Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Клинико-экспериментальная оценка противовоспалительных свойств бетулина

На правах рукописи

Сергеев Дмитрий Владимирович

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ БЕТУЛИНА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 ЯНВ 2013

Санкт-Петербург - 2012

005048580

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Дьячук Георгий Иванович Официальные оппоненты:

Родичкин Павел Васильевич, доктор медицинских наук профессор

ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ,

старший преподаватель кафедры военной психофизиологии

Крауз Владислав Алексеевич, доктор медицинских наук профессор

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая

академия» МЗ РФ, профессор кафедры фармакологии

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН (Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится 2013 года в_ часов на заседании

диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, д. 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, д. 6).

Автореферат разослан

декабря 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор

Богомолов Борис Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время активно ведется поиск и изучение различных лекарственных средств растительного происхождения. Фитопрепараты популярны как среди врачей, так и среди пациентов, поскольку по общепринятому мнению их эффективность и безопасность проверены временем (Stickel et al., 2005; Christen, Cuendet, 2012). Тем не менее, лишь небольшое количество средств растительного происхождения обладают выраженной эффективностью и широким спектром активности с минимальными побочными эффектами (Seeff, 2007). В связи с этим большой интерес представляет изучение активности тритерпеновых соединений из коры березы и в первую очередь наиболее распространенного из них - бетулина, обладающего разнообразными фармакологическими эффектами (Барнаулов О.Д., 1986; Дьячук Г.И. с соавт., 2004; Weckesser et al., 2010). В частности, противовоспалительная активность бетулина опосредована его репаративным, антиоксидантным, противомикробным и противовирусным действием (Иванова С.А. с соавт., 2004; Радькова Е.А., 2007; Носик H.H. с соавт., 2005; Szuster-Ciesielska et al., 2010). Также известно, что противовоспалительная активность бетулина значительно превышает таковую у нестероидных противовоспалительных средств (Рапп O.A., 1993). Все это обусловливает необходимость оценки противовоспалительного действия бетулина при различных вариантах воспаления, в том числе у больных хроническим гепатитом С.

Проблема вирусных гепатитов с гемоконтактным путем передачи не утратила своей актуальности. Хотя на первое место среди парентеральных вирусных гепатитов выходит гепатит В, которым инфицировано порядка 2 млрд. человек на земном шаре (Шахгильдян И.В. с соавт., 2003), но лидерство постепенно переходит к HCV-инфекции (Шахгильдян И.В. с соавт., 2008). По данным ВОЗ, что во всём мире вирусом гепатита С инфицировано 500700 миллионов человек, что составляет около 10% населения земного шара (Аналитический обзор «Вирусные гепатиты в Российской Федерации», 2008; Maghlaoui, 2012). В России число инфицированных HCV составляет около 5 млн. человек (Михайлов И.В., Шахгильдян И.В., 2007). В то же время имеется высокая вероятность хронизации (80%), а также развития цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы как исхода HCV-инфекции (de Oliveria Andrade et al., 2009). Основным направлением лечения гепатита С является этиотропная терапия комбинацией препаратов интерферона и рибавирина (Козлов В.К. с соавт., 2008). Стандартная терапия хронического гепатита С пегилированными формами интерферона-а и рибавирином приводит к элиминации вируса у 50% больных, инфицированных 1-м генотипом HCV, и у 80% пациентов, инфицированных 2-м и 3-м генотипами вируса (Zeuzem, 2008), что показывает относительную устойчивость вируса гепатита С к этиотропной терапии. Помимо того, этиотропная противовирусная терапия имеет множество

нежелательных побочных эффектов (Pockros, 2012), делая невозможным её применение у ряда пациентов.

Латентное течение HCV-инфекции, отсутствие методов специфической профилактики и, кроме того, высокая стоимость этиотропной терапии и невысокая эффективность в случае хронизации гепатита С, повышают необходимость поиска новых методов патогенетического лечения этого заболевания с участием гепатопротекторов. Желательным для данной категории веществ является наличие противовоспалительных свойств в сочетании с минимальными побочными эффектами.

Все это послужило основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования

Изучить противовоспалительные свойства бетулина и в экспериментальных и клинических условиях обосновать его применение.

Задачи исследования

1. На модели полнослойной кожно-плоскостной раны у крыс изучить противовоспалительные и репаративные свойства бетулина с дальнейшей их оценкой на модели ожогов уха кролика.

2. Изучить влияние бетулина на различные фазы воспалительного процесса на модели «ватной гранулемы».

3. Оценить бактерицидные свойства бетулина на культурах микроорганизмов S. aureus, В. cereus, P. aeruginosa и Е. coli.

4. На модели D-галактозаминового гепатита у крыс оценить гепатопротекторное действие бетулина.

5. Оценить динамику клинико-лабораторных, молекулярно-биологических (вирусную нагрузку при различных генотипах) показателей и антиоксидантное действие бетулина у пациентов с хроническим гепатитом С.

Личный вклад автора

Личное участие автора осуществлялось на всех этапах подготовки и проведения научной работы, включавших определение основной идеи исследования и методов его выполнения. Автором самостоятельно проведен аналитический обзор современной зарубежной и отечественной литературы, выполнены все экспериментальные исследования и комплексное клиническое обследование пациентов, включенных в исследование с оценкой и анализом результатов их обследования.

Научная новизна работы

В данной работе получены новые данные о противовоспалительной активности бетулина в различных концентрациях на моделях полнослойной кожно-плоскостной, ожоговой раны, модели «ватной гранулемы», а также о

гепатопротекторном действии на модели Б-галактозаминового гепатита и у больных хроническим гепатитом С с цитолитическим синдромом.

Впервые показано, что противовоспалительное действие бетулина в эксперименте обусловлено как специфическим ранозаживляющим, противоожоговым, антиэкссудативным и антипролиферативным действием, так и бактерицидной активностью преимущественно в отношении грамотрицательных микроорганизмов.

Установлены наиболее эффективные концентрации бетулина, обладающие выраженным противовоспалительным и репаративным действием. Впервые установлено, что гепатопротекторное действие бетулина при Б-галактозаминовом гепатите обратно пропорционально его концентрации.

В клинике установлено, что бетулин нормализовал активность АЛТ и снижал уровень РНК вируса гепатита С в плазме крови больных хроническим гепатитом С, проявляя гепатопротекторную и противовирусную активность.

Практическая значимость работы

Данные, полученные в результате проведенного исследования, позволили рекомендовать включение бетулинсодержащих мазей в схему лечения раневых и ожоговых процессов, а также определить оптимальную концентрацию бетулина и состав мазевой основы.

Полученные экспериментальные данные о наличии у мазевых композиций, содержащих бетулин, противовоспалительного и репаративного эффектов могут представлять практический интерес в области хирургии и косметологии.

Экспериментально и клинически обоснована возможность использования бетулина в практике гепатологии в качестве нового гепатопротектора с противовирусной активностью.

Данные о гепатопротекторной и противовирусной активности бетулина легли в основу методических рекомендаций «Бетулин - новый гепатопротектор в терапии легочного туберкулеза и вирусных поражений печени».

Основные положения выносимые на защиту

1. Бетулинсодержащие мазевые композиции обладают противовоспалительной активностью на различных моделях (раны, ожоги, «ватная гранулема»), при этом оптимальная концентрация бетулина в мази составляет 0,5%.

2. Низкая противомикробная активность бетулина в отношении грамположительных микроорганизмов и его плохая растворимость обусловливают необходимость комбинировать бетулин с антисептиком, обладающим поверхностной активностью.

3. Гепатопротекторное действие бетулина при Б-галактозаминовом гепатите в эксперименте обратно пропорционально его концентрации.

4. Применение препаратов на основе бетулина оказывает положительное влияние на динамику цитолитического синдрома, активность ферментов антиоксидантной системы и вызывает снижение вирусной нагрузки у больных ХГС, не вызывая каких-либо нежелательных явлений.

Апробация работы и публикации

Основные положения работы доложены на 81-й конференции, посвященной 80-летию образования СНО в СПбГМА им. И.И. Мечникова «Человек и здоровье 2008» (Санкт-Петербург, 2008); 7 международном симпозиуме гепатологов Беларуси «Актуальные вопросы гепатологии» (Витебск, 2008); научно-практической конференции «Исследования и разработки по приоритетным направлениям в медицине» (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Болезни печени в клинической практике» (Харьков, 2009); научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Современные аспекты инфекционной патологии» (Астрахань, 2009); научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины и биологии» (Санкт-Петербург, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 - в рекомендованных ВАК журналах, из них одна статья в иностранном журнале.

Реализация работы

Результаты исследования используются в лечебной работе отделения экспериментальной терапии хронических вирусных гепатитов специализированной клиники ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, внедрены в научный процесс лаборатории токсикологии Федерального государственного учреждения науки "Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГУН ИТ ФМБА России).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 24 таблицы и 31 рисунок. Библиография включает 221 источник, в том числе 58 отечественных и 163 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все животные, необходимые для проведения экспериментальных исследований, получены из питомника «Рапполово» РАМН (Ленинградская область). В работе использован 95% бетулин (С30Н50О2, мол. масса (FW) -442,7), производства ЗАО «СНС-фарма», Санкт-Петербург, экстрагированный

из бересты берёзы обычных для территории России видов (Bettila pabescens, Betula pendula).

Ранозаживляющие свойства бетулина изучали на 170 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г на модели кожно-плоскостных ран (в нашей модификации). Опыты проводили в 4 серии с интервалами в 2 недели. В каждой серии животных делили поровну - на 5 групп. Каждой крысе на спине выстригали участок площадью 800 мм2. Затем на этом участке под эфирным наркозом по трафарету вырезали кожу до фасции в виде овала площадью 400 мм2. В опыте использовали мази с содержанием бетулина 0,2, 0,5 и 5%. Помимо бетулина в состав мазевых композиций входили: гекторит - 5 0 (для 5% мази — 4,0) и катамин АБ (бензалкония хлорид) 0,1% до 100,0. Для сравнения эффективности использовали известную ранозаживляющую мазь, содержащую метилурацил в концентрации 10% (МУМ).

Противоожоговые свойства изучали на 15 кроликах путём прижатия к выстриженному участку наружной поверхности уха на 10 с раскалённого до 150 °С цилиндрического стержня диаметром 1 см. Опытной группе ожоги обрабатывали 0,5% бетулиновой мазью. Препаратом сравнения служил официнальный противоожоговый крем «Пантенол», содержащий пантотеновую кислоту как основное действующее вещество.

Все использованные в эксперименте мазевые композиции (10% метилурациловая, а также 0,2, 0,5 и 5% бетулиновые мази, крем «Пантенол») наносили на раневую (ожоговую) поверхность со вторых суток ежедневно вплоть до полного заживления.

Активность препаратов оценивали по скорости сокращения раневой (ожоговой) поверхности, срокам отхождения струпа (характеру гиперемии в различные сроки), гистологической картине раневого процесса на 7, 14 и 21 сутки, (ожогового процесса на 3, 8 и 13 сутки) и по срокам полного заживления ран (ожогов).

Для определения скорости сокращения площади раневой (ожоговой) поверхности и величины гиперемии использовали планиметрический метод в модификации JI.H. Поповой (1942).

Для морфологического исследования образцы материала фиксировали в 10% нейтральном формалине, затем обезжиривали и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, заливали в парафин и изготавливали гистологические препараты с толщиной срезов 3-5 мкм с использованием стандартного оборудования и реактивов для парафиновой проводки. Для получения обзорных препаратов срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты изучали при помощи светооптического микроскопа JIOMO МИКМЕД 5 при увеличении хЮО и х200. Микрофотографирование препаратов проводили при помощи цифровой фотокамеры Nikon D70s.

Влияние бетулина на экссудативную и пролиферативную фазы воспалительного процесса изучали на 24 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г на модели «ватной гранулемы». Всем животным под легким эфирным наркозом, в области спины выстригали шерсть и в

асептических условиях ножницами делали продольный разрез кожи и подкожной клетчатки длиной 1-1,5 см. Затем пинцетом в подкожную клетчатку имплантировали стерильный ватный шарик массой 15 мг (М0), после чего на рану накладывали швы. Животные были разделены на 3 группы: контрольную, получавшую аппликации мазевой основы (катамин АБ 0,1%), опытную с использованием 0,5% бетулиновой мази и группу сравнения, получавшую 0,5% преднизолоновую мазь. Животным всех групп мазевые композиции наносили на место проекции ватного шарика тонким слоем, ежедневно, с последующей изоляцией в индивидуальные клетки на 30 минут. На 8 сутки животных декапитировали под эфирным наркозом, извлекали имплантированный шарик с образовавшейся вокруг него грануляционной тканью, взвешивали (Мь - масса влажной гранулемы, мг), затем гранулемы высушивали в сушильном шкафу при t 55-60°С до постоянного веса и определяли массу сухой гранулемы (М2, мг) с последующим расчетом изменения массы, что соответствует фазам экссудации (М|-М?) и пролиферации (М2-М0).

Испытания бактерицидного действия бетулина и катамина АБ по отношению к условно-патогенным микроорганизмам были проведены в лаборатории микробиологии Испытательного центра СПбГМА имени И.И. Мечникова. Противомикробные свойства изучали путем добавления в питательный агар исследуемых веществ с использованием в качестве тест-культур штаммов P. aeruginosa, S. aureus, Е. coli и В. cereus в концентрации 109,105, 104 по стандарту мутности.

В расплавленный и остуженный до 40°С питательный агар вносили определенное количество катамина АБ (1 мл на 20 мл среды, конечная концентрация в чашке - 0,1%), бетулина (0,1 г на 20 мл среды, концентрация 0,5%), смеси бетулина и катамина АБ (0,1 г и 1 мл соответственно на 20 мл среды). На поверхность агара с помощью пипеточного дозатора наносили по 5 капель каждого разведения исследуемого материала объемом 0,02 мл. Чашки выдерживались до полного высыхания капель, переворачивались и инкубировались в термостате при 37 °С. Расчет количества микроорганизмов в единице объема исследуемого материала проводили с учетом разведения и объема засеянной капли.

Гепатопротекторное действие бетулина изучали на 30 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г на модели D-галактозаминового гепатита, являющегося одной из наиболее адекватных моделей вирусного поражения печени. Всем животным галактозамин вводили внутрь через зонд, один раз в день в течение 4-х суток в дозе 500 мг/кг массы тела. Животные были разделены на 3 группы: I группа служила контролем, II группе (сравнения) вводили внутрь 95% бетулин в дозе 5 мг/кг массы тела животного, один раз в день, в течение 7 суток, III группе аналогичным способом вводили бетулин в концентрации 70%.

Введение бетулина в 70 и 95% концентрации начинали через 24 часа после введения галактозамина. Непосредственно перед забоем каждую группу

подопытных животных (контроль - галактозаминовый гепатит, 70 и 95% бетулин) делили на две равные подгруппы. Животных первой группы забивали под лёгким эфирным наркозом и забирали кровь для определения биохимических показателей. У животных второй подгруппы проводили барбитуратовый тест (в норме продолжительность тиопенталового сна -5,2±0,4 мин). Содержание в сыворотке гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТГТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), холинэстеразы (ХЭС) и холестерина определяли на универсальном биохимическом анализаторе «Cobas Mira+» фирмы Хоффман-Ля Рош Лтд. Нормальные значения ГГТП составляют 21,7±2,9 е.а, ЩФ - 6,1±1,3 е.а., ХЭС - 1067±54 е.а.

Концентрацию гликогена в печени определяли по методике Кемпа и Хеийнингена с небольшой модификацией: для экстракции глюкозы из печени использовали не метанол, а этиловый спирт (Kemp, Heijningen, 1954).Нормальные значения концентрации гликогена в печени составляют 2,67±0,22 г%.

Клиническое исследование проведено в период с 2009 по 2011 на базе ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России (директор — доктор биологических наук академик РАМН О.И. Киселев) в отделении экспериментальной терапии вирусных гепатитов.

Обследовано 42 пациента с установленным диагнозом хронический гепатит С и активностью аланинаминотрансферазы (АЛТ) в 1,5-2 раза превышающей нормальные значения, из них: 18 мужчин (43%) и 24 женщины (57%) в возрасте от 20 до 71 года (средний возраст 38±14 лет).

При ретроспективном анализе амбулаторных карт была отобрана группа сравнения, состоящая из 22 больных ХГС (13 мужчин и 9 женщин в возрасте от 19 до 48 лет).

Кроме того, были обследованы 17 здоровых добровольцев: 10 женщин и 7 мужчин (средний возраст 29±5 лет) не имеющих каких либо заболеваний печени.

За всеми больными проводили клиническое наблюдение, включавшее: опрос жалоб, выяснение анамнеза заболевания, эпидемиологических данных с проведением общего осмотра и учетом индекса массы тела (ИМТ).

Лабораторное обследование состояло из общеклинических, биохимических, серологических и молекулярно-биологических методов.

Клинический анализ крови проводили на гематологическом анализаторе РСЕ-90 (ERMA INC, Япония). Он включал определение количества эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов, лейкоцитов и лейкоцитарной формулы, СОЭ.

С целью уточнения функционального состояния печени определяли следующие биохимические показатели крови: уровень общего билирубина, активность щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП), аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT) на автоматическом анализаторе Konelab 20i (Konelab, Финляндия). Содержание общего белка определяли фотокалориметрическим методом.

Всем пациентам проведено определение рибонуклеиновой кислоты вируса гепатита С (РНК ВГС) и его генотипирование методом полимеразно-цепной реакции с помощью амплификатора «Терцик» и тест систем «АмплиСенс» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзор). У 18 пациентов исследуемой группы также проводили количественную оценку РНК ВГС в 1 мл плазмы крови в режиме real time тест-системами «Амплисенс HCV FRT» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзор).

У 23 больных исследуемой группы, у 22 больных группы сравнения и у 17 здоровых добровольцев определяли активность ферментов антиоксидантной системы супероксидцисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГПО) в эритроцитах с помощью полуавтоматического биохимического анализатора Microlab-300 ROKI-2002 (Vital Scientific, Голландия). Нормальные значения: для СОД 1092-1817 Ед/г НЬ, для ГПО 29,6-82,9 Ед/г НЬ.

В комплекс обязательных исследований для всех пациентов входило ультразвуковое исследование органов брюшной полости с целью уточнения степени поражения печени, а также выявления сопутствующей патологии. Исследования проводили на аппарате Logiq а200. Перед процедурой все больные проходили соответствующую подготовку.

Лечение 42 больных проводили бетулином в виде БАД к пище «Бетуал». Больные принимали по 2 капсулы 4 раза в день (160 мг) в течение 90 дней в режиме монотерапии

Больным группы сравнения в течение 30 дней назначали препарат «Хофитол» перорально по 2 таблетки 3 раза в день (1200 мг) в режиме монотерапии.

У всех больных ХГС на момент проведения исследования имелись противопоказания к проведению противовирусной терапии интерфероном-альфа и рибавирином.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы SPSS v. 17.0. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии различий и влияний) принимали равным 0,05. Характеристики выборок представлены в виде средних величин (М), стандартных отклонений (SD) и ошибок средних величин (ш). В случае использования методов непараметрической статистики данные представлены в виде медиана [25%-75%]. Проверку закона распределения при необходимости анализа количественных переменных проводили при помощи теста Колмогорова-Смирнова. В последующем в случаях нормального распределения для сравнения более двух выборок использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с дальнейшим сравнением независимых выборок попарно с помощью t-критерия Стьюдента. В случае несоответствия закону нормального распределения, для сравнения более двух независимых выборок использовали Н-тест по методу Краскела и Уоллиса. Для сравнения двух зависимых выборок применяли непараметрический тест Уилкоксона. Для определения силы связи использовали двухсторонний корреляционный анализ Пирсона в случае нормального распределения или двухсторонний ранговый

корреляционный анализ Спирмена при несоответствии нормальному закону. При изучении бактерицидных свойств бетулина, при подсчете колоний и оценке точности разведений пользовались статистикой Пуассона.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Визуальное изучение кожно-плоскостных ран в определенные сроки раневого процесса показало, что струп в опытных группах с обработкой ран бетулином в 0,2, 0,5 и 5% концентрации отошел на (11±1)-е, (12±1)-е и (11±1)-е сутки соответственно. В группе с обработкой ран МУМ струп отошел на (13±1)-е сутки, а в группе контроля - на (21±2)-е сутки. У животных контрольной группы экссудат в ране был гнойным, во всех остальных группах - серозным. Скорость сокращения площади раны у животных с обработкой ран бетулиновой мазью 0,2, 0,5 и 5% концентрации до 7-х суток включительно составила 5,5, 6,8 и 6,8% в сутки, до 14-х суток включительно - 10,5, 10,7 и 11,1% в сутки, до 21-х суток включительно - 6,7, 9,5 и 8% в сутки соответственно. У МУМ, как препарата сравнения, на 7-е, 14-е и 21-е сутки -6,6, 5,2 и 3,4% в сутки, а в группе контроля - 2,6, 11,7 и 5,5% в сутки соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Скорость сокращения ран, % в сутки (п=170)

Согласно полученным данным, наибольшая скорость сокращения была у животных, чьи раны обрабатывали бетулиновой мазью 0,5 % концентрации. Наибольший интервал скорости заживления наблюдался в контрольной группе животных. До 7-х суток площадь раны сокращалась незначительно в связи с ее расползанием уже через 2-3 суток под действием гнойного экссудата. До 14-х суток рана сокращалась с наибольшей скоростью, что, по-видимому, объясняется рубцовым стягиванием раны.

Гистоморфологическое исследование показало, что, несмотря на позднее отхождение струпа (12-е сутки), эпителизация раны, обрабатываемой 0,5% бетулином, завершалась уже на 7-е сутки, тогда как при использовании 0,2 и

5% бетулиновой мази эпителизация полностью завершилась только к 14-м суткам. Для МУМ эти сроки полной эпителизации - 21-е сутки, а в группе контроля эпителизация у ряда животных превысила 29 сутки (табл. 1).

Таблица 1

Сроки полной эпителизации ран (п=170)

Препарат Сроки полной эпителизации, сутки (М±т)

Контроль (без обработки) 29±2**

Метилурациловая мазь (10%) 21±1*

Бетулин, 0,2% концентрация 14 ±1**

Бетулин, 0,5% концентрация 7±0,5**

Бетулин, 5% концентрация 14±1**

Примечание:

*) различия статистически значимы по сравнению с контролем, р < 0,05

**) различия статистически значимы по сравнению с метилурациловой

мазью, р < 0,05

Макроскопическое исследование ожоговых ран в определенные сроки ожогового процесса показало, что скорость сокращения площади ожога в группе с 0,5% бетулином, «Пантенолом» и мазевой основой до 3-х суток включительно составила 11,5, 5,5 и 10,1% в сутки, до 8-х суток включительно -0,8, 1,5 и 0,7% в сутки, до 13-х суток включительно - 1,5, 1,1 и 0,7% в сутки соответственно. Полученные данные свидетельствуют о более быстром сокращении площади ожоговой поверхности под действием бетулина 0,5% концентрации (рис. 2).

56 4-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-

1-е 2-е 3-е 4-е 5-е 6-е 7-е 8-е 9-е 10-е 11-е 12-е 13-е Время, сут

Рис. 2. Скорость сокращения площади ожоговой поверхности, мм2 в сут (п=15)

Первоначальная площадь ожога составляла 79 мм . Первоначальное увеличение площади ожога (отрицательные данные) обусловлено последующими реактивными изменениями в соединительной ткани, т. е. переходом поврежденных тканей из состояния некробиоза в некроз.

Гистоморфологическая картина показала различия в динамике репарации у исследуемых групп животных. В группе контроля (мазевая основа) процессы репарации проходили неравномерно. В первую очередь, площадь некроза в этой группе была максимальной. После полного отторжения некротизированных участков соединительная ткань заметно опережала наползающий на нее эпидермис по скорости роста и дифференцировки, т. е. у контрольной группы животных заживление проходило с образованием грубого деформирующего рубца.

В группе с обработкой ран «Пантенолом» нет тенденции к полному отторжению некроза, а дифференцировка соединительной ткани и эпителия проходит более синхронно, что говорит о более полноценном заживлении.

В опытной группе с обработкой ран 0,5% бетулиновой мазью некроз обожженной ткани минимален, восстанавливается хрящевая пластинка, позволяя ране полноценно эпителизироваться. В группах контроля и сравнения часть некротизированной ткани отторгается на всю толщу уха, оставляя круглые отверстия, примерно равные диаметру ожоговой поверхности (контроль) или значительно меньше ожоговой поверхности («Пантенол»), Побочных эффектов при использовании бетулиновых мазей во всех изучаемых концентрациях не наблюдалось.

Дальнейшая оценка влияния бетулина на различные фазы воспалительного процесса подтвердила наличие у бетулина антиэкссудативной и антипролиферативной активности (рис. 3).

100 90 80 70 5 60 8 50 | 40 30 20 10 0

?.?.:........................... ■ Экссудация

|~1 Пролиферация

Контроль (бензалкония хлорид 0,1%)

Бетулиновая мазь Преднизолоновая 0,5% мазь 0,5%

Рис. 3. Влияние бетулиновой 0,5% мази на экссудативную и пролиферативную фазы воспалительного процесса на модели "ватная гранулема" (п=24)

Наибольшую активность проявили преднизолоновая и бетулиновая мази, поскольку масса экссудата и грануляционно-фиброзной ткани вокруг шариков у животных, обрабатываемых этими препаратами была наименьшей, в то время, как на фоне аппликаций мазевой основы (бензалкония хлорида) экссудация и пролиферация были наболее выражены.

Последующее изучение влияния 0,5% бетулина и 0,1% катамина АБ на рост исследуемых бактериальных тест-культур в обоих случаях выявило наличие антибактериальной активности.

Анализ полученных результатов показал, что бетулин в 0,5% концентрации подавлял рост Е. coli во всех разведениях, при этом происходило общее снижение количества остальных проверяемых штаммов. В то же время катамин АБ оказался высокоэффективным в отношении грамположительных микроорганизмов, то есть происходило полное подавление роста штаммов S. aureus и B.cereus во всех разведениях. При совместном действии бетулина и катамина АБ происходило усиление антимикробного действия - отсутствовал рост Е. coli, S. aureus, В. cereus и наблюдалось уменьшение количества Р. aeruginosa.

Полученные данные в целом совпадают с результатами проведенного ранее исследования Е.А. Радьковой (2007), в котором было обнаружено, что 0,02%, 0,2% и 0,5% растворы бетулина не тормозили рост S. aureus и бактерий рода Bacillus. Вышесказанное свидетельствует прежде всего в пользу отсутствия у бетулина бактерицидного действия в отношении грамположительных микроорганизмов. В то же время заметное повышение антибактериальной активности при добавлении в агар катамина АБ на наш взгляд может быть обусловлено как антисептическим действием самого катамина АБ, так и повышением растворимости бетулина в агаре.

Следовательно, 0,5% бетулинсодержащую мазь при отсутствии антисептика (напр., катамина АБ) целесообразнее наносить на неинфицированные раны, а в случае гнойных ран использовать лишь со II фазы раневого процесса (фазы регенерации), поскольку активность самого бетулина в концентрации 0,5% по отношению к гноеродной флоре невысока.

Поскольку D-галактозаминовый гепатит у крыс, является одной из наиболее адекватных моделей вирусного гепатита, то он был использован нами для моделирования вирусного поражения печени.

На 8-ой день после последнего введения крысам галактозамина, содержание в сыворотке крови у подопытных животных крыс ферментов ГГТП и ЩФ было повышено в 3,9 и 4,1 раза соответственно. Содержание в сыворотке крови крыс с галактозаминовым гепатитом фермента ХЭС было снижено в 1,9 раза, а концентрация гликогена в печени животных уменьшилась в 2,2 раза (табл. 2).

Таблица 2

Влияние бетулина в 70 и 95% концентрации на течение галактозаминового гепатита

ХПоказатели Препарать1\ у-ГТП крови, е.а. (М±ш) ЩФ крови, е.а. (М±гп) ХЭС крови, е.а. (М±ш) Гликоген печени, г % (М±ш) Длительность наркотич. сна, мин (М±ш)

Контроль (гепатит) 85,6±4,2 25,2±3,9 556 ±38 1,19 ±0,15 48,7±5,2

Бетулин 95% 33,0±5,5* 15,2±1,7* 680 ± 40 1,9 ±0,18* 17,8±2,7*

Бетулин 70% 35,4±3,9* 14,2 ±1,9* 735±36* 2,25 ±0,21* 15,4±3,4*

Примечание: * - статистически значимо по сравнению с контролем (р < 0,05)

Влияние изученных веществ на содержание в сыворотке крови подопытных животных ХЭС, маркера белоксинтезирующей функции печени, было обратно пропорционально концентрации бетулина. Бетулин в 95% концентрации проявлял лишь тенденцию к повышению ХЭС, тогда как в 70% концентрации бетулин отчетливо повышал концентрацию ХЭС в сыворотке крови подопытных животных на 32,2% (р < 0,05). Концентрация гликогена в печени также возрастала обратно пропорционально концентрации бетулина, причем в обоих случаях изменения были статистически значимыми (р < 0,05). Тем не менее, бетулин в обеих концентрациях (95 и 70%) статистически значимо снижал длительность тиопентапового наркотического сна (в 2,7 и 3,16 раза соответственно), способствуя тем самым восстановлению детоксикационной функции печени.

Полученные данные явились основанием для дальнейшего клинического исследования, которое позволило охарактеризовать течение ХГС у лиц, проживающих в г. Санкт-Петербурге и Ленинградской области.

У большинства больных отмечено манифестное течение ХГС. В частности, проявления астено-вегетативного синдрома встречались у 55 (86%), а диспепсия - у 52 (81%) больных. Указанные жалобы носят неспецифический характер и могут иметь отношение к сопутствующей патологии желчевыводящих путей. Индекс массы тела у обследованных больных составил в среднем 25,5±4,7 кг/м2 (избыточный вес), что не оказывает значимого влияния на терапию ХГС (Bressler et al., 2003). Последующее обследование по органам и системам в большинстве случаев не выявило какой-либо значимой симптоматики кроме гепатомегалии, которая встречалась в 87,5% случаев.

Оценка биохимических показателей выявила, что у всех больных ХГС протекал с цитолитическим синдромом, преобладали больные со средней степенью биохимической активности ХГС (2-4 нормы AJIT). В то же время, активность ACT могла оставаться в пределах нормальных значений, причем

связь между выраженностью жалоб и активностью цитолиза не была статистически значимой и носила характер тенденции (г= 0,417, р=0,108). Другие биохимические показатели (общий билирубин, общий холестерин, щелочная фосфатаза, глюкоза крови) за исключением гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) находились в пределах нормальных значений.

У всех больных выявлена РНК вируса гепатита С (ВГС) в плазме крови методом ПЦР и определен его генотип. Полученные данные свидетельствуют о преобладании HCV генотипа За у больных, проживающих в данном регионе (51,6% больных). Количественная оценка РНК ВГС в 1 мл крови (вирусная нагрузка), проведенная у 18 больных составила 1х 106 [960750-1,2х10б] копий/мл, что является относительно невысоким показателем при отсутствии приема противовирусных препаратов. Дальнейший корреляционный анализ выявил наличие тенденции к слабой прямой корреляционной связи между выраженностью субъективных ощущений и величиной вирусной нагрузки у больных ХГС (г=0,312, р=0,258). Аналогичная тенденция к слабой обратной корреляции наблюдалась между уровнем вирусной нагрузки и активностью ACT (г=-0,308, р=0,214).

Активность ферментов антиоксидантной защиты (СОД и ГПО) в обеих группах (исследования и сравнения) была неоднородна и могла сильно варьировать, хотя в среднем статистически значимо (по сравнению со здоровыми добровольцами) превышала нормальные значения.

Для СОД суммарная (для обеих групп больных) средняя активность составила 2028±605 Ед/г НЬ (р=0,016), для ГПО - 86,3±66,5 Ед/г НЬ (р=0,013).

Также у больных ХГС нами была установлена отчетливая тенденция к увеличению активности ГПО при повышении активности AJIT, по крайней мере, в 1,5 раза выше нормальных значений (г=0,301, р=0,059). Выявленная тенденция позволяет говорить о возможной корреляции между степенью выраженности цитолитического синдрома и активностью антиоксидантной системы у данной группы больных.

Последующий клинический опыт лечения разных групп больных бетулином и «Хофитолом» в обоих случаях позволил выявить положительную динамику субъективных ощущений; в обеих группах жалобы были оценены суммой баллов (табл. 3).

Таблица 3

Влияние терапии бетулином и «Хофитолом» на наличие жалоб у больных ХГС

Показатель Жалобы (баллы), M±SD

До лечения бетулином (п=42) 4,7±3,2

После лечения бетулином (п=42) 1± 0,7

Критерий Уилкоксона(р) 0,028

До лечения «Хофитолом» (п=22) 3,9±2,5

После лечения «Хофитолом» (п=22) 0,7± 0,5

Критерий Уилкоксона(р) 0,034

Динамика клинико-лабораторных показателей в обеих группах также была положительной (табл. 4).

Таблица 4

Влияние бетулина и «Хофитола» на динамику цитолитического синдрома через 1 месяц терапии

Показатель АЛТ (Ед\л), M±SD ACT (Ед\л), M±SD

До лечения бетулином (п=42) 107±65 65±42

Через 1 месяц после лечения бетулином (п=42) 92±63 60±30

Критерий Уилкоксона(р) 0,245 0,434

До лечения «Хофитолом» (п=22) 131± 69 76± 45

Через 1 месяц после лечения «Хофитолом» (п=22) 119± 97 47± 30

Критерий Уилкоксона(р) 0,680 0,043

Терапию бетулином решено было продлить до трех месяцев, поскольку для оценки противовирусного действия препарата необходим ранний вирусологический ответ (Gallegos-Orozco et al., 2003; Martinot-Peignoux et al., 2009). После окончания третьего месяца терапии бетулином активность АЛТ приблизилась к нормальным значениям (р=0,046). Снижение активности ACT имело лишь характер тенденции (р =0,669). Снижение АЛТ и ACT составило 54% и 48% соответственно (рис. 4).

140 т

До лечения После лечения

Рис. 4. Динамика активности АЛТ и ACT на фоне патогенетической терапии бетулином через 3 месяца терапии (п=42)

В обеих группах наблюдалось повышение активности ферментов антиоксидантной защиты. Прием бетулина вызвал статистически значимое (р=0,001) повышение активности СОД (табл. 5).

Таблица 5

Изменения показателей антиоксидантной защиты при применении

бетулина

Показатель (п=22) СОД (Ед/г Hb), M±SD ГПО (Ед/г Hb), M±SD

До лечения 1928±498 134,2±45,9

Через 1 месяц 1985±761 115,3±57,8

После лечения 3316±1800 135,4±21

р, ANO VA 0,001 0,792

Через месяц от начала терапии активность СОД возросла незначительно, тем не менее, после 3 месяца приема бетулина активность СОД у больных увеличилась в среднем в 1,7 раза.

На фоне терапии «Хофитолом» наблюдалась тенденция к повышению активности СОД, а также статистически значимое возрастание активности ГПО (табл. 6).

Таблица 6

Изменения показателей антиоксидантной защиты при применении «Хофитола»

Показатель (n=22) СОД (Ед/г Hb), M±SD ГПО (Ед/г Hb), M±SD

До лечения 2184±633 35,9±13,6

После лечения 2213±470 51,6±25,4

Критерий Уилкоксона(р) 0,532 0,013

Таким образом, у каждой группы больных имелись свои характерные особенности.

Также 3-месячный курс лечения бетулином вызвал снижение уровня РНК ВГС в плазме крови пациентов на что является хорошим показателем

для гепатопротекторного средства (рис. 5).

и

Ьн

еэ

»1 X :Я

0. я

й о S К

£

1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0

До лечения

После лечения

Рис. 5. Динамика уровня РНК ВГС в плазме крови пациентов на старте и через три месяца на фоне терапии бетулином (п=18)

На протяжении всего курса лечения больные не отмечали ухудшения самочувствия или каких-либо других нежелательных явлений, которые могли быть связаны с приемом бетулина, что говорит о хорошей его переносимости.

ВЫВОДЫ

1. Противовоспалительные свойства бетулина, выявленные при экспериментальном и клиническом исследовании, обусловлены репаративной (ранозаживляющей и противоожоговой) активностью, а также антиэкссудативным, антипролиферативным, антибактериальным, противовирусным и антиоксидантным действием.

2. Бетулинсодержащие мази обладают ранозаживляющими свойствами во всех исследуемых концентрациях (0,2, 0,5 и 5%), однако наибольшая скорость репарации проявилась в группе животных с обработкой ран 0,5% бетулиновой мазью.

3. Бетулинсодержащая 0,5% мазь оказывает выраженное противоожоговое действие, не уступая препарату сравнения «Пантенол», в то же время ее антиэкссудативное и антипролиферативное действие уступает таковому у 0,5% преднизолоновой мази.

4. Суспендированный в агаре бетулин в концентрации 0,5% проявил противомикробную активность в отношении Е. coli, а также влиял на рост В. cereus и P. aeruginosa, однако проявлял наименьшую активность к гноеродной флоре (S. aureus).

5. Бетулин в концентрации 70% оказывает более выраженное гепатопротекторное действие в сравнении с 90% бетулином у крыс с D-галактозаминовым гепатитом.

6. На фоне лечения больных хроническим гепатитом С в течение 3 мес препаратом сухого экстракта бересты, содержащим бетулин, отмечено улучшение самочувствия пациентов, положительная динамика биохимических показателей (снижение активности аланинаминотрансферазы, повышение активности супероксиддисмутазы) и уменьшение количества РНК вируса гепатита С в плазме крови больных хроническим гепатитом С на llogio копий/мл.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для лечения ран и ожогов целесообразно применять мазевые композиции на основе бетулина в концентрации 0,5%.

2. Бетулинсодержащие мазевые композиции могут быть рекомендованы к применению в хирургии и косметологии при наличии гипертрофических и келоидных рубцов.

3. Использование бетулинсодержащих мазей предпочтительно в сочетании с ПАВ-антисептиком (например, катамином АБ) для подавления роста гноеродной флоры.

4. Полученные результаты о выраженной гепатопротекторной активности бетулина позволяют рекомендовать его к применению в медицинской практике.

5. Биологически активные добавки к пище, содержащие бетулин и зарегистрированные МЗ РФ, рекомендуется применять в клинике ХГС, с целью стабилизации биохимических показателей и снижения вирусной нагрузки у больных в промежутках между курсами противовирусной терапии, а также у больных, которым противовирусная терапия противопоказана.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сергеев Д.В. Оценка эффективности бетулина при экспериментальном и вирусном гепатитах / Д.В. Сергеев // Актуальные вопросы гепатологии: мат. 7 международного симпозиума гепатологов Беларуси. - в 2-х т. - Гродно: ГРМУ, 2008.-Т. 2.-С. 179-180.

2. Сергеев Д.В. Бетулин в терапии хронического гепатита С / Д.В. Сергеев // Современные аспекты инфекционной патологии: мат. науч.-практ. конф. — Астрахань: АГМА, 2009. - Т. 4, № 4 - С. 141.

3. Сергеев Д.В. Опыт применения бетулина у больных хроническим гепатитом С / Д.В. Сергеев, Е.В. Эсауленко, Г.И. Дьячук // Болезни печени в клинической практике: мат. науч.-практ. конф. / под ред. В.П. Малого, И.С. Кратенко. - Харьков: ХМАПО [и др.], 2009. - С. 153.

4. Бетулин — новый гепатопротектор в терапии легочного туберкулеза и вирусных поражений печени / А.К. Иванов, A.B. Белянина, О.И. Киселев, Е.В. Эсауленко, Г.И. Дьячук, А.Н. Шиков, Д.В. Сергеев. - СПб.: Изд-во СПбГМА, 2010.-36 с.

5. Сергеев Д.В. Ранозаживляющие свойства бетулина / Д.В. Сергеев // Актуальные проблемы медицины и биологии: мат. науч.-практ. конф. - СПб.: СПбГМА им. И.И.Мечникова, 2011. - С. 372-373.

6. Сергеев Д.В. Репаративные эффекты бетулина / Д.В. Сергеев, Г.И. Дьячук // Профилактическая медицина - 2011: мат. конф. - СПб.: СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2011. - С. 280-281.

7. Эсауленко Е.В. Клинический опыт использования бетулина в терапии хронического гепатита С / Е.В. Эсауленко, Д.В. Сергеев // Профилактическая и клиническая медицина. - 2011. - Т. 2, № 2. - С. 208211.

8. Сергеев Д.В. Ранозаживляющие и противоожоговые свойства бетулинсодержащих мазей / Д.В. Сергеев, С.Н. Прошин, Г.И. Дьячук // Медико-биологические и социально-биологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2011. - № 2. - С. 76-79.

9. Birch bark extract as therapy for chronic hepatitis С - A pilot study / A.N. Shikov, G.I. Djachuk, D.V. Sergeev, O.N. Pozharitskaya, E.V. Esaulenko, V.M. Kosman, V.G. Makarov // Phytomedicine. - 2011. - Vol. 18, № 10. -P. 807-810.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминотрансфераза

АСТ - аспартатаминотрансфераза

ГГТП - гамма-глутамилтранспептидаза

ГПО - глутатионпероксидаза

ПАВ - поверхностно-активное вещество

РНК ВГС - рибонуклеиновая кислота вируса гепатита С

СОД - супероксиддисмутаза

ХГС - хронический гепатит С

НЬ - гемоглобин

НСУ - вирус гепатита С

Подписано в печать 21.12.2012. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 10145Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.:(812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Актуальность проблемы

В настоящее время активно ведется поиск и изучение различных лекарственных средств растительного происхождения. Фитопрепараты популярны как среди врачей, так и среди пациентов, поскольку по общепринятому мнению их эффективность и безопасность проверены временем (Stickel et al., 2005; Christen, Cuendet, 2012). Тем не менее, лишь небольшое количество средств растительного происхождения обладают выраженной эффективностью и широким спектром активности с минимальными побочными эффектами (Seeff, 2007). В связи с этим большой интерес представляет изучение активности тритерпеновых соединений из коры березы и в первую очередь наиболее распространенного из них -бетулина, обладающего разнообразными фармакологическими эффектами (Барнаулов О.Д., 1986; Дьячук Г.И. с соавт., 2004; Weckesser et al., 2010). В частности, противовоспалительная активность бетулина опосредована его репаративным, антиоксидантным, противомикробным и противовирусным действием (Иванова С.А. с соавт., 2004; Радькова Е.А., 2007; Носик H.H. с соавт., 2005; Szuster-Ciesielska et al., 2010). Также известно, что противовоспалительная активность бетулина значительно превышает таковую у нестероидных противовоспалительных средств (Рапп O.A., 1993). Все это обусловливает необходимость оценки противовоспалительного действия бетулина при различных вариантах воспаления, в том числе у больных хроническим гепатитом С.

Проблема вирусных гепатитов с гемоконтактным путем передачи не утратила своей актуальности. Хотя на первое место среди парентеральных вирусных гепатитов выходит гепатит В, которым инфицировано порядка 2 млрд. человек на земном шаре (Шахгильдян И.В. с соавт., 2003), но лидерство постепенно переходит к HCV-инфекции (Шахгильдян И.В. с соавт., 2008). По данным ВОЗ, что во всём мире вирусом гепатита С инфицировано 500-700 миллионов человек, что составляет около 10% населения земного шара (Аналитический обзор «Вирусные гепатиты в Российской Федерации», 2008; Ма§Ыаош, 2012). В России число инфицированных НСУ составляет около 5 млн. человек (Михайлов И.В., Шахгильдян И.В., 2007). В то же время имеется высокая вероятность хронизации (80%), а также развития цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы как исхода НСУ-инфекции (ёе ОНуепа Апёгаёе ег а1., 2009). Основным направлением лечения гепатита С является этиотропная терапия комбинацией препаратов интерферона и рибавирина (Козлов В.К. с соавт., 2008). Стандартная терапия хронического гепатита С пегилированными формами интерферона-а и рибавирином приводит к элиминации вируса у 50% больных, инфицированных 1-м генотипом НСУ, и у 80% пациентов, инфицированных 2-м и 3-м генотипами вируса ^еигет, 2008), что показывает относительную устойчивость вируса гепатита С к этиотропной терапии. Помимо того, этиотропная противовирусная терапия имеет множество нежелательных побочных эффектов (РоскгоБ, 2012), делая невозможным её применение у ряда пациентов.

Латентное течение НСУ-инфекции, отсутствие методов специфической профилактики и, кроме того, высокая стоимость этиотропной терапии и её невысокая эффективность в случае хронизации гепатита С, повышают необходимость поиска новых методов патогенетического лечения этого заболевания с участием гепатопротекторов. Желательным для данной категории веществ является наличие противовоспалительных свойств в сочетании с минимальными побочными эффектами.

Все это послужило основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования

Изучить противовоспалительные свойства бетулина и в экспериментальных и клинических условиях обосновать его применение.

Задачи исследования

1. На модели полнослойной кожно-плоскостной раны у крыс изучить противовоспалительные и репаративные свойства бетулина с дальнейшей их оценкой на модели ожогов уха кролика.

2. Изучить влияние бетулина на различные фазы воспалительного процесса на модели «ватной гранулемы».

3. Оценить бактерицидные свойства бетулина на культурах микроорганизмов S. aureus, В. cereus, Р. aeruginosa и Е. coli.

4. На модели D-галактозаминового гепатита у крыс оценить гепатопротекторное действие бетулина.

5. Оценить динамику клинико-лабораторных, молекулярно-биологических (вирусную нагрузку при различных генотипах) показателей и антиоксидантное действие бетулина у пациентов с хроническим гепатитом С.

Личный вклад автора

Личное участие автора осуществлялось на всех этапах подготовки и проведения научной работы, включавших определение основной идеи исследования и методов его выполнения. Автором самостоятельно проведен аналитический обзор современной зарубежной и отечественной литературы, выполнены все экспериментальные исследования и комплексное клиническое обследование пациентов, включенных в исследование с оценкой и анализом результатов их обследования.

Научная новизна работы

В данной работе получены новые данные о противовоспалительной активности бетулина в различных концентрациях на моделях полнослойной кожно-плоскостной, ожоговой раны, модели «ватной гранулемы», а также о гепатопротекторном действии на модели D-галактозаминового гепатита и у больных хроническим гепатитом С с цитолитическим синдромом.

Впервые показано, что противовоспалительное действие бетулина в эксперименте обусловлено как специфическим ранозаживляющим, противоожоговым, антиэкссудативным и антипролиферативным действием, так и бактерицидной активностью преимущественно в отношении грамотрицательных микроорганизмов.

Установлены наиболее эффективные концентрации бетулина, обладающие выраженным противовоспалительным и репаративным действием. Впервые установлено, что гепатопротекторное действие бетулина при О-галактозаминовом гепатите обратно пропорционально его концентрации.

В клинике установлено, что бетулин нормализовал активность АЛТ и снижал уровень РНК вируса гепатита С в плазме крови больных хроническим гепатитом С, проявляя гепатопротекторную и противовирусную активность.

Практическая значимость работы

Данные, полученные в результате проведенного исследования, позволили рекомендовать включение бетулинсодержащих мазей в схему лечения раневых и ожоговых процессов, а также определить оптимальную концентрацию бетулина и состав мазевой основы.

Полученные экспериментальные данные о наличии у мазевых композиций, содержащих бетулин, противовоспалительного и репаративного эффектов могут представлять практический интерес в области хирургии и косметологии.

Экспериментально и клинически обоснована возможность использования бетулина в практике гепатологии в качестве нового гепатопротектора с противовирусной активностью.

Данные о гепатопротекторной и противовирусной активности бетулина легли в основу методических рекомендаций «Бетулин - новый гепатопротектор в терапии легочного туберкулеза и вирусных поражений печени».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бетулинсодержащие мазевые композиции обладают противовоспалительной активностью на различных моделях (раны, ожоги, «ватная гранулема»), при этом оптимальная концентрация бетулина в мази составляет 0,5%.

2. Низкая противомикробная активность бетулина в отношении грамположительных микроорганизмов и его плохая растворимость обусловливают необходимость комбинировать бетулин с антисептиком, обладающим поверхностной активностью.

3. Гепатопротекторное действие бетулина при В-галактозаминовом гепатите в эксперименте обратно пропорционально его концентрации.

4. Применение препаратов на основе бетулина оказывает положительное влияние на динамику цитолитического синдрома, активность ферментов антиоксидантной системы и вызывает снижение вирусной нагрузки у больных ХГС, не вызывая каких-либо нежелательных явлений.

Апробация работы и публикации

Основные положения работы доложены на 81-й конференции, посвященной 80-летию образования СНО в СПбГМА им. И.И. Мечникова «Человек и здоровье 2008» (Санкт-Петербург, 2008); 7 международном симпозиуме гепатологов Беларуси «Актуальные вопросы гепатологии» (Витебск, 2008); научно-практической конференции «Исследования и разработки по приоритетным направлениям в медицине» (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Болезни печени в клинической практике» (Харьков, 2009); научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Современные аспекты инфекционной патологии» (Астрахань, 2009); научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины и биологии» (Санкт-Петербург, 2010).

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 - в рекомендованных ВАК журналах.

Реализация работы

Результаты исследования используются в лечебной работе отделения экспериментальной терапии хронических вирусных гепатитов специализированной клиники ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, внедрены в научный процесс лаборатории токсикологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки "Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУН ИТ ФМБА России).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 24 таблицы и 31 рисунок. Библиография включает 221 источник, в том числе 58 отечественных и 163 иностранных.

114 ВЫВОДЫ

1. Противовоспалительные свойства бетулина, выявленные при экспериментальном и клиническом исследовании, обусловлены репаративной (ранозаживляющей и противоожоговой) активностью, а также антиэкссудативным, антипролиферативным, антибактериальным, противовирусным и антиоксидантным действием.

2. Бетулинсодержащие мази обладают ранозаживляющими свойствами во всех исследуемых концентрациях (0,2, 0,5 и 5%), однако наибольшая скорость репарации проявилась в группе животных с обработкой ран 0,5% бетулиновой мазью.

3. Бетулинсодержащая 0,5% мазь оказывает выраженное противоожоговое действие, не уступая препарату сравнения «Пантенол», в то же время ее антиэкссудативное и антипролиферативное действие уступает таковому у 0,5% преднизолоновой мази.

4. Суспендированный в агаре бетулин в концентрации 0,5% проявил противомикробную активность в отношении Е. coli, а также влиял на рост В. cereus и Р. aeruginosa, однако проявлял наименьшую активность к гноеродной флоре (S. aureus).

5. Бетулин в концентрации 70% оказывает более выраженное гепатопротекторное действие у крыс с D-галактозаминовым гепатитом по сравнению с 95% бетулином.

6. На фоне лечения больных хроническим гепатитом С в течение 3 мес. препаратом сухого экстракта бересты, содержащим бетулин, отмечено улучшение самочувствия пациентов, положительная динамика биохимических показателей (снижение активности аланинаминотрансферазы, повышение активности супероксиддисмутазы) и уменьшение количества РНК вируса гепатита С в плазме крови больных хроническим гепатитом С на 1 logю копий/мл.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для лечения ран и ожогов целесообразно применять мазевые композиции на основе бетулина в концентрации 0,5%.

2. Бетулинсодержащие мазевые композиции могут быть рекомендованы к применению в хирургии и косметологии при наличии гипертрофических и келоидных рубцов.

3. Использование бетулинсодержащих мазей предпочтительно в сочетании с ПАВ-антисептиком (например, катамином АБ) для подавления роста гноеродной флоры.

4. Полученные результаты о выраженной гепатопротекторной активности бетулина позволяют рекомендовать его к применению в медицинской практике.

5. Биологически активные добавки к пище, содержащие бетулин и зарегистрированные МЗ РФ, рекомендуется применять в клинике ХГС, с целью стабилизации биохимических показателей и снижения вирусной нагрузки у больных в промежутках между курсами противовирусной терапии, а также у больных, которым противовирусная терапия противопоказана.