Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение фармакологических свойств и разработка новой лекарственной формы бетулина

На правах рукописи

КАРЛИНА МАРИНА ВАЛЕРЬЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И РАЗРАБОТКА НОВОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ БЕТУЛИНА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2005

Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова на кафедре фармакологии

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Дьячук Георгий Иванович кандидат фармацевтических наук Пожарицкая Ольга Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Лесиовская Елена Евгеньевна доктор биологических наук, профессор Зарубина Ирина Викторовна

Ведущая организация: НИИ экспериментальной медицины РАМН

Защита состоится «&» X)/ 2005 г в [!_ часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.030.01 при Институте токсикологии ФМБА России (193019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке по адресу: Санкт-Петербург, ул. Бехтерева 1

Автореферат разослан « 3» У/ 2005г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук

•>, ! > л '

Саватеева-Любимова Т.Н.

¿006 -¿2/4 О

2115216

з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В последние годы во всем мире растет интерес к препаратам природного происхождения. Значительную часть (около 25%) лекарственных средств, многие ароматические вещества, биологически активные добавки к пище (БАД) и другие ценные вещества получают из природного растительного сырья. Интерес к применению препаратов, полученных из лекарственных растений для лечения и профилактических целей, обосновывается высокой эффективностью, широким спектром фармакологической активности, плавным нарастанием фармакологического эффекта, а также возможностью использовать их в течение продолжительного времени без возникновения осложнений и побочных эффектов.

Известно, что лупановые тритерпеноиды обладают широким спектром биологической активности. Перспективным источником для получения этих соединений служат растения семейства Betulaceae (Гончарова Н.Д., 1975; Рапп O.A., 1993). Из внешнего слоя коры березы выделяют сумму тритерпеноидов, преобладающим компонентом которой является бетулин.

Бетулин обладает противовоспалительной, гиполипидемической (Василенко Ю.К. и др., 1993), гепатопротекторной и желчегонной активностью (Дьячук Г.И. и др., 2003), а также проявляет противоопухолевые (Sheth К. et al., 1993), противовирусные, бактерицидные свойства (Василенко Ю.К. и др., 1993). Токсикологические исследования показали, что он не обладает тератогенным, мутагенным, канцерогенным, эмбриотоксическим, аллергогенным, кумулятивным и сенсибилизирующим действием.

Достаточная сырьевая база и биологическая активность бетулина ставят его в ряд ценных природных источников для использования как в нативном состоянии, так и в виде различных продуктов трансформации, а также делает актуальным разработку лекарственных препаратов и БАД на его основе. Цель работы

Теоретическое и экспериментальное обоснование, создание и направленное изучение эффективности нового препарата на основе бетулина для расширения возможности профилактики и лечения хронических заболеваний.

Задачи исследования

1. Разработать состав, технологию суспензии бетулина в мягких желатиновых капсулах, разработать методики качественного и количественного анализа.

2. Изучить биофармацевтические свойства субстанции и суспензии бетулина.

3. Исходя из особенностей состава созданного препарата на основе бетулина, выбрать адекватные экспериментальные модели для

последующего изучения фармаЦлршятеадйвнгавноии

БИБЛИОТЕКА

С. Пет 0Э

gwggyj

4. На модели острого токсического гепатита, вызванного парацетамолом, исследовать гепатопротекторную активность субстанции бетулина и разработанной суспензии на его основе.

5. В хроническом эксперименте на модели ватной гранулемы оценить противовоспалительное действие суспензии бетулина при оральном и местном применении.

6. На модели язвенного повреждения слизистой оболочки желудка, вызванного аспирином, провести изучение антиульцирогенной активности суспензии бетулина.

7. Оценить фармакокинетические показатели суспензии бетулина. Научная новизна

Научно и экспериментально обосновано создание лекарственной формы бетулина в виде мягких желатиновых капсул, заполненных стабильной при хранении липидной матрицей, содержащей бетулин.

Изучено влияние типа и состава полимерной композиции на реологические свойства суспензии и на скорость высвобождения бетулина. Впервые изучена фармакокинетика бетулина из масляной суспензии. Впервые показана более высокая эффективность разработанной лекарственной формы по сравнению с субстанцией при гепатопротекторном действии.

Впервые изучены противоязвенные и противовоспалительные свойства разработанной лекарственной формы бетулина. Научно-практическая значимость

Разработана технология и нормативная документация (проект ТУ) на мягкие желатиновые капсулы с масляной суспензией бетулина.

Установлено влияние состава и технологии на биофармацевтические свойства и стабильность лекарственной формы бетулина.

Проведены доклинические испытания, подтвердившие гепатопротекторную и противовоспалительную эффективность разработанной лекарственной формы.

Экспериментально обоснована возможность использования разработанной лекарственной формы в практике гепатологии и гастроэнтерологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты экспериментальных исследований по влиянию вспомогательных веществ на реологические и биофармацевтические свойства бетулина

2. Разработка технологии суспензии бетулина в мягких желатиновых капсулах.

3. Изучение фармакокинетических параметров суспензии бетулина.

4. Суспензия бетулина в дозе 0,5 мг/кг оказывает нормализующее влияние на биохимические показатели крови, отражающие метаболизм и функцию печени.

5. Выраженный гепатопротекторный эффект на модели парацетамолового гепатита субстанция бетулина проявляет в дозе 1 мг/кг, а суспензия бетулина - в дозе 0,5 мг/кг.

6. Суспензия бетулина проявляет противовоспалительное действие на модели «ватной гранулемы» в дозе 0,5 мг/кг.

7. Суспензия бетулина проявляет противоязвенное действие на модели аспириновой язвы в дозе 1,5 мг/кг.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых СПбГМА (СПб, 2004), научно-практической конференции сотрудников и студентов СПбГМА, посвященной 60-летаю победы в ВОВ (СПб, 2005); VIII и IX Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (СПб, 2004,2005).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов исследования и выбора методов анализа, четырех глав, содержащих результаты экспериментальных исследований и их обсуждение, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, 18 рисунков. Список литературы включает 339 источников литературы.

Приложение включает проект ТУ на мягкие желатиновые капсулы с суспензией бетулина, акт о наработке желатиновых капсул и санитарно-эпидемиологическое заключение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Объектом исследования служила субстанция с содержанием бетулина 98%, предоставленная ЗАО «СНС-Фарма» (Санкт-Петербург). В разработке технологии лекарственной формы бетулина применяли метод дисперсионного анализа с применением пакета программ для персональной ЭВМ.

Доклинические исследования разработанной лекарственной формы бетулина включали изучение фармакокинетики in vivo и изучение фармакологических свойств.

Исследование фармакокинетики проведено на белых беспородных мышах, массой 20-25 г. Суспензию бетулина вводили перорально в дозе 200 мг/кг однократно. Образцы крови у мышей отбирали после их декапитации через 15 и 30 мин, а также через 1, 2, 4, 8, 16 часов. Определение содержания бетулина в крови проводили методом ВЭЖХ.

Гепатопротекторное действие изучено на модели острого гепатита, вызванного парацетамолом у крыс (белые нелинейные самцы, массой 180-200

г). Животным 1 раз в сутки в течении 14 дней вводили внутрижелудочно бетулин в дозах 0,5, 1 и 5 мг/кг и суспензию бетулина в дозах 0,1, 0,5 и 5 мг/кг, затем в течение двух последующих дней однократно вводили парацетамол в дозе 1000 мг/кг.

Противовоспалительные свойства суспензии бетулина изучены на модели «ватной гранулемы». Эксперименты проведены на белых нелинейных крысах -самцах массой 180-200 г. Формирование модели проводилось под легким эфирным наркозом. Животным выстригали шерсть в области спины и делали продольный разрез кожи и подкожной клетчатки длиной 1-1,5 см. Затем пинцетом в подкожную клетчатку имплантировали стерильный ватный шарик массой 15 мг (Мо), после чего на рану накладывали швы. Суспензию бетулина вводили перорально в течение 10 дней до операции и 8 дней после и наносили на место проекции ватного шарика ежедневно в течение 8 суток. На 8-й день у животных первой группы, а на 18-е сутки у животных второй и третьей групп под легким эфирным наркозом извлекали имплантированный шарик с образовавшейся вокруг него грануляционный тканью и взвешивали (Mi - масса влажной гранулемы). Затем гранулемы высушивали до постоянного веса и определяли массу сухой гранулемы (М2 - масса сухой гранулемы) с последующим расчетом изменения масс, что соответствует фазам соответственно экссудации (М1-М2) и пролиферации (М2 -Мо).

Противоязвенные свойства суспензии бетулина изучены на модели аспириновой язвы. Для опыта использовали белые нелинейные крысы - самцы массой 240 - 310 г. Суспензию бетулина в дозах 0,5, 1 и 1,5 мг/кг вводили внутрижелудочно через зонд. В день постановки опыта крысам дважды с перерывом в 4 часа вводили ацетилсалициловую кислоту в дозе 150 мг/кг. За 1 час до второго введения крысы получали исследуемый препарат. Через 24 часа животных забивали с помощью декапитации. Желудки вскрывали по большой кривизне и визуально (макроскопически) оценивали степень поражения желудка.

Разработка состава и технологии новой лекарственной формы бетулина.

Бетулин относится к соединениям, практически нерастворимым в воде, что создает значительные сложности при разработке оральных лекарственных форм, поскольку плохая растворимость препарата в ЖКТ ограничивает его всасывание и снижает терапевтический эффект.

Разработка твердых дисперсных систем бетулина. С точки зрения фармацевтической технологии использование лекарственных веществ в виде твердых дисперсных систем (ТДС) позволяет увеличить скорость их растворения и абсорбции и достичь их равномерного распределения в носителе (Тенцова А.И., 1981).

В качестве носителя для ТДС был выбран водорастворимый полимер -полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 1500 (Пожарицкая О.Н. и др., 1999) и ПЭГ 6000 (Nurten О., Sefika О., 1997).

ТДС готовили методом сплавления с соотношением носителя и бетулина 1:1 и 2:1 (молекулярное соотношение). Биофармацевтическую оценку ТДС бетулина in vitro проводили методом «вращающаяся корзинка».

Введение бетулина в ТДС с ПЭГ 1500 и 6000 позволило достичь более равномерного, пролонгированного высвобождения. Увеличение растворимости бетулина с возрастанием количества введенного ПЭГ 1500 происходит, вероятно, за счет солюбилизирующего действия полимера. Увеличение содержания ПЭГ 6000 в ТДС влияет на характер высвобождения незначительно. Дальнейшее увеличение количества вводимого полимера не технологично, так как при этом происходит значительное увеличение массы навески, что делает невозможным применение в желатиновых капсулах.

Разработка суспензии бетулина. Для труднорастворимых лекарственных веществ, в случае перорального их назначения, рациональной лекарственной формой является суспензия, так как данная форма обеспечивает большую суммарную поверхность, что обеспечивает лучший терапевтический эффект (Тенцова А.И., 1974).

Бетулин обладает выраженными гидрофобными свойствами (log Р составляет 9,01±0,39), поэтому в качестве основы для разрабатываемой суспензии нами была выбрана липофильная матрица.

В качестве дисперсионной среды использовали масло кукурузное. В качестве веществ, придающих суспензии необходимые реологические свойства, были исследованы: воск пчелиный, лецитин, твин-80, ПЭГ-400 и этилолеат.

Оценку полученных суспензий проводили по внешнему виду, текучести, седиментационной устойчивости, по специфическому показателю качества для суспензий - ресуспендируемости и однородности частиц дисперсной фазы. Методом дисперсионного анализа с применением пакета прикладных программ «Statgraphics» проведена оценка степени влияния изучаемых факторов на текучесть и коллоидную стабильность суспензий.

На основании полученных данных для дальнейшего изучения нами были отобраны следующие составы суспензий:

№1 бетулин -15%, воск пчелиный - 1,3%, масло кукурузное - 83,7%;

№2 бетулин - 15%, воск пчелиный - 1,0%, твин-80 - 0,5%, масло кукурузное - 83,5%;

№3 бетулин - 15%, воск пчелиный - 1,0%, ПЭГ-400 - 0,5%, масло кукурузное - 83,5%.

Биофармацевтическую оценку отобранных суспензий проводили методом «вращающаяся корзинка». Наилучшее высвобождение бетулина достигается при содержании в суспензии 1,3% воска и отсутствии ПАВ: к 90 минуте выход бетулина составляет ~76%. При снижении количества воска с 1,3 % до 1 % и введении ПАВ в концентрации 0,5% скорость выхода бетулина в среду растворения значительно снижается (рис. 1).

время, мин

суспензия с воском -•- суспензия с ПЭГ400 —суспензия с твин-80 -

Рис. 1. Влияние вспомогательных веществ на высвобождение бетулина из

суспензии

Изучение стабильности суспензий методом «ускоренного старения» показало значительное увеличение перекисных чисел исследуемых суспензий, что говорит о необходимости введения антиоксидантов.

На основании данных о реологических свойствах и стабильности исследуемых составов суспензий был сделан вывод, что суспензия, содержащая 15% бетулина и 1,3% воска пчелиного, обладает наилучшей текучестью и стабильностью, обеспечивает удовлетворительное высвобождение бетулина в опыте in vitro и наименее подвержена процессам перекисного окисления. Для данной суспензии были проведены исследования по подбору антиоксиданта. В качестве антиоксидантов нами были использованы бутилгидрокситолуол в концентрации 0,1%, витамин Е - 1%, и комплексный антиоксидант роноксан А в концентрации 0,2%. Было установлено, что роноксан А в концентрации 0,2% (комплексный антиоксидант, содержащий лецитин, токоферола ацетат и аскорбилпальмитат) оказался оптимальным антиоксидантом для разработанного нами состава суспензии.

Таким образом, с учетом физико-химических свойств бетулина и результатов собственных исследований, в качестве рациональной лекарственной формы нами была выбрана масляная суспензия. Для разработанной суспензии (с точки зрения растворимости, и как следствие, доступности, бетулина) выбрали вспомогательные вещества, создающие прочную, достаточно эластичную и стабильную при хранении липидную матрицу, такие как масло кукурузное, воск пчелиный и роноксан А.

На основании проведенных исследований разработана технология получения масляной суспензии бетулина в мягких желатиновых капсулах.

Для идентификации бетулина в суспензии был использован метод ТСХ в условиях, подобранных для субстанции бетулина: система растворителей

бензол : хлороформ 1:1, визуальная оценка зон на хроматограмме после обработки пластины раствором ванилина в спиртовом растворе H2S04 с последующим нагреванием при температуре 105°С. Для бетулина Rf составило 0,25. На хроматограмме по сравнению со стандартным образцом бетулина обнаруживается одно дополнительное пятно с Rf~0,78, соответствующее пятну раствора вспомогательных веществ суспензии.

Количественное определение бетулина в суспензии проводили по методике, разработанной для субстанции с незначительными модификациями. Метрологические характеристики метода анализа: f = 4; Х= 0,0309; S2 = 0,000004; S = 0,002; Р - 95%; t(P,f) - 2,78; Д х = 0,0023; е = 7,6%.

Биофармацевтическая оценка in vitro желатиновых капсул с суспензией бетулина была проведена методом «вращающаяся мешалка» в двухфазной системе растворителей (рис. 2), т.к. при использовании в качестве среды растворения воды и водных растворов не происходит растворения действующего вещества, в случае применения неводных растворителей не распадается желатиновая оболочка.

90

| 80

§ 70

§*80

и»

i I 40

в » 30

р 20

I 10

О

время, ч

—•—система октанол соляная кислота —■— система октанол вода А система октанол буфер рН в,8

Рис. 2. Профили высвобождения бетулина из мягких желатиновых капсул

В системе буферюктанол высвобождение бетулина идет до 45 мин эксперимента: к 45 мин растворяется около 30 % бетулина, дальнейшее растворение не происходит. При использовании системы соляная кислота:октанол высвобождение бетулина начинается с небольшой задержкой и ко 2-му часу достигает 80 %. В случае использования системы вода:октанол растворение бетулина начинается после 15 мин эксперимента и ко 2-му часу высвобождается 84 % бетулина, дальнейшее растворение бетулина в обоих случаях не наблюдается.

Поскольку в желудке происходит эмульгирование липидов и содержится небольшое количество липазы, способное гидролизовать триглицериды,

которые входят в состав суспензии бетулина, а также, учитывая, что лекарственные вещества всасываются лучше в неионизированном состоянии (бетулин в кислой среде желудка будет находиться в неионизированном состоянии), можно предположить, что наиболее активное всасывание бетулина будет происходить именно в желудке.

Исходя из результатов эксперимента в качестве среды наиболее адекватно описывающей процесс высвобождения была выбрана система соляная кислота:октанол.

Для описания процесса растворения бетулина в системе кислота:октанол наиболее подходящим уравнением является уравнение закона кубического корня (г=0,9611), по сравнению с функцией распределения Вейбулла (г=0,699) и уравнением кинетики первого порядка (г=0,8057). Уравнение линейной регрессии выглядит следующим образом: Wt1/3 =0,821 lt - 0,367. Константа скорости растворения, рассчитанная методом наименьших квадратов, составила 0,8211 ч"'.

Изучение гепатопротекторного действия субстанции бетулина.

Гепатопротекторное действие субстанции бетулина было изучено на модели парацетамолового поражения печени.

Анализ гепатозащитного действия субстанции бетулина оценивали по уровню активности индикаторных ферментов цитолитического синдрома АсАт и АлАт (табл. 1).

Таблица 1

Парацетамол

Группа животных АлАт, АсАт,

ЕД/л ЕД/л

Интактные животные 1,65±0,12 1,85±0,05

Контроль 2,75±0,09 3,59±0,09

(гепатит)

Бетулин 0,5 мг/кг 2,47±0,08 2,94±0,07

Бетулин 1 мг/кг 1,69±0,14* 1,84±0,18*

Бетулин 5 мг/кг 1,71±0,1* 1,89±0,14*

Силибор 100 мг/кг 1,68±0,08* 1,87±0,02*

* Достоверно по сравнению с контролем, р< 0,05. Установлено, что гепатопротекторное действие субстанции бетулина проявлялось в дозах 1 и 5 мг/кг, уровень снижения повышенных трансаминаз составил от 38 до 59%. Следует отметить выраженную гепатозащитную активность субстанции бетулина уже в дозе 1 мг/кг. Препарат сравнения силибор оказывал действие аналогичное бетулину в изучаемой дозе.

Проведенное исследование свидетельствует о снижении под влиянием бетулина уровня индикаторных ферментов цитолитического синдрома поражения печени.

При повреждении гепатоцитов парацетамолом наблюдаются воспалительные изменения, характеризующиеся признаками мезенхимально-воспалительного синдрома. О влиянии бетулина на течение данного синдрома судили по уровню тимоловой пробы и изменению весового коэффициента печени (табл. 2). Бетулин снижает степень выраженности воспалительных процессов в органе, причем, он эффективен уже в дозе 1 мг/кг.

Таблица 2

Изменение показателей весового коэффициента печени и тимоловой реакции

(М±т)

Группа животных Весовой коэффициент печени (усл. ед.) Тимоловая реакция Ед. Б-Н

Интактные животные 41 ±0,7 2,63±0,09

Контроль (гепатит) 56±1,1 3,28±0,11

Бетулин 0,5 мг/кг 45±0,8 2,95±0,07

Бетулин 1 мг/кг 39±0,5* 1,85±0,04*

Бетулин 5 мг/кг 42±0,8* 1,91 ±0,07*

Силибор 100 мг/кг 44±0,3* 2,16±0,08*

* Достоверно по сравнению с контрольной группой (гепатит), р<0,05.

О тяжести и характере холестатического синдрома свидетельствуют повышение активности щелочной фосфатазы (ЩФ), повышение концентрации билирубина, триглицеридов (ТГ) и холестерина (ХС). Данные по опеделению биохимических показателей представлены в таблице 3.

Таблица 3

Изменения некоторых биохимических показателей при введении бетулина

(М±т)

Группа животных Парацетамоловый гепатит

ЩФ, ммоль ч*л ХС, ммоль/л ТГ сыворотки, ммоль/л Билирубин непрямой, ммоль/л

Интактные 14,4 ±0,4 1,77±0,03 1,08±0,13 16,8±1,2

Контроль (гепатит) 21,3±0,3 2,79±0,06 4,02±0,17 25,1±1,7

Бетулин 0,5 мг/кг 18,7±0,3 2,34±0,05 3,22±0,13 22,9±1,1

Бетулин 1 мг/кг 14,3±0,5* 2,27±0,01 1,1±0,15* 17,3±0,9*

Бетулин 5 мг/кг 15,1±0,2* 2,31±0,02 1,22±0,05* 17,7±0,12*

Силибор 100 мг/кг 16,9±0,3* 2,40±0,05 1,24±0,16* 19,5±1,6*

*р <, 0,05 по сравнению с контролем (гепатит)

Под влиянием бетулина наблюдали нормализацию изучаемых биохимических показателей, нарушенных введением парацетамола. Так, при парацетамоловом гепатите снижение активности ЩФ на фоне введения бетулина в дозе 0,5 мг/кг составило 9%, 1 мг/кг - 33%,5 мг/кг - 30%, а силибора

100 мг/кг - 21%. Подобная тенденция отмечена в изменении триглицеридов сыворотки крови - их снижение находилось в пределах 70-73%.

Гистологическое строение печени крыс в экспериментальной группе с введением парацетамола характеризуется признаками наибольшего повреждения, что подтверждает соответствие модели методическим рекомендациям. Выявленные морфологические изменения гепатоцитов в группе крыс, получавших силибор, указывают на признаки острого токсического гепатита с признаками умеренного и слабовыраженного повреждения. Наименьшие проявления острого токсического гепатита отмечены в группе крыс, получавших бетулин в дозе 1 мг/кг, что указывает на >

его выраженный эффект в качестве гепатопротектора. В печени животных, получавших бетулин в дозе 1 мг/кг, наблюдались дольки, имеющие нормальное гистологическое строение. На этом фоне была выявлена дискомплексация (

балочного строения, что отражало проявления дистрофических изменений в виде внутриклеточной белковой дистрофии, где отмечена зернистая, гиалиново-капельная и мелкокапельная жировая дистрофия. Некрозы гепатоцитов отсутствовали, лимфоидная инфильтрация портальных трактов слабовыраженная.

Изучение гепатопротекториого действия суспензии бетулина.

Гепатопротекторные свойства суспензии бетулина были изучены на той же модели гепатита.

О влиянии масляной суспензии бетулина на функцию печени судили по изменению активности индикаторных ферментов цитолитического синдрома АсАТ и АлАТ (табл. 4).

Таблица 4

Влияние суспензии бетулина на состояние индикаторных ферментов печени

(М±т)

Группа животных АлАт, ЕД/л АсАт, ЕД/л

Интактные животные 1,12±0,11 0,78±0,09

Контроль (гепатит) 2,71±0,09 1,67±0,15

Суспензия бетулина 0,1 мг/кг 2,23±0,08 1,56±0,12

Суспензия бетулина 0,5 мг/кг 1,67±0,1 * 1,2±0,1*

Суспензия бетулина 5 мг/кг 1,57±0,14* 1,31+0,11*

* Достоверно по сравнению с контролем, р< 0,05.

Полученные данные показали, что активность АлАт и АсАт в группе с парацетамоловым гепатитом возрастала по сравнению с интакгными животными на 40% и 54% соответственно. Причем гепатопротекторное действие суспензии бетулина проявлялось в двух изучаемых у животных дозах - 0,5 и 5 мг/кг. Показатель трансаминазы находился на уровне интактных животных. В дозе 0,1 мг/кг суспензия бетулина не проявляла гепатозащитный эффект.

Изучено влияние суспензии бетулина на морфофункциональное состояние печени . Исследование гистологической картины печени крыс, подвергшихся введению суспензии бетулина в дозах 5 и 0,5 мг/кг, показало, что морфологическая картина острого токсического гепатита характеризовалась слабо выраженными повреждениями, что указывает на выраженный гепатопротекторный эффект.

В группе животных, получавших суспензию бетулина в дозе 5 мг/кг, нормальная гистоархитектоника утрачена, наблюдалось распространенное поражение долек с дискомплексацией балочного строения, в гепатоцитах перипортально и к центру долек белковая гиалиново-капельная и гидропическая дистрофия, захватывающая по протяженности 1/2 - 2/3 длины балок. Гепатоциты в центральных отделах долек с сохранением обычного гистологического строения, некрозы в печени единичные. Воспалительная инфильтрация в портальных трактах слабо выраженная.

В группе животных, получавших суспензию бетулина в дозе 0,5 мг/кг, наблюдалась дискомплексация балочного строения, что отражало проявления дистрофических изменений в виде белковой зернистой, гиалиново-капельной дистрофии, которая захватывала гепатоциты в балках на 1/2-2/3 их длины. Некрозы гепатоцитов отсутствовали, лимфоидная инфильтрация портальных трактов слабо выраженная. Эти изменения соответствовали острому токсическому гепатиту со слабо выраженными проявлениями поражения.

Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о наличии у суспензии бетулина гепатопротекторных свойств. Кроме того, можно полагать, что биодоступность бетулина из масляной суспензии выше, поскольку меньшая доза суспензии бетулина (0,5 мг/кг) вызывает эффект, подобный гепатозащитному эффекту субстанции бетулина в дозе 1 мг/кг.

Противовоспалительные свойства суспензии бетулина изучены при введении его внутрь и при наружной обработке ран с использованием экспериментальной модели «ватная гранулема». Выбор модели определялся тем, что она позволяет изучать влияние вещества как на стадию экссудации, так и на стадию пролиферации.

Суспензия бетулина проявляет выраженный противовоспалительный эффект в дозе 0,5 мг/кг в отношении фазы экссудации и пролиферации (табл. 5). Как показали результаты исследования в контрольной группе выявлено

* Выражаю благодарность ассистенту кафедры патанатомии СПбГМА им. И И. Мечникова к м н Самусенко И.А. за помощь в выполнении и обсуждении данных гистоморфологического исследования

нагноение раневой поверхности у 60% животных, в группах подопытных животных, как в первой, так и во второй, признаки нагноения отсутствовали. Таким образом, выраженность фазы экссудации была достоверно ниже у животных, получавших суспензию бетулина, которая составляла 58-66%. Практически такой же выраженности эффект выявлен и в отношении фазы пролиферации (55,9-59,9%).

Действие проявляется как при местном применении, так и при системном введении. Отсутствие в подопытных группах случаев нагноения позволило предполагать антибактериальное действие бетулина, что подтверждается данными литературы (Ыв-ВакЫп М. е1 а!., 2001).

Таблица 5

Влияние суспензии бетулина на течение воспалительного процесса

(М±т

Группы Бетулин (масл. суспензия) местно 0,125 мг/мл Бетулин (масл. суспензия) 0,5 мг/кг «per os» Контроль -кукурузное масло «per OS»

Время воздействия 8 дней после операции 10 дней до операции и 8 дней после 10 дней до операции и 8 дней после

Масса ватных шариков до имплантации (Мо), мг 15,0±0,0 15,0±0,0 15,0±0,0

Средняя масса влажной гранулемы (М,), мг 81±14,5* 73,2±5,7* 172,0±25,0

Средняя масса сухой гранулемы (М2), мг 29,2±2,96* 28,4±2,1* 48,4±4,4

Выраженность фазы экссудации (МрМг), мг 51,8±11,7* -58% 41,8±6,7* -66% 123,6±20,7 100%

Выраженность фазы пролиферации (М2-Мо), мг 14,7±1,7* -55,9% 13,4±3,7* -59,9% 33,4±2,7 100%

Ml/i ""

* р<0,05

Противоязвенное действие суспензии бетулина изучено на модели повреждения желудка введением аспирина. Суспензия бетулина оказывала антиульцирогенный эффект в дозе 1,5 мг/кг, ее действие проявлялось в уменьшении удельного веса всех язв в общем числе поражений (табл. 6). В дозах 0,5 и 1 мг/кг суспензия не проявляла антиульцирогенного действия.

Таблица 6

Оценка противоязвенного действия суспензии бетулина (М ± т)

Группа Животных Эрозии * Точечные кровоизлияния ** Круглые язвы *** Полосовидные Язвы

п 8 (мм.) п 8 (мм.) № кол-во язв у одного животного Б (мм.) п Б (мм.)

Суспензия бетулина 4 0,1-0,5 0 1 0,4x0,1

Настой корня солодки 4 0,1-0,5 2 0,1-0,2 1(2)/2 0,3-0,4

Контроль 4 0,1-0,5 3 0,1-0,3 2(1)/1 0,1-0,2 3(2) 0,3x0,2

п - количесво животных в - площадь поражения

* - эрозии - изменение цвета слизистой желудка с изменением её структуры не проникающие в глубокие слои.

** - так как точечные кровоизлияния были множественными (на одном участке имелось до 5 мелких точечных кровоизлияний) то учитывали количество случаев и размер отдельных кровоизлияний

*** - 1(2) - первое число указывает на количество язв; число в скобке указывает на количество крыс, у которых обнаружено данное повреждение.

Результаты, приведенные в таблице, позволяют считать, что эффективность суспензии бетулина сопоставима с активностью настоя корня солодки. Активность проявилась в уменьшении удельного веса всех язв в общем числе поражений.

Исследование фармакокинетики суспензии бетулина проводили в опытах на мышах. Предварительно был разработан метод экстрагирования бетулина из крови.

В экспериментах на мышах, которым однократно вводили суспензию бетулина (расчетная доза 200 мг/кг), выявлено, что кинетика обнаружения бетулина в крови имеет характерную для перорально применяемых лекарственных средств форму «прибойной волны» (Рис. 3).

время ,ч

Рис. 3. Содержание бетулина в крови мышей после однократного применения суспензии при пероральном введении

Средняя концентрация бетулина в плазме крови после первого часа составила 55 мкг/мл. При этом поступление препарата в кровь происходит с задержкой около 10 мин. Пик концентрации бетулина достигается ко 2 часу и составляет 95 мкг/мл. Затем со 2 до 4 часа содержание бетулина в крови снижается на 75,6%, а к 16-ти часам концентрация препарата составляет 9% от максимальной.

Параметры фармакокинетики были рассчитаны модельно-независимым методом статистических моментов (табл. 7).

Таблица 7

Показатели фармакокинетики бетулина

Показатель

Ттах, ч Стах, мкг/мл AUCoo, MRT, ч ч-мкг/мл С1, мл/ч/кг Vss, мл/кг Т,/2,Ч

Без учета коэффициента биодоступности

2 95,06 428,2 6,3 467,1 2942,7 зд

С учетом коэффициента биодоступности

2 95,06 428,2 16,3 93,4 588,42 3,1

Коэффициент биодоступности, вычисленный как отношение AUCoo к введенной дозе, дает значение 0,2.

При сравнении данных, полученных в опытах in vivo для суспензии бетулина и in vitro для суспензии бетулина в мягких желатиновых капсулах видно, что наибольшая корреляция между полученными результатами наблюдается при использовании in vitro системы соляная кислота:октанол. В обоих случаях нарастание концентрации происходит с небольшой задержкой,

постепенно, максимум концентрации бетулина in vivo и in vitro достигается к 2

часам.

ВЫВОДЫ

1. С учетом физико-химических и технологических свойств бетулина разработана лекарственная форма в виде масляной суспензии в мягких желатиновых капсулах. Капсулы содержат 40 мг бетулина, масло кукурузное, воск пчелиный и роноксан А. В условиях предприятия ЗАО "Фармаген" проведена апробация технологии капсул бетулина.

2. Разработаны методы качественного и количественного анализа бетулина в лекарственной форме. Разработан проект ТУ на мягкие желатиновые капсулы бетулина 0,04 г.

3. При изучении фармакокинетических параметров бетулина в разработанной лекарственной форме установлено, что максимум концентрации препарата в крови достигается через 2 часа после введения, коэффициент биодоступности составляет 0,2. Доказана корреляция между результатами, полученными in vitro и in vivo.

4. Биохимические и морфологические исследования показали, что бетулин

• предупреждает развитие цитолитического, холестатического и

мезенхимально-воспалительного синдромов на модели острого гепатита, вызванного парацетамолом. Доказано, что разработанная суспензия бетулина проявляет гепатопротекторную активность в меньшей дозе - 0,5 мг/кг по сравнению с субстанцией - 1 мг/кг.

5. Суспензия бетулина проявляет антиульцерогенное действие на модели язвенного поражения желудка, вызванного аспирином.

6. Суспензия бетулина оказывает противовоспалительное действие на модели ватной гранулемы. Установлен выраженный эффект в отношении фазы экссудации и пролиферации при местном применении и пероральном введении.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанная технология получения масляной суспензии бетулина в мягких желатиновых капсулах может быть использована в промышленном производстве.

2. Выраженная гепатопротекторная активность суспензии бетулина позволяет рекомендовать ее для возможного применения в клинике гепатологии и внутренних болезней.

3. Полученные результаты свидетельствуют о выраженной противовоспалительной активности суспензии бетулина, что может быть использовано в клинике гастроэнтерологии.

4. Биологически активные добавки к пище, содержащие бетулин и/или суспензию бетулина, рекомендуются к применению в качестве алкогольпротекторных средств, для профилактики алкогольного поражения печени.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Дьячук Г.И., Вишневецкая Т.П., Лапкина Г.Я., Карлина М.В. Гепатопротекторное действие бетулина // Материалы X Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2003. - С.605.

2. Дьячук Г.И., Шестакова Н.П., Карлина М.В., Юрченко И.В. Исследование фармакокинетики бетулина // Вестник Санкт-Петербургской государственной академии им. И.И. Мечникова. - 2004. - № 2 (5). - С. 107110.

3. Дьячук Г.И., Юрченко И.В., Вишневецкая Т.П., Карлина М.В. Изучение гепатопротекторных свойств бетулина // Вестник Санкт-Петербургской государственной академии им. И.И. Мечникова. - 2004. - № 1 (5). - С. 142145.

4. Иванова СЛ., Кремков A.B., Карлина М.В. Ранозаживляющие свойства бетулина // Мат. науч.-практ. конф. «Проблемы укрепления здоровья и профилактики заболеаний». - СПб, 20-27 апреля 2004. - С. 110-111.

5. Карлина М.В., Ещенко А.Ю., Пожарицкая О.Н., Дьячук Г.И. Изучение биологической доступности бетулина из масляной суспензии в опытах in vitro и in vivo // VIH междунар. съезд «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», 21-23 июня 2004. - Миккели, Финляндия, 2004. - С.665-669.

6. Карлина М.В., Иванова С.А. Разработка методов качественного и количественного анализа бетулина // Мат. науч.-практ. конф. «Проблемы укрепления здоровья и профилактики заболеваний». - СПб, 20-27 апреля 2004.-С.121.

7. Карлина М.В., Иванова С.А., Пожарицкая О.Н., Дьячук Г.И. Качественный и количественный анализ бетулина в субстанции и суспензии // VIII междунар. съезд «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», 21-23 июня 2004. - Миккели, Финляндия, 2004.-С.255-258.

8. Карлина М.В., Юрченко И.В. Разработка новой лекарственной формы бетулина // Мат. науч.-практ. конф. «Проблемы укрепления здоровья и профилактики заболеаний». - СПб, 20-27 апреля 2004. - С.120.

9. Вавилова A.B., Карлина М.В. Изучение противовоспалительных свойств суспензии бетулина // Мат. науч.-практ. конф. сотрудников и студентов СПбГМА им. И.И. Мечникова, посвящ. 60-летию победы в ВОВ 20-30 апреля 2005. - С. 36-37.

10. Дьячук Г.И., Вишневецкая Т.П., Карлина М.В., Юрченко И.В. Сравнительная эффективность различных лекарственных форм бетулина // Мат. науч.-практ. конф. сотрудников и студентов СПбГМА им. И.И. Мечникова, посвящ. 60-летаю победы в ВОВ 20-30 апреля 2005. - С. 83-84.

11. Карлина М.В., Пожарицкая О.Н., Ещенко А.Ю., Дьячук Г.И. Изучение биологической доступности бетулина из масляной суспензии в мягких желатиновых капсулах в опытах in vitro и in vivo // IX междунар. съезд

«Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», 22-25 июня 2005. - СПб, Россия, 2005. - С.754-759.

12. Комаров Ю.И., Карлина М.В. Влияние суспензии бетулина на течение гепатита, вызванного парацетамолом // Мат. науч.-практ. конф. сотрудников и студентов СПбГМА им. И.И. Мечникова, посвящ. 60-летию победы в ВОВ 20-30 апреля 2005. -С. 131-132.

Подписано в печать 28.10.2005. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 70. Заказ 114Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: 550-40-14 Тел./факс: 247-57-76

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

2 1511

РНБ Русский фонд

2006-4 22140

>¡

i