Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Экспериментальное изучение гепатопротекторных и желчегонных свойств бетулина

На правах рукописи

ЮРЧЕНКО ИГОРЬ ВАСИЛЬЕВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫХ И ЖЕЛЧЕГОННЫХ СВОЙСТВ БЕТУЛИНА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Пет ербург 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургской медицинской академии им. И.И.Мечникова

Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор Георгий Иванович Дьячук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Барнаулов Олег Дмитриевич доктор медицинских наук профессор Борис Владимирович Андреев

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая

академия

Защита состоится 26 апреля 2005 года на заседании диссертационного совета Д 215.002.07 при Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (194044, г.Санкч-Петербург, ул. академика Лебедева, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (194044, г.Сапкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.б).

Автореферат разослан 23 марта 2005 года

Ученый секретарь диссертационно! о совета

доктор медицинских наук профессор Борис Николаевич Б01 омолов

ЪЪЪ<3

ВВЕДЕНИЕ

Акгуальность исследования

В последнее время хронические заболевания печени занимают существенное место среди причин смертности и нетрудоспособности (Соринсон С.Н , 1998) Более того, отмечается тенденция роста числа больных с хроническими поражениями печени. которые распространены преимущественно у лиц работоспособного возраста (Подымова С.Д., 1993) Это вызвано тем, что условия существования современного человека характеризуются наличием в окружающей среде большого числа химических соединений, вызывающих изменения биологических процессов в печени и приводящих к её токсическому поражению.

Круг веществ, проявляющих гепатозащитные свойства, достаточно велик, однако, в соответствии с современной классификацией лекарственных веществ, из их числа выделяют небольшую группу гепатопротекторов, оказывающих избирательное терапевтическое действие на печень. К ним относятся растительные полифенольные антиоксиданты (легалон, силибор, катерген, валилив), фосфолипидный препарат эссенциале, который проявляет иммуномодулирующие эффекты в условиях острой гепатопатии (Конопля H.A., 2000). Терапевтическая активность названных препаратов не всегда оказывается достаточной. Большинство из применяемых гепатопротекторов являются импортными, что побуждает к поиску новых эффективных отечественных гепатозащитных средств. Особенно велика потребность в гепатозащитных средствах при терапии заболеваний печени токсической этиологии. Гепаготропные токсиканты широко используются в промышленности, сельском хозяйстве, в быту (алкоголь, лекарственные средства и др.) (Bonkovsky II L. et al., 1996). По данным комитета здравоохранения Санкт-Петербурга (2003) болезни печени с 1997г. возросли в 2,1 раза.

Известно, что в окружающей среде присутствует около 80 000 гепатотоксических ксенобиотиков с которыми человек кошактирует в течение своей жизни. В 30% случаев острых отравлений возникают клинические проявления химического поражения печени, у 7% людей, получивших лекарственные препараты, развивается медикаментозное поражение этою органа (Арчаков А И., Корузина Н.И., 1988).

Общим .зля всех форм токсических поражений печени являемся усиление свободно радикальных процессов и перекисиого окисления липидов (ПОЛ), нарушение структуры мембран гепаюцитов и повышение их проницаемости (Костин С В , 2000)

Полому изучение и выявление биологически активных веществ, способных блокировать патологические процессы в печени, является весьма актуальной проблемой

Исторически в народной медицине широко используются экстракты (как водные, так и спиртовые) различных частей березы (почки, листья, кора), в том числе и для лечения заболеваний органов пищеварения, мочевыделигельной системы. Настои и отвары почек и листьев березы известны своими противовоспалительными и раноза-живляющими свойствами при хронических формах экземы, лечении ран. эрозий, пролежней. Эффективными они считаются и при желтухах Рекомендации по их применению дают не только народные травники, но и официальные медицинские издания («Русская медицинская газета», 1834г.). Береста, наряду с листом подорожника, использовалась в качестве раневых пластырей В годы Великой Отечественной войны березовая кора использовалась в пищу как в виде отваров, каш («дуранда»), так и в виде добавок бересты в хлеб

В задачу нашего исследования входило изучение гепатозащитного действия бетулина - это тривиальное название (Мэзон, 1831) непредельного пентациклического тритерпенового спирта лупанового ряда бегулина - СзоН5о02 или луп-20(29)-ен-3 ß, 28-диола Бстулин получают экстракцией органическим растворителем наружного слоя коры -бересты наиболее распространенных в России видов берёзы -пушистой и бородавчатой (Betula pubescem Ehrh, В verrucosa). В бересте бетулин является основным экстрактивным веществом (около 70% по массе) и обуславливает ее белый цвет Цель исследования

Экспсримешально изучи[ь наличие и выраженность гепатопро-тек горных и желчегонных свойств бетулина Задачи исследования

1 Изучить защитное действие бетулина при токсическом поражении печени четырёххлористым углеродом.

2 Изучить гепатопрогекторное действие бетулина при токсическом поражении печени парацетамолом

3 Изучить renaiопротекторное дейавие бег>пина при токсическом поражении печени этанолом

4 Изучить гспакнашиIнос действие бег> тина при Омалаккна-миновом гепа! ите.

5 Изучить репаративные свойства печени, ее функциональное состояние и биохимические показатели крови в условиях воздействия бетулина при токсическом поражении печени

6. Изучить влияние бетулина на процессы желчеобразования и желчевыделеиия при токсическом поражении печени

Научная новизна работы

В работе получены новые данные о гепатопротекторном действии бетулина в условиях экспериментальной модели гепатита, вызванного СС14, парацетамолом, этанолом и галактозамином.

Показано, что гепатозащитное действие бетулина связано с нормализующим влиянием на индикаторные ферменты цитолиза печени (АлАТ, АсАТ), предупреждением выраженности воспалительных процессов в печени, уменьшением показателей холестатического синдрома.

Установлено дозозависимое влияние бетулина на процессы регенерации в печени в условиях токсического ее поражения. Выявлена роль бетулина в реализации антиоксидантных и гепатопротекторных эффектов.

Бстулин восстанавливал секрецию желчи и концентрацию в ней желчных кислот, холестерина, билирубинов и фосфолипидов, восстанавливал процессы гидроксилирования желчных кислот и нормализо-вывал соотношение три- и дигидроксихолановых кислот.

Научно-практическая значимость

Полученные данные имеют важное научно-практическое значение, поскольку выявленные и изученные гепатозащитные свойства бетулина. представляют его перспективную значимость в качестве новою гепатопротскторного средства

Установлены выраженные дозозависимые оффекш бетулина на процессы перекисного окисления пипидов и физиологической регенерации гепатоцитов в условиях юксического поражения печени.

Экспериментально обоснована возможность использования в терапевжческой практике нового гепа юпро гектора. Материалы по препарату представлены в ФК МЗ РФ с целью получения разрешения на его клинические испытания в качестве гепатопротектора в комплексной терапии гепатите и ¡епатозов

Полученные в рабоге результаты значительно расширяют представления о спектре биологической активное!и и возможных

механизмах действия бегллина. чго погоняет дак, 1еоретическое обоснование С1 о испотьювания в клинической пракшке

Получены Регисч рационные удостоверения и Оанитарно-I игиенические заключения МЗ РФ

1 № 004726.Р 643.09.2002 от 16 09.2002г. на «Берёзовый экстракт сухой - С» - сырье для производства биологически активных добавок к пище.

2. № 004823 Р 643 09.2002. от 16.09.20021. на биологически активную добавку к пище «Берёзовый экстракт сухой»

3. № 004820.Р.643.09 2002 01 16.09.2002г. на биоло! ически активную добавку к пище «Бегула-Дэ-токс»

4. № 77 99.20.937.Ь.000145 02.04. от 02.02.2004г. на биологически активную добавку к пище «Гастробетол».

5 № 77.99.20.937.Б.000542.04.04. от 13.04.2004г. на биологически активную добавку к пище «Алкощит».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бетулин в дозах 1-10 мг/кг оказывает выраженное гепатопро-текторное действие на моделях токсического поражения печени СС14, парацетамолом, этанолом и при Б-галактозаминовом гепатите.

2. Бетулин оказывает нормализующее влияние на биохимические показатели крови, отражающие метаболизм и функцию печени.

3 Бетулин предупреждает выраженность воспалительных процесссов в печени и показатели холестатического синдрома при экспериментальном гепатите.

4. Наиболее выраженный гепатопротекторный эффект по результатам гистоморфологического исследования бетулин проявляет в дозе 1 мг/кг.

5. Бетулин устраняет депрессию желчеобразования и восстанавливает секрецию желчи до уровня нормальных величин при введении парацетамола.

Внедрение в практику результатов исследования

Полученные результаты исследований использукнся в учебном процессе при преподавании физиологии, фармакологии и терапии для студентов, интернов, клинических ординаторов в СПбГМА им И.И.Мечникова. Биологически активная пищевая добавка «Берёзовый экстракт сухой», содержащая бетулин, проходит апробацию в НИИ гриппа РАМН, на отделениях I астроэнтероло! ии. гепаюло1ии клинической больницы Петра Великого, Св преподобномученницы Елизаветы, городской инфекционной больницы им П И Боткина,

I протеком противотуберкулезном чиспансере Ре^.нлдп,! исследования специфической активности бегутина. ею бешредности и безопасноеIи леьти в основу доку-менгов. направленных в Фармакологический Комитет МЗ Российской Федерации для получения разрешения на клинические испытания

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на 2 м Всероссийском сьеде фармакологов (Москва, 2003). X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), научно-практической конференции аспирантов и молодых учёных СПбГМЛ им И И Мечникова (СПб, 2004).

Основные положения диссертации изложены в семи научных работах местной и центральной печати, в т.ч двух статьях.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.

Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, иллюстрирована 1 1 рисунками и 16 таблицами.

Библиографический указатель содержит 154 наименований, в том числе 53 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая структура исследований

Работа выполнена на 242 линейных крысах, массой 170-260 i

В работе использован 95% бстулин (СзоН^оСЬ, мол. масса (FW) -442,7, tmanji (MP) 252-256°С), полученный экстракцией !-н бутанолом из бересты берёзы обычных для территории России фармакопейных видов (Betula pubescens Ehrh , Belula verrucosa); производитель - ЗАО "CI IC-фарма", Санкт-Петербург.

Для сравнения эффективности использован известный официнальный i еттатопротскюр - силибор Исследования выполнены с соблюдением принципов гуманного отношения к лабораторным животным в соответствии с международными рекомендациями (1993)

Рис I Сфуюурная формула 6ет>лина

Ме

Синонимы

Луп-20[29]ен ЗВ,28-диол (Ьир-20[29]-спе-ЗВ,28-ёю1), бетуленол, бетулинол, березовая камфора

НО

Ме Ме

Моделирование экспериментального гепатита

Гепатопротекторное действие изучали на моделях экспериментального поражения печени. Для моделирования острого гепатита на крысах применяли парацетамол, четырёххлористый углерод, этиловый спирт и О-галактозамин.

Моделирование повреждения печени с использованием парацетамола выполняли следующим образом: животным 1 раз в день на протяжении 14 суток вводили внутрь бетулин в дозах 1 и 5 мг/кг, затем в течение двух последующих дней однократно вводили парацетамол в дозе 1000 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали силибор в дозе 100 мг/кг. Контрольные животные получали парацетамол и вместо лекарственных препаратов - эквиобъёмное количество дистиллированной воды.

При применении четырёххлористого углерода в качестве гепато-токсина. бетулин вводили ежедневно в течение 6 суток до первого введения токсиканта, в дозах 5 и 10 мг/кг. Четырёххлорисгый углерод в виде 50% масляного раствора вводили внутрь трёхкратно через день в дозе 0,3 мл на I ООг массы тела

В условиях применения 40% этилового спирта в дозе 7,0 мл/кг, бетулин вводили ежедневно в дозах 1 и 5 мг/кг за 2 часа до введения токсиканта в течение 7 суток

Галактозаминовый гепатит считается наиболее адекватной моделью вирусных поражений печени (Венгеровский А.И и соавт . 1999. 2002) ГМалактозамин вводили животным внутрь через зонд, один раз в лень в течении 4-х суток в дозе 500 мг/кт массы животно! о

Ьет\тин вводит крысам вн\ трь, в до;с 5 mi/ki массы ic.u живтното. один ра? в тень в гсчсние 7 счток В качестве препарата сравнения испольювали отвар листьев берёзы

Биохимические методы исследования

Об уровне цитолитичсско! о синдрома судили по акгивносш АлТ и АсТ в сыворо1ке крови, а также по содержанию в ткани печени малонового диальдегида, пировиноградной и молочной кислот (Владимиров Ю.А., Арчков А.И , 1972)

Интенсивность холестатического синдрома оценивали по акшв-ности щелочной фосфатазы, концентрации непрямого билирубина, холестерина и триглицеридов (Weigl Е et al., 1975).

Влияние бетулина на мезенхимально-воспалительный синдром изучали по уровню тимоловой пробы и весовому коэффициенту печени

АлТ, АсТ и щелочную фосфатазу определяли с помощью набора реактивов «Реком», «Лахема» (Bergmuer Н.Г., et. al., 1986)

Тимоловую пробу определяли фотоэлектроколориметром (Меньшикова В.В., 1987)

Уровень холестерина, триглицеридов, билирубина определяли общепринятым методом (Колб В.Б.. Камышников В С., 1982)

Содержание в сыворотке крови гамма-глутамилтранспептидазы (у-ГТП), холинэсгеразы, щелочной фосфатазы и холестерина определяли на универсальном биохимическом анализаторе «Cobas Mira+» фирмы Хоффман-Ля Рош Л)д в лаборатории дорожной больницы Санкт-Петербурга. Концентрацию ьтикогена в печени определяли по методике Kemp A., Heijnmgen А. (1954) с небольшой модификацией (для эксфакции гликогена из печени использовали не метанол, а этиловый спирт).

Изучение функционального состояния печени а) Барбитуровый тест

На фоне парацегамолового гепатита оценку функционального состояния печени проводили с помощью гекссналовой пробы на мышах. Гсксснал вводили в дозе 80 мг/кг внутрибрюшинно На модели галактозам и нового гепатита использовали тиопентал натрия, котрый вводили в латеральную хвостовую вену крыс в дозе 33 мг/кг По продолжительности боковою положения оценивали скорое ib метаболизма барбитуратов. осущеС1вляемой цитохром Р-450 зависимой монооксигеназной системы гепатоциюв

о) Проба ( оромсутьфа.чеинои (ЬС(!>) <«идете ¡ьсппцет о состоянии жскреторной и антиюксической функции печени Содержание БСФ в крови крыс определяли спекгрофотометрически через 1, 5. 15 и 45 мин после введения красителя (1-5мг/кг) в хвостовую вену крыс Вычисляли коэффициент ретенции БСФ, элиминируемого в виде конъюгатов с цистеином и глутамином

в) Относительная масса печени

Данная проба характеризует степень выраженности воспалительных процессов печени Весовой коэффициент печени рассчитывается, как отношение массы печени в мг к массе тела в граммах и проанализирован у животных с этаноловым гепатитом

г) изучение активности цитохрома

Состояние антитоксической функции печени при токсическом I епатите и лечении его бетулином оценивали по содержанию Р-450. Стабильность цитохрома Р-450 оценивали по интенсивности образования функционально инертного цитохрома Р-420 в процессе инкубации микросом в течении 10 мин при 37°С. Рассчитывали степень спонтанной тепловой инактивации цитохрома Р-450 как изменение в процентах разностей между конечным содержанием этого гемопротеина и цитохрома Р-420 по сравнению с исходной величиной (Котелевцев C.B. и соавт., 1986).

Морфогистохимические исследования

Для морфологического исследования печени крыс материал фиксировали в течение 10 ч в 10% растворе формалина. Затем взятые кусочки печени обезжиривали в спиртах нарастающей концентрации, заливали в парафин и изготавливали препараты с использованием стандартного оборудования и реактивов для парафиновой проводки. С целью изучения препараты окрашивали рутинной гистологической окраской гематоксилином и эозином. Применялось гистохимическое окрашивание Суданом III срезов, изготовленных на замораживающем микротоме, что позволяло выявить в ткани печени жир. Исследования проводили светооптическим микроскопом ВИОЛАМ при увеличении х180 в 10 полях зрения (одно поле зрения обычно содержало 4 печёночные дольки). Таким образом, расчет поражения в процентном отношении производился исходя из этого количества долек.

Сопоставления и гистологическую оценку измерений проводили с интактной 1руппой крыс, содержавшихся в лабораторных условиях

Исследование жслчс! онной активности

Поскольку 1епатотоксичнос1ь парацегамола обусловлена образованием реактивных метаболитов при участии системы цитохрома Р-450, инициацией ПОЛ, снижением сишешческих процессов, а также нарушением процессов желчеобразования, то задачей данною исследования было изучение влияния бетулина па состояние желчеобразо-вательной функции печени при парацетамоловом гепатите

Исследования проведены на крысах - самцах массой 170-190 г. Острое лекарственное поражение печени вызывали путём введения в желудок парацетамола в дозе 0,25 на 100 г массы тела животного в виде взвеси на 1 % крахмальном клейстере 1 раз в день в течение двух суток (Dixon М, F, et., 1971). Контрольные животные получали соответствующий объём 1% крахмального клейстера. Бетулин применяли в дозе 1 мг/кг внутрь 1 раз в день профилактически в течение 10 суток до введения парацетамола.

Об эффективности гепатопротекторного действия бетулина судили по изменению интенсивности секреции желчи (мл * 100 г * 4 час.), концентрации основных её компонентов - желчных кислот (Ковалёв И.Е. и соавт., 1982), холестерина, билирубина (Скакун Н.П. и соавт., 1982), фосфолипидов (Саратиков А.С. и соавт., 1977), а также по изменению концентрации тригидроксихолановых и

дигидроксихолановых кислот (Кашкова Э.К. и соавт., 1989). Желчь собирали в течение 4 ч в усло-виях острого опыта у крыс, находящихся под этаминаловым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно), через катетер, вставленный в общий желчный проток. Исследования проводили через 1, 3 и 7 суток после завершения введения парацетамола. На каждый срок исследования подбирали по 6 животных.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета с!агистических программ Statistika for Windows 97. V. 7,7. В 1ексте на рисунках и таблицах представлены средние значения исследуемых показа!елей (М) и средняя квадратичная ошибка (м). Определение значимости различий между сравниваемыми показателями проводили с использованием параметрического t-критерия Стьюдента Различия в сравниваемых группах исследований считалось достоверным при р<0,05 (Лакин Г.Ф., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние бетулина па течение острого гепатита при токсическом повреждении печени парацетамолом. Анализ механизма гепатоза-щитно! о действия бегулина при токсическом поражении печени парацетамолом выполнен на основании изучения активности индикаторных ферментов иитолитического синдрома АсАТ и АлАТ Повреждение гепатоцитов токсикантом приводи! к циюлизу гепатоцитов и высвобождению специфических печеночных ферментов АлАТ и АсА'1.

Результаты выполненных биохимических исследований представлены в табл.1.

Таблица 1

Влияние бетулина на состояние индикаюрных ферментов печени

Працетамол

Группа животных АлАТ, ЕД/л АсАТ, ЕД/л

Интактные животные 1,65±0,12 1,85±0,05

Контроль (гепатит) 2,75±0,09 3,59±0,09

Бетулин, 5 мг/кг 1,71±0,1* 1,89±0,14*

Бетулин, 1 мг/кг 1,69+0,14* 1,84+0,18*

Силибор, 100 мг/кг 1,68±0,08* 1,87±0,02*

Примечание. * Достоверно по сравнению с контролем, р< 0,05.

Высокая активность маркерных ферментов (АлАТ и АсАТ) свидетельствует о развитии иитолитического синдрома. Так, активность АлАТ в группе с парацетамоловым гепатитом возрастала по сравнению с интактной группой на 40% Гепатопрогекторное действие бетулина характеризовалось предупреждением повышения активности транса-миназ. Следует отметить выраженную гепатозащитную активность бе1улина уже в дозе 1 мг/кг Препарат сравнения силибор оказывал действие аналогичное бетулину в изучаемой дозе.

Таким образом, проведенное исследование свидетельсг вуег о снижении под влиянием бетулина уровня индикаторных ферментов иитолитического синдрома при токсическом поражении печени

При повреждении юпспоцикж парапетами кш наб подаются воспали 1е п,ные изменения. характеризующиеся признакам1т мезепчиматьно воспалительною сширома О втиянии бетулина на течение данного синдрома супили по уровню тимоловой пробы и изменению весового коэффициента печени (табл 2).

Таблица 2

Влияние бетулина на воспалительный синдром

Группа животных Весовой коэффициент печени, уел ед. Тимоловая реакция, Ед.Б-Н

Интактные животные 41,0±0,7 2,63±0,09

Контроль (т епатит) 56,0±1,1 3,28+0,11

Бетулин, 1 мг/кг 39,0±0,5* 1,85±0,04*

Бетулин, 5 мг/кг 42,0±0,8* 1,91±0,07*

Силибор, 100 мг/кг 44,0±0,3* 2,16±0,08*

Примечание. * Достоверно по сравнению с контрольной группой (гепатит), р<0,05.

Поскольку показатель весового коэффициента печени характеризует степень выраженности воспалительных процессов в органе, то бетулин, по-видимому, предупреждает их. Причем, как видно из представленных данных в таблице 2, бегулин эффективен в дозах 1 и 5 мг/кг Силибор несколько уступал в своей способности снижать воспалительные процессы в печени, хотя эти различия не были статистически значимы

О тяжести и характере холестажческого синдрома свидетельствуют повышение активности щеточной фосфатазы, повышение концентрации билирубина. Бетулин предупреждал увеличение щелочной фосфатазы, наблюдаемое у животных с парацетамоловым 1епатитом

Нормализующее влияние бетулина отмечено в изменении концентрации билирубина, триглицеридов и холестерина Таким образом, если в условиях .экспериментального тспатита отмечено достоверное увеличение показателей холестэтического синдрома, то

синдрома, го бс!улин в лозах 1 и 5 мг/кг предупреждал и\ прирост и у 1ерживал биохимические показатели на уровне исходных данных итактных животных Разтичия в выраженности эффект на фоне бетулина и силибора не были достоверными

Гистологическое строение печени крыс (рис 2а)* в экспериментальной группе с введением парацетамола (рис 26) характеризовалось признаками наибольшею повреждения, что подтверждает соответствие модели методическим рекомендациям. Наименьшие проявления острого токсического гепатита отмечены в группе крыс, получавших бетулин в дозе 1 мг/кг, что указывает на его выраженный гепаюпро-текторный эффект (рис.2в).

Выявленные морфологические изменения гепатоцитов в группе крыс, получавших силибор, указывают на признаки острого токсического гепатита с признаками умеренного и слабовыраженного повреждения, что также свидетельствует о его гепатозащитном действии (рис.2г).

щтшш .н л%, .м«"- ¿л. >> .4» -«лв* »ъйлвж 1

Рис.2а. Печень ишактной крысы. Окраска гематоксилином и эозином Увеличение х200 Рис 26. Печень крысы, получавшей парацетамол. Острый лекарственный гепатит. Выраженные дистрофические изменения и очаги некроза Окраска темагоксилином и эозином. Увеличение х180

* Автор выражает глубокую благодарность ассистенту кафедры пато-ло! ической анатомии СПбГ МА им И И.Мечникова к м н Самусеггко И А ¡а помошь в выполнении фрагмента работы и обсуждении ре;>льтаюв морфогистохимилеских исследований

-V/' г* ••Ъ-т-^^^щЬ -- » - \ „ » . \' V ^ * *• V'«с\ УЛ. »• • <' -* » 1Ч - • - - .. . . "»*. Т'--7 V-Л, - -ч * - * --¡»Г**..'" *•

Рис 2в. Печень крысы, получавшей парацетамол и бетулин. Острый лекарственный гепатит. Выраженная дискомпенсация балочного стоения, слабо выраженные дистрофические изменения Окраска 1 ематоксилином и эозином. Увеличение х180 Рис.2г. Печень крысы, получавшей парацетамол и силибор. Дискомпенсация балок, белковая и жировая дистрофия затрагивает гепатоциты но периферии дольки и перицентральные отделы. Единичные перипортальные некрозы гепатоцитов. Окраска гемаюксилином и эозином. Увеличение х! 80

Влияние бетулина на течение острого гепатита при токсическом повреэ/сдении печени четыреххлористым углеродом.

Введение четыреххлористо! о углерода провоцирует некроз гепа-тоцитов. воспалительный 01ёк паренхимы, мощную клеточную инфильтрацию, нарушение впутрипечёночиой гемодинамики и, как следствие, холестаз При интоксикации разрушается структура мембран, отмечается их прозрачность и снижается текучесть. Вследствие этого изменяемся электрохимический потенциал мембраны. что приводит к нарушению патрийзависимых транспортных систем, таких как транспорт желчных кислот, и определяет развитие опосредованною цитолизом холестаза.

Влияние бетулина на активность сывороточных ферментов и показатели углеводного обмена при токсическом гепатите у крыс, вызванном четыреххлористым угтеротом. представлены в табл.3.

"1 ао шил '

Влияние бсчулина на биохимические пока »а гели при юкскческом (СГ14) гена I и те ) крыс

Группы животных АлАТ СД/л АсАТ ЕД/л Молочная кистота, мг% 11ировино Iрадная кислота. т%

Ишакгные 1,374 0,1 3 1,52+0,12 85 3(9,4 2,44+0.10

Контроль (гепатит) 4,78±0,09 3,48±0,21 140±7.8 11,59 + 0.11

Бетулин, 5 мг/кг 1,87+0,2 \* 1,83±0,07* 92,7±7,6* 2,35-0.17*

Берлин. 10 М1/кг 1,91+0,17 1,95+0,14* 96,2.±6,2* 2,32±0,\3*

Силибор. 100 мг/к! 2,65+0,08* 2,01+0,12* 115^7,4^ 2,8210,12*

Примечание * Достоверно по сравнению с контрольной I рунной (гепатит), р<0,05.

Из 1абл.З видно, что активность АлАт и АсА] у животных, получавших бе!улин в дозе ]0 мг/кг, была ниже чем у не леченых животных на 60.9-56.4%, а у животных получавших бстулин в дозе 5 мг/кг соот ве гственно 60,1 - 44,0%.

Под действием бетулина наблюдалось и более выраженное снижение образования молочной и пировиноградной кислот, чем в контрольной группе, что указывае1 на улучшение аэробных процессов окисления в гепатоцигах

Резулыаш изучения влияния бетулина на уровень цитохрома Р-450 даю1 основание заключить, чю бетулин обличаем (счение токсического поражения печени, вызванного четыреххлористым у!леродом, оказывая существенные позитивные сдвиги в мечаболизме печеночных клеток и индуцирующее влияние на ферменты обезвреживающей системы печени Об згом свидетельствует е!о способноеи> восстанавливай! уровень цитохрома Р-450, а ингибируя процессы ПОЛ способе|вует, тем самым, бысIрой нормализации функциио-пальпого состояния органа

//<< ¡сдавания и тяпни осту.ниш па активность иитиакс и-дштини/ системы прово п-1 !и всчслствие важное!и роти аитиокси папгною эффекта и механизме терапевтического действия 1епатопро-текгоров при патологии печепи

Весьма благоприятным фактором влияния бегулина на ючение жспериментальпог о гепатита следует считать и более низкое по сравнению с контролем (нелеченые крысы) содержание в ткани малонового диальдегида олного из конечных продуктов ПОЛ. Инги-бирование бетулином продуктов ПОЛ, резко инл>цируемы\ четырех-члористым углеродом, связано, по-видимому, с его определенной ангиоксидангной активностью Не исключено, что подобное действие характерно и для силибора.

По-видимому, антиоксиданшые функциональные группы бетулина встраиваются в мембраны гепатоцитов и превращают [ идроперекиси полиеновых жирных кислот в нетоксичные оксикислоты с обрывом цепей ПОЛ (Бобырев В П и соавт., 1994).

Влияние бетулина на состояние микросомалышх ферментов печени при интоксикации ССЫ изучали по стабильности цитохрома Р-450. которую оценивали по интенсивное ж образования фупкции-онально инертного цитохрома Р-420.

Четырёххлористый углерод вызывал снижение в микросомальной фракции печени уровня цитохрома Р-450 на 60% в результате конверсии в функционально инертный цитохром Р-420. Цитохром Р-450 отравленных животных становился малостабильным, к 10 мин тепловой инкубации в микросомах обнаруживаем только цитохром Р-420

Бетулин существенно превосходит силибор по степени предотвращения конверсии цитохрома Р-450 в Р-420, сохраняя его содержание на уровне нормы По видимому, этот механизм связан, с одной стороны со значительным антиоксидан I пым действием бегулина и его ингибирующим влиянием на фосфолигюлиз. с друюй -поступлением в мембраны 1епатоцитов фосфатидилхолипа и фосфатидилэтаноламипа, что стабилизирует а-егшраль пептидного компонеша циюхрома Р-450

11олученные результаты указывают на то, чго бегулин предупреждав индуцированное четырёххлористым углеродом ПОЛ и снижает скорость продукции малонового диальдегита в микросомах печени Четырёххлористый углерод, создавал картину токсического гепатита при коюром содержание малонового диальтегида возрастало на

212.а диеновых конъюгагов на I 1 6% I ¡рофилактическое вне денис бегу 1ина пред}прежтало нарушение процессов ГЮЛ

Влияние бетулина на течение острого гепатита при токсическом повреждении печени типовым спиртом. С целью моделирования подострого повреждения печени использовали вве (ение 40% эганола крысам в желудок 7 0 мл/кг на протяжении 7 дней В оттичие от других токсикантов, которые моделировали токсический 1спати1. этанол мoдeJтиpoвaJI жировой тдатоз. При изучении биохимических показателей достоверно отмечено влияние бетулина на развитие циюлитического синдрома

Влияние бетулина на состояние индикаюрных ферметов печени представлено на рис 3.

Рис 3. Влияние бегулина на содержание АлАТ и АсАТ при токсическом повреждении печени этанолом.

3,5

Интактные Контроль Бетулин Бетулин Силибор 100 животные (гепатит) 5мг/кг 1мг/кг мг/кг

□ АлАТ, ЕД/л а АсАТ, ЕД/л

При токсическом повреждении печени этанолом бетулин проявил гепагозащитный эффект в дозах I и 5 мг/кг Снижение уровня индикаторных ферментов печени в сравнении с кош рольной группой составило соответственно 28% АлАТ и 60% АсАТ

Влияние бетулина на течение маенхичально-воспалительного синдрома при экспериментальном ¡танолоном гепатите

представ 'юно в габл.З

Таблица 3

Влияние бетулина на 1ечение мезенхимально-воспалительного

синдрома

Группа животных Весовой коэффициент печени, усл. ед. Тимоловая реакция, Ед. Б-11

Интактныс животные 34,0±0,8 1,96+0,04

Контроль (гепатит) 52,0±0,9 2,88+0,14

Бегулин, 1 мг/кг 35,0+0,6* 1,78±0,02*

Бетулин, 5 мт/кг 37,0±0,8* 1,91 ±0,05*

Силибор, 100 мг/кт 40,0±0,4* 1,96±0,06*

Примечание +Достоверно по сравнению с контрольной группой (гепатит), р<0.05

Полученные данные свидетельствуют о наличии у бетулина лечебною влияния на течение мезенхималыто-воспалительного синдрома при экспериментальном этаноловом гепатите

Влияние бетулина на развитие холестатического синдрома при экспериментальном этаноловом гепатите представлено в табл 4.

Из представленных в таблице 4 данных видно, что при введении этанола в качестве гепатогоксина показатель снижения активности щелочной фосфатазы достоверно не отличался в опытных группах и составлял: бетулин 1 мг/кг - 27%, бетулин 5 мг/кг - 26%, силибор 100 мг/кг - 23%.

Снижение триглицеридов сыворотки крови находилось в пределах 58 - 60%, холестерина 32 - 37%, билирубина 19 - 21%

Морфологические изменения печени у крыс, получавших бегулин в дозе 5 мг/кг и силибор характеризовались одинаковой гистологической картиной, лишь незначительно отличавшиеся по

млсппнб) поражения [ енс110ци1ы с тельцами \'1<п юри выявлятиеь не во всех от 1елах тотек а незначительное когичссгво отмечено в параненIрапьных отделах В центре долек имеются единичные поврежденные гепатиты, на периферии - неповрежденные гепатониты (рис.4а).

Т аблица 5

Изменения биохимических показа!елей под влиянием бстулина при этаноловом гепатите

Группы животных Этаноловый г епатит

щелочная фосфагаза, ммоль ч*л холест ераза, м моль/л триглицериды сыворотки, ммоль/л билирубин непрямой, ммоль/л

Интактные 13,8 + 0,6 1,79 ±0,08 1,34 ±0,24 14,6 ± 1,5

Контроль (гепатит) 19,7± 0,3 2,54 ± 0,04 3,12 ±0,15 21,2 ±0,14

Бетулин, 1 мг/кг 14,4 ±0.6* 1,6 ± 0,02* 1,24 ±0,24* 16,8 ±0,9*

Бетулин, 5 мг/кг 14,6 ±0,2* 1,72 + 0,04* 1,31 ±0,18* 17,1 ±0,2*

Силибор, 100 мг/кг 15,1 ±0,4* 1,77 + 0,02* 1,41+0,12* 16,9 ± 1,2*

Примечание. *р < 0,05 по сравнению с контрольными данными

В группе крыс, получавших бетулин в дозе 1 мг/к?. некрозы гепатоцитов 01су тствовали или регистрировались в единичных случаях, лимфоидная инфильтрация слабовыраженная Тельца Маллори не выявлялись. Наблюдалось полнокровие центральных вен и сосудов портальных трактов Все эти данные свидетельс!вуют об отсутствии признаков алкогольного токсического гепатоза и о наличии выраженного генатзащитного эффекта бетулина в дозе 1 мг/кг

Бетулип в значигельной степени редуцировал возникающие при гепатите тискомплексацию печёночных балок. 01ёк вокруг синусоидных гтроаранств. воспали 1ельную инфильтрацию стромы.

белковую. жировую дисфофию и колликвационный некроз гематоциюв (рис.4а.б)

, г. *. ■'-у, * V-. (ч>! ,- ' >£ Ч -ФШ • ' \г' 1 'г Щ^пАшШк *,-*'„" г ■. ■ '.-.«г -.--4». ¡Т^^ЩЩ^ШШ

Рис.4а. Печень крысы, получавшей этанол. Острый алкогольный гепатит. Выраженные дистрофические изменения и очаги некроза. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 180 Рис.4б. Печень крысы, получавшей этанол и бетулин. Слабо выраженные дистрофические изменения и единичные очаги некроза. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х180

Влияние бетулина на течение гепатита, вызванного й-галак-тозамином изучали как на наиболее адекватной модели вирусных поражений печени. Галактозамин вводили животным внутрь один раз в день в течение 4 суток, в дозе 500 мг/кг массы животного. Бетулин вводили крысам внутрижелудочно, в дозе 5 мг/кг массы тела животного, один раз в день, в течение 7 суток.

В качестве препарата сравнения использовали отвар листьев берёзы Введение бетулина и отвара листьев берёзы начинали через 24 часа после введения галактозамина

Одним из критериев оценки функционального состояния 1епаю-цитов при экспериментальном гепатите служит барбитуратовый гест Тиопентал натрия вводили крысам в дозе 33 мг/кг внутривенно в латеральную хвостовую вену О длительное!и наркотического сна судили по продолжительности бокового положения животных

На 8-ой день после поспеанего введения крысам i алактозамина, содержание в сыворотке крови у иоаопытных животных крыс ферментов утпутамилгранспептидазы и щелочной фосфатазы было повышено в 4,1 и 3 раза соответственно

Содержание в сыворотке крови крыс с гадаю озаминовым гепатитом холинэстеразы было достоверно снижено в 1,9 раза, а концентрация гликогена в печени животных уменьшилась в 2,1 раза (табл. 6)

Таблица 6

Влияние бетулина на содержание ферментов в крови, гликогена в нечени при галактозаминовом гепатите

Показатели Препараты у-ПП крови, (еа) щелочная фосфагаза крови, (е а) холин-эстераза крови, (е а ) гликоген печени, i% длительность наркотич сна, мин

Интактныс животные 21,7 ±2,9 6,1 ± 1,3 1067 ±54 2,67 ± 0,22 5,2±0,4

Влияние галактозамина

Контроль (гепатит) 87,3 ±4,5 26,< ±4,1 564 ±36 1,26 ±0,12 49,6 ± 4,9

Бетулин 5 мг/кг 32,0 ±5,9* 14,9 ±1,5* 671 ±41 1,85 ±0,16* 18,4 ±2,7*

Огвар листьев березы 41,8 ±4,9* 14,4 ±1,7* 726 ±38* 2,18 ±0,23* 16,9 ±4,7*

Примечание: * р < 0,05 по сравнению с контролем по критерию Стьюден га (t).

Продолжительность тиопеттталовот о наркотического сна, характеризующего состояние детоксикационной функции печени у подопытных крыс, была достоверно повышена по сравнению со значением этого показателя у интактных животных.

Бетулин и отвар листьев березы досюверно снижали повышенный уровень у-ГТП в сыворотке крови у подопышьтх животных на 63,3% и 52,1%; щелочной фосфатазы - на 43,8% и 45,7%; в 1,45 и 1,73 раза соответственно повысили сниженное содержание гликогена в печени.

Влияние и ¡ученных фи гонренара юв на содержание в сыворотке крови подопытных животных холинэсгеразы. маркера белокситезирующей функции печени, было не столь однонаправленным Г-'сли отвар листьев берёзы увеличивал содержание холинэстсразы в сыворотке крови подопытных животных на 28,7%, то для бетулина отмечена лишь выраженная тенденция к повышению значения данного показателя (19,0%). При этом бетулин и отвар листьев березы достоверно снизили длительность тиопенталового наркотического сна в 2,7 и 2,9 раза соответственно, т е. способствовали восстановлению нарушений детоксикационной функции печени.

Лечебная гепатозащитная активное 1ь бе гул и на при галактозаминовом гепатите, по-видимому, определяется выраженными противовоспалительными свойствами этого природного соединения, выделяемого из коры и листьев берёзы (Карачурина Л Т. и соавт., 2002).

О влиянии бетулина на процессы желчеобразования при токсическом поражении печени парацетамолом судили но изменению интенсивности секреции желчи, концентрации основных её компонентов (мл * 100 г * 4 ч) желчных кислот, холестерина, билирубина, фосфолипидов, а также по изменению концентрации тригидроксихолановых и дигидроксихолановых кислот.

Полученные данные свидетельствуют о выраженных нарушениях желчеобразовательной функции печени при интоксикации парацетамолом. Во все сроки исследования секреция желчи снижалась по сравнению с контролем. Так, снижение количества выделившейся за 4 ч желчи (мл * 100 г) через 1 и 3 сут. составило 33 и 45%, а на 7 сут. наблюдалось частичное восстановление желчеогделения, хотя величина показа!еля не достигала контрольною уровня и оставалась ниже его на 15%.

Наряду со снижением секреции желчи отмечалось снижение концешрации желчных кислот на 40 и 50%, холес1ерина на 39 и 57%, билирубина па 35 и 46% и фосфолипидов на 35 и 52% соответственно в эти же сроки наблюдения.

Профилактическое применение бетулина оказывает благоприятное действие на течение экспериментального гена!и 1а, в результате чею нарушения желчеобразовательной функции печени наблюдалось в

меньшей степени Причем к конц\ срока исс ie ювания (7 с\ i ) происхотило не только полное восстановление же шеобразовательной функции печени, но и в какой-то степени ее стимуляция Так. секреция желчи у животных, получавших бетулин, через ! сут была выше на 25%, чем у нелеченых животных, через 3 сут - на 63% Бетулин способствовал повышению концентрации желчных кислот -важнейших гормоноподобных физиолотически активных веществ, участвующих в i у моральной регуляции организма (Ганиткевич Я В , 1980) "

Уровень желчных кисло! у животных, получавших бетулин, стал выше 1акового на 33% в первые сутки и на 75% на 3 сутки, в сравнении с контрольной группой животных. Как показали результаты исследований, бетулин не только способствовал восстановлению суммарного содержания желчных кислот, а также тригидроксихолановых кислот и дигидроксихолановых кислот, но и приводил к норме их соотношение.

Важную роль играет желчеотделение в обмене билирубина. Одной из причин снижения выделения билирубина (так же как и желчных кислот, хол"стерина, фосфолипидов) с желчью при поражении печени napj .етамолом, является угнетение активности ферментных систем генаюцитов, участвующих в обмене билирубина, особенно цитохрома Р-450 (Саратиков A.C. и соавт, 2002) Усиление компенсаторных процессов при применении бетулина, направленных на снижение гепатотоксичпости парацетамола, способствует нормализации процессов желчеобразования, в том числе обмена билирубина Это подтверждается полученными данными. Так, концентрация билирубина желчи на 3 сут. достигла 86% от контрольного уровня, а па 7 сут восстановилась не только до контрольною уровня, но и в определённой степени была выше его. Полученные данные позволяют заключить, что бетулин способствует восстановлению желчеобразователыюй функции печени, быстрее и более эффективно восстанавливает секрецию желчи и концентрацию в ней жирных кислот, холестерина, билирубина, и фосфолипидов Под его влиянием восстанавливается процесс гидроксилирования желчных кислот, в результате чего нормализуется соотношение три- и дигидроксихолановых кислот(см рис 5).

Рис 5 Влияние бетулина на процессы желчеобразования при интоксикации парацетамолом

(3 сутки)

секреция желчи

ТГОХ

желчные кислоты

' интактные контроль

( холестерин

гепатит

леченный гепатит

билирубин

фосфолипиды

Изучение острой и хронической токсичности. Целью изучения острой токсичности бетулина явилось определение ЬД50 на 2-х видах животных при различных путях введения, а также наблюдение клинической картины острого отравления. Основным критерием токсичности служила гибель животных

Бетулин вводили мышам и крысам внутрь и внутрибрюшинно в дозах 500, 1000, 1500, 2000 и 2500 мг/кг с учетом максимально допустимых объемов введения жидкости для лабораторных животных. При ежедневном наблюдении случаев гибели животных после введения бетулина внутрь и внутрибрюшинно на было, не отмечено изменений общего состояния, а вес животных при 3-х кратном взвешивании в течение периода наблюдения достоверно не изменялся в сравнении с животными контрольной труппы.

Таким обраюм бетулин по сюмснп токсичности можно о шее I и к малотоксичным веществам, ЬП,., ко юрою при энтерапьном и внугрибрюшинном введении составляет 2500 мг/кг

Хронический гоксиколо!ический эксперимент был проведен в весенний период в течение 3-х мсс на 60 крысах линии Вистар, весом 180-260 г. Сроки проведения эксперимента определены в соответсгвии с требованиями "Руководства по экспериментальному (доклиническому) и ¡учению новых фармакологических веществ", М , 2000 г Общетоксичсское действие бетулина изучали при введении внутрь (с помощью зонда) в дозах 1. 10 и 50 мг/к1. Для проведения эксперимента животные были разделены на 4 группы: контрольную и 3 подопытных, по 15 животных в каждой.

Определение различных показателей функции систем и органов животных проводили до введения вещества, а затем каждые 30 дней в течение 3-х месяцев ежедневного введения препарата. Ежедневные наблюдения за животными не выявили каких-либо отклонений их состояния и поведения по сравнению с контрольной группой. Па протяжении всего периода исследования не отмечено случаев спонтанной гибели животных. Изучение динамики веса животных выявило прирост массы тела по отношению к исходным показателям через 1 месяц наблюдения на 9 - 28%; через 2 месяца на 17 34%, через 3 месяца - на 17 - 35% без достоверных отличий между контрольной и подопытными группами.

После ежедневного введения бетулина в течение трех месяцев животных забивали, органы взвешивали, проводили гистомор-фологическое исследование и рассчитывали весовые коэффициенты органов. Анализ весовых показателей не выявил достоверных различий среди всех 4-х групп животных.

Изучение интефальных показателей основных систем организма животных (сердечно-сосудистой, выделительной, дыхательной, центральной и периферической нервной систем) не выявили достоверных изменений при сравнении с контрольной группой животных Месгно-раздражающет о, кожно-резорбтивного,

аллергенною и мутагенного действия обнаружено не было.

'[аким образом, результаты изучения общеюксического действия бетулина на органы и системы организма животных свидетельствуют об отсутствии токсического действия препарата

выводы

1 Установлены ге п ато п роте кто р н ы е и желчегонные свойства, безвредность и безопасность бетулина - вещества, выделенного из коры березы.

2. Биохимические, функциональные и морфологические исследования показали, что бетулин в дозах 1-10 мг/кг предупреждает развитие цитолитического, холестатического и мезенхимально - воспалительного синдромов на моделях острою гепатита, вызванного парацетамолом, четыреххлористым углеродом, этанолом и 0-1 алактозамином, что позволяет отнести его к группе природных гепатопротекторов.

3. Бетулин оказывает влияние на процессы желчеобразования и желчевыделения на фоне парацетамолового гепатита. Отмечено предупреждение снижения общих желчных кислот, билирубина и холестерина и на 4 сутки после интоксикации восстановление интенсивности секреции желчи.

4. Морфогистохимические исследования печени крыс с токсическим

гепатитом, вызванным парацетамолом и этанолом, показали, что бетулин предупреждает деструкцию гепатоцитов,

воспалигельную инфильтрацию в портальных трактах, белковую и мелкокапельную дистрофию гепатоцитов, фокальный колликвационный некроз.

4. Берлин обладает малой гоксичнос!ыо (в дозе 2500 м|/ю не вызывав! гибели животных), не оказывает влияния на общее состояние животных, поведение, функции сердца, печени, почек, на гематологические и биохимические показатели крови и можег быть рекомендован для клинических испытаний в качестве ге па го п роте к гора.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Полученные результаты, свидетельс! вующие о выраженной специфической активности, безвредности и безопасноеж бетулина, являются основанием рекомендовать его в медицинскую практику в качестве гепатопротектора

2. Наличие выраженного желчегонного действия у бетулина, сопряженного с нормализацией состава желчи, позволяет рассматривать его в качестве I епатоиротектора, эффективною е случаях поражений печени, осложненных холестазом.

3. Биологически активньге добавки к пище, содержащие бетулип и зарегистрированные МЗ РФ. мо!ут быть рекомендованы к клиническому изучению в качестве основы диетотерапии как острых, так и хронических заболеваний печени, в т.ч., осложненных холестазом.

4. Биологически активные добавки к пище, содержащие бетулин рекомендуются к применению в качестве алкогольпротекторных средств для профилактики токсических поражений печени этанолом.

5. Биологически активные добавки к пище, содержащие бетулин рекомедуются к применению в качестве средств профилактики токсических поражений печени лекарственными препаратами и промышленными гепатотоксикантами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дьячук Г И.. Вишневецкая ТП, Юрченко И.В , Слернин Ю.И.. Жиганова Т А Влияние бетулина на течение острого отравления этанолом // Материалы X Российскою национального конгресса «Человек и лекарство». М. 2003 С. 590

2. Дьячук Г И., Вишневецкая Т П., Юрченко И.В., Стернии Ю.И , Карлина М В. Гепатопротекторное действие бетулина // Материалы X Российского национального конгресса «Человек и лекарство». М -2003 -С. 605.

3. Дьячук Г.И., Лапкина Г.Я.., Юрченко ИВ.. Стернин Ю.И., Карлина М В. Влияние бе!улина на функциональное состояние печени // Материалы 2-го съезда Российского научного общества фармакологов. - М. - 2003, т И. - С. 301.

4 Дьячук Г И., Вишневецкая Т.П., Юрченко И.В. Изучение желчеобразовательной функции печени при введении бетулина. // Проблемы укрепления здоровья и профилактика заболеваний. Материалы научно-практической конференции. - СПб. 2004. -С 86

5 Юрченко И.В., Карлина М В Разработка новой лекарственной формы бетулина // Проблемы укрепления здоровья и профилактика заболеваний Материалы научно-практической конференции - СПб. - 2004. - С 120.

6 Дьячук Г.И., Шестакова Н.П., Карлина МВ, Юрченко И.В Исследование фармакокинетики бетулина // Вестник СПбГМА им. И И. Мечникова. - 2004. №2 С.107-110.

7. Дьячук Г.И . Юрченко И В., Вишневецкая Т.П., Карлина М В. Изучение гепатопротскгорных свойств бетулина. // Вестник СПбГМА им ИИ Мечникова 2004 - №1(5) - С. 142-145.

»-5196

РНБ Русский фонд

2006-4 3339

Актуальность исследования

В последнее время хронические заболевания печени занимают существенное место среди причин смертности и нетрудоспособности (Соринсон С.Н., 1998). Более того, отмечается тенденция роста числа больных с хроническими поражениями печени, которые распространены преимущественно у лиц работоспособного возраста (Подымова С.Д., 1993). Это обусловлено тем, что условия существования современного человека характеризуются наличием в окружающей среде большого числа химических соединений, вызывающих изменения биологических процессов в печени и приводящих к её токсическому поражению.

Круг веществ, проявляющих гепатозащитные свойства, достаточно велик, однако, в соответствии с современной классификацией лекарственных веществ, из их числа выделяют небольшую группу гепатопротекторов, оказывающих избирательное терапевтическое действие на печень. К ним относятся растительные полифенольные антиоксиданты (легалон, силибор, катерген, валилив), фосфолипидный препарат эссенциале, который проявляет иммуномоделирующие эффекты в условиях острой гепатопатии (Конопля H.A., 2000). Терапевтическая активность названных препаратов не всегда оказывается достаточной. Большинство из применяемых гепатопротекторов являются импортными, что побуждает к поиску новых эффективных отечественных гепатозащитных средств. Особенно велика потребность в гепатозащитных средствах при терапии заболеваний печени токсической этиологии. Гепатотропные токсиканты широко используются в промышленности, сельском хозяйстве, в быту (алкоголь, лекарственные средства и др.) (Bonkovsky H.L. et al., 1996). По данным комитета здравоохранения С-Петербурга (2003) болезни печени с 1997г. возросли в 2,1 раза.

Известно, что в окружающей среде присутствует около 80 ООО гепатотоксических ксенобиотиков с которыми человек контактирует в течение своей жизни. В 30% случаев острых отравлений возникают клинические проявления химического поражения печени, у 7% людей, получивших лекарственные препараты, развивается медикаментозное поражение этого органа (Арчаков А.И., Корузина Н.И., 1988).

Общим для всех форм токсических поражений печени является усиление свободно радикальных процессов и перекисного окисления липидов (ПОЛ), нарушение структуры мембран гепатоцитов и повышение их проницаемости (Костин C.B., 2000).

Поэтому изучение и выявление биологически активных веществ, способных блокировать патологические процессы в печени, является весьма актуальной проблемой.

Исторически в народной медицине широко используются экстракты (как водные, так и спиртовые) различных частей березы (почки, листья, кора), в том числе и для лечения заболеваний органов пищеварения, мочевыделительной системы. Настои и отвары почек и листьев березы известны своими противовоспалительными и ранозоживляющими свойствами при хронических формах экземы, лечении ран, эрозий, пролежней. Эффективными они считаются и при желтухах. Рекомендации по их применению дают не только народные травники, но и официальные медицинские издания («Русская медицинская газета», 1834г.). Береста наряду с листом подорожника использовалась в качестве раневых пластырей. В годы Великой Отечественной войны березовая кора использовалась в пищу как в виде отваров, так и в виде добавок бересты в хлеб.

В задачу нашего исследования входило изучение гепатозащитного действия бетулина - это тривиальное название (Мэзон, 1831) непредельного пентациклического тритерпенового спирта лупанового ряда бетулина -С30Н50О2 или луп-20(29)-ен-3 ß, 28-диола. Бетулин получают экстракцией органическим растворителем наружного слоя коры — бересты наиболее распространенных в России видов берёзы (Betula pubescens, Betula pendula). В бересте бетулин является основным экстрактивным веществом (около 70% по массе) и обеспечивает ее белый цвет.

Цель исследования

Экспериментальное изучение гепатопротекторных и желчегонных свойств бетулина.

Задачи исследования:

1. Изучить защитное действие бетулина при токсическом поражении печени четырёххлористым углеродом.

2. Изучить гепатопротекторное действие бетулина при токсическом поражении печени парацетамолом.

3. Изучить гепатопротекторное действие бетулина при токсическом поражении печени этанолом.

4. Изучить гепатозащитное действие бетулина при D-галактозаминовом гепатите.

5. Изучить репаративные свойства печени, её функциональное состояние и биохимические показатели крови в условиях воздействия бетулина при токсическом поражении печени.

6. Изучить влияние бетулина на процессы желчеобразования и желчевыделения при токсическом поражении печени.

Научная новизна работы

В работе получены новые данные о гепатопротекторном действии бетулина в условиях экспериментальной модели гепатита, вызванного СО4, парацетамолом, этанолом и галактозамином.

Показано, что гепатозащитное действие бетулина связано с нормализующим влиянием на индикаторные ферменты печени (АлАТ, АсАТ), предупреждением выраженности воспалительных процессов в печени, уменьшением показателей холестатического синдрома.

Установлено дозозависимое влияние бетулина на процессы регенерации в печени в условиях токсического ее поражения. Выявлена роль бетулина в реализации антиоксидантных и гепатопротекторных эффектов.

Бетулин восстанавливал секрецию желчи и концентрацию в ней желчных кислот, холестерина, билирубинов и фосфолипидов, восстанавливал процессы гидроксилирования желчных кислот и нормализовывал соотношение три- и дигидроксихолановых кислот.

Научно-практическая значимость

Полученные данные имеют важное научно-практическое значение, поскольку выявленные и изученные гепатозащитные свойства бетулина, представляют его перспективную значимость в качестве нового гепатопротекторного средства.

Установлены выраженные дозозависимые эффекты бетулина на процессы перекисного окисления липидов и физиологической регенерации гепатоцитов в условиях токсического поражения печени.

Экспериментально обоснована возможность использования в практике гепатологии нового гепатопротектора. Материалы по препарату представлены в ФК МЗ РФ с целью получения разрешения на его клинические испытания в качестве гепатопротектора в комплексной терапии гепатитов и гепатозов.

Полученные в работе результаты значительно расширяют представления о спектре биологической активности и возможных механизмах действия бетулина, что позволяет дать теоретическое обоснование его использования в клинической практике.

Получены Регистрационные удостоверения: 004726.Р.643.09.2002. «Берёзовый экстракт сухой - С» - сырье для производства биологически активных добавок к пище (16.09.2002г.). 004820.Р.643.09.2002. «Биологически активная добавка к пище «Бетула - Дэ-токс»».( 16.09.2002г.).

004823.Р.643.09.2002. «Биологически активная добавка к пище «Берёзовый экстракт сухой»». (16.09.2002г.).

Санитарно-гигиеническое заключение МЗ РФ № 77.99.20.937.Б. 000542.04.04. от 13.04.2004г. на биологически активную добавку к пище «Алкощит».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бетулин в дозах 1-10 мг/кг оказывает выраженное гепатопротекторное действие на моделях токсического поражения печени ССЦ, парацетамолом, этанолом и при О-галактозаминовом гепатите.

2. Бетулин оказывает нормализующее влияние на биохимические показатели крови, отражающие метаболизм и функцию печени.

3. Бетулин предупреждает выраженность воспалительных процессов в печени и показатели холестатического синдрома при экспериментальном гепатите.

4. Наиболее выраженный гепатопротекторный эффект по результатам гистоморфологического исследования бетулин проявляет в дозе 1 мг/кг.

5. Бетулин устраняет депрессию желчеобразования и восстанавливает секрецию желчи до уровня нормальных величин при введении парацетамола.

Внедрение в практику результатов исследования

Полученные результаты исследований используются в учебном процессе при преподавании физиологии, фармакологии и терапии для студентов, интернов, клинических ординаторов в СПбГМА им. И.И. Мечникова. Биологически активная пищевая добавка «Берёзовый экстракт сухой», содержащая бетулин, проходит апробацию на отделениях гастроэнтерологии, гепатологии клинической больницы Петра Великого, Св. преподобномученницы Елизаветы, городской инфекционной больницы им. П.И.Боткина, городском противотуберкулёзном диспансере. Результаты исследования специфической активности бетулина, его безвредности и безопасности легли в основу документов, - направленных в Фармакологический Комитет МЗ России для получения разрешения на клинические испытания.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на 2'м Всероссийском съезде фармакологов (Москва, 2003), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), научно-практической конференции аспирантов и молодых учёных СПбГМА (СПб, 2004).

Основные положения диссертации изложены в 7 научных работах местной и центральной печати, в т.ч. 4 статьях.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, включающих 5 разделов, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы.

ВЫВОДЫ

1. Установлены гепатопротекторные и желчегонные свойства, безвредность и безопасность бетулина — вещества, выделенного из коры березы.

2. Биохимические, функциональные и морфологические исследования показали, что бетулин в дозах 1-10 мг/кг предупреждает развитие цитолитического, холестатического и мезенхимально — воспалительного синдромов на моделях острого гепатита, вызванного парацетамолом, четыреххлористым углеродом, этанолом и О-галактозамином, что позволяет отнести его к группе природных гепатопротекторов.

3. Бетулин оказывает влияние на процессы желчеобразования и желчевыделения на фоне парацетамолового гепатита. Отмечено предупреждение снижения общих желчных кислот, билирубина и холестерина и на 4 сутки после интоксикации восстановление интенсивности секреции желчи.

4. Морфогистохимические исследования печени крыс с токсическим гепатитом, вызванным парацетамолом и этанолом, показали, что бетулин предупреждает деструкцию гепатоцитов, воспалительную инфильтрацию в портальных трактах, белковую и мелкокапельную дистрофию гепатоцитов, фокальный колликвационный некроз.

5. Бетулин обладает малой токсичностью (в дозе 2500 мг/кг не вызывает гибели животных), не оказывает влияния на общее состояние животных, поведение, функции сердца, печени, почек, на гематологические и биохимические показатели крови и может быть рекомендован для клинических испытаний в качестве гепатопротектора.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты, свидетельствующие о выраженной специфической активности, безвредности и безопасности бетулина, являются основанием рекомендовать его в медицинскую практику в качестве гепатопротектора.

2. Наличие выраженного желчегонного действия у бетулина, сопряженного с нормализацией состава желчи, позволяет рассматривать его в качестве гепатопротектора, эффективного в случаях поражений печени, осложненных холестазом.

3. Биологически активные добавки к пище, содержащие бетулин и зарегистрированные МЗ РФ, могут быть рекомендованы к клиническому изучению в качестве основы диетотерапии как острых, так и хронических заболеваний печени, в т.ч., осложненных холестазом.

4. Биологически активные добавки к пище, содержащие бетулин рекомендуются к применению в качестве алкогольпротекторных средств для профилактики токсических поражений печени этанолом.

5. Биологически активные добавки к пище, содержащие бетулин рекомедуются к применению в качестве средств профилактики токсических поражений печени лекарственными препаратами и промышленными гепатотоксикантами.