2007) Известные на сегодняшний день лекарственные препараты, проявляющие б-НТг-антагонистическую активность (кетансерин, ципрогептадин и другие) внедрены в медицинскую практику как средства для профилактики мигренозного приступа

Однако, все имеющиеся в настоящее время лекарственные препараты, несмотря на достаточно высокий уровень специфической активности, обладают целым рядом побочных эффектов (Woittiez A J et al, 1986, McCormack P M et al, 1990) и имеют высокую стоимость Выявление новых активных веществ с 5-НТ2-серотониноблокирующими свойствами среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола, может послужить базой для создания нового класса эффективных средств с противомигренозной активностью

Проведенные на базе Волгоградского государственного медицинского университета исследования установили широкий спектр биологической активности конденсированных производных бензимидазола, синтезированных в НИИ физической и органической химии Южного Федерального Университета Так, для веществ этого химического ряда была выявлена антиоксидантная (Островский О В , 1996) антигипоксическая (Косолапов В А, 1995), антиаритмическая (Спасов А А, 1999), антиагрегантная активность, как в отношении тромбоцитов, так и эритроцитов (Дегтярев АН, 2001, Турчаева АФ, 1995) Для некоторых веществ этого класса была выявлена антагонистическая активность по отношению к гистаминовым Н] и № рецепторам (Черников М В, 2000), пуриновым P2Yi рецепторам (Стуковина

А Ю., 2006) и 5-НТз серотониновым рецепторам (Киабия С Т, 2003, Яковлев Д С , 2007) Для производного имидазобензимидазола - препарата эноксифол было установлено корректирующее влияние на реологические свойства крови при состояниях, сопровождающихся развитием «синдрома повышенной вязкости крови», сахарном диабете и ишемических заболеваниях (Самохина МП, 2003) Настоящая работа является продолжением ранее проведенных исследований по поиску активных серотонинергических средств среди различных классов производных бензимидазола и изучению их механизмов действия

Цель исследования. Поиск новых соединений, проявляющих 5-НТ2-антагонистическую активность среди новых конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола и изучение их фармакологических свойств. Задачи исследования.

1 Изучить 5-ШУантагонистическую активность новых конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола.

2 Провести анализ зависимости между структурой и функциональной активностью исследованных соединений по отношению к данному типу рецепторов

3 Определить зависимость блокирующего действия веществ на второй подтип серотониновых рецепторов от их физико-химических свойств

4 Изучить острую токсичность наиболее активных соединений

5 Исследовать влияние наиболее активных веществ на гемореологические свойства крови экспериментальных животных.

6 Изучить влияние наиболее активных веществ на сосудистые эффекты серотонина

7 Изучить влияние наиболее активных соединений на основные медиаторные системы мозга с определением возможного спектра нейротропной активности

Научная новизна. Впервые проведено исследование 5-НТ2 антагонистической активности новых производных бензимидазола

№-замещенных имидазо[1,2-а]бензимидазола (29 веществ), ы'-замещенных имидазо[1,2-а]бензимидазола (12 веществ), Ы\1^3-замещенных бензимидазолина (14 веществ), К1-замещенных 2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола (9 веществ), 1\'4-замещенных 1,2,4-триазоло[1,5-а]бензимидазола (3 вещества), 2,5-замещенных бензимидазола (10 веществ) Наиболее активными, среди исследованных веществ, оказались Ы9-замсщенныс имидазо[1,2-а]бензимидазола, Ы'-замещенные 2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола и Ы4-замещенные триазоло[1,5-а]бензимидазола

Выявлены зависимости между структурой, а также физико-химическими свойствами (величиной липофильности, молекулярной рефракции и парциальными зарядами) и уровнем 5-НТ2-антагонистической активности у данного класса химических соединений

Впервые исследовано влияние вещества К9 -производного имидазо[1,2-а] бензимидазола под лабораторным шифром РУ-17 на вязкость крови, агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, деформируемость и заряд мембраны эритроцитов, осмотическую и кислотную резистентность, коагулографические параметры Показано, что в основе механизма гемореологического действия лежит антагонистическая активность по отношению к 5-НТ2 рецепторам, которая проявляется в изменении чувствительности мембраны эритроцитов и тромбоцитов к серотонину, что приводит к улучшению деформабильности и снижению агрегации клеток крови

Впервые исследовано влияние вещества под лабораторным шифром РУ-17 ^-производного имидазо[1,2-а]бензимидазола на основные нейромедиаторные системы мозга дофаминергическую, адренергическую, серотонинергическую, холинергическую и ГАМК-ергическую

Научно-практическая значимость работы. Установленные в ходе исследований закономерности между структурой, физико-химическими свойствами и 5-НТ2-блокирующей активностью соединений являются базисом для целенаправленного поиска и оптимизации синтеза новых производных

бензимидазола с заданной структурой и уровнем 5-НТ2-антагонистической активности

Выраженные антисеротониновые свойства №-производного имидазо [1,2-а]бензимидазола под лабораторным шифром РУ-17, позволяют рекомендовать его для расширенных доклинических фармакологических исследований с целью дальнейшего создания нового антимигренозного средства

Реализация результатов исследования. В результате выявленных закономерностей между структурой, физико-химическими свойствами и 5-НТ2-блокирующей активностью производных бензимидазола составлены рекомендации «Зависимость между антагонистической активностью по отношению к серотониновым 5-НТ2 рецепторам и химической структурой различных типов производных бензимидазола» и «Фармакологические свойства веществ с 5-НТ2-антагонистической активностью», которые учитываются при целенаправленном поиске биологически активных веществ с подобным типом действия в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, НИИ фармакологии ВолГМУ и Волгоградского научного центра РАМН и ABO Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ, фармацевтической и токсикологической химии Волгоградского государственного медицинского университета

Основные положения, выносимые на защиту. 1. К наиболее активным 5-НТ2-антагонистам относятся 1Ч9-замещенные имидазо[1,2-а]бензимидазола, N'-замещенные 2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола и ^-замещенные триазоло[1,5-а]бензимидазола

2 Соединение под лабораторным шифром РУ-17 по уровню 5-НТ2-антагонистической активности превосходит вещества сравнения кетансерин на 10,8% и ципрогептадин на 40,9%, соответственно

3 Соединение РУ-17 снижает сосудистые эффекты серотонина

4 Соединение РУ-17 оказывает выраженное гемореологическое действие, что проявляется в снижении вязкости крови, ингибировании процессов агрегации эритроцитов и тромбоцитов

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 8-th ECNP Regional Meeting Moscow Russia, 2005, на IX-й и Х-й Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области 2004-2005 г, на 63-й и 65-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых ВолГМУ, 2005 г, 2007 г; на III Съезде Фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 2007 г

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ в том числе одна печатная работа в журнале рекомендуемом ВАК

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 169 страницах текста, иллюстрирована 5 рисунками, содержит 36 таблиц Состоит из "Введения", "Обзора литературы" (глава I), и 4-х глав собственных исследований (главы III-VI), обсуждения результатов (глава VII), выводов и списка литературы, включающего 48 отечественных и 122 зарубежных источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследования были выполнены на 10 кроликах породы «Шиншилла» массой 4-4,5 кг, 350 половозрелых нелинейных белых крысах обоего пола массой 270-320 г и на 90 нелинейных мышах обоего пола массой 18-22 г Животные содержались в стандартных условиях вивария, без ограничения доступа к пище и воде Эксперименты проведены с учетом правил лабораторной практики (GLP) при проведении доклинических исследований в Российской Федерации, разработанные в соответствии с Федеральным законом "О лекарственных средствах" N 86-ФЗ от 22 06 1998 (Собрание законодательства Российской Федерации от 29 июня 1998 г, N 26, ст 3006, от 13 января 2003 г N 2 ст 167, от 10 января 2000 г, N 2, ст 126, от 7 января 2002 г (Часть I), N 1, ст 2) и положением о Министерстве здравоохранения

Российской Федерации, утвержденным постановлением Правительства Российской Федерации от 29 04 2002 N 284 (Собрание законодательства Российской Федерации, 6 мая 2002 г, N 18, ст 1771) Все исследования были одобрены комитетом по этической экспертизе испытаний (протокол № 25-2005 от 10 декабря 2005 г )

Изученные соединения под лабораторным шифром РУ относятся к замещенным имидазо[1,2-а]бензимидазола, Ы'-замещенным имидазо[1,2-а] бензимидазола, К1,^-замещенным бензимидазолина, М'-замещенным 2,3-дигидроимидазо [ 1,2-а] бензимидазола, М4 -замещенным 1,2,4-триазоло [1,5-а] бензимидазола, 2,5-замещенным бензимидазола, которые были синтезированы в НИИ физической и органической химии Южного Федерального Университета (НИИ ФОХ ЮФУ) (рис I)1.

Я:

>

-и2

N -з&чещенные имидазо [1,2-а]бензимидазола

ХТ хп:

К1-замещенные имидазо [1,2-а]бензимидазола

I

NN

N1-дизачещенные бензимидазолина

К1-замещенные 2,3-дигидроимидазо [1,2-а]бензимидазола

Л.

хпХ

^-замещенные триазоло 2,5-дизамещенные

[1,5-а]бензимидазола бензимидазола

Рисунок 1-Химические структуры изученных веществ конденсированных производных бензимидазола, под лабораторным шифром РУ

Антагонистическая активность по отношению к серотониновым 5-НТ2л рецепторам исследована на модели серотонин-индуцированной активации тромбоцитов методом малоуглового светорассеивания (Деркачев Э Ф. и др, 1998) Регистрацию малоуглового светорассеяния проводили на приборе «Лайт-Скан» (НПФ «Люмекс», С-Петербург) Исследования проведены на

' Выражаем искреннюю благодарность к х н, ведущему научному сотруднику НИИ ФОХ ЮФУ В А Анисичовой за любезно предоставленные субстанции веществ

тромбоцитах кролика В качестве среды использовался Трис-HCl буфер при температуре 37°С и рН=7,4 В качестве индуктора активации тромбоцитов использовали селективный агонист 5-НТ2 рецепторов - а-метил-5-гидрокситриптамин («Sigma», США)(10'бМ) Препарат сравнения неселективный 5-НТг антагонист - ципрогептадин («Sigma», США) Время инкубации исследуемых веществ и препарата сравнения составляло 2 мин Все вещества исследовались в концентрации 10'7 М

Изучение зависимости 5-HT¡ блокирующих свойств изучаемых веществ от га физико-химических свойств Изучение зависимости 5-НТ2-антагонистической активности соединений проводился методом многопраметрового регрессионного анализа, при этом производился расчет квантово-химическим методом таких показателей, как липофильности (LogP), величины молекулярной рефракции (MR) и парциальный заряд атомов всей молекулы, гетероциклического ядра и радикалов по отдельности (Burkert U, 1982, Розенблит А Б и др, 1983, Минкин В.И, 1997)

Методы определения гемореологических параметров Влияние веществ на агрегацию тромбоцитов индуцированную АДФ и серотонином исследовали на двухканалыюм лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола» (модель 230 LA) научно-произодственной фирмы ("Биола", г Москва) по методу (Born G, 1962) в модификации (Габбасова ЗА и др, 1989).

Рассчитывали следующие показатели индекс агрегации тромбоцитов, максимальный наклон, индекс дезагрегации Вязкость крови определяли на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия) Влияние веществ на агрегацию эритроцитов оценивали по индексу агрегации (Dmtenfass L , 1989) Троибиновое, протромбиновое время, активированное парциачьное тромбопластиновое время, каолиновое время, содержание фибриногена и растворимых фибрин-мономерных комплексов определяли хронометрически, на гемокоагулометре «SOLAR» (Белоруссия) с использованием наборов реактивов производства «Технология - стандарт» (Россия), по классическим

методикам, основанным на автоматическом определении клоттингового времени (Баркаган 3 С, Момот А П, 2001)

Изучение влияния веществ на уровень мозгового кровотока 2 Регистрацию локального кровотока проводили в теменной области головного мозга крыс с помощью ультразвукового допплерогрофа «ММ-Д-К» («Минимакс» Санкт-Петербург, Россия) (Топчян А В и др, 1997) Датчик УЗДП-010-01 с рабочей частотой 25 МГц, диаметром 0,3 см устанавливался на расстоянии 6-7 мм дистальнее основания проекции средней мозговой артерии по направлению ее центральной ветви

Фармакологический анализ центральных механизмов действия Для детального изучения центрального механизма психотропного действия соединения РУ-17 использовались методики, основанные на взаимодействии с основными нейромедиаторами (Андреева Н И, 2005) Влияние на моноаминергические системы мозга изучалось в тестах с фенамином, галоперидолом, апоморфином, клофелином, 5-гидрокситриптамином и L-ДОФА; холинергическое действие изучалось по изменению эффектов ареколина и никотина, ГАМК-ергическое влияние - в тесте с пикротоксином

Исследование токсичности соединений проводилось в соответствии с требованиями и инструкциями Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития В качестве интегрального показателя условной широты терапевтического действия использовался условный терапевтический индекс соединений, который определяли как отношение показателя LD50 к ЕС50 (под ред Хабриева Р У, 2005)

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного t-критерия Стьюдента, q -критерия Даннета, критерия Манна-Уитни и ANOVA (Newman Keuls test) с использованием пакета прикладных программ «Statistika 6 0» (Гланц С, 1998)

2 Выражаем благодарность заведующему кафедрой фармакопогии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета профессору, д м н И Н Тюренкову, за предоставленую возможность работать в лаборатории и консультации

Результаты экспериментов и их обсуждение

В настоящем исследовании проведен скрининг 77 новых конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола, относящихся к ^-замещенным имидазо[1,2-а]бензимидазола, М'-замещспным имидазо[1,2-а]бензимидазола, Н',Ы3-замещенным бензимидазолина, М1-замещенным 2,3-дигидроимидазо[1,2-а] бензимидазола, К14-замс1ценным 1,2,4-триазоло[1,5-а]бензимидазола, 2,5-замещенным бензимидазола, по выявлению антагонистических свойств по отношению к серотониновым 5-НТ2 рецепторам Величина 5-НТ2-антагонистической активности оценивалась по изменению степени выраженности активации тромбоцитов кролика под влиянием селективного агониста серогониновых 5-НТгрецепторов - а-метил-5-гидрокситриптамина, в концентрации 1 * 10"6 М

В результате проведенного скрининга, из 77 соединений, 10 соединений проявили высокую активность, 22 среднюю, 14 соединений низкую и 31 соединение оказалось неактивно

Только одно вещество - дигидрохлорид 2-фенил-9-пиперидино-этилимидазо [1,2-а]бензимидазола под лабораторным шифром РУ-17 - продемонстрировало эффект, превышающий таковой препарата сравнения кетансерина Несколько меньшая активность выявлена у веществ РУ-67 > РУ- 286 > РУ-284

При этом, как показал анализ зависимости 5-НТгантагонистической активности от химической структуры, наиболее активным оказался класс соединений относящихся Ы9-пиперидиноэтилзамещенным имидазо[1,2-а] бензимидазола Подобная зависимость наблюдается среди других типов би- и трициклических производных бензимидазола введение пиперидин содержащего радикала также приводит к значительному увеличению активности

Кроме вышеуказанной зависимости антисеротониновой активности от типа гетероциклического ядра и строения этиламинного заместителя, изменение строения С2-радикала также влияло на выраженность

серотониноблокирующих свойств. При этом, более активными были соединения, имеющие фенильный, метокси- (диметокси-) и окси- (диокси-) фенильные радикалы во 2-м положении гетероциклического ядра

Для уточнения выявленных на этапе анализа структурно-функциональных зависимостей для каждого из исследованных соединений были определены некоторые физико-химические характеристики, а именно, величины липофильности, молекулярной рефракции и парциальные заряды всех атомов, за исключением водородных.

Наиболее значимая, высокая отрицательная корреляционная зависимость определена для величины максимального положительного заряда радикала у атома С3 гетероциклического ядра Так же наблюдается статистически значимая корреляция умеренной степени выраженности положительная - с величиной показателя молекулярной рефракции гетероциклического ядра, липофильности и молекулярной рефракции радикала у атома К9, а также липофильностью радикала у атома С3, отрицательная - с величиной липофильности этого ядра

Высокая отрицательная корреляция с максимальным положительным зарядом радикала у атома С3 гетероциклического ядра в сочетании с положительной корреляционной зависимостью от липофильности этого же заместителя, может говорить о том, что электростатическое взаимодействие с одноименно заряженными структурами рецепторной молекулы приводит к затруднению позиционирования молекулы вещества в рецепторном кармане, и кроме того, о возможности гидрофобного взаимодействия радикала в данном положении с фрагментами рецепторной молекулы с образованием дополнительной точки фиксации

Позитивная зависимость от липофильности заместителя у 9-го атома азота гетероциклического ядра показывает, что именно радикал в данном положении участвует в формировании гидрофобных взаимодействий с рецепторной молекулой И напротив, отрицательная корреляция с

липофильностью гетероциклического ядра указывает на его вероятную не вовлеченность в образовании гидрофобных связей

Положительная корреляция между уровнем 5-Шу антагонистической активности и стерическими параметрами ядра и радикала в положении Ы9 свидетельствует об отсутствии пространственных затруднений при взаимодействии с соответствующим рецептором (в пределах вариабельности размеров исследованных веществ) и о несколько лучшей стерической комплементарности молекул веществ с ключевыми фрагментами сайта связывания рецепторной молекулы при относительном увеличении размеров, как гетероциклического ядра, так и заместителя у атома 1Ч9

С помощью проведенного анализа зависимости 5-НТ2-антагонистических свойств исследованных соединений от их физико-химических характеристик была построена классическая регрессионная модель Хэнча (1) У= 5346,1 (М(Ь+)2-19216,1 (М(Ь+;2)2-13,9 (1оёРк2)2-

р=5* 103 р=7^*!0 3 р-г.бхНГ1

12,2(1оёРК42)2- 370,2 р=2,1х102

К=0,81 8=9,02 9,9 (р=1,13*10Г4)

Где У - 5-НТ2-антагонистическая активность

М(2а11+ - средний положительный заряд атома по всей молекуле

М<2а1Г2 - квадрат среднего положительного заряда атома по всей молекуле

1о§Рю-липофильность радикала в почоэкении 2

1о§Рк42 - квадрат липофильности радикала в положении 2

Я - коэффициент множественной корреляции

8 - стандартная ошибка

Р - значимость уравнения по критерию Фишера

Статистические характеристики полученного регрессионного уравнения показывают, что оно с высокой достоверностью описывает зависимость 5-НТ2-блокирующей активности производных бензимидазола от их физико-химических параметров Это дает возможность утверждать, что с помощью полученной зависимости можно с достаточной точностью, на основании структурной формулы, производить расчетную оценку 5-НТ2-антагонистической активности новых, в том числе планируемых к синтезу,

производных бензимидазольных систем с целью оптимизации поиска высокоактивных веществ этого ряда

Анализ полученного регрессионного уравнения свидетельствует о том, что наиболее значимый вклад в проявление 5-ШУблокирующих свойств соединений вносят показатели среднего положительный заряда всей молекулы, и липофильности радикала у 2-го углеродного атома

При дальнейшем изучении соединения РУ-17 был экспериментально определен показатель острой токсичности Ь05о (табл 1) В результате было установлено, что 1>О50 у соединения РУ-17 - 164 мг/кг, а ЬЭ50 у препарата сравнения ципрогептадина - 55,3 мг/кг

Таблица 1 - Показатели 5-НТ2-антагонистической активности (ЕС50), острой токсичности (Ь0$о) и условный терапевтический индекс, соединение РУ-17 и ципрогептадина ___

Вещество ECyj LD50, мг/кг Условный терапевтический индекс (LD50/ ECjo)

М мкг/л

РУ-17 7,8x10'8 32,52 164,0 5,046

Ципрогептадин 1,7*10"7 56,0 55,3* 0,987

Примечания - по данным Yakuji G 1980

Исходя из данных, полученных в результате поиска, дальнейшему углубленному изучению было подвергнуто соединение под лабораторным шифром РУ-17 - 2-фенил-9-пиперидиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола дигидрохлорид, как наиболее перспективное для дальнейшего фармакологического изучения

Основная область применения блокаторов второго подтипа серотониновых рецепторов - профилактика возникновения приступов мигрени (Lowe G D et al, 1981, Glennon R А , 1987, Hamel E , 1999) Так же известно, что применяемые для профилактики мигрени лекарственные препараты, блокирующие серотониновые 5-НТ2 рецепторы, такие как кетансерин и ципрогептадин и др так же применяют при нарушениях периферического кровообращения (перемежающаяся хромота, болезнь Рейно и др), и тромбозах

(периферических тромбофлебитах, геморроидальном тромбозе и др.), так как у них выявлены антиагрегантные свойства (Dormandy J.A. et al., 1988; Marasini В. et al., 1988; KlimuiukP.S. etal., 1989; Alhaider A.A., 1991).

В соответствии с этим представлялось целесообразным изучение его влияния на агрегацию тромбоцитов и гемореологические показатели. С этой целью были проведены исследования влияния изучаемого вещества на агрегацию тромбоцитов, вызванную серотонином и АДФ in vivo и in vitro, на коагулографические показатели (тромбиновое время, протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время, уровень фибриногена, суммарная фибринолитическая активность), на вязкость крови интактных животных и на кровь, обработанную серотонином, влияния на осмотическую и кислотную резистентность эритроцитов, индекс доставки кислорода в ткани, а также влияние на спазмогенный эффект.

В результате исследования было выявлено, что соединение РУ-17 дозозависимо подавляло серотонин-индуцированную активацию тромбоцитов. При этом в концентрации 1х10"4М эффект составил -77,7%, в то время как препарат сравнения ципрогептадин в той же концентрации подавлял серотонин-индуцированную активацию тромбоцитов лишь на 50% (рис. 2).

lxlO"4 1х10"5 1 х i о"6

□ РУ-17 □ Ципрогептадин

по оси ординат - степень подавления серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов (А%); по оси абсцисс - концентрация исследуемых веществ (модь/л)

Примечание - * - данные достоверны по отношению к контрольной группе, критерий Манна-Уитни (р<0,05).

Рисунок 2 - Влияние соединения РУ-17 и ципрогептадина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов (серотонин 1 х 10"4М) крови кроликов ( Д%)

Аналогичные данные были получены в исследованиях на тромбоцитах интактных крыс. При добавлении в качестве индуктора серотонина в дозе 1ХЮ"4М достоверно усиливался процесс агрегации тромбоцитов.

Изучаемое вещество РУ-17 и ципрогептадин (в эквимолярных дозах) подавляли агрегацию тромбоцитов вызванную серотонином на 61,2% и на 64,4%, соответственно (рис. 3, 4).

£ <з

1 РУ-17

□ Ципрогептадин

по оси ординат - степень подавления серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов (А%); по оси абсцисс -исследуемые вещества (моль/л) Примечание - * - данные достоверны по отношению к контрольной группе интактных крыс, критерий Манна-Уитни (р<0,05).

Рисунок 3 - Влияние соединения РУ-17 и ципрогептадина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов (серотонин 1х10"4М) крови крыс ( А%)

S

к н с О

X''

i

3

время, мин

по оси абсцисс - время (мин.); по оси ординат - оптическая плотность (относительные единицы). 1 - агрегатограмма, соответствующая контрольной группе, 2 - агрегатограмма, соответствующая группе крыс, получавших соединение РУ-17, 3 - агрегатограмма, соответствующая группе крыс, получавших ципрогептадин.

Рисунок 4 - Влияние соединения РУ-17 и ципрогептадина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов крыс (опыты ex vivo)

Кроме того, исследуемое вещество подавляло АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов крыс в диапазоне доз от 5 до 25 мг/кг (рис. 5). При исследовании влияния соединения РУ-17 на коагулографические показатели

плазмы крови крыс было выявлено что, соединение введенное, в дозах 5, 10 и 25 мг/кг достоверно влияет на коагулографические показатели.

Исследуемое вещество предупреждало развитие нарушений вязкости крови при добавлении серотонина при скоростях сдвига от 10 до 300 с-1, а также снижало индекс агрегации эритроцитов и повышало их осмотическую резистентность, при этом уровень активности не отличался от такового у препарата сравнения ципрогептадина, введенного в эквимолярных дозах (табл. 2).

РУ-17 (внутривенно) ЕЗ 5мг/кг Ш0мг/кг 025мг/кг

по оси ординат - степень подавления ееротонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов (Д%); по оси абсцисс - концентрация исследуемых веществ (моль/л)

Примечание - * - данные достоверны по отношению к контрольной группе интактных крыс, критерий Манна-Уитни (р<0,05). Рисунок 5 - Влияние соединения РУ-17 при внутривенном введении на АДФ (5 мкМ) зависимую агрегацию тромбоцитов крови интактных крыс (А%)

Таблица 2. - Влияние соединения РУ-17 и ципрогептадина (в эквимолярных дозах) на вязкость крови интактных крыс (опыты ex vivo), сПз (М±т)

Группы животных Скорость едбига, с"1 ИАЭ

300 100 50 10

Контроль 3,6±0,1 4,3±0,1 5,1±0,2 7,2+0,4 2,0

Контроль+серотонин 4,3±0,1* 5,3±0,1* 6,3±0,2* 9,6+0,3* 2,2

РУ-17 +серотонин 3,6+0,1* 4,1 ±0,2* 4,8+0,3* 7,3+0,6*

Ципрогептадин +серотонин 3,7+0,1* 4,3±0,1# 4,9±0,1* Тб+од1"1 2,1

Примечание - ИАЭ - индекс агрегации эритроцитов

* - данные достоверны по отношению к контрольной группе интактных крыс, критерий Манна-Уитни (р<0,05), # - данные достоверны по отношению к контрольной + ееротонин группе интактных крыс, критерий Манна-Уитни (р<0,05)

При изучении влияния соединения РУ-17 на эффект серотонина в проекции средней мозговой артерии крыс были получены следующие результаты. Серотонин, введенный внутриартериально в дозе 20 мкг/кг,

оказывает выраженный вазоконстрикторный эффект. При этом происходит уменьшение объемной скорости в изучаемом сосуде в среднем на 69,4%, что согласуется с литературными данным (Мирзоян P.C., 2000; Васильева, Т. М. и др., 2005) (рис. 6).

После внутривенного введения соединения РУ-17 в дозе 10 мг/кг за 1 минуту до инъекции серотонина объемная скорость кровотока уменьшалась в среднем на 20%, то есть соединение РУ-17 более чем в 2,5 раза уменьшало вазоконстрикторный эффект серотонина на данной модели (рис. 7).

по оси ординат - степень подавления объемной скорости кровотока (Л%); по оси абсцисс -время (мин)

Рисунок 6 - Влияние серотонина (20 мкг/кг, в/а) на объемную скорость кровотока в проекции средней мозговой артерии крыс контрольной группы (по о тношению к исходным данным в Д%)

по оси ординат степень подавления объемной скорости кровотока (Д%); по оси абсцисс -время (мин)

Рисунок 7 - Влияние серотонина (20 мкг/кг, в/а) на объемную скорость кровотока в проекции средней мозговой артерии крыс, на фоне РУ-17 (10 мг/кг, в/в) (по отношению к исходным данным в Д%)

Большинство нейротропных средств, помимо основного механизма действия, способны влиять на другие нейромедиаторные системы. Для

выявления возможных эффектов и механизмов подобного рода, руководствуясь требованиями фармакологического комитета по доклиническому изучению лекарственных средств (Воронина Т А, Неробкова Т Л, 2005) был проведен нейрофармакологический анализ действия соединения РУ-17 в дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг

В тесте «фенаминовой стереотипии», соединение РУ-17 при внутрибрюшинном и пероральном введении, в дозе 1 мг/кг не изменяло ни один из изучаемых эффектов фенамина Однако в дозе 10 мг/кг при обоих путях введения увеличивалась длительность стереотипии, что может свидетельствовать о потенцировании дофамин/адренергических эффектов фенамина

На модели «галоперидоловой каталепсии» было установлено, что исследуемое соединение при внутрибрюшинном и пероральном введении не влияло на выраженность каталепсии у крыс в исследованных дозах (1 и 10 мг/кг), что не подтверждает данных по его влиянию на дофаминергическую систему, полученных в предыдущем тесте Более того, на модели с введением апоморфина, вещество РУ-17 при внутрибрюшинном и пероральном введении статистически значимо не изменяло выраженность развития стереотипии в изученных дозах (1 и 10 мг/кг), что также позволяет утверждать, что изучаемое соединение не изменяет дофаминергическую нейропередачу в нигростриарной системе мозга (Раевский К С , Наркевич В Б , 2005)

В то же время в дозе 10 мг/кг при обоих путях введения наблюдалось потенцирование эффектов центрального а2-адреномиметика клофелина В сочетании с данными «фенаминового теста», полученный результат свидетельствует, что исследуемое соединение в дозе 10 мг/кг оказывает центральное адренопозитивное действие

На модели с введением прекурсора серотонина 5-гидрокситриптофана соединение РУ-17 как при внутрибрюшинном, так и при пероральном введении, в обеих дозах статистически достоверно уменьшало выраженность гиперкинеза Согласно данным 8 РегоШка, наблюдается высокая

корреляционная связь между способностью некоторых веществ ингибировать подобный серотонининдуцированный гиперкинез и возможностью блокировать второй тип серотониновых рецепторов (РегоШка Б.], й а1., 1981). Полученный результат подтверждает наличие у исследуемого вещества 5-НТг-антагонистического действия (рис. 8).

_ 30

3

¡25

О

120 §

| 15

|ю

О

Р 5

У V

10 а

-5

И физ. р-р в/бр, ч/з I ч 5-ГТФ 300 мг/кг в/бр 0 ру-17 10 мг/кг в/бр, ч/з 1 ч 5-ГТФ 300 мг/кг в/бр

□ ру-17 Ю мг/кг рег 08, ч/з 1ч 5-ГТФ 300 мг/кг в/бр Иру-17 1 мг/кг в/бр, ч/з 1ч 5-ГТФ 300 мг/кг в/бр

Ш ру-17 1 мг/кг рег о$, ч/з I ч 5-ГТФ 300 мг/кг в/бр

по оси ординат - количество «встряхиваний головой»; по оси абсцисс - время (мин) Примечание - * - достоверно по отношению к контролю (р<0,05).

Рисунок 8 - Влияние РУ-17 при внутрибрюшинном и пероральном введении на 5-гидрокситриптофановый гиперкинез

Также было установлено, что изучаемое соединение на фоне малых доз Ь-ДОФА не изменяет поведение животных в сравнении с группой контроля. Не выявление потенцирования эффектов малых доз Ь-ДОФА при взаимодействии веществ, говорит об отсутствии у соединения РУ-17 МАО-ингибирующего действия. С помощью тестов с использованием никотина и ареколина было изучено влияние исследуемого вещества на центральную холинергическую передачу. При этом, соединение РУ-17 не изменяло длительности тремора у крыс в никотиновом тесте, что указывает на отсутствие у него Н-холинергического действия. На модели с введением центрального М-холиномиметика ареколина, исследуемое вещество в дозе 10 мг/кг при пероральном введении снижало интенсивность и длительность проявлений тремора, однако, так как данные проявления наблюдались только после

перорального введения исследуемого вещества и отсутствовали в случае вяутрибрюшинного введения, наиболее вероятным представляется образование метаболитов соединения РУ-17 с антихолинергическими свойствами

В тесте пикротоксиновых судорог была исследована способность соединения РУ-17 взаимодействовать с ГАМК-ергической системой мозга При этом, каких либо статистически значимых изменений эффектов ГАМК-А-антагониста пикротоксина отмечено не было

Таким образом, обобщая полученные результаты можно утверждать, что класс конденсированных производных бензимидазола представляется перспективным в плане исследования на предмет наличия блокирующих свойств по отношению к 5-НТ2-рецепторам Проявление подобного вида активности у производных имидазо[1,2-а]бензимидазола зависит от строения азотсодержащих заместителей у 9-го атома азота гетероциклического ядра Кроме того, важное значение имеет вид заместителя в С2-положении При этом максимальная антагонистическая активность наблюдается у N9-пиперидиноэтилзамещенных имидазобензимидазола с фенильным и метоксифенильным радикалами у 2-го атома углерода

В ходе работы было выявлено соединение под лабораторным шифром РУ-17, с высокой антагонистической активностью по отношению ко второму подтипу серотониновых рецепторов Было изучено его влияние на агрегацию тромбоцитов лабораторных животных в условиях m vitro и m vivo при использовании в качестве индукторов как серотонина, так и АДФ, влияние на вязкость крови, коагулографические показатели, осмотическую и кислотную резистентность эритроцитов, а также на спазмогенный эффект серотонина в средней мозговой артерии крыс В результате данных экспериментов выявлены антиагрегантные эффекты, позитивное влияние на реологические свойства крови и осмотическую резистентность эритроцитов, а также вазодилатирующие свойства в сосудах головного мозга, предупреждающие вазоконстрикторный эффект серотонина

Выраженные антисеротониновые свойства Ы^-производного имидазо[1,2-а] бензимидазола под лабораторным шифром РУ-17 в условиях in vivo проявляющиеся в антиагрегантных и вазодилатирующих эффектах, превосходящие по величине таковые у препаратов сравнения, антагонистов 5-НТ2-редепгоров ципрогептадина и кетансерина, позволяют рассматривать РУ-17 для расширенных доклинических фармакологических исследований

ВЫВОДЫ

1 Установлено, что 1Ч9-замещенные имидазо[1,2-а]бензимидазола, N1-замещенные 2,3-дигидроимидазо[1,2-а]бензимидазола и ¿^-замешенные триазоло[1,5-а]бензимидазола проявляют антисеротониновую активность в отношении 5-НТ2-рецепторов, при этом наиболее перспективными соединениями являются №-пиперидиноэтилзамещенные имидазо[1,2-а] бензимидазола

2 Выраженность 5-НТ2-антагонистической активности соединений зависит от их физико-химических свойств, в частности 5-НТ2-блокирующий эффект коррелирует с величиной липофильности и молекулярной рефракцией заместителя у 1 -го и 9-го атома азота гетероциклического ядра (в зависимости от типа производного), а также величиной липофильности и парциальным максимальным положительным зарядом у 2-го атома углерода гетороциклического ядра

3 Наибольшая 5-НТ2-блокирующая активность выявлена у №-замещенного имидазо[1,2-а]бензимидазола имеющего при девятом атоме азота пиперидиноэтильный радикал и у второго атома углерода фенильный радикал -соединение под лабораторным шифром РУ-17, превосходящего по уровню активности на модели серотонинидуцированной активации тромбоцитов селективные 5-НТ2-антагонисты кетансерин и ципрогептадин на 10,8% и 40,9%, соответственно

4 Соединение РУ-17 является менее токсичным, чем препарат сравнения ципрогептадин, а по условной терапевтической широте превосходит его в 5 раз

5 Соединение под лабораторным шифром РУ-17 обладает достоверной гемореологической активностью, проявляющейся нормализацией повышенной вязкости крови, вызванной серотонином, ингибированием процессов серотонин- и АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, повышением осмотической стойкости эритроцитов, при незначительном влиянии на коагулографические показатели

6 Соединение РУ-17 введенное в дозе 10 мг/кг внутривенно, уменьшает вазоконстрикторные эффекты серотонина, увеличивая объемную скорость кровотока в среднем в 2,5 раза

7 Соединение РУ-17 оказывает центральное антисеротониновое действие в тесте с 5-гидроксигриптофаном, адренопозитивное действие в тесте с клофелином и фенамином, не влияя в тестах с галоперидолом, апоморфиномном, Ь-ДОФА , никотином, ареколином и пикротоксинаом на дофамиергическую, холинергическую и ГАМК-ергическую медиаторные системы мозга

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Влияние пиперазин и пиперидин замещенных имидазобензимидазолов на серотонининдуцированную активацию тромбоцитов // Тез докл IX Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области Волгоград 2004 - С 31-32, (соавт Черников М В )

2 Целенаправленный поиск антагонистов серотониновых 5-НТ2 и 5-НТ3 рецепторов // Разработка, исследование маркетинг новой фармацевтической продукции сборник научных трудов Вып 60 - Пятигорск, 2005 - С 322-323 (соавт Яковлев Д С , Черников М В , Спасов А А, Анисимива В А)

3 Поиск новых 5-НТ2 антагонистов в ряду производных имидазобензимидазола и дигидроимидазобензимидазола // Материалы 63-ой открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ, посвященной 70-летию ВолГМУ (с международным участием)

23

«Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» -Волгоград, 2005 - С 192 (соавт Ворона А С , Журавлева Ю А , Кравцов И Б )

4 Влияние новых серотонинблокирующих соединений на 5-окситриптофановый гиперкинез у мышей // Тез докл X Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области Волгоград 2005 -С 14, (соавт Яковлев Д С)

5 Изучение влияния новых производных бензимидазола на центральную холинергическую систему // Тез докл X Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области Волгоград 2005 - С 51, (соавт Яковлев Д С )

6 Влияние новых производных имидазола на некоторые медиаторные ситемы мозга // Биологические основы индивидуальной чувтвительности к психотропным средствам Материалы 4-ой международной конф - M , 2006 -С 83,147 (соавт Яковлев Д С , Черников MB)

7 Влияние нового производного безимидазола на уровень артериального давления у крыс // Материалы 65-ой открытой итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ВолГМУ, «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» Волгоград 2007 - С 228

8. 3-D-QSAR-aHauH3 антагонистов 5-НТ2-серотониновых рецепторов в ряду азотсодержащих гетероциклических соединений // Психофармакология биолог наркол 2007 т 7, спец выпуск (сентябрь) ч 1 - С 1573-1838 (соавт. Желтухина А H, Васильев П M, Спасов А А, Черников M В , Анисимова В А )

9 Терапевтический потенциал антагонистов серотониновых 5-НТ2 и 5-НТ3-рецепторов // Психофармакология биолог наркол 2007 т 7, спец выпуск (сентябрь) ч 1 - С 1573-1838 (соавт Яковлев ДС, Черников MB, Анисимова В А)

10 Searching for 5-НТ2- and 5-НТ3- receptor antagonists as a potential neuropsychotropic agent // European Neuropsychopharmacology VOLUME 15 (2005) Supplement 2 The 8th ECNP Regional Meeeting Moscow, Russia April 1416, 2005 - P S126-S127 (co-authors Yakovlev D S , Chernikov M V , Spasov A A , Anisimova VA)

Горягин Иван Иванович

ПОИСК И ИЗУЧЕНИЕ 5-НТ2АНТИСЕРОТОНИНОВОЙ АКТИВНОСТИ В РЯДУ КОНДЕНСИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА

Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Бумага офсетная № 65 Гарнитура «Тайме» Тираж 120 экз Заказ № 2219

Отпечатано с готового оригинал-макета

в ООО «Бланк» Лиц №3550 400131, г Волгоград, ул. Скосырева , 2а