Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Изучение эндотелиопротективного действия ацетилизочистозида и его комбинации с эналаприлом

[[я правах рукописи

Брусннк Максим Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ АЦЕТИЛИ-ЗОЧИСТОЗИДА И ЕГО КОМБИНАЦИИ С ЭНАЛАПРИЛОМ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

" 2 ДЕК 2010

Старая Купавна - 2010

004615975

Работа выполнена на кафедре фармакологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович доктор биологических наук Кочкаров Владимир Ысхаковнч

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Митрохин Николай Михайлович доктор медицинских наук, профессор Филиппова Ольга Всеволодовна

Ведущая организация: Государственное образовательное учре-

ждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится « » 2010 г. в "Т^7—"часов на засе-

дании диссертационного совета Д 217.004.01 при Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ) по адресу: 142450, Московская область, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦ БАВ.

Автореферат разослан « ~/3 » 2010 г.

Автореферат размещен на официальном сайте ВНЦ БАВ http://www.vncbav.ru.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Корольченко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. К настоящему времени роль эндотелия доказана в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Эндотелиальная дисфункция (ЭД) рассматривается как предиктор целого ряда заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, а также патогенетическим компонентом органных повреждений при сахарном диабете, гипоэстрогенных и других состояниях (Белоусов, Ю.Б. 2000, Hasdan, G., 2002, Kawano, Н, 2002).

При данных заболеваниях эндотелий первоочередной мишенью, поскольку участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции [Schiffrin, E.L 2001, Verma, S. 2002].

При развитии различных патологических состояний участие эндотелия многогранно и связано как, с регуляцией сосудистого тонуса, так и с участием в процессе атерогенеза, тромбообразования, защиты целостности сосудистой стенки и др. (Марков, Х.М., 2004, 2006). В качестве основных стимулов, вызывающих ответ эндотелиальной клетки следует выделить изменение скорости кровотока (увеличение напряжения сдвига), тромбоцитарные медиаторы (серо-тонин, АДФ, тромбин), а также циркулирующие и/или "внутристеночные" ней-рогормоны (катехоламины, вазопрессин, ацетилхолин, эндотелии, брадикинин, гистамин и др.).

Среди изобилия биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, важнейшим является оксид азота - NO. Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка NO с помощью эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) из L-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов (Зодионченко, B.C., 2002, Маколкин, В.И., 2002, Мазуров, В.И., 2006).

Недостаточная продукция NO в сосудистом русле является ранним признаком ЭД. С одной стороны это связано со снижением биодоступности NO, с другой - со сниженной активностью eNOS в результате присутствия эндогенных или экзогенных ингибиторов её функционирования или снижения доступности его субстрата, L-аргинина. В основе снижения биодоступности NO лежат изменения продукции синтезируемых сосудистыми эндотелиальными клетками (ЭК) биологически активных соединений, среди которых наибольшее-значение имеют свободные радикалы кислорода (СРК), которые, соединяясь с NO, образуют избыточное количество такой реактивной формы кислорода (РФК) как пе-роксинитрит (ONOO") (Lee, W. Н., 2003). Пероксинитрит являясь высокотоксичным соединением повреждает мембраны и ДНК клетки, вызывает мутации и перекисное окисление липидов низкой плотности (Cooper, С.Е., 2003). При этом возникает оксидантный стресс, активирующий большое количество окси-дантчувствительных факторов транскрипции (таких как нуклеарный фактор каппа-В (NF-кВ), которые повышают экспрессию адгезивных молекул эндотелия (ICAM-1, VCAM-1), а также различного рода факторов роста и хемокинов,

способствующих развитию воспалительных и других процессов протекающих при атеросклерозе (Kielstein, J.T., 1999).

Учитывая возможные механизмы реализации предотвращения развития ЭД, следует отметить, что одними из перспективных групп для фармакологической коррекции ЭД являются флавоноидные соединения (Woodman О.L.,2009, Xiao Н.В., 2009, Zhu В.Н., 2000). Исследования, посвященные изучению ангио-протекторных и антиоксидантных свойств природных флавоноидов, в том числе и при диабетической микро- и макроангиопатии, выявили, что флавоноиды обладают эндотелиопротективным действием. Особенности антиоксидантного действия этих веществ состоят в том, что они могут инактивировать не только гидропероксидный, апкоксильный и липидные радикалы, но и супероксидный анион-радикал. Наличие антирадикальных свойств у данных соединений основывается на том, что химическая структура флавоноидов содержит ароматическое кольцо и присоединенные к нему гидроксильные группы, которые способны тормозить процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) на стадии кислородной инициации и передачи электронов с одной активной формы на другую. Возможным механизмом утилизации кислородных радикалов является способность гидроксильного соединения флавоноидов отдавать атом водорода и связывать более токсичные соединения, нейтрализуя их таким образом.

Цель исследования: изучение эндотелипротективного действия нового флавоноидного соединения ацетилизочистозида (гликозида 4'-глюкопиранозида изоскутелляреина) и его комбинации с ингибитором АПФ -эналаприлом в эксперименте.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Оценить развитие эндотелиальной дисфункции при комбинированной L-NAME и стресс - индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб.

2. Исследовать влияние сочетанной L-NAME и стрессорной патологии на динамику показателей биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

3. Изучить эндотелиопротективную активность ацетилизочистозида при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.

4. Изучить эндотелиопротективную активность ингибитора АПФ - эна-лаприла при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.

5. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения ацетилизочистозида и ингибитора АПФ эналаприла при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO в эксперименте.

Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ моделирования комбинированной L-NAME и стресс - индуцированной NO-дефицитной эндотелиальной дисфункции. Продемонстрировано, что эндотели-альная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотели-

альной дисфункции (КЭД) в 5 раз, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессия NO-синтазы), а также отрицательной динамикой морфологических показателей сердечно-сосудистой системы.

В работе впервые показано, что ацетилизочистозид 20 мг/кг (однократно внутрибрюшинно в течение 7 суток) оказывает эндотелийпротективное действие на модели комбинированной L-NAME и стресс - индуцированной N0-дефицитной ЭД. Эналаприл 0,5 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) как монотерапия также обладает эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии. Сочетанное использование ацетилизочисто-зида с ингибитором АПФ энапаприлом показало положительное эндотелиопро-тективное взаимодействие.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность соче-танного применения ацетилнзочистозида с ингибитором АПФ эналаприлом для коррекции комбинированной L-NAME и стресс -индуцированной N0-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на аце-тилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндоте-лийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total N0, экспрессию NO-синтетазы), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и адренореактивности, и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания ацетилнзочистозида при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротек-тивной активности эналаприла малеата «Рениприл» производства ОАО «Фарм-стандарт-Лексредства», включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084/01-2000).

Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндо-телиопротективной активности ацетилнзочистозида используются и в лекционных курсах кафедр фармакологии КГМУ, фармхимии и фармакогнозии БелГУ.

Апробация работы. Материалы работы доложены 17 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» в 2010, на межвузовской научной конференции посвященной памяти проф. В.В.Пнчугина и 75-летию КГМУ, итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2010. г. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту

1. Комбинированная L-NAME и стресс - индуцированная NO-дефицитная эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосу-

дистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитро-пруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессия NO-синтетазы), а также характерной динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, диаметр миокардиоцитов и адренореактивности и т.д.).

2. Ацетилизочистозид 20 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрибрю-шинно оказывает эндотелийпротективное действие на модели комбинированной L-NAME и стресс - индуцированной NO-дефицнтной ЭД. Эналаприл 0,5 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрижелудочно как монотерапия также обладали эндотелиопротективным эффектом на выбранной модели патологии.

3. Сочетанное использование ацетилизочистозида (20 мг/кг) с эналапри-лом 0,5 мг/кг оказывает выраженное эндотелиопротективное действие на модели комбинированной L-NAME и стресс -индуцированного дефицита N0, что выражается в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. При этом более существенно снижается АД, в отличие от монотерапии отдельно ацетилизочистозидом и эналаприлом, Результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышения адренореактивности на фоне снижения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинации ацетилизочистозида с эналаприлом увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов.

3. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 210 источник, из них 32 отечественных и 178 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 124 страницах машинописи, содержит таблиц - 13, рисунков - 31, схем -1.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 250300 г. N-HHTpo-L-aprHHHH метиловый эфир (L-NAME) вводился ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 12,5 мг/кг. Эмоционально-болевой стресс согласно методике воспроизводили на 7-ые сутки путем подвешивания крыс за дорсальную складку кожи на 24 ч (Ковалев Г.В., 1987).

На 8 день от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы "Bioshell". Функциональные пробы: внутривенное введение ацетил-холина (40мкг/кг) (J.B.Laursen, 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Гала-ганМ.Е, 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика P23ID «Gould» США, АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и интенсивность функционирования структур (ИФС) (произведение частоты сердечных сокращений и давления, развиваемого левым желудочком (мм. рт. ст. х уд.мин).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Нагрузка объёмом (внутривенное' одномоментное введение 0,9 % раствора NaCl, из расчёта 0,4 мл на 100 г.) (Ф.З.Меерсон, 1980).

2. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 110"5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) (19,72) (Ф.З.Меерсон, 1980).

3. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 сек) (Ф.З.Меерсон, 1980).

4. 3-х минутную гипоксию. (E.H.Пашин, 1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005).

Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (e-NOS) определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (Метельская В.А., Туманова Н.Г, 2002).

Для морфологического подтверждение развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца (во всех сериях эксперимента), почек, надпочечников, участков брюшной и сонной артерий). Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Использованы окраски гематоксилином Pero и эозином для выявления ранних повреждений мио-кардиоцитов, по Ван Гизон, ставились ШИК-реакция. При морфометрии сердца использован метод раздельного взвешивания миокарда с определением индексов , определение диаметра кардиомиоцитов по методике Г.Г.Автандилова (1994). Определялись абсолютная и относительная масса надпочечников, в почках оценивался диаметр почечных телец и их клубочков.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. Исследована эндотелиотропная активность ацетилизочистозида (4'-0-р-0-[(-б"-ацетил)-глюкопиранозид изо-скутелляреина) в дозе 20 мг/кг/сут внутрибрюшинно. Ацетилизочистознд, выделен из растения чистец болотный (Stachys palustris L.). Согласно литературным данным, именно в этой дозе у скутелляреиновых производных флавонои-дов выявлены эндотелио- и кардиотропные эффекты (Zhou, J. , 2002, Gao, R.,2008,

В хронических экспериментах при моделировании дефицита оксида азота все лекарственные вещества вводились в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно в течение 7 дней через 30 минут после введения L-NAME.

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований на крысах (Deng L.Y., 1993).

Ингибитор АПФ эналаприла малеат («Рениприл», производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Курск ) спользовали в дозе 0,5 мг/кг

что соответствует данным доступной литературы и выявляет эффективное гипотензивное и кардиопротективное действие в экспериментах, ранее проведённых в нашей лаборатории.

Комбинированное использование ацетилизочистозида - 20 мг/кг (внутрибрюшинно), эналаприла мапеата 0,5 мг/кг (внутрижелудочно) проводилось по вышеописанному протоколу один раз в сутки в течение 7 дней на фоне введения L-NAME.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (±т) и вероятности возможной ошибки (р) рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные, при р<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика функциональных, биохимических и морфологических показателей при моделировании комбинированного L-NAME и стресс -нндуцированном дефицита NO.

Однократное внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 12,5 мг /кг в течение 7 суток в сочетании с 24 часовым эмоционально-болевым стрессом привело к стойкому повышению артериального давления (рис. 1).

В дальнейшем проведение функциональных проб с оценкой реакции на эндотелий-зависимое и эндотелий-независимое расслабление показало существенные различия в группе животных с патологией в сравнении с интактными животными. На рисунке 2а - верхняя кривая - АД систолическое, далее - АД диастолическое и ЧСС. Реакция на введение ацетилхолина характеризуется резким падением артериального давления и брадикардией. После окончания миокардиального компонента - (метка 2) артериальное давление восстанавливается. Треугольник над кривой восстановления артериального давления принимался нами как площадь эндотелиальной реакции.

На рис. 26 представлена реакция на ацетилхолин при моделировании эндотелиальной дисфункции. При этом, видно, что площадь эндотелийзависимой реакции в несколько раз меньше чем у интактных животных.

Аналогично оценивали эндотелийнезависимую реакцию на нитропрус-сид. Обращает на себя внимание отсутствие принципиальной разницы в пло-

щадях эндотелийнезависимых реакций у интактных и опытных групп, несмотря на существенно более высокие цифры АД (рис. 3).

кэд

□ Животные с патологией

АДр

ш

4-1.2"-,.

ММ рТ.СТ.

250

ШИнтактные 0 животные с патологией

-Интактные

-Животные с патологией

eNOS

к

■100 90 80

Ш] Интактные

НЖивотные с патологией

Рис. I. Функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании L-NAME индуцированного дефицита NO.

Здесь и далее в одинаковой последовательности: АД - артериальное давление, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции, АДр - адренореактивность, НС — нагрузка сопротивлением, eNOS - экспрессия NO-синтетазы, NOx - total NO, ДМ - диаметр кардномиоцнтов. * - р < 0,05 в сравнении с группой интактных

животных

NOx

Ш Интактные 0 Животные с патологией

ДМ

17.4

ШЩЩ ШШй® ШШш

ЯШ

Н

И Животные с патологией

- ИктшЛныс: II- животные ¿'антологией;

■ гза.ео Л--1? й-ЙА Л 14 Й'41 о-Й-*? 1 ■ 4 <М. 41»С1 5Х5ТОИС ЬР <т Нй > Я2Н1 2 иа 1в«Э 058 Ргос 9 — • 230.00 АРС1 $-*8ТОЫС В? < \ не 41 Й-48 Г>

г 2ee.ee :-у О ОО . 0РС1 01А5ГС>иС ВР <1Т1 НС > 512Н! —Л— 30 200.09 ЙСС1 ЫйЗТОЫС ВР < К1 НС > к 31 гн- ^ ?е

150.00 - ЗП111!Щ_ ззэ 609.09 А&С1 КЕЙЕТ КйТ£ < 130.00 , III лги! 46?

А б

Рис. 2.

Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эндоте-лийзависимую вазодилятацию (внутривенное введение ацетилхолина 40 мкг\кг) у интактных животных.

Примечание: здесь и везде далее САД- систолическое артериальное давление (мм.рт.ст.); ДАД- диастолическое артериальное давление (мм.рт.ст.); ЧСС- частота сердечных сокращений (уд.мин);

Треугольники над кривой артериального давления-объяснение по тексту.

Математическое выражение описанного явления представлено нами в виде коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющимся отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин. В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил -1,1 ±0,09, у животных с патологией - в 5 раз больше - его значение составило 5,1±0,4(рис. 1).

1л41Д'1.. лай ^¿-¡Г-й. лЦзи.и в 1 ■ >:. < У 1 к:.к iiii.ii:к

н х х-

¿'1» -к: и**-;--: Я ( «н. , . <х ¿» „ ингяг: ■■ см - ш 11111! 11 ' ¡111

1 Лг* );■}

■Ц.и № ЧШ' Ш 1 1 тя | . м| --------i............- 1)1;; -¿>¡11-й ¡у;; 5:

. ---------------.— —т ....... а '5 71

б

Рис. 3.

Кривые САД, ДАД, ЧСС при проведении функциональной пробы на эндоте-лийзависимую вазодилятацию (внутривенное введение нитропруссида натрия 30 мкг\кг) у интактных животных.

Треугольники над кривой артериального давления - объяснение по тексту.

Сочетанная Ь-МАМЕ и стресс - индуцированная эндотелиальная дисфункция привёл к увеличению абсолютных значений ЛЖД в пробе на адрено-реактивность и снижению миокардиального резерва в пробе нагрузки сопротивлением (рис. 1). У интактных животных ЛЖД к 25 секунде снижалось до 83,6±7,7, а у животных с Ь-ЫАМЕ-индуцированной патологией значительно сильнее - до 67,0±5,5 %.

Характерная динамика биохимических маркеров Ь-ЫАМЕ-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис.1. Так, концентрация нитрит-ионов (]МОх) у животных, получавших Ь-ЫАМЕ составил 61,2 ±3.6, тогда как у интактных - 114,1±4.1 мкМ.

Экспрессия эндотелиальной ЫО-синтазы (еЫ08) сывороткой интактных животных составила 72,9±3.8, тогда как у животных, получающих Ь-ЫАМЕ 21,4±4.7%

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие Ь^АМЕ-индуцированной эндотелиальной дисфункции явились результаты морфологических исследований (рис.4). На представленных гистологических препаратах, слева (а) - интактные миокардиоциты, справа (б) -миокардиоциты животных на 7-е сутки с Ь-1\!АМЕ-индуцированной патологией. Наглядно видно, что площадь поперечного сечения резко увеличена при сохранённом диаметре ядер при одном увеличении. Морфометрические исследо-

вания показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,1±1.1, а у животных, поучавших Ь-ЫАМЕ- 18,4±1.1 мкМ (рис.1).

V ; 4 «- - ' *

А ,

\ I , * Ы * т

• * ' - ; , 1 * ■ 1 •

Г: { I < * г.. ( • ■ , "

<■■ • , 1 - 4 4* **

' " ' ■.. ■ :: V. 4. < Л . ¥ 1 гЭ

р2 * : » " » „ .. -Ж Ч ■ <• ■ V Ч ' '*» * <

» ■ *г'ь 1 ,Ь л*

Ч V У - Л

ж . 4 • ., * да.- , , % ■■•ч» ■ ■ <* <

V ' " ' »' г , 1

щ ■, „ ■■■ л " *.. ... : ; ■' .... « 4 . *

* * «» * . ' , ^

Рис. 4.

Морфология миокарда у интактных и опытных животных: а - гистологическая картина миокарда у интактных крыс на поперечном срезе; б - гипертрофия кардиомиоцитов и их ядер у крысы с артериальной гипертензией в модели патологии на поперечном срезе. Окр. гематоксилином и эозином, а, б - х440

Аналогично прослеживалась морфологическая картина изменений сосудистой стенки почечных артериол (рис.5). У интактных животных (а) — клетки эндотелия расположены плоско, при Ь-ЫАМЕ-патологии (б) - сосуд спазмиро-ван, стенка утолщены, эндотелий «вздыблен».

Таким образом, ежедневное в течение 7 суток введение Ь-ЫАМЕ 25 мг внутрибрюшинно вызывает развитие эндотелиальной дисфункции, характеризующейся резким увеличением КЭД, АД, повышением адренореактивности с развитием скрытой сердечной недостаточности, характерными биохимическими сдвигами и гистологической картиной гипертрофией миокарда и гиперплазии сосудистого русла.

V.

«1.

< V г |

# , 1

' А ч

! *

Морфологическая картина почечных артерий у интактных и опытных животных: а - неизмененная артерия почки у интактной крысы; б - перестройка стенки почечной артерии с резким утолщением ее стенки и сужением просвета, гиперплазией эластических структур и гипертрофией гладкомышечных элементов у крысы с артериальной гипертензией в модели с патологией . Окр. гематоксилином и эозином, а, б - х440

2. Исследование эндотелиопротекгнвной активности ацетилизочи-стозида и эналаприла при комбинированной Ь^АМЕ и стресс - индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Наши исследования показали, что ацетилизочистозид обладает выраженным эндотелиопротективным эффектом, превосходящим таковую у эналаприла. Так, КЭД у интактных животных составил — 1,1±0,1, у животных с патологией— 5,1±0,4, с применением ацетилизочистозида (20 мг/кг)- 1,6±0,2, с применением эналаприла (0,5 мг/кг) — 3,3±0,3 (рис.6).

Проба на адренореактивность у животных патологией на фоне терапии ацетилизочистозидом и эналаприлом также обнаружила снижение максимальных цифр левожелудочкового давления. У интактных животных - 199,2±8,3, у животных с патологией - 244,2±4,8, у эналаприла (0,5 мг/кг)- 216,2±10,8, Аналогичная тенденция выявлена в пробе на нагрузку сопротивлением. Сократимость на 25 секунде нагрузки составила у интактных животных - 83,6±2,1 к 5-й секунде, взятой за 100%. Ь-ЫАМЕ-индуцированная патология - 67,0±2,3%, с применением ацетилизочистозида (20 мг/кг) - 80,2±3,2 с применением эналаприла - 82,7±2,8.

ЕЭСАД 0ДАД

I II III IV

I - Интактные:11- Ь-Жпвотныес патологией: III-ацетилщочистозпд 20 мг/кг; У-эналапрнл 0.5 мг/кг:

В эналаприл 0,5 мг/кг И ацетилизочистозид 20 мг/кг ЕЗ Животные с патологией Ш Интактные

244.2*'

192.2

■Ж

мм.рт.ст. 250

100

90 --

80 --

Ш эналаприл 0,5 мг/кг И ацетилизочистозид 20 мг/кг ЕЭ Животные с патологией ® Интактные

-Интактные

—Животные с патологией

■ ацетилизочистозид 20 мг/кг — -к — эналаприл 0,5 мг/кг

5" 20" 25"

72.9

¡Л эналаприл 0,5 мг/кг И ацетилизочистозид 20 мг/кг ЕЭ Животные с патологией О Интактные

¡эналаприл 0,5 мг/кг й ацетилизочистозид 20 мг/кг ЕЭ Животные с патологией 13 Интактные

Рис. 6. Влияние ацетилизочистозида 20 мг/кг и эналаприла 0,5 мг/кг, на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ЫАМЕ индуцированного дефицита N0.

* - р < 0,05 в сравнении с патологией,

** - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных

В эналаприл 0,5 мг/кг Н ацетилизочистозид 20 мг/кг 0 Животные с патологией Ш Интактные

На рис. 6 представлена экспрессия эндотелиальной МО-синтазы в % от контроля сывороткой животных, получавших Ь-ЫАМЕ и указанные препараты. Для интактных животных показатель составил 72,9±3,8 у животных с патологией 20,1±4,7, применением ацетилизочистозида (20 мг/кт) и эналаприла (0,5 мг/кг), соответственно, 39,5±3,5, 48,6, что достоверно выше, чем у животных с патологией, но ниже интактных. Концентрация нитрит ионов в сыворотке крови под влиянием ацетилизочистозида увеличивалась в большей степени в сравнении с эналаприлом (рис. 6).

Влияние указанных препаратов на диаметр миокардиоцитов также выявило существенные преимущества ацетилизочистозида (20 мг/кг) в способности предотвращать гипертрофию миокардиоцитов в сравнении с эналаприлом..

Таким образом, по совокупности функциональных, биохимических, морфологических показателей, отражающих эндотелиопротективные эффекты, ацетилизочистозид 20 мг/кг проявил активность, сопоставимую или превосходящую таковую у ингибитора АПФ эналаприла.

3. Изучение эндотелиопротектнвной активности сочетанного применения резвератрола и ингибитора АПФ при Ь^АМЕ- индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Сочетанное применение эналаприла (0,5 мг/кг) с ацетилизочистозидом (20 мг/кг) на фоне комбинированного Ь-ЫАМЕ и стресс - индуцированного дефицита оксида азота приводило к значительному снижению артериального давления, что не достигалось при монотерапии отдельно ацетилизочистозидом и эналаприлом (рис. 7).

КЭД при сочетанном использовании ацетилизочистозида и эналаприла составил 1,4±0,1, что достоверно отличается от монотерапии эналаприлом -КЭД - 3,3±0,3 и приближается к показателям у интактных животных - КЭД -1,1±0,1 и в 2,5 раза отличается от показателя животных с патологией - 5,1±0,4 (рис.7).

Абсолютная цифра максимального ЛЖД на введение адреналина у животных, получавших эналаприл с ацетилизочистозидом составила - 205,6±3,6, что меньше чем у эналаприла - 216,2±10,8, и ацетилизочистозида, при показателе у интактных - 199,2±8,3 и у животных с патологией - 244,2±4,8 мм рт. ст. (рис. 7).

Аналогичная ситуация отмечалась при проведении пробы на нагрузку сопротивлением. У интактных жиотных показатель составил - 83,6± %, Ь-ЫАМЕ-индуцированная патология - 67,0± %, ацетилизочистозид - 80,2±2,1, сочетанное применение ацетилизочистозида и эналаприла - 88,2±3,0 (рис. 7).

В эналаприл 0,5 мг/кг+ацетшшз В ацетилизочистозид 20 мг/кг И эналаприл 0,5 мг/кг ЕЗ Животные с патологией 11 Интактные

1 - Интпктные:П-Жпвотные с ппкГюгиеп: Ш-эйплапрпл 0.5" мг/кг. 1У-аиет(!Д|12оч«ст(Шл 20 мг/кг: V- энаяапршг 0.5 мг/кг+ацепглщо'щстещи 20 мг/кг

§

121.7*

Ж

тгг

Ш эналаприл 0,5 мг/кг+ацетилизочистозш В ацетилизочистозид 20 мг/кг 0 эналаприл 0,5 мг/кг О Животные с патологией ■ Интактные

Е7%*

ТОО/.*

-Интактные

- Животные с патологией "эналаприл0,5 мг/кг ацетилизочистозид 20 мг/кг эналаприл 0,5 мг/кг+ацегилизочистозид 20 мг/] ■ и

20"

25"

□ эналаприл 0.5 мг/кг+ацетилизочнстозид 20 мг/кг

□ пцетплизочистозил 20 мг/кг Вэналаприл 0.5 мг/кг

□ Животные с патологией 03 Интактные

□ эналаприл 0.5 мг/кг+ ацетилизочистозид 20 мг/кг И ацетилизочистозид 20 мг/кг

□ эналаприл 0.5 мг/кг

□ Животные с патологией О Интактные

Рис. 7. Влияние комбинированного применения ацетилизочистозида 20 мг/кг и эналапри-ла 0,5 мг/кг на функциональные, биохимические и морфологические показатели при моделировании Ь-ИАМЕ индуцированного дефицита N0.

* - р < 0,05 в сравнении с группой животных с патологией,

** - р < 0,05 в сравнении с группой интактных животных

0 эналаприл 0.5 мг/кг+ацетилнзочпетозпд 20 мг/кг О ацетилизочистозид 20 мг/кг О эналаприл 0.5 мг/кг О Животные с патологией

Оценка экспрессии eNOS не выявила влияния комбинации препаратов. В то же время концентрация нитрит ионов (NOx) при сочетанном использовании эналаприла и ацетилизочистозида оказалась выше, чем при монотерапии энала-прилом (рис. 7).

Морфометрия диаметра миокардиоцитов также показала преимущество комбинации эналаприла и ацетилизочистозида по сравнению с монотерапией эналаприлом. Диаметр миокардиоцитов составил в группе эналаприл + ацетилизочистозида - 9,5±0,3, ионотерапии эналаприлом - 10,2±1,0, интактных -9,1±1,1, животных патологией - 17,4±1,1 мкм.

Таким образом, сочетанное применение ингибитора АПФ эналаприла с с флавоноидом ацетилизочистозидом выявило существенные преимущества по сравнению с монотерапией эналаприлом' по совокупности функциональных, биохимических и морфологических критериев, характеризующих выраженность и степень эндотелиальной дисфункции, а также сопутствующих ей признаков гипертрофии миокарда и ремоделирования сосудистого русла.

ВЫВОДЫ

1. Комбинированная L-NAME и стресс - индуцированная модель дефицита оксида азота сопровождается у лабораторных животных развитием выраженной артериальной гипертензии (190/145 мм рт.ст.), повышением адреноре-активности и снижением резервов сократимости При этом коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД®), представляющий собой соотношение площади под кривой сосудистой реакции на эндотелийнезависимую вазодилатацию (нитропруссид натрия) к площади сосудистой эндотелийзависимой вазодилата-ции (ацетилхолин) оказался в 5 раз выше, чем у интактных животных.

2. Сочетанная L-NAME и стрессорная модель патологии одновременно приводит к снижению, в 3,5 раза, уровня нитрит-ионов NOx и в 2 раза, снижается экспрессия фермента eNOS. Морфологически наблюдается гипертрофия миокарда и мышечного слоя сосудистой стенки.

3.Ацетилизочистозид в дозе 20 мг/кг однократно в течение 7 суток проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, что выражалось в снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и исчерпание миокардиального резерва на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Ацетилизочистозид 20 мг/кг предотвращал увеличение поперечного диаметра миокардиоцитов. Монотерапия ацетилизочистозидом не позволяла достичь целевых значений артериального давления.

4. Эналаприл 0,5 мг/кг проявлял эндотелиопротективное и кардиопротек-тивное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0 по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Монотерапия эналаприлом не достигала целевых значений артериального давления.

5. Комбинированное использование ацетилизочистозида (20 мг/кг) с эна-лаприлом 0,5 мг/кг оказывало эндотелиопротективное действие на модели L-NAME-индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. Результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности на фоне на фоне снижения сократимости миокарда на пике реоксигенации. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов под влиянием комбинации ацетилизочистозида с эналаприлом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Брусник М.С., Кочкаров В.И., Покровский М.В., Покровская Т.Г., Да-ниленко JI.M. Эндотелиотропное действие полифенольных соединений из stachys palustris / Сборник материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - Москва, 2010- С.585-586.

2. Брусник М.С., Кочкаров В.И., Покровский М.В., Покровская Т.Г. Возможность использования флавоноидов в фармакологической коррекции эн-дотелиальной дисфункции / «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» Сборник трудов межвузовской научной конференции,посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ/ -Курск-2009.-С. 127-128.

3. Брусник М.С., Кочкаров В.И., Покровский М.В., Покровская Т.Г. Кардиопротективное действие сочетаний резвератрола с эналаприлом и ло-зартаном при гипоэстрогенном дефиците/ «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» Сборник трудов межвузовской научной конференции,посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ/ - Курск - 2009. - С. 129-130.

4. Брусник М.С., Кочкаров В.И., Покровский М.В., Покровская Т.Г. Эн-дотелипротективные эффекты сочетаний резвератрола с эналаприлом и ло-зартаном при гипоэстрогенном дефиците / «Актуальные вопросы фармакологии и фармации» Сборник трудов межвузовской научной конференции,посвященной памяти профессора Владислава Васильевича Пичугина и 75-летию КГМУ/ - Курск -2009. - С. 131-132.

5. Барсуков В.С, Дудка В.Т., Артюшкова Е.Б., Полонская К.В., Бобраков К.Е., Колесник И.М., Чулюкова Т.Н., Брусник М.С., ДолженковаТ.В. Фармакологическая коррекция морфологических изменений в сердце и почках при L-NAME.индуцированном дефиците NO / Сборник материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - Москва, 2010- С.576

6. В. И. Кочкаров , М. С. Брусник, Т. Г. Покровская, J1. М. Даниленко, М. В. Покровский. Эндотелиопротективные и кардиопротективные эффекты производных изоскутелляреина и их комбинаций с эналаприлом/Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2010. -№ 1 (91)-с. 55-58

7. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г., Гладченко М.П., Артюшкова Е.Б., Пашин E.H., Брусник М.В., Чулюкова Т.Н., Клявс Ю.П., Корнеев М.М., Зеленкова Т.И., Малыхин В.А., Белоус A.C., Залозных Я.И., Маяков А.И. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиалыюй дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте /Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2006. - № 10 (91) - с. 72-77.

8. Корокина Л.В., Граник В.Г., Макаров В.А., Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б., Покровская Т.Г., Покровский М.В., Корокин М.В., Маяков А.И., Брусник М.С., Пашин E.H. Изучение эффектов синтетических доноров оксида азота при L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции /Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2006. - № 9 (90) -с. 141-145

9. Покровская Т.Г., Кочкаров В.И., Покровский М.В., Артюшкова Е.Б., Пашин E.H., Корокин М.В., Корокина Л.В., Залозных Я.И., Клявс Ю.П., Брусник М.В., Корнеев М.М., Черноморцева Е.С., Чулюкова Т.А., Зеленкова Т.И., Ахметзянова И.Н., Смешко Н.В., Малыхин В.А. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции /Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2007. - № 1-2 (94-95) - с. 146-150

10. Белоус A.C., Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г., Артюшкова Е.Б., Пашин E.H., Брусник М.В., Чулюкова Т.Н., Клявс Ю.П., Корнеев М.М., Зеленкова Т.И., Малыхин В.А., Залозных Я.И. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты смеси гомеопатических разведений афинно очищенных поликлональных кроличьих антител к эндотелиальной синтазе оксида азота (eNOS) С12, С30, С200 при экспериментальном моделировании L-Name индуцированной эндотелиальной дисфункции /Кубанский научный медицинский вестник. - Краснодар 2007. - № 1-2 (94-95) - с. 23-26

11. Покровская ТТ., Кочкаров В.И., Покровский М.В., Даниленко Л.М., Артюшкова Е.Б., Метельская В.А., Туманова Н.Г., Клявс Ю.П., Корнеев М.М., Брусник М.С. Исследование эндотелиопротективного эффекта L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном // Биомедицина -№4-2006-С, 107-109.

12. Корокина Л.В., Граник В.Г., Макаров В.А., Кочкаров В.И., Артюшкова Е.Б., Покровская Т.Г., Покровский М.В., Маяков А.И., Брусник М.С., Коррекция L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции при использовании синтетических доноров оксида азота / Биомедицина - №4 - 2006 -С. 90-92.

Подписано к печати 08.11.2010 г. Формат 60x84 1/16. Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1427

Отпечатано с готового оригинал-макета на полиграфической базе ГОУ ВПО «Орловский государственный технический университет» 302020, г. Орел, Наугорское шоссе, 29.

К настоящему времени роль эндотелия доказана в патогенезе сердечнососудистых заболеваний. Эндотелиальная дисфункция (ЭД) рассматривается как предиктор целого ряда заболеваний, в том числе артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, а также патогенетическим компонентом органных повреждений при сахарном диабете, гипоэстрогенных и других состояниях [3, 87, 88, 90].

При данных заболеваниях эндотелий является первоочередной мишенью, поскольку участвует в регуляции сосудистого тонуса, гемостаза, иммунного ответа, миграции клеток крови в сосудистую стенку, синтезе факторов воспаления и их ингибиторов, осуществляет барьерные функции [181,201].

При развитии различных патологических состояний участие эндотелия многогранно и связано как с регуляцией сосудистого тонуса, так и с участием в процессе атерогенеза, тромбообразования, защиты целостности сосудистой стенки и др. [21,23, 24, 26]. В качестве основных стимулов, вызывающих ответ эндотелиальной клетки следует выделить изменение скорости кровотока (увеличение напряжения сдвига), тромбоцитарные медиаторы (серотонин, АДФ, тромбин), а также циркулирующие и/или "внутристеночные" нейрогормоны (катехоламины, вазопрессин, ацетилхолин, эндотелии, брадикинин, гистамин и др.) [303].

Среди изобилия биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, важнейшим является оксид азота - N0. Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка N0 с помощью эндотелиальной Ж)-синтазы (еЖ)8) из Ь-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов [7,13, 14, 90].

Недостаточная продукция N0 в сосудистом русле является ранним признаком ЭД. С одной стороны, это связано со снижением биодоступности

N0, с другой - со сниженной активностью еЖ)8 в результате присутствия эндогенных—или, экзогенных ингибиторов её функционирования или снижения доступности его субстрата, Ь-аргинина. В основе снижения биодоступности N0 лежат изменения продукции синтезируемых сосудистыми эндотелиальными клетками (ЭК) биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение имеют свободные радикалы кислорода (СРК), которые, соединяясь с N0, образуют избыточное количество такой реактивной формы кислорода (РФК) как пероксинитрит (01400") [121]. Пероксинитрит являясь высокотоксичным соединением повреждает мембраны и ДНК клетки, вызывает мутации и перекисное окисление липидов низкой плотности [152]. При этом возникает оксидантный стресс, активирующий большое количество оксидантчувствительных факторов транскрипции (таких как нуклеарный фактор каппа-В (ЪШ-кВ), которые повышают экспрессию адгезивных молекул эндотелия (1САМ-1, УСАМ-1), а также различного рода факторов роста и хемокинов, способствующих развитию воспалительных и других процессов протекающих при атеросклерозе [47, 196].

Учитывая возможные механизмы реализации предотвращения развития ЭД, следует отметить, что одними из перспективных групп для фармакологической коррекции ЭД являются флавоноидные соединения [205, 206, 210]. Исследования, посвященные изучению ангиопротекторных и антиоксидантных свойств природных флавоноидов, в том числе и при диабетической микро- и макроангиопатии, выявили, что флавоноиды обладают эндотелиопротективным действием. Особенности антиоксидантного действия этих веществ состоят в том, что они могут инактивировать не только гидропероксидный, алкоксильный и липидные радикалы, но и супероксидный анион-радикал. Наличие антирадикальных свойств у данных соединений основывается на том, что химическая структура флавоноидов содержит ароматическое кольцо и присоединенные к нему гидроксильные группы, которые способны тормозить процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) на стадии кислородной инициации и передачи электронов с одной активной формы на другую. Возможным механизмом утилизации кислородных радикалов является способность гидроксильного соединения флавоноидов отдавать атом водорода и связывать более токсичные соединения, нейтрализуя их таким образом.

Цель исследования: изучение эндотелипротективного действия нового флавоноидного соединения ацетилизочистозида (гликозида 4 — глюкопиранозида изоскутелляреина) и его комбинации с ингибитором АПФ -эналаприлом в эксперименте.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи исследования:

1. Оценить развитие эндотелиальной дисфункции при комбинированной Ь-ИАМЕ и стресс - индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте с использованием результатов функциональных проб.

2. Исследовать влияние сочетанной Ь-ЫАМЕ и стрессорной патологии на динамику показателей биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

3. Изучить эндотелиопротективную активность ацетилизочистозида при Ь-ЫАМЕ и стресс - индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

4. Изучить эндотелиопротективную активность ингибитора АПФ -эналаприла при Ь-ИАМЕ и стресс - индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

5. Изучить эндотелиопротективную активность сочетанного применения ацетилизочистозида и ингибитора АПФ эналаприла при Ь-ЫАМЕ и стресс -индуцированной модели дефицита N0 в эксперименте.

Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ моделирования комбинированной Ь-ЫАМЕ и стресс - индуцированной N0-дефицитной эндотелиальной дисфункции. Продемонстрировано, что эндотелиальная дисфункция' характеризуется изменениями- соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессия NO-синтазы), а также отрицательной динамикой морфологических показателей сердечнососудистой системы.

В работе впервые показано, что ацетилизочистозид 20 мг/кг (однократно внутрибрюшинно в течение 7 суток) оказывает эндотелийпротективное действие на модели комбинированной L-NAME и стресс - индуцированной NO-дефицитной ЭД. Эналаприл 0,5 мг/кг (однократно внутрижелудочно в течение 7 суток) как монотерапия также обладает эндотелиопротективными эффектами на выбранной модели патологии. Сочетанное использование ацетилизочистозида с ингибитором АПФ эналаприлом показало положительное эндотелиопротективное взаимодействие.

Практическая значимость. В работе обоснована эффективность сочетанного применения ацетилизочистозида с ингибитором АПФ эналаприлом для коррекции комбинированной L-NAME и стресс -индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид натрия (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессию N0-синтетазы), а также добиться положительной динамики морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов, прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением и адренореактивности, и т.д.).

Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания ацетилизочистозида при состояниях, сопровождающихся эндотелиальной дисфункцией.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования, касающиеся антигипертензивной и эндотелиопротективной активности эналаприла малеата «Рениприл» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», включены в состав документов, поданных на регистрацию в МЗ РФ (РУ № 000084/01-2000).

Материалы диссертационного исследования, касающиеся изучения эндотелиопротективной активности ацетилизочистозида используются в лекционных курсах кафедр фармакологии КГМУ, фармхимии и фармакогнозии БелГУ.

Апробация работы. Материалы работы доложены 17 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» в 2010, на межвузовской научной конференции посвященной памяти проф. В.В.Пичугина и 75-летию КГМУ, итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых КГМУ в 2010. г. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, НИИ экологической медицины КГМУ. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Положения, выносимые на защиту

1. Комбинированная L-NAME и стресс - индуцированная NO-дефицитная эндотелиальная дисфункция характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) в 5 раз, резким снижением показателей биохимических маркеров (Total NO, экспрессия NO-синтазы), а также характерной динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр миокардиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением, и адренореактивности и т.д.).

2. Ацетилизочистозид 20 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрибрюшинно оказывает эндотелийпротективное действие на модели комбинированной Ь-ИАМЕ и стресс - индуцированной Ж)-дефицитной ЭД. Эналаприл^0,5 мг/кг однократно в течение 7 суток внутрижелудочно как монотерапия также обладали эндотелиопротективным эффектом на выбранной модели патологии. *

3. Сочетанное использование ацетилизочистозида (20 мг/кг) с эналаприлом 0,5 мг/кг оказывает выраженное эндотелиопротективное действие на модели комбинированной Ь-КАМЕ и стресс - индуцированного дефицита N0, что выражается в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов Т\Юх. При этом более существенно снижается АД, в отличие от монотерапии отдельно ацетилизочистозидом и эналаприлом. Результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности на фоне снижения реакции на реоксигенацию. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение под влиянием комбинации ацетилизочистозида с эналаприлом увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов.

3. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 210 источников, из них 32 отечественных и 178 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 124 страницах машинописи, содержит таблиц - 13, рисунков -31, схем - 1.

выводы

17~ Комбинированная L-NAME и стресс - индуцированная^ модель дефицита оксида азота сопровождается у лабораторных животных развитием выраженной артериальной гипертензии (190/145 мм рт.ст.), повышением адренореактивности и снижением резервов сократимости. При этом коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД®), представляющий собой соотношение площади под кривой сосудистой реакции на эндотелийнезависимую вазодилатацию (нитропруссид натрия) к площади сосудистой эндотелийзависимой вазодилатации (ацетилхолин) оказался в 5 раз выше, чем у интактных животных.

2. Сочетанная L-NAME и стрессорная модель патологии одновременно приводит к снижению, в 3,5 раза, уровня нитрит-ионов NOx и в 2 раза, снижается экспрессия фермента eNOS. Морфологически наблюдается гипертрофия миокарда и мышечного слоя сосудистой стенки.

3.Ацетилизочистозид в дозе 20 мг/кг однократно в течение 7 суток проявлял выраженное эндотелиопротективное действие на модели L-NAME и стресс-индуцированного дефицита NO, что выражалось в снижении КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx. Результаты нагрузочных проб выявили предотвращение повышения адренореактивности и исчерпание миокардиального резерва на фоне повышения реакции на реоксигенацию. Ацетилизочистозид 20 мг/кг предотвращал увеличение поперечного диаметра миокардиоцитов. Монотерапия ацетилизочистозидом не позволяла достичь целевых значений артериального давления.

4. Эналаприл 0,5 мг/кг проявлял эндотелиопротективное и кардиопротективное действие на модели сочетанной L-NAME и стресс -индуцированного дефицита NO по совокупности функциональных, биохимических и морфологических показателей. Монотерапия эналаприлом не достигала целевых значений артериального давления.

5. Комбинированное использование ацетилизочистозида (20 мг/кг) с эналаприлом 0,5 мг/кг оказывало эндотелиопротективное действие на модели комбинированной Ь-ЫАМЕ и стресс -индуцированного дефицита N0, выражающееся в снижении КЭД, а также в предотвращении снижения содержания нитрит-ионов МЭх. Результаты нагрузочных проб выявили способность комбинации предотвращать повышение адренореактивности на фоне на фоне снижения сократимости миокарда на пике реоксигенации. Морфологические исследования миокардиоцитов обнаружили предотвращение увеличения поперечного диаметра миокардиоцитов под влиянием комбинации ацетилизочистозида с эналаприлом.

102

Заключение

Начальный этап наших исследований был посвящен формированию объективной методологии для изучения эндотелиальной дисфункции в эксперименте. Эксперименты проводились на белых крысах линии Wistar, моделировалась экспериментальная • патология, которая в последующем оценивалась с использованием физиологическими, биохимическими и морфологическими методами.

Моделирование эндотелиальной дисфункций (ЭД) ежедневным в/б введением в течение 7 дней крысам-самцам ингибитора фермента eNOS N-нитро-Ь-аргинин метилового эфира (L-NAME-индуцированная ЭД) приводит к выраженной артериальной гипертензии (АГ). Соответственно АД у животных с патологией составило САД - 190,3 ± 6,7, ДАД - 145,0 ± 3,9 мм рт.ст., тогда как у интактных животных САД - 137,7 ±3,7, ДАД - 101,9 ± 4,3 мм рт.ст. Следует отметить, что полученные результаты согласуются и подтверждают результаты подобных исследований, поскольку данная модель патологии воспроизводит дисфункцию эндотелия, развивающуюся в организме при повышенном уровне эндогенного ингибитора фермента eNOS ассиметрического диметиларгинина (АДМА) [45, 68, 145].

Так, известно, что повышенный уровень АДМА наблюдается при атеросклерозе [45, 57, 68, 145, 150], и коррелирует с выраженностью заболевания, а также со сниженной экскрецией продуктов метаболизма NO. Данное повышение концентрации АДМА является причиной дисфункции эндотелия при атеросклерозе, о чем свидетельствует, в частности, снижение эндотелийзависимой вазодилатации. Плазма крови больных атеросклерозом вызывает сокращение сосудистых колец in vitro, причем данный эффект устраняется при инкубации с L-аргинином. Также, торможение eNOS под влиянием АДМА приводит к оксидативному стрессу в эндотелиальных клетках (ЭК) и повышает экспрессию редокс-чувствительных генов, которые ' кодируют адгезивные молекулы эндотелия в такой же степени, как это имеет место на ранней стадии атеросклероза [58].

Механизм ингибирования выработки N0 в случае использования Ь-ИАМЕ заключается в конкурентном ингибировании фермента е!\Ю8 аналогом Ь-аргинина — Ь->1МА. Ь-ИАМЕ фактически является пролекарством: в организме этот эфир гидролизуется с участием специальных ферментов — эстераз, давая активный ингибитор — Ь-КЫА. В свою очередь, дефицит сосудистого N0 вызывает существенные изменения функций системы кровообращения в целом. Эти нарушения включают: снижение эффектов эндотелийзависимых вазодилататоров и повышение вазоконстрикторных влияний, рост АД, нарушения системной и региональной гемодинамики, функций сердца, увеличение экспрессии адгезивных молекул эндотелия, агрегации тромбоцитов; прилипание их и лейкоцитов к сосудистой стенке; пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток с образованием неоинтимы, синтез внеклеточного матрикса и др.[56,76].

Для оценки степени развития эндотелиальной дисфункции в ходе проведенных нами исследований был выявлен показатель, названный нами КЭД® (коэффициент эндотелиальной дисфункции), являющийся, отношением площади эндотелийнезависимой вазодилатации (ЭНВД) -восстановления АД в ответ на введение нитропруссида (НП) к площади эндотелийзависимой вазодилатации (ЭЗВД) - восстановления АД в ответ на введение ацетилхолина (АХ). На наш взгляд именно КЭД® является объективным показателем ЭД, так как, с одной стороны, учитывает снижение вазодилатационного ответа на ацетилхолин, а с другой стороны, учитывает увеличение ответа вазодилатации на нитропруссид, который связан с гиперреактивностью точек приложения эндогенного N0 в результате его длительного дефицита.

Степень развития эндотелиальной дисфункции, выявленная с помощью КЭД®, демонстрировала увеличение данного показателя у животных с блокадой 1Ч0-синтазы - 5,4 по сравнению с интактными животными - 1,1.

L-NAME-индуцированная модель патологии приводит к повышению показателей~сократимости миокарда, ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt. Значения были достоверно выше соответствующих значений интактных животных, что, вероятно, обусловлено гипертрофией левого желудочка. Кроме того, проба на адренореактивность, нагрузка сопротивлением на 25 секунде пережатия аорты и постгипоксическая реактивность миокарда сопровождались достоверно более высокими значениями ЛЖД и скоростных показателей, что также согласуется с данными по эндотелиальной дисфункции [124, 171].

Результаты* определения биохимических маркеров ЭД подтвердили результаты физиологических методов. Так, NO-продуцирующая функция эндотелия, исследованная на основании данных увеличения- экспрессии е-NOS (в процентах от контроля) и содержания нитрит-ионов NOx, обнаружила, что моделирование E-NAME- индуцированного дефицита N0 приводит к резкому снижению экспрессии e-NOS и содержания нитрит-ионов (NOx).

Также результаты гистологических исследований показали развитие гипертрофии- миокардиоцитов, утолщение мышечного слоя сосудистой стенки и спазм артериол, наиболее выраженный' в почечных артериях, а также «вздыбливание» эндотелиоцитов:

Данный комплекс методических подходов, использованный нами* с применением функциональных, биохимических и морфологических методов, связанный с развитием дефицита' N0! вследствие блокады N0-синтазы, позволил нам в достаточной степени объективно оценивать состояние функции эндотелия при моделировании» ЭД, и последующей ее фармакологическойкоррекции.

Используя^ данный методический комплекс, в дальнейшем были проведены сравнительные исследования» флавоноидного гликозида -ацетилизочистозида с ингибитором АПФ эналаприлом.

Как показали результаты исследования, на фоне L-NAME-индуцированного дефицита NO ацетилизочистозид в дозе 20 мг/кг снижал

КЭД (1,6±0Д) в сравнении с животными с патологией (5,4±0,6), не приводя цифры давления к заданному уровню. В данном случае это является свидетельством самостоятельного значения КЭД и вовлечения в патогенетический процесс не только нитроергической системы, но и всех элементов гуморального и нейрогенного контуров регуляции системы кровообращения.