Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Исследование иммуноактивных свойств гуморальных факторов тимуса северного оленя

ю О К 911'

ЛВДШ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

ПРОТОПШОВ Борис Владимирович

ИСИВДОВАНИЕ ИШУНОАКТИВНЫХ СВОЙСТВ ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ТИМУСА. СЕВЕРНОГО ОЛЕНЯ

14.00.35 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 1991

Работа выполнена б Институте клинической иммунологии СО АМН СССР, г. Новосибирск. .

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор В.И.Коненков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.И.Аутеншгос

кандидат медицинских наук Е.Р.Черных

Ведущая организация - Институт иммунологии МЗ СССР

Защита состоится "_"_1991 г. в_часов на заседании специализированного совета К.001.01.01 (Аллергология и иммунология) при Институте клинической иммунологии СО АМН СССР (630091, г. Новосибирск, ул. Ядринцов-ская, 14).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО АМН СССР.

Автореферат разослан "_"_1991 г.

Учений секретарь специализированного совета ,

кандидат биологических наук . О.Т.Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время с тамуноактивными """^препаратами тишческой природы связываются большие надежды в плаве их возможного применения с целью физиологической коррекции нарушенных функций клеток иммунной системы. Однако, с одной стороны, отсутствие четких разработок по их применении при различных иммунопатологических состояниях, информативных критериев по оценке их эффективности, а с другой - неясность механизмов их действия, не позволяет применять препараты тимуса в клинике с точно прогнозированным эффектом. Необходим и поиск новых высокоактивных полипептидных тимических экстрактов, обладающих селективным воздействием на отдельные субпопу ляции функционально активных иммунокомпетентных клеток, а таете выявление активных действующих пептидов и их композиций у производимых препаратов.

В настоящее время показаны свойства гормонов тимуса регулировать экспрессию многих универсальных и функционально активных мембранных глдкопротеидов, представленных как на предшественниках Т-лкмфоцитов - sc-1 антигена (Ярилин A.A. с еоавт. 1086 ), РНА рецептора ( Baldasaare А. е.а. 1988 ), Thy-1 ( Млхна И.Г. 1988 ), рецепторов к глюкокоргикоидам ( Ма d.d., Но а.н. 1984 ), а также и на зрелых формах Т-клеток - Е рецептора ( Goldstein A.L. 1975 ) И рецептора К И1-2 ( Sztein м., Serrate s. 1986 )• Кроме этого установлено, что ряд тимических гуморальных факторов (тимозин фракция 5 ( Talmadge J.е., Lenz в. 1984} тимусннй гуморальный фактор - тнр ( sholmm J., Eshel I. 1980 ) И TP-I ( Menconi E. e.a. 1980 ) ПРОЯВЛЯЮТ СВОЮ аКТШ&-ность при реализации клетками иммунной системы своих эффектор-ных и регуляторных функций. Выявление механизмов действия тимических препаратов в отношении функциональной активности клеток иммунной системы является актуальной задачей. Учитывая важность экспрессии молекул гистосоЕместимости в процессах функционирования иммунокошетентных клеток и в межклеточных взаимоотношениях, особое значение приобретает выявление способностей тимических гуморальных факторов к регуляции уровня экспрессии генных продуктов главного комплекса гистосовместимости (ГОГС).

Очевидно, что проблема тишческой регуляции уровня экспрессии нъа антигенов на клетках иммунной системы важна в плане выявления механизмов действия гормональных факторов вилоч-

' ковой железы. Решегаэ этого вопроса позволило бы с новых позиций подойти к физиологической коррекции многих иммунопатологических состояний и значению тимической активности в функционировании иммунокомпетентных клеток.

Цель и задачи исследования. Изучить воздействие нового препарата из тимуса северного оленя - олевила, на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток здоровых лиц в сопоставлении с фармакопейными тимическими препаратами.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1.« Изучить воздействие олевила на уровни экспрессии га;., антигенов I и II классов на поверхностных мембранах Т-лшйоци-тов, их субпопуляциях с фенотипом СБ4+ исоз+, не-Т-лимфоцитов и моноцитов периферической крови здоровых лиц.

2. Исследовать влияние олевила и его фракций на функциональную активность лимфоцитов, стимулированных аллогеннщи клетками в смешанных культурах.

3. Проанализировать взаимосвязи функциональной активности иммунокомпетентных клеток в смешанных культурах с уровнем экспрессии антигенов гиетосовместимости II класса на поверхностных мембранах отвечающих и стимулирующих клеток и их изменение при воздействии олевила.

4. Провести сравнительный анализ иммуномодулиругацей активности олевила с другими тимическими препаратами - тактивином, тималином и их синтетическим аналогом - тимогеноы.

Основные результаты исследования и их новизна. В результате изучения иммуноактивных свойств нового препарата из вилоч-ковой железы северного оленя - олевила (название условное), выявлены его механизмы действия на функциональную активность лимфоцитов периферической крови здоровых доноров.

Методами двойной иммунофяуоресценции с панелью моноклональ-ных антител (МкАТ) впервые установлено, что тимические гуморальные факторы, в том числе олевил, увеличивает уровень экспрессии ны-вл антигенов на Т-лимфоцитах, что является признаком активации данного класса клеток иммунной системы. Показано, что клетками-мишенями для олевила являются и не-Т-лимфоциты, на поверхностной мембране которых каблвдаегся снижение суммарного количества ньа-ш молекул.

Впервые показано, что типические гуморальные факторы воздействуют на процессы экспрессии ньа-dr молекул гистосовмести-мости на поверхностных мембранах регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов с фенотипом cd4+ и cd8+. При этом наблюдаются процессы преимущественной активации Т-клеток с хелперно-индуктор-ными свойствами, что выражается е инверсии баланса экспрессии hla-dr антигенов на сщ+ .и сш+ Т-лимфоцитах в сторону преобладания dr молекул на субпопуляции хелперов/индукторов.

Установлено, что тимические гуморальные факторы модулируют уровень функциональной активности лимфоцитов. Модулирующий эффект препаратов зависит от исходного уровня параметров активации и функционального состояния Г-лимфоцитов и максимально проявляется на клетках, обладаюнщх низкой пролиферативной активностью в CKJI и минимальным содержанием hla-dr молекул на поверхностной мембране.

Выявлены франции олевила, обладающие наивысшей активностью в отношении экспрессии антигенов II класса ГКГС и функциональной активности лимфоцитов периферической крови. При этом установлено, что в состав олевила входят полипепгиды, оказывающие как селективное действие на Т— или В-лимфоциты, так и проявляющие активность в отношении обоих классов иммунокомпетентных клеток.

Впервые проведенный сравнительный анализ активности отечественных типических препаратов тактивина, тималина и тимоге-на на функциональные свойства клеток иммунной системы в СКЛ и сопоставление их эффектов с таковыми олевила, позволили сделать вывод о наибольшей, активности олевила, его полипептидных фракции и тимогена.

Детальное сопоставление механизмов действия олевила и так-тиЕина показало их схожесть в отношении Т-звена иммунитета и различие е воздействии на В-клетки.

Практическая значимость. Выявленные иммуномодулирующие свойства препарата тимической природы - олевила, позволяют ожидать положительный эффект при использовании препарата е клинике у больных с иммунопатологическими процессами, сопровождающимися дефектами хелперных Т-лимфоцитов. Определена активность и установлены дозозависимые эффекты олевила и его полипептвдннх фракций на исследованные параметры клеток-мишеней, что позволяет рекомендовать применение препаратов в конкретных дозировках,

Модифицированный метод двухцветной количественной пзго-фиуоринетрив с МкАТ и первичная аллогенн&ч СК.1 »-орут быть рекомендованы в практику научных лабораториях как тест-систе:;к для оценки и сравнения активности тхмпчесхих г?моральны?; факторов.

Предложен катод оиеккг свойств юздвоактяьпых препарат«© по их способности активировать регулягорше суопсцуляцпи Т-лам-фоцетов о фенотипом CD4+ и cds+, что является пЕЗлзрыаткЕнрт критерием при определении направленное?!: денег::;:.? я ргг^гьтн-руЕщего эффекта препаратов.

Разработаны щшнцгзш подбора донорег-, ла* когорюс обладают наибольшей чувствительности) к дэ;:ст::::.с' р£гудягор:шх гакичвекЕГ факторов и могут быть кепояьвоват: г теет-ягсг^-ах для определения и сравнения активности разлкчикх гхл^еекпх препаратов.

Основные положения, выносимые на задпту.

1. Тшшческие гуморальные факторы оказквакт воздействие на экспрессию HLA антигенов II класса, локализованных ка поверхностной мембране CD4+ и cds+ позитивных субклассов Т-лн^ошгтов, однако эффекты олеЕила шире и проявляются не только на Т-клег-ках, но н на не-Т-лимфоцитах.

2. Иимунолоютеская активность слевила связана с преимущественной активацией и усилением функциональной активности хел-перно-шдукторкых Т-димфоцптов с фенотипом cd4+,ee+, что подтверждается максималькж аффектом препарата к моменту пика про-лиферативной активности Г-хелперов в СКЛ.

3. Гуморальные факторы тимуса северного оленя с различной молекулярной массой способны изменять функциональную активность лимфоцитов и воздействовать на уровни экспрессии hla-dr антигенов на поверхностных мембранах Т- и не-Т-лимфоцитов, при этом эффекты^ и активность ряда фракций отличаются от таковых, присущих цельному препарату олевил.

4. Тест-система регистрации поверхностных маркеров активации на различных субклассах лимфоцитов периферической крови в сочетании с принципами отбора доноров клеток крови позволяет проводить скрининг активности тимических гуморальных факторов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора ли-

тературы, описания материалов к методов, результатов исследования и их с0с.7"'д°1:т1я, кзлс.теянчх в 6-ти главах, заключения z выводов. Иллюстрирована 23 таблицами и 9 рисунками. Список литературы состоит из 196 источников, из них 39 отечественных автороЕ.

Апробация работы и публикации. Материалы работы были доложены и обсуздены на региональной конференции иммунологов Сибири и Дальнего Востока "Иммунология на Востоке страны" (Красноярск, 1988 г.), I Всесоюзном симпозиуме по икмуногенетике (Новосибирск, 1989 г.), Г Всесоюзном съезде иммунологов (Дагомыс, 1989 г.), конференции молодых ученых СО АМН СССР "Молодые ученые медики - науке и практическому здравоохранению" (Новосибирск, 1989 г.), конференции молодых ученых Сибири и Дальнего Востока (Красноярск, 1990 г.). По теме работы имеется положительное решение о выдаче авторского свидетельства на заявку К 4678398 "Способ получения икыуноактивных тимусных полипептидов" .

Диссертация апробирована на расширенном семинаре Института клинической игжунологии СО АМН СССР 14 марта 1991 года. Но тогзо диссертации опубликовано 6 печатных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Работа проведена на мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови здоровых доноров в возраста от 18 до 40 лет, зафиксированных на Областной станции переливания крови г. Новосибирска. Общая численность группы 115 человек. Методами иммунофлуоресцентного анализа исследованы МНК от 61 донора. Постановка культур была осуществлена с МНК от 80 доноров. Комплексом перечисленных методов исследования МНК от 26 доноров.

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови осуществлялось стандартным методом по Bojum а. (1968) на одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографина, плотностью 1,078 г/см . После выделения и подсчета МНК подвергались преин-кубации с тимическими препаратами в опытных пробах или только в полной питательной среде в контрольных.

Приемы преинкубации мононуклеарных клеток с иммуноактивными факторами тимической природы. Навески тимических факторов север-

ного оленя растворялись в питательной среде rpmi-i640 (НПО "Вектор", Ыинмедбиопроы), стерилизовались фильтрацией через мшшипоровые фильтры с диаметром пор 0,22 мкМ (Владипор) и добавлялись к культивируемым клетка:.! в диапазоне конечных концентраций от Ю-4 мкг/мл до 10 мкг/мл. 1,5. и 18-часовые цреинкубации МНК проводились в конечной концентрации I06 клеток в мл в полной культуральной среде HPMI-1640 с добавлением 20$ пулированной, термоинактивированной сыворотки человека АВ(1У), 2 мМ ь-глутамина (Plow), 50 мкг/мл гентамицина (Phar-machim). Культивирование проводилось во влажной атмосфере еоз-духа с 5% С02 при 37°С в С02 инкубаторе (Plow). После окончания преинкубации МНК использовались для иммунофлуоресцентных методов исследования.

Иымунофяуоресцентные исследования. В работе применялся метод двухцветной мембранно-ядерной флуоресцентной метки, выполняемый в несколько этапов. Вначале мононуклеары инкубировались с щтотоксичныш антителами ЛТ-2 против Т-лимфоцптов человека (Институт иммунологии МЗ СССР) и пулированным кроличьим комплементом, затем, на втором этапе реакции, после тщательной отмывки клетки в параллельных пробах обрабатывались ИкАТ e3d8 против hla-abc антигенов (Институт иммунологии ш СССР) или ИКО-1 против HLA-DE антигенов (БОНД АМН СССР). Далее прореагировавшие с ШсАТ МНК последовательно прокрашивались флуорохром-ными красителяш - кроличьей сывороткой против иммуноглобулинов мыши, меченной ФИТЦ (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи) и этидиум бромидом (Serva-) 0,04 мг/мл. В серии работ по анализу уровня экспрессии hla антигенов на поверхности cd4+ и cds+ Т-лимфоцитов использовались МкАТ 0КТ4 и 0КТ8 ("Ortho Diagnostic"). Количественная двухцветная цитофдуориметрия проводилась на микроскопе - фотометре MFV-compact-M!C ("Ernst Leitz") С использованием блока иллюминаторов и селективных фильтров, позволяющих одновременно идентифицировать Т-клетки, окрашенные в красный цвет эти,тот ем бромида и наличие на их мембране hla молекул, имеющих зеленое свечение за счет ФИГЦ. Качественная цитофлуоримет-рия заключалась в регистрации уровней экспрессии hla антигенов I z II классов, путем измерения интенсивности свечения 100 ФИТЦ позитивных клеток в каждой группе. Различия в уровне экспрессии hla молекул выявлялись при анализе гистограмм экспрессии по специально разработанному пакету прикладных программ дан ПК НР-

Культуральные исследования. Постановка теста СКЛ. Культивирование МНЕ велось в среде RPMI-1640 с 20% пулярованной ш-активированной сывороткой человека АВ(1У), 2 Ш L-глут амина и 50 мкг/мл гентамицина во влажной атмосфере СО^инку батора о 5% С02 при 37°С. Постановка первичной аилогенной СКЛ осуществлялась следующим образом. МНК от различных sap доноров, при соотношении отвечающих в стимулирующих клеток 1:1, концентрации клеток Ю6 в мл смешивались в лунках круглодонннх 96-лу-ночных планшетов ("Linbro") в общем объеме 0,2 мд и культивировались в течение 120 часов. Использовалось 10^ стимуляторов и Ю5 отвечающих клеток. Стимулирующие клетки предварительно обрабатывались митоотцином С ("Serva") в концентрации 25 мкг/мл в течение 30 минут. В опытные лунки, перед сиевлва-нием клеток, вносились исследуемые тиыические препараты в конеч-* ных концентрациях от 1СГ4 мкг/мл до 10 мкг/шг. В контрольных лунках культивирование велось без препаратов в полной питательной среде. Учет реакции проводился по включению 5-(12®1)-йод--2"-дезоксиуридина, вносимого по 0,037 МБк на лунку за 18 часов до окончания культивирования. По истечении срока культивирования клетки с помощью Cell Harvester автоматически переносились на стекловолоконные фильтры. Радиоактивность осевшей на фильтрах кислотонерастворимой фракции определялась на у -счетчике Ria Gamma-1271 (ькв, Швеция). По данным каждой СКЛ рассчитывались индекс стимуляции (ИС), представляющий отношение стимулированной пролифератавной активности лимфоцитов к уровню спов-танной пролиферации, регистрируемой в монокультуре клеток-ответчиков, а также индекс влияния (ИВ) каждого иммуноактивного препарата на пролиферагиввую активность в СКЛ, представляющий собой отношение уровня радиоактивности симулированных лимфоцитов в лунках с препаратом к таковому без препарата.

Математическая обработка полученных результатов осуществлялась на ПК ДБК-2М и "Hewlett Paokard-85". Проверка нулевой гипотезы о соответствии эмпирических данных нормальному распределению, как правило, не подтверждалась, в связи с чем при статистической обработке использовались непараметрические критерии "U" Билкоксона-Манна-Уитни и ранговый коэффициент корреляции Спирыена. Достоверность воздействия иммунеактивных препаратов на фиксируемые параметры устанавливалась по парному критерию

В,икокссна.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние тимических гуморальных факторов северного оленя на уровень экспрессии ньа антигенов I и II классов на поверхностных мембранах лимфоцитов и моноцитов периферической крови.

Экспрессия молекулярных продуктов генов 1КГС является необходимым условием функциональной активности клеток иммунной системы. Проведенные исследования представительства молекул гистосовместиности на поверхностных мембранах клеток иммунной системы здоровых доноров позволили оценить исходный уровень их экспрессии и изменение его после воздействия олевила.

Установлено, что олевил активен только в отношении экспрессии ньа антигенов II класса на Т-лимфоцитах и не-Т-клетках, Ее оказывая влияния на экспрессию ньа-авс молекул на Т-, не-Т-лимфоцитах, а тайга ньа-авс и ньа-бй молекул на моноцитах периферической крови. Эффекты олевила на экспрессию ньа-ое антигенов проявлялись в широком диапазоне доз от Ю-3 мкг/мл до 10 мкг/мл. Активность препарата возрастала до дозы Ю-2 мкг/мл, выходя на плато и снижалась в дозах, больших Ю-1 мкг/мл. Максимальный эффект наблюдался в дозе, равной 10-2 мкг/мл.

По данным изучения экспрессии антигенов гистосовместимости Ы класса на Т-лимфоцитах выявлено, что только 3,97 - 0,22л Т-клеток экспрессируют ньд-ин молекулы на своих поверхностных иеыбранах. В то Ее время уровень экспрессии ньа-ое антигенов составляет 5,58 ± 0,29 условных единиц (усл.ед.). После I,5-часового воздействия олевила на ЫНК отмечалось значительное возрастание количества Т-лимфоцитов, экспрессирундих ньа-зж антигены до 11,38 ^ 0,41%' (р < 0,01) и плотности ньа-ш молекул на них до 12,80 ± 0,52 усл.ед. (р < 0,01) (Рис. I).

Тарим образом, содержание ньа-бл положительных Т-лим$оци-тов под влиянием олевила увеличивается в 3,26 раза, уровень экспрессии оя антигенов на них в 2,52 раза, а объединенный показатель экспрессии (ОПЭ), представляющий произведение обеих пере-иенннх - более чем в 8 раз. Наблюдаемые изменения экспрессии ньл-йи антигенов на популяции Т-лиыфоцитов под^действием олевила свидетельствуют о процессах активации Т-клеточного звена иммунитета.

Рис. I. Влияние олевила на численность ньа-он+ Т-лизфоцитов, не-Т-клеток, моноцитов и уровни экспрессии антигенов гисгосовместимости II класса на из поверхностной мембране.

Примечания: - численность ньа-пй. пологителышх клеток (#); ем- уровень экспрессии ньа-би антигенов (усл.ед.).

Светлые столбики - контрольные значения показателей; темные - значения в присутствии олевила. * - р < 0,05; ** - р <0,01.

Следующим этапом исследования явилось изучение воздействия олевила на экспрессии антигенов гистосовыестимости II класса на регуляторных субпопуляциях Т-лимфодитов периферической кровя здоровых лиц, идентифицируемых МкАТ серии. ОКТ. Установлено, что содержание 0КГ4+ Т-лимфоцитов составило 46,30 - 1,13? клеток, среди них нъа-ое. положительных 4,00 ^ 0,54^ со средней экспрео-сией ш? молекул 4,60 ± 0,78 усл.ед., а численность 0КТ8+ Т-лии-фоцитов 25,40 ± 0,795?, среди них ш несущих 5,80 - 0,34? со средним уровнем экспрессии 5,87 ± 0,29 усл.ед. При этом соотношение 0КТ4/ ОКТ8+клетох для обследованных: доноров равно 1,84 ± - 0,25. Выявлено преобладание суммарного количества ньа-ш антигена на субяопуляции 0КТ8+ Т-лимфоцитов, в 2,30 - 1,29 раза.

После кратковременной преинкубацгга ШК в присутствии опти-

дальней дозн олевила наблюдается значительный прирост показателей регистрируемых параметров экспрессии hla-dr антигенов на обеих субпопуляциях CD4+ и cds'1" Т-лимфоцитов. Причем ШЭ hla-dr молекул та <ЖТ4+ клетках возрастал более чем в II раз, а ШЭ hla-dr антигенов на GKT8+ клетках увеличивался в 4,5 раза по сравнению с показателями на клетках, инкубировавшихся без олевила. При этом олевил не оказывал влияния на численность 0КГ4+ и 0КТ8+ Т-лимфоцитов. Для оценки воздействия олевила на активированные dr+ Т-клетки мы применили математический показатель - индекс активации регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (ИА), определяемый по формуле:

ОПЭ dr+, QKT4+

ИД - ——__

опэ dr+, окта+

где ОПЭ dr+ 0КТ4+ и ОПЭ ш+ 0КТ8+ - сушарное содержание hla-dr антигенов .на субпопуляциях t-ЛИМфОЦИТОВ cd4+ и сб8+ соответственно. ИА Т-лимфоцитов доноров оказался равным 0,53 --0,19. Узсе после 1,5-часового воздействия олевила на ИНК отмечается инверсия ИА в сторону преобладания маркеров активации на Т-лиыфоцитах с хелперно-индукторннми свойствами (соЛ-клетки) (ИА = 3,22 - 2,34), а после 18-часового культивирования МНК в присутствии олевила ИА возрастал еще в 3,72 раза - свидетельство преимущественной активации субклаеса хелперных Т-лшйоци-тов (Рис. 2).

Иной характер носило воздействие олевила на не-Т-лимфоци-тн. Экспериментальные данные свидетельствуют о снижении уровня экспрессии hla-dr антигенов на них на 305? (Рис. i).

В серии экспериментов при более длительном культивировании МНК с олевилом в течение 18 часов были выявлены способности препарата запускать и усиливать процессы синтеза РНК, что проявлялось в повышении показателей регистрируемых параметров экспрессии hla-dr антигенов на популяции Т-лимфоцитов.

Исследование свойств олевила показало, что препарат обладает выраженной модулирующей активностью в отношении экспрео-сии антигенов гистосовместимости II класса на поверхностных мембранах клеток-мишеней - Т- и не-Т-лимфоцитов. Так, группе с низшими ИВ олевила на ОПЭ hla-dh антигенов на Г-лимфоцитах соответствуют большие (р <0,01) показатели таких параметров, как содержание Т-лимфоцитов,■ уровень экспрессии ni,,.-u.; молекул на них и ОПЭ h1a-dr антигенов в контроле. И наоборот, в группе

+/ГПЯ+ ОДЭ Ш+ср4'

СВ4 /СМ'

ОПЭ шГсш"*

Рис. 2. Воздействие олевила на регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитсв.

Примечания: СПЭ Ш+СП4+ и ОПЭ бн+сс8+ - суммарное количество ньа-ш антигенов (объединенный показатель экспрессии) на 004. и свв позитивных Т-лимфоцитах соответственно.

По оси ординат - иоо-гаошвние исследуемых показателей. Светлые столбики - значения показателей до воздействия олевила; темные - опытные значения показателей после воздействия олевила. *«. - р < 0,01.

с большими ИВ олевила на ОПЭ ньа-ш антигенов на Т-лимфоцитах, контрольные показатели всех трех параметров были наименьшими и при воздействии олевила возрастали значительнее (р < 0,01). Сходной модуяирувдей активностью олевил обладает и в отношении экспрессии ньа-ш? антигенов, локализованных на не-Т-лимфоцитах (Табл. Г).

Представленные экспериментальные данные позволяют сделать следующие выводы. Олевил, не изменяя процентного содержания основных классов клеток иммунной системы периферической крови: Т-лимфоцитов, моноцитов и не-Т-клеток, способствует активации Т-клегочного звена иммунитета, при этил отмечаются процессы преимущественной активации Т-лимфоцитов с функциональными свой-

Таблица I

Модуляция олевилом уровня экспрессии ньа-бй антигенов на поверхностных мембранах Т-лимфоцитов и не-Т-клеток

ИВ олевила на ОПЭ ньА-т антигенов Контроль, среда ВРМ1-1640 ОПЭ НЬА-БН Олевил ОПЭ НЬА-Ш

Т-лимфоциты 3,42*0,56 17,71-2,24 36,28*5,01 12,78*1,75 113,37* 8,39 206,35*15,84

не-Т-лим- 0,77-0,02 1217,10*106,00 937,67*75,80

фоциты 1,00*0,03 1026,40* 60,00 1024,15*65,44

стваыи хелперов-индукторов. Снижение уровня экспрессии нъа-ш молекул на не-Т-лимфопдтах возможно свидетельствует о дифферен-цировочном эффекте олевила на популяцию В-лимфоцитов, составляющую большинство не-Т-клеток. Максимальная активность олевила проявляется в дозе 10-2 ыкг/ш. Эффекты олевила на клетках-мишенях усиливаются в течение 18 часов культивирования, что указывает на включение в работу специфических структур генома клеток, регулирующих процессы экспрессии молекулярных продуктов генов ГКГС. Необходимо отметить, что примененная для оценки эффекта олевила тест-система представляется перспективной при выявлении клеток-мишеней дая препаратов с иммуноактивными свойствами и оценки их активности.

Изменение црсяиферативной активности лимфоцитов в СЮ.Г при воздействии гуморальных факторов тимуса северного оленя.

Тест СКЛ является высокоинформативной моделью дан изучения функциональных свойств иммуноковдегентных клеток, требующих дош своей реализации наличия антигенов ньа комплекса. Ниже представлены результаты по влиянию олевила на пролифератквннй ответ тест-лимфоцитов в СКЛ. Выявлено, что максимальной активностью в отношении стимулированной аллогенными клетками пролиферации лимфоцитов олевил обладает в дозе Ю-2 мкг/мл, совпадающей,с таковой, определенной в тест-системе по воздействию препарата на уровень экспрессии нъа антигенов на клетках-мишенях. ИВ оле-

вила равен 1,51 - 0,82.

Установлено, что максимальные приросты пролиферативного ответа лимфоцитов-ответчиков при воздействии олевила в СКЛ отмечаются на 4-е и 5-е сутки культивирования, что совпадает с пиком пролиферативной активности Т-хелперов в СКЛ и подтверждается изложенными ранее результатами об изменении уровня экспрессии маркеров активации на субпопуляции Т-лимфоцитов хелиеров/индукторов.

Отмечены модулирующие свойства олевила при воздействии на функциональную активность лимфоцитов в СКЛ, заключающиеся в том, что эффект препарата определяется и во многом зависит от контрольных уровней исследуемых параметров (правило исходного уровня Вильдера (wilder J. Г967). Результаты исследовав шя позволяют сделать заключение о том, что эффекты олевила на пролпферативную активность тест-лимфоцитов в смешанных культурах наиболее выраяены при использовании в качестве от-вечазщих - лимфоциты доноров с низкой способность» к ответу на аллоангигены я пониженными уровнями спонтанной пролифера-тивной активности. ИВ олевила на пролиферативный ответ таких лимфоцитов равен 2,07 i 0,24. Напротив, при использовании в качестве ответчиков в СКЛ лимфоцитов с повышенными функциональными свойствами, при воздействии олевила наблюдалось подавление пролиферативного ответа в СКЛ. ИВ составил 0,89 - 0,04. Выявленные закономерности подтверждаются достоверными коэффициентами корреляции мевду эффектом олевила на пролиферацию лимфоцитов в СКЛ и изначальными уровнями стимулированной аллоанти-генами пролиферации клеток-ответчиков (г = -0,422; р < 0,01; п = 45), а также их пролиферативной активности в монокультуре (г = -0,311; р с 0,05; п= 45). Таким образом, результирующий эффект олевила на функциональные свойства лимфоцитов здоровых доноров проявляется в стимуляции функциональной активности хелперно-индукторных Т-лимфоцитов.

Комплексный анализ характера изменений- пролиферативной активности лимфоцитов в СКЛ и уровня экспрессии антигенов при воздействии олевила.

Экспрессия HLA.-DR антигенов на мембранах иммунекомпетентных клеток, являясь маркером.функционального состояния отдельных классов клеток, в свою очередь зависит от функциональной активности клеток иммунной системы. По результатам наблюдений,

включапцих показателя функциональной активности лимфоцитов, фиксируемые в СКЛ и уровней экспрессии ньа-ш молекул на клетках-ответчиках, использованных в СКЛ без и при воздействии олевила установлена тесная зависимость ИВ алев ила на ответ лимфоцитов в смешанных культурах от изменения, под воздействием препарата, таких показателей экспрессии, как чио-леяность льа^и положительных Т-лимфоцитов (г = -»0,674; р< 0,01; п = 22), уровня экспрессии шг молекул на Т-клетках (г = +0,617; р < 0,01; п = 22) и ОПЭ ньа-Ш антигенов на Т-лиыфоцитах (г = +0,554; р <0,01; а = 22). Выявленные связи сочетанного изменения параметров экспрессии ньа-ш молекул на Т-лимфоцитах-ре сп ондерах и их ответов в СКП раскрывают механизмы регуляции олевилом функциональной активности имму-нокоыпетентных клеток, заключавшиеся в модуляции уровня эко-прессии гликоцротеидов гистосовместимости II класса, влекущей за собой изменение функционирования клеток иммунной системы на начальных этапах иммунного ответа - распознавании чужеродных и, возможно, собственных антигенов и дальнейшей активации ретуляторннх и эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов.

Сравнительный анализ иммуноыодулиругацей активности

гуморальных факторов тимуса северного оленя различной молекулярной массы.

В результате исследования иммуноактивннх свойств отдельных фракций, различающихся между собой по молекулярной массе, выделенных из экстрактов вилочковой железы северного оленя установлено, что ряд фракций обладает активностью в отношении экспрессии антигенов гистосовместимости II класса на поверхностных мембранах клеток иммунной системы. Определено, что фракции Я№ 3, 7 и 9 (здесь и далее порядковые номера всех фракций условны, а молекулярные массы не приводятся, так как представляют коммерческий интерес) увеличивают как численность ш* Т-лимфоцитов, так и уровень экспрессии ньа-Ш антигенов на них, а фракции Ш 2 ж 3 проявляют активность в отношении экспрео-сии ньа-ш молекул на популяции не-Т-лимфоцитов, сходную с активностью цельного препарата олевил. Таким образом, фракция £ 3 обладает эффектами, присущими препарату олевил, а фракции 1® 2, 7 и 9 имеют изолированную активность либо * только в отношении Т-лимфоцитов (фракции Й 7 и 9), либо только В-лимфоци-

из 1.5

1,0

U, 70

I 2 3 4 5 G 7 С 3 1С II 12

ip.

Рис. 3. Воздействие гуморальных факторов тимуса северного оленя различной молекулярной массы на уровень про-лифератавной активности лимфоцитов, стимулировая-ных в СКЛ.

Примечания: по оси абсцисс - номера фракций, по оси ординат - индекс влияния фракций на ответ в СКЛ.

* -р<Г0,05.

тов (фракция Л 2) и могли бы служить в качестве модуляторов направленного действия.

Иммуноактивные свойства отдельных лолилептидных фракций были исследованы в модели аллогенной СКЛ. Бнло выявлено, что способностью воздействовать па функциональную активность лимфоцитов периферической крови обладают фракции №№ I, 3, 7, 9 и 10. При этом фракции А® 3, 7, 9 и 10 увеличивали пролифера-тявный ответ лимфоцитов, стимулированных аллогенными клетками, а при воздействии фракции № I наблюдалось снижение включения радиоактивной метки в лимфоциты, пролифэрирующие в СКЛ (Рис. 3).

Была определена активность всех фракций в диапазоне доз от Ю-2 мкг/мл до 10 мкг/мл и сопоставлена с активностью препарата олевил. Наибольшей активностью обладала фракция № ?, превосходящая активность олевила, далее следовали фракции

10, 7 и 3.

Таким образом, обнаружены активные фракции пз тшуеа северного оленя, оказывающие стимулирующее влияние на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток и обладающие как эффектами, сходными с таковыми олевила, так и селективными, только на Т- либо на В-лимфоциты.

Сравнительный анализ Е/иуно активных свойств гуморальных факторов тшуса различного происхождения:.

Ниже представлены результаты сравнения иммунологических свойств отечественных препаратов тимической природы - тактиви-на, лшалина и их синтетического аналога - тпмогена и сопоставлены их свойства и активность с активностью олевила и его отдельных фракций. Наиболее детально проведено сравнение олевила с тактивином - как наиболее часто применяемым е настоящее время среди тимических препаратов в практическом здравоохранении.

Б результате проведенных исследований установлено, что тактивин, как и олевил оказывает воздействие только ка уровень экспрессии антигенов ГКГС II класса. Эффекты тактивина проявлялись в повышении числа ньа-ш несущих Т-лимфоцитов и возрастании уровня экспрессии поверхностных вв молекул на них. В отношении экспрессии нха-ш антигенов, локализованных на не-Т-лимфопдтах и моноцитах тактивин эффекта не оказывал. Активность тактиьша в данной тест-системе определялась е диапазоне доз от Ю-2 мкг/мл до 10 мкг/мл, а оптимальная доза составила мкг/мл. При сравнении дозозазисимых воздействий олевила и такткБина, обращает внимание тог факт, что олевил проявлял активность в более широком диапазоне доз - от Ю-3 мкг/мл до 10 мкг/мл, а тактивин в дозе Ю-3 мкг/мл вообще активностью не обладал. В дозе Ю-2 мкг/мл олевил проявлял активность со степенью достоверности 99%, а тактивин - 95$.

Сравнение воздействия тактивина и олевила на регуляторные субпопуляции Т-лимфоцитов СБ4+ и С08+ не выявило достоверных различий в эффектах препаратов на уровень экспрессии поверхностных маркеров активации. Тактивин так же, как и олевил, активировал преимущественно св4+ Т-клетки, смещая баланс нха-бн антигенов в сторону их преобладания на Т-лимфоцитах с функциональными свойствами хелперов/индукторов. Данные исследования позволяют сделать заключение об идентичности механизмов дейст-

тс 10

«Р 1

3

чшвн

тималин

Ю-? Ы

Рас. -1. Срэгкзгелън&я гаттанослъ даетгескях препаратоз и гтггорельквх факторов тглуса северного оленя раз-:.~лч:~.сИ молеггуяярксй г.'зсе^.

Пр^лечания: но горизонтальной осп - активность препарата в молях.

вш такпгеила и олевила в отношении Т-звена шлунигета и различии в их действии на не-Т-клетки.

Установлено, что тактивин повисает пролкферативнуи активность лимфоцитов, стимулированных аллогеннкми клеткам® в СКЛ. Наибольший эффект проявлялся в дозе тактивина Ю-3- мкг/мл. Сопоставление дозозависимых схййектов олевпла и тактивина в СКЛ

О -- О

показало, что в дозах 10 мкг/мл и 10 мкг/мл олевил достоверно (р<0,05) активнее тактивина, а в дозе Ю-1 мкг/мл большую активность проявлял тактивин (р <0,05).

Кроме тактивина, в тесте СКЛ была определена активность гималина и тимогена. Тимоген проявлял наибольшую активность при добавлении в культуру в дозе 10"^ мкг/мл, а тималин - в дозе 20 мкг/мл. Оба препарата обладали модулирующей активностью в отношении пролиферации стимулированных в СКЛ лимфоцитов.

Таким образом, все исследованные препараты (олевил, так-тивин, тимоген и.тималин) повышали функциональную активность лимфоцитов здоровых доноров, стимулированных в СКЛ аллогенны-

ми клетками.

Сопоставление активностей препаратов в молярных рабочих дозах позволило установить, что наиболее эффективными являются олевил и тимоген. Активность тактивина и тималина на порядок ниже по сравнению с ниш. Кроме этого выявлено, что поли-пептдцная фракция из тимуса северного оленя й 9 обладает самыми выраженными стимулирующими эффектами на функциональную активность лимфоцитов, превышающим эффекты всех исследованных препаратов. А фракции № 10, 7 и 3 оказались активнее тактивина и тималина, но несколько слабее действия препаратов олеви-ла и тимогена (Рас. 4).

Резюмируя вышеизложенные результаты, можно сделать заключение о перспективности препарата олевил и его фракций и о целесообразности перехода к следующему этапу исследования -клиническому испытанию препарата с возможной регистрацией его эффектов в разработанных тест-системах.

ВЫВОДЫ

1. При сравнительном анализе воздействия олевила на моно-нуклеарные клетки периферической крови здоровых лиц установлено, что в избранной тест-системе максимально реагируют на инкубацию с фактором тимуса Т-лимфоциты, в меньшей степени не-Т-лиыфоциты и полностью интактны моноциты.

2. Воздействие олевила на Т-звено иммунной системы проявляется в значительном возрастании на поверхностной мембране Т-лимфоцатов суммарного количества ньа-ш антигенов и в повышении прагшферативной активности Т-лимфоцитов при распознавании аллоантигенов в СКЛ. Количество поверхностных ни.-т молекул на не-Т-лимфоцит ах снижается.

3. Олевил активирует оба субкласса регуляторных Т-лимфо-цитов с преимущественным воздействием на хелперы/индукторы с фенотипом СП4-+,БН+ что подтверждается максимальным эффектом препарата к моменту пика пролиферативной активности Т-хелперов в СКЛ. Индекс соотношения сп4+т+ и св8+мг+ лимфоцитов, в норме составляющий 0,53, возрастает при инкубации с олевилом до 1,67.

4. Результирующий эффект олевила на параметры активации и

функциональной активности Т-лимфоцитов подчиняется правилу исходного уровня п максимален при инкубации с клетками, обладающими низкой пролиферативной активностью в СКЛ и минимальным содержанием ньа-бя молекул на поверхностной мембране. Внявленная закономерность позволяет производить отбор индивидов, чьи лимфоциты могут быть использованы для скрининга активности различных партий препарата.

5. Гуморальные факторы тимуса северного оленя с различной молекулярной массой способны оказывать как активирующее, так и депрессивное воздействие на пролиферагивную активность клеток в СКЛ, на динамику экспрессии поверхностных нъа-ш? антигенов Т- и не-Т-лнмфоцигов.

6. Эффекты олевила в клеточных культурах в целом сходны с активностью гуморальных тшических факторов иного происхождения (тактивина, тималина я тшлогена), однако отличаются способностью проявляться в значительно более низких дозах и связаны с воздействием не только на Т-клетки, но и на не-Т-лимфоциты.

7. Метод одномоментной регистрации маркерных характеристик лимфоцитов, позволяющий установить субпопуляционную принадлежность регистрируемых клеток и экспрессию поверхностных маркеров активации в сочетании с разработанными принципами отбора доноров клеток крови, является удобной тест-системой для проведения скрининга активности тимических факторов различного происхождения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коненков В.И., Мусатов М.И., Орлов Н.Б., Наумов Ю.Н., Петрова З.Д., Короткова И.Ю., Протопопов Б.В. Ассоциированность генов нъа комплекса с параметрами иммунного статуса и роль ньа молекул в проявлении функциональной активности клеток иммунной системы // Клиническая иммунология и имму-ногенетика: Сб. тр. - Новосибирск, 1988. - С. 57-63.

2. Наумов Ю.Н., Протопопов Б.В., Коненков В.И. Влияние тактивина на экспрессию ньа-ы? антигенов на поверхностной мембране клеток йммунной системы здоровых лиц и больных ревматоидным артритом // Экспериментальная и клиническая им-

мунодогия на Востоке страны: Тез. докл. региональной конф. - Красноярск, 1988. - С. 72.

3. Протопопов В.В., Коненков В.И. Изменение экспрессии hla-dr антигенов и функциональной активности клеток иммунной системы человека при воздействии такгивина // Иммуногене-тические аспекты аутоиммунных заболеваний и вторичных им-мунодефицитов человека: Тез. докл. I Всесоюзн. стат. - Новосибирск, 1989. - С. 57-58.

4. Протопопов Б.В. Воздействие тактивина на экспрессию антигенов гистосовместимости и функциональную активность клеток иммунной системы человека // Тез. докл. I Всесоюзн. иммунологического съезда. - М., 1989. - С. 105.

5. Протопопов Б.В. Тимические полипептиды - универсальные регуляторы функциональной активности клеток иммунной системы человека // Некоторые вопросы медико-биологических проблем Севера: Тез. докл. региональной конф. молодых ученых. -Красноярск, 1990. - С. 51.

6. Безгачев В.Г., Граков B.C., Лозовой В.П., Кокевгопсов B.C., Протопопов Б.В., Коненков В.И., Мурников В.Т., Антонов И.Г. Способ получения иммуноактивных тимусных полипептидов - решение о выдаче авторского свидетельства от 12.02,91 г. по заявке № 4678398.

Подписано к печати 29.01.1991г. Зак.201.Тир. 100 экз. 1991г. Бумага писчая.

Тип.СО АМН СССР. г.Новосибирск