Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка технологии таблетированной лекарственной формы на основе нового полусинтетического производного бетулина, обладающего противотуберкулезной активностью

На правах рукописи

ПОГРЕБНЯК ЛЮДМИЛА ВЛАДИМИРОВНА

Разработка технологии таблетированной лекарственной формы на основе нового полусинтетического производного бетулина, обладающего противотуберкулезной активностью

15.00.01.- Технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЯТИГОРСК 2005

Работа выполнена в Пятигорской государственной фармацевтической

академии

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Семенченко Владимир Федорович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Андреева Ирина Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор Молчанов Геннадий Иванович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Курский государственный медицинский университет

Защита состоится «19» января 2005 г. в ^'Фчасов на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 при Пятигорской государственной фармацевтической академии (357532, г. Пятигорск, пр.Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Пятигорской государственной фармацевтической академии Автореферат разослан

/У » дмсаЦл

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор фармацевтических наук, профессор

Е.В. Компанцева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Изыскание эффективных лекарственных средств на основе природных соединений для профилактики и лечения различных заболеваний относится к числу актуальных проблем современной фармации. Лекарственные препараты, содержащие тритерпеноиды и соответствующие фитокомплексы, обладают широким спектром биологического действия, который связан с влиянием этих соединений на различные группы ферментных систем (каталазу, пероксидазу, карбоксипептидазу, ацетилхолинэстеразу и т.д.). Заслуживает внимания свойство природных тритерпеноидов служить исходным материалом для полусинтеза производных с наиболее выраженным фармакотерапевтическим эффектом. Такой опыт уже имеется в отношении производных глицирризиновой кислоты, создание которых позволило использовать тритерпеноиды солодки в медицинской практике.

Другой перспективной моделью для реализации усиления терапевтического воздействия и расширения спектра фармакологического эффекта являются тритерпеноиды, выделенные из коры березы, в частности, бетулин. Бетулин по химической структуре представляет собой 20(29)-лупен-Зр,28-*диол. Вещество обладает антисептическими свойствами, т.е. может быть использовано как предмет компьютерного прогноза биологической активности, причем в социально значимом и востребованном направлении получения производных, обладающих противотуберкулезным действием.

Использование современных компьютерных технологий при исследовании структурных особенностей отдельных классов природных веществ открывает перспективы теоретического прогнозирования антибактериальных препаратов с ожидаемой активностью с минимальными затратами финансовых и трудовых ресурсов.

Указанные выше направления подтверждают актуальность проводимых исследований.

Цель и задачи исследования. Цель настоящих исследований -разработка таблетированной лекарственной формы для синтезированного на основе целенаправленной химической модификации мажорного тритерпеноида коры березы (бетулина) высокоэффективного антимикробного соединения. Для реализации данной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Предложить оптимальную технологическую схему выделения чистого бетулина (20(29)-лупен-3|3,28-диола) из экстракта коры березы.

2. Теоретически обосновать возможность синтеза на основе бетулина нового вещества с заданным фармакологическим действием.

3. Разработать оригинальный вариант синтеза нового дихлорциклопропанового производного бетулина (циклобет), разработать его технологическую схему.

4. Исследовать токсичность бетулина и циклобета на здоровых животных.

5. Изучить действие циклобета на микобактерии туберкулеза.

6. Установить основные составляющие механизма действия циклобета in vitro и in vivo.

7. Разработать состав и технологию лекарственной формы, содержащей циклобет и обеспечивающей его противотуберкулезный эффект.

8. Разработать методику качественного и количественного определения дихлорциклопропанового производного бетулина (циклобета) в таблетках.

Научная новизна

Разработан оптимальный способ выделения индивидуального бетулина из суммарного экстракта коры березы. Теоретически обоснована возможность синтеза дихлорциклопропанового производного бетулина с противотуберкулезным действием. Впервые осуществлен синтез 19-(2,2-дихлоро-1-метил-циклопропил)-лупан-3,28-диола, который получил рабочее название циклобет. Установлена низкая токсичность бетулина и циклобета, соответствующая по шкале токсичности практически нетоксичным веществам. Впервые изучено влияние циклобета на микобактерии туберкулеза. Выявлено, что по своему противотуберкулезному действию циклобет не уступает аналогичному влиянию официнальных лекарственных препаратов (в частности, рифампицина). Отмечено, что в противотуберкулезном действии циклобета существенное место принадлежит усилению прооксидантной активности. Разработан состав и технология таблетированной лекарственной формы, содержащей циклобет. Установлены особенности технологии производства данного БАВ. Разработана методика контроля качества полученных таблеток

Практическое значение работы

Проведенные исследования выявили противотуберкулезную активность циклобста. Результаты исследований могут служить экспериментальным обоснованием для разработки на основе полученного БАВ новых лекарственных средств для терапии больных туберкулезом, т.е. настоящие исследования посвящены социально значимому направлению в медицине.

Внедрение результатов исследования в практику

Проведена апробация и внедрение результатов исследований на предприятиях: Институт цитологии и генетики РАН и НПР информационных систем и технологий «Сплайн» - акты внедрения научной разработки по наработке субстанции циклобет и использовании методики получения дихлорциклопропановых производных; ООО Квантум Фармасьютикалс - акт внедрения научной разработки на способ прогнозирования противотуберкулезной активности органических молекул, ОАО «Ирбитский ХФЗ» - акт апробации технологии таблеток циклобет. Новизну исследований подтверждает наличие соответствующей приоритетной справки Российского агентства по патентам и товарным знакам Российской Федерации на изобретение: «Дихлорциклопропановое производное пентациклического тритерпеноида бетулина, обладающее противотуберкулезным действием». Разработан проект технических условий на «Производное бетулина из внешней коры березы с мягким туберкулостатическим эффектом, биологически активная добавка».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Результаты апробации технологической схемы выделения чистого бетулина из суммарного препарата путем перекристаллизации в бутаноле.

2. Способ синтеза нового соединения - циклобет - с заданным противотуберкулезным действием путем межфазного дихлорциклопропанирования.

3. Результаты исследований острой токсичности и гепатотоксичности бетулина и циклобета.

4. Данные исследования по противотуберкулезной активности дихлорциклопропанового производного бетулина (циклобета), связанной с прооксидантным эффектом.

5. Результаты исследования и разработки . состава таблетированной лекарственной формы, содержащей циклобет.

Апробация и публикация результатов исследования

Результаты работы доложены на Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2001-2004 гг.), а также на 54-й, 56-й, 58-й, 59-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров ПятГФА (г. Пятигорск, 1999 г., 2001 г., 2003 г., 2004 г.). По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических

наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (№ государственной регистрации 01.99.0010422).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 таблицами и 16 рисунками. Состоит из введения, 7 глав (одна из которых посвящена обзору литературы, 6 - собственным исследованиям), общего заключения, выводов и списка литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Природные запасы тритерпеноида бетулина выражаются многими тысячами тонн. Поэтому, используя современные методы компьютерного прогноза структуры соединений, а также предсказывая тот фармакологический эффект, который новое соединение окажет на организм, можно существенно снизить затраты на поиск новых перспективных противотуберкулезных препаратов.

Исследования проводились с партиями сырья, полученными на лесоскладах г. Пятигорска (каждая партия не менее 5 кг сырья).

Объектами исследования являлись субстанция бетулина, полученная из экстракта коры березы, а также синтетическое дихлорциклопропановое производное бетулина (циклобет).

В главе ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СЫРЬЯ изучены технологические и товароведческие параметры коры березы: количество экстрактивных веществ (34,11%), влаги (5,25%), сульфатной золы (0,45%).

Проведенные ранее исследования показали, что для большинства тритерпеноидов коры березы универсальным растворителем и хорошим экстрагентом является хлороформ. При его отгонке из приемной колбы получалось значительно больше суммарного продукта, чем при экстракции в тех же условиях ацетоном и спиртом этиловым. Этот факт говорит о том, что хлороформ обладает большей растворяющей (экстрагирующей) способностью по отношению к тритерпеноидам коры березы.

Нами предложена технология получения суммарного экстракта из коры березы методом мацерации.

Среднее содержание бетулина в хлороформном экстракте из коры березы составляло 58,33 % при среднем содержании общей суммы тритерпеноидов 35,45 %.

Также была проведена сравнительная оценка методов выделения и очистки субстанции бетулина из суммарного хлороформного экстракта "Бетуленол". Анализ доступной литературы показал, что имеющиеся способы выделения этого соединения трудоемки и дорогостоящи, поэтому нами была разработана новая методика выделения бетулина путем трехкратной перекристаллизации из бутилового спирта, отличающаяся от известных методов высокой степенью чистоты целевого продукта, т.к. предложенный растворитель обладает большей тропностью к бетулину.

На основании этого предложена технологическая схема выделения субстанции бетулина из коры березы, представленная на рис. 1.

g

Температура плавления полученного продукта 252±2°С. Для доказательства строения соединения использовались следующие методы: проба смешения с заведомо чистым образцом бетулина (Sigma) - депрессии температуры плавления не наблюдалось; хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ). Посторонних пятен на хроматограммах не обнаружено, т.е. полученный бетулин имеет хроматографическую чистоту; спектроскопический анализ: регистрировались инфракрасный спектр и спектр магнитного ядерного резонанса на ядрах Н1. Полосы поглощения в ИК-области и химические сдвиги в ЯМР-спектре соответствовали таковым для чистого образца бетулина.

Как упоминалось ранее в литературных источниках, для бетулина выявлен ограниченный спектр биологической активности. Технологическая доступность и структурные особенности бетулина создают все предпосылки для целенаправленной модификации молекулы в желаемом направлении.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ И ТЕХНОЛОГИЯ НАПРАВЛЕННОГО СИНТЕЗА ПРОИЗВОДНЫХ БЕТУЛИНА. С целью поиска химически доступных производных нами был проведен компьютерный фармакологический скрининг 54 производных на основе бетулина, получение которых возможно в одну стадию.

Для прогнозирования были использованы наиболее значимые молекулярные дескрипторы: потенциалы ионизации, сродство к электрону, дипольный момент, теплота гидратации и т.д., всего 149 на каждую молекулу. Дескрипторы были вычислены нами при помощи общедоступных программ МОРАС, DRAGON и GAMESS.

Процедура прогнозирования биологической активности состояла в оценке расстояния между новыми молекулами и молекулами базового набора в п-мерном пространстве их дескрипторов. В базовый набор (обучающую выборку) вошли 1057 молекул современных лекарственных средств, применяемых в медицинской практике и имеющих различное фармакологическое действие.

Среди проанализированных производных бетулина удалось отобрать только одно, сочетающее высокую прогнозируемую алгоритмом MATRIX активность и химическую доступность - 19-(2,2-дихлоро-1-метил-

циклопропил)-лупан-3,28-диол, химическая структура которого представлена на рис. 2

С!

I

Рис. 2.19-(2,2-дихлоро-1-метил-циклопропил)-лупан-3,28-диол (циклобет)

В результате машинного эксперимента было выяснено, что ближайшим аналогом вещества циклобет является препарат салюзид, на четвертой позиции (после дактиномицина (противоопухолевый препарат) и госсипола (противовирусного препарата) находится солютизон. Попадание в число ближайших соседей сразу двух лекарственных веществ из одной фармакологической группы определило приоритеты дальнейшего экспериментального скрининга в направлении исследования именно противотуберкулезного эффекта.

Таблица 1.

Прогноз биологической активности бетулина и циклобета (I) (курсивом выделены лекарственные препараты с антимикробным

действием)

ЛЕКАРСВЕННЫИ АКТИВНОСТЬ БЕТУЛИН 1

ПРЕПАРАТ (дистанция) (дистанция)

Салюзид Противотуберкулезное средство 65387 217

Дактиномицин Противоопухолевый антибиотик 66931 520

Госсипол Противовирусная активность 69656 1707

Солютизон Противотуберкулезное средство 71016 2303

Кислота фолиевая Анаболическое средство 60427 2329

Метотрексат Антиметаболит фолиевой кислоты 60329 2369

Тиоацетазон Прптивотуберкулезное средство 72673 3024

Кломифенцитрат Антиэстрогенное средство 58081 3345

Фурагин Противомикробное средство (ШСД) 57867 3445

Цефоперазон Антибиотик (гр. цефалоспоринов) 56874 3868

Дантролен Противосудорожная активность 75769 4369

Рутин Витамин Р 54223 5028

Фтивазид Противотуберкулезное средство 53685 5261 1

Фурацилин Противомикробное средство (ШСД) 53183 5489

ЛЕКАРСВЕННЫЙ АКТИВНОСТЬ БЕТУЛИН I

ПРЕПАРАТ (дистанция) (дистанция)

Празозин Антагонист альфа 1-адренорецепторов 52447 5801

Диэтилстильбэстрол Эстрогенное средство 51948 6021

Тамоксифен Антиэстрогенное средство 80876 6594

Акрихин Противомалярийное средство 50602 6605

Фтазин Противомикробное средство (ШСД) 50377 6703

Цефтриаксон Антибиотик (гр. цефалоспоринов) 50267 6749

Кверцетин Витамин Р 49073 7275

Флавастатин Ингибитор ГМГ-КоА редуктазы 47253 8065

Феникаберан Ингибитор фосфодиэстеразы 46829 8250

Этацизин Блокатор № каналов (антиаритмик) 46324 8469

Мебендазол Антигельминтное средство 45280 8926

Триамтерен Калийсберегающий диуретик 45125 8995

Доксазозин Антагонист Альфа 1-адренорецепторов 44895 9092

Пипотиазин Антагонист 02 рецепторов 44345 9338

Нами была разработана методика синтеза целевого соединения: 10 г бетулина растворяют в 300 мл хлороформа, добавляют 0,5 г триэтилбензиламмония хлорида, 100 мл водного раствора натрия гидроксида и перемешивают реакционную смесь в течение двух часов. Далее содержимое колбы разбавляют большим объемом воды, отделяют органический слой и промывают его водой до нейтральной реакции. Хлороформный слой сушат над натрия сульфатом и отгоняют растворитель на роторном испарителе. Темный маслообразный остаток растворяют при нагревании в 100 мл спирта изопропилового, добавляют 2 г активированного угля и фильтруют в горячем виде. Через два часа в растворе появляется осадок, представляющий собой непрореагировавший бетулин, который отделяют, а из фильтрата спирт изопропиловый отгоняют в вакууме на водяной бане до небольшого объема. Маслообразный остаток растворяют при нагревании в минимальном количестве углерода четыреххлористого (около 50 мл) и кристаллизуют при комнатной температуре. Через два часа продукт отделяют и сушат. Выход - 3,37 г (28%).

ТШ1=293-4°С (ССЦ).

Полученное вещество имеет рабочее название - циклобет. Строение целевого продукта подтверждено методом ЯМР-'Н спектроскопии (Рис. 3,4). Так, в спектре исходного бетулина присутствуют два дублета при 4,6 м.д., соответствующие олефиновым протонам. Эти сигналы отсутствуют в спектре конечного соединения, что в сочетании с данными элементного анализа однозначно доказывает структуру продукта реакции.

Рис. 4. Н'-ЯМР спектр бетулина

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БЕТУЛИНА И ЕГО СИНТЕТИЧЕСКОГО ДИХЛОРЦИКЛОПРОПАНОВОГО

ПРОИЗВОДНОГО (ЦИКЛОБЕТА). При изучении острой токсичности бетулина и циклобета нами установлено, что оба соединения относятся к практически нетоксичным веществам. Для дальнейших экспериментов были выбраны дозы 50 мг/кг, что составляет 1/100 от ориентировочной ЬОзо, равной 5000мг/кг.

Изучение гепатотоксичности [по В.В.Гацуре] показало, что бетулин в дозе 50 мг/кг привел к недостоверному укорачиванию сна по сравнению с контрольными животными, а циклобет в дозе 50 мг/кг увеличил продолжительность сна на 5,4 %. Полученные результаты свидетельствуют, что бетулин не обладает гепатотоксичностью, а циклобет в дозе 50 мг/кг обладает незначительной тенденцией к угнетению микросомальных ферментов печени.

Испытание циклобета на противотуберкулезную активность показало, что в 45% случаев произошло угнетение микобактерии туберкулеза (рис 5.)

□ Стрептомицин

■ Изониазид ПКанамицин

□ Рифампицин

■ Этамбутол шПротионамид

■ Циклобет

Рис. 5. Сравнительный анализ действия противотуберкулезных препаратов и циклобета в отношении штаммов МБТ

Полученные результаты этих опытов послужили основанием для продолжения исследований по выявлению механизма действия циклобета, описанные в главе ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ НОВОГО ДИХЛОРЦИКЛОПРОПАНОВОГО ПРОИЗВОДНОГО БЕТУЛИНА

(ЦИКЛОБЕТА).

В числе особенностей следует отметить легкость растворения циклобета в спирте этиловом и других органических растворителях, что значительно облегчает проведение эксперимента и, безусловно, является положительным кинетическим фактором.

Изучение влияния циклобета на микрофлору кишечника показало, что исследуемое вещество не подавляет нормальную микрофлору кишечника.

Исключение составляли бактерии Bacillus subtilis, или сенной палочки. В ходе эксперимента наблюдалось выраженное подавление роста В. subtilius по сравнению с контролем. Во всех остальных случаях задержка роста бактерий была вызвана использованием ДМСО в качестве растворителя. Следовательно, возможен длительный прием БАВ без применения специальных средств для нормализации деятельности желудочно-кишечного тракта.

Циклобет, являясь веществом с высоким коэффициентом липофильности, по-видимому, локализуется там, где расположены субстраты - мишени атаки свободных радикалов и пероксидов, наиболее уязвимые для процессов перекисного окисления биологические структуры. К числу таких структур относятся, прежде всего, биологические мембраны и липопротеины крови, а основными мишенями в них являются ненасыщенные жирные кислоты.

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что циклобет обладает прооксидантной активностью и способствует ускорению цепных реакций пероксидации.

Предположительно, прооксидантный эффект циклобета связан с его способностью реагировать с молекулами - ловушками свободных форм кислорода, приводя к блокированию их действия. Но, дихлорциклопропановая группировка, являясь акцептором активного кислорода, может реализовывать и антиоксидантное действие, реагируя с синглетным кислородом по схеме (рис.

Рис. 6. Реакция дихлорциклопропановой группы с синглетным кислородом

Возможность проявления антиоксидантного эффекта наблюдалась нами при проведении испытания in vitro (рис. 7)

I

i Антиоксидантная активность

' производного бетулина in vitro

i L. I

' О О I

а о ¡ i

« 3

! T О ,

£ СО I

t; «о ,

о 5 • *

-60 -4

Рис. 7. Зависимость антиоксидантной активности циклобета от дозировки

Как следует из экспериментальных данных, в дозе свыше 5х104Г проявляется антиоксидантный эффект, причем максимум приходится на дозировку именно Ю"' Г, понижение ПОЛ при которой составило 7,47% по сравнению с контролем (Р>0,05). При этом антиоксидантный эффект заметно меньше прооксидантного, проявляющегося в дозе 10"4. Следовательно, циклобет характеризуется двойной анти прооксидантной активностью, направленность которой зависит от дозировки (рис. 7).

Результаты опытов in vivo не показывают антиоксидантной активности, т.к. в дозе 50 мг/кг вещество является прооксидантом.

Угнетение микобактерий туберкулеза, по-видимому, связано с прооксидантным эффектом циклобет. Известно, что микобактерия окружена восковой оболочкой. Накапливаясь в ней, вещество-прооксидант ускоряет ПОЛ в мембране микобактерии, что приводит к угнетению ее жизнедеятельности.

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ ТАБЛЕТОК ДИХЛОРЦИКЛОПРОПАНОВОГО ПРОИЗВОДНОГО БЕТУЛИНА (ЦИКЛОБЕТА). Для разработки оптимальной лекарственной формы циклобета нами были изучены основные технологические свойства порошка (прессуемость, сыпучесть и сила выталкивания таблеток из матрицы), а также определена доза исследуемого вещества в одной таблетке.

Содержание действующего вещества в таблетке рассчитывали по рекомендациям Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Но установленная доза - 0,6 г, с учетом неудовлетворительных технологических качеств субстанции (плохая сыпучесть, малая насыпная масса, плохая прессуемость) не может быть помещена в одну таблетку, т.к. требуется добавка вспомогательных веществ, а, следовательно, таблетка будет слишком велика для проглатывания. Поэтому рассчитанную дозу циклобета разделили на два приема (по 0,3 г).

Нами также был изучен фракционный состав шести серий порошка циклобета. В результате проведенных исследований оказалось, что субстанция не вся пригодна для прямого прессования. Частицы размером более 0,5 мм должны быть подвергнуты измельчению, иначе наблюдаются значительные колебания в массе таблеток, и нарушается точность дозирования.

В результате эксперимента было выяснено, что порошок циклобета обладает недостаточной сыпучестью (1,3 г/с), малой насыпной массой (0,41 г/см3) и «средней» прессуемостью, что свидетельствует о невозможности выполнять технологию прямым прессованием. При этом при определении прессуемости оказалось, что из чистой субстанции не удаётся получить таблетку, удовлетворяющую требованиям общей фармакопейной статьи на таблетки по механической прочности.

При определении распадаемости таблеток, полученных из субстанции циклобета при давлении прессования 120 МПа, было установлено, что все анализируемые таблетки сохранили свою целостность при наблюдении в течение 30 минут, что не соответствует требованиям Государственной фармакопеи. Следовательно, необходимо введение стадии влажного гранулирования порошка циклобета.

Из анализа полученных данных (табл. 2) следует, что использование растворов ВМВ для грануляции циклобета позволило увеличить сыпучесть и насыпную массу гранулятов, прочность модельных таблеток, однако распадаемость и давление выталкивания не соответствовали нормам. При разработке условий влажного гранулирования для дальнейших исследований нами был использован 5% крахмальный клейстер.

Таблица 2

Результаты определения технологических характеристик гранулятов и модельных таблеток циклобета (х, п=6)

№ Наименование показателя Наименование увлажнителя

Спирт этиловый 10% спирт, р-р ПВП с/м 3% р-р МЦ-16 5% крахмал, клейстер

1. Сыпучесть (г/с) 5,6 6,4 6,8 7,5

2. Насыпная масса (г/см3) 0,48 0,51 0,54 0,57

Давление выталкивания (МН/м2) 18,4 20,5 21,4 22,2

4. Прочность на раскол (Н) 51,4 68,5 72,5 73,5

5. Распадаемость (мин.) 32,5 25,6 28,2 24,5

На таблетках наблюдались сколы, шероховатость боковой поверхности. В связи с этим необходимо было провести выбор наполнителей и антиадгезионных добавок, улучшающих эти свойства. Для устранения этих недостатков мы использовали в качестве антиадгезионной добавки стеарат кальция. В результате проведенных исследований было выяснено, что наиболее интенсивное снижение силы выталкивания происходило до содержания в таблетируемой массе кальция стеарата, равного 0,625%. Указанное содержание взято нами за основу при составлении таблеточной смеси.

В качестве солюбилизатора и средства, улучшающего распадаемость таблеток в состав модельной смеси был введен натрия додецилсульфат (ТУ 609-10-1405-79).

Учитывая все вышеизложенное, нами была разработана модельная пропись таблеток, при реализации которой таблетки отвечают всем требованиям Государственной Фармакопеи (статья «Таблетки).

Состав на одну таблетку:

(г)

0,3000 0,110 0,003 0,003 0,110 0,526

циклобет

лактоза

натрия додецилсульфат кальция стеарата

крахмал кукурузный

средняя масса

Технологическая схема производства таблеток представлена на рис. 8

Качественный анализ циклобета в таблетках проводили по разработанной нами методике, включающей два этапа определения: на хлорид-ион - после сжигания в муфельной печи - серый осадок с раствором серебра нитрата; на тритерпеновое ядро - спектрофотометрия в УФ-области поглощения раствора субстанции от 220 до 320 нм максимум должен находиться при длине волны

(245±2) нм.

Определение количественного содержания циклобета в таблетках проводили по разработанной нами методике, в основе которой лежит метод спектрофотометрического определения, предложенный профессором Э.Т. Оганесяном для тритерпеноидов. Максимум поглощения в УФ-области спектра находится при 310 нм и не изменяется при введении в молекулу терпена дихлорциклопропановой группировки, т.к. в основе циклобета находится ядро бетулина. Количественное содержание циклобета, растворенного в концентрированной серной кислоте, определяли на спектрофотометре после извлечения его из точной навески таблеточной массы хлороформом.

После проведения испытаний с целью установления срока годности таблеток методом «ускоренного старения» следует, что таблетки циклобета после хранения при температуре 60°С эквивалентны 3,5 годам хранения в естественных условиях и соответствуют предложенным нами требованиям к качеству (внешний вид, прочность на истирание, распадаемость, средняя масса и содержание действующего вещества). Срок годности может быть установлен 3,5 года.

ВР 1.1. Обработка производственных помещений

ВР 1.2 Санитарная подготовка

ВР1.3 Подготовка воздуха

ВР2.1.

Взвешивание

ВР 2.2.

Измельчение

вр

23

Просеивание сырья

ВР 24.

Подготовка увлажнителя

ТП 3.1.

Смешивание и увлажнение

ТП 3.2.

Влажное гранулирование

ТП 33

Сушка гранулята

ТП 4.1 Таблетирование

ТП 4.2. Обеспылевание таблеток

ТП 4.3. Регенерация таблеток

ВР 1

Санитарная подготовка производства

Подготовка сырья

ВР2

Получение массы для таблетирования

ТПЗ

Сухое гранулирование к-

ТПЗ 4.

^^Отхода^

Потери мехакичес кие

^-

Потери \ [ механичес ]

Таблетирование и

отбраковка

таблеток-ядер

ТП

4

УМО 5

Упаковка, фасовка, оформление

Рис 8 Технологическая счема производства таблеток

Общие выводы

1. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена технологическая схема выделения субстанции бетулина из внешней коры березы, позволяющая получать продукт с высоким выходом и низкой себестоимостью.

2. Проведены квантово-химические расчеты бетулина и его 50 химических модификаций. Полученные молекулярные дескрипторы использованы для компьютерного скрининга на основе многомерного анализа данных. Результаты прогнозирования биологической активности позволили выбрать наиболее перспективные соединения из числа производных бетулина.

3. Впервые осуществлен направленный синтез нового соединения и методом Н'-ЯМР доказана структура 19-(2,2-дихлоро-1-метил-циклопропил)-лупан-3,28-диол, для которого была теоретически выявлена противотуберкулезная активность.

4. Проведено исследование общей острой токсичности и специфической гепатотоксичности нового дихлорциклопропанового производного (циклобета). Показано, что циклобет относится к практически неопасным веществам, а в терапевтической дозе 50 мг/кг приводит к несущественному угнетению активности микросомальных ферментов печени.

5. Экспериментально доказана эффективность циклобета в отношении больничных штаммов микобактерий туберкулеза в дозе 20 мг/мл (аналогично рифампицину) в 95% случаев.

6. Выявлен механизм действия циклобета на микобактерии туберкулеза, предположительно связанный с экспериментально показанной прооксидантной активностью. Доказана возможность проявления исследуемым соединением как прооксидантного, так и антиоксидантного эффекта.

7. Разработан состав и предложена технологическая схема получения таблеток циклобета. В качестве вспомогательных веществ предложены лактоза, натрия додецилсульфат, крахмал и кальция стеарат. Основными

этапами производства являются смешение, влажное гранулирование и прессование.

8. Разработана методика количественного определения циклобета в таблетках методом спектрофотометрии, установлены нормы качества, а также срок годности таблеток (3,5 года).

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Погребняк Л.В., Семенченко В.Ф.. Оптимизация процесса выделения 20(29)-лупен -Зр,28-диола из экстракта внешней коры березы и перспективы его использования в фармации. - Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров /54; 1999; Пятигорск/: Материалы ...- Пятигорск: ПятГФА, 1999.-С.31.

2. Погребняк Л.В., Василенко Ю.К., Погребняк А.В. Молекулярный механизм гипохолестеринемического действия производных 20(29)-лупен-3,28-диола. - Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров /54; 1999; Пятигорск/: Материалы ...- Пятигорск: ПятГФА, 1999.- С. 138.

3. Погребняк Л.В., Семенченко В.Ф., Погребняк А.В.Выделение и фармацевтические перспективы применения 20(29)-лупен- диола из внешней коры Bctula pendula Roth. - Фармация в XXI веке: инновации и традиции: Тез. докл. междунар. конф. (7-8 апреля 1999; - Санкт-Петербург). СПб.:СПХФА, 1999.-С. 191.

4. Компьютерное прогнозирование и синтез нового производного пентациклического тритерпеноида бетулина. / Погребняк Л.В., Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Оганесян Э.Т. и др. // - Человек и лекарство: Тез. докл. VIII Российск. нац. конгр. (11-15 апреля 2001). - М., 2001.- С.604.

5. Практические результаты использования данных о квантово-химическом строении молекул 1060 современных лекарственных средств. /Оганесян Э.Т., Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Погребняк Л.В. и др.// - Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров /56; 2001; Пятигорск/: Материалы ...- Пятигорск: ПятГФА, 2001.- С. 115.

6. Компьютерный прогноз и направленный синтез нового производного бетулина, обладающего противотуберкулезным действием /А.В. Погребняк, Ю.К. Василенко, Э.Т. Оганесян, А.А. Глушко, Л.В. Погребняк и др.// Хим.-фармац. журн. - 2002. - Т.36. - № 10. - С.71 -73.

7. Погребняк Л.В., Глушко А.А., Гужва Н.Н., Богдашев Н.Н, Погребняк А.В. Теоретическое прогнозирование биологической активности коричных кислот и тритерпеноидов с использованием квантово-химических параметров.- Пятигорск: ПятГФА, 2003.- 20 с. Деп. в ВИНИТИ 17.04.2003.

№745-В2003. Аннотировано: Деп. науч. работы.- 2003.- № 6(376).- С.15.-Реф. №115.

8. Погребняк Л.В., Василенко Ю.К.. Прооксидантная активность дихлорциклопропанового производного бетулина. - Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров /58; 2003; Пятигорск/: Материалы ...- Пятигорск: ПятГФА, 2003.- С. 357-358.

9. Погребняк А.В., Погребняк Л.В., Глушко А.А., Богдашев Н.Н.. О практическом использовании системы прогнозирования биологической активности «Matrix». - Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров /58; 2003; Пятигорск/: Материалы ...- Пятигорск: ПятГФА, 2003.- С. 360.

10. Компьютерная программа MSpace: опыт практического использования для моделирования и дизайна биологически активных веществ и лекарственных форм /А.В. Арльт, Н.Н. Богдашев, А.А. Глушко, Л.В. Погребняк и др., всего 14 чел./ - Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов (Пятигорская государственная фармацевтическая академия). - Вып. 59. - Пятигорск, 2004. - С.244-246.

Разработка технологии таблетированной лекарственной формы на основе нового полусинтетического производного бетулина, обладающего противотуберкулезной активностью

ПОГРЕБНЯК ЛЮДМИЛА ВЛАДИМИРОВНА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать ^¿-.2004. Формат бумаги 60x84 1/16. Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная Усл. печ. л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ № 11В0 Пятигорская государственная фармацевтическая академия 357533, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11

/