Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль галектина-1 в механизмах дисрегуляции апоптоза и дифференцировки CD4+-лимфоцитов

На правах рукописи

ЯКУШИНА Валентина Дмитриевна

РОЛЬ ГАЛЕКТИНА-1 В МЕХАНИЗМАХ ДИСРЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СБ4+-ЛИМФОЦИТОВ

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2014

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

доктор медицинских наук, руководитель лаборатории структурных основ патогенеза социально значимых заболеваний Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «25» сентября 2014 г. в 11°° часов на заседании диссертационного совета Д208.096.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России и на сайте www.ssinu.ru Автореферат разослан «¿¿Л) ¿¿¿¿¿¿^ 2014 г,

Рязанцева Наталья Владимировна

Новицкий Вячеслав Викторович

Салмина Алла Борисовна

Потапова Оксана Валентиновна

Ученый секретарь диссертационного совета

Петрова Ирина Висторовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

2UM

Актуальность проблемы. Дисрегуляция процессов дифференцировки и апоптоза СЕ)4+-лимфоцитов является патогенетическим фактором многих социально значимых заболеваний. Известно, что ряд аутоиммунных и аллергических заболеваний ассоциированы с избыточной активностью Thl-, Th2-, Thl7-лимфоцитов, а также недостаточностью Т-регуляторного звена [Dardalhon V. et al., 2008; Piccirillo C.A., 2010; Korn T. et al., 2010; Lin C.H. et al., 2013]. Вместе с тем предполагается, что иммуносупрессориая активность регуляторных Т-лимфоцитов способствует опухолевой прогрессии [von Boehmer H., 2005; Yamaguchi T. et al., 2006; Yaqub S. et al., 2008; Nishikawa H. et al., 2010]. В связи с этим изучение механизмов регуляции субпопуляиионного баланса СМ+-лимфонитов необходимо для понимания молекулярных основ заболеваний, связанных с дисрегуляцией иммунитета, и разработки новых патогенетически обоснованных методов диагностики и таргетной терапии.

В последнее время среди прочих молекул кооперации клеток иммунной системы внимание исследователей обращено па белок галсктин-1, секретируемый стромальными клетками тимуса, лимфоузлов, самими лимфоцитами, а также клетками некоторых типов опухолей [Dhirapong A. et al., 2009]. Предполагается, что, связываясь с гликопротеинами поверхности клеток врожденного и приобретенного иммунитета, галектин-1 выполняет противовоспалительные функции [Yang R.Y. et al., 2008]. Терапевтическое значение галектина-1 показано на экспериментальных моделях аутоиммунной патологии: аутоиммунной миастении Гравис, аутоиммунного энцефаломиелита, артрита, гепатита, болезни «трансплантат против хозяина», аутоиммунного увеита и диабета [Salatino M. et al., 2008]. С другой стороны, секреция галсктина-1 опухолевыми клетками рассматривается в качестве возможного механизма опухолевой прогрессии [Rubinstein N. et al., 2004; Не J., Baum L.G., 2006; Compagno D. et al., 2013].

Важной особенностью галсктина-1 является его разнонаправленное действие на клетки в зависимости от их субпонуляционной принадлежности, стадии активации и наличия других костимулирующих сигналов. При этом представления о механизмах иммунорегуляторного действия галектина-1 находятся на стадии формирования. К настоящему времени проведены исследования влияния галектипа-1 на миграционную активность и агюптоз нейтрофилов, активацию макрофагов и продукцию ими медиаторов воспалення, а также на активацию, пролиферацию, дифференцировку и гибель В-лимфоцитов в зависимости or функционального состояния [Paclik D. et al., 2011; Anginot A. et al., 2013; Auvynct C. et. al., 2013; Tsai C.M. et al., 2014]. Кроме того, представлены данные, характеризующие особенности клональпой селекции, пролиферации и апоптоза С1)8н -лимфоцитов под действием галсктина-1 [Liu S.D. et al., 2008; Moreau A. et al., 2012]. CD4+-лимфоциты также рассматриваются в качестве мишени иммунорегуляторного действия галектина-1.

Степень разработанности. Роль галектина-1 в регуляции гомеостаза CD4+-лимфоцитов на различных этапах иммунного ответа остается недостаточно изученной. Так, к настоящему времени не установлен факт влияния галектина-1 на апоптоз, дифференцировку и функциональную активность CD4+-лимфоцитов. Идентификация патогенетического значения нарушения галею-ин-1-опосредованной регуляции баланса С04+-лимфоцитов при различных аутоиммунных заболеваниях позволит рассматривать данный белок в качестве возможного маркера диагностики и/или терапевтического агента.

Цель исследования: установить роль галектина-1 в механизмах дисрегуляции апоптоза и дифференцировки СВ4+-лимфоцитов.

Задачи исследования:

1. Установить закономерности влияния рекомбинантного галектина-1 на реализацию апоптоза СОЗ/СВ28-активированных CD4+-лимфоцитов in vitro.

2. Оценить вовлеченность митохондриального пути в реализацию апоптоза активированных лимфоцитов при действии рекомбинантного галектина-1 in vitro.

3. Оценить влияние галектина-1 на уровень экспрессии мРНК транскрипционных факторов дифференцировки С04+-лимфоцитов (Tbet, Gata-3, RORc, FoxP3) и продукцию профильных цитокинов (IFNy, IL-13, IL-17, IL-10) при СВЗ/СБ28-активации клеток in vitro.

4. Оценить экспрессию галектина-1 при патологии, сопровождающейся дисрегуляцией дифференцировки СБ4+-лимфоцитов (на примере ревматоидного артрита).

5. Выявить особенности влияния рекомбинантного галектина-1 на субпопуляционный состав и иммуносупрессорную функцию регуляторных CD4+-лимфоцитов in vitro.

Научная новизна. Получены новые данные о влиянии галектина-1 на апоптоз и дифференцировку С04+-лимфоцитов при действии на клетки в условиях активации через CD3 и CD28, а также на фенотип и функциональную активность регуляторных Т-лимфоцитов при действии на дифференцированные клетки.

Впервые в условиях in vitro показано, что действие галектина-1 в концентрациях от 2,5 до 4,0 мкг/мл на активированные СБ4+-лимфоциты дозозависимо индуцирует митохондриальный путь апоптоза, что характеризуется деполяризацией митохондриальной мембраны, снижением количества антиапоптотического белка Вс1-2 и увеличением содержания проаптоптотического белка Вах.

Впервые установлено, что действие галектина-1 in vitro на CD3/CD28-активированные С04+-лимфоциты приводит к увеличению экспрессии мРНК транскрипционных факторов дифференцировки ТЪ2-лимфоцитов (Gata-З) и регуляторных Т-лимфоцитов (FoxP3) на фоне снижения экспрессии мРНК транскрипционных факторов дифференцировки Thl-лимфоцитов (Tbet) и Thl7-лимфоцитов (RORc). Новые данные, полученные в результате оценки экспрессии транскрипционных факторов, позволяют сделать заключение, что галектин-1 регулирует направление дифференцировки активированных СБ4+-лимфоцитов.

Впервые проведена оценка экспрессии гена галектина-1 у пациентов с ревматоидным артритом. Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что сниженная экспрессия галектина-1 является одним из патогенетических факторов, обуславливающих дисрегуляцию апоптоза и дифференцировки CD4+-

лимфоцитов.

Впервые было проведено комплексное исследование иммунофенотипа и функциональной активности регу ля торных Т-лимфоцитов при действии галектина-1 на предварительно дифференцированные клетки. Полученные в результате новые данные позволяют объяснить иммуносупрессорную функцию галектина-1 посредством поддержания фенотипа регу ля торных Т-лимфоцитов и повышения их функциональной активности.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования in vitro раскрывают механизмы нарушения регуляции апоптоза и дифференцировки С04+-лимфоцитов, опосредованной гапектином-1. Полученные данные о способности галектина-1 в процессе активации через CD3 и CD28 индуцировать апоптоз С04+-лимфоцитов и направлять дифференцировку по пути Th2 и регуляторных Т-лимфоцитов, а также способствовать экспансии регуляторных Т-лимфоцитов при действии на дифференцированные клетки вносят вклад в понимание механизмов дисрегуляции апоптоза и дифференцировки CD4+-лимфоцитов.

Идентификация патогенетического значения нарушения регуляции апоптоза и дифференцировки С04+-лимфоцитов, опосредованной галектином-1, позволяет рассматривать данный процесс в качестве основы для разработки новых методов селективной коррекции иммунного ответа. При этом галектин-1 может выступать в качестве компонента терапии или диагностического маркера при аутоиммунных заболеваниях.

Методология и методы исследования. Экспериментальный блок исследований выполнен на мононуклеарных лейкоцитах относительно здоровых доноров, культивированных в условиях активации С04+-лимфоцитов (модель 1) и направленной дифференцировки в регуляторные Т-лимфоциты (модель 2). Объектом исследования эскпрессии мРНК галектина-1 явились мононуклеарные лейкоциты относительно здоровых доноров и пациентов с ревматоидным артритом.

В работе использованы высокоинформативные методы, выполненные на базе Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России и лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий инновационного парка Балтийского федерального университета им. И. Канта. Основные методы исследования:

1. Выделение и культивирование мононуклеарных лейкоцитов;

2. Оценка количества апоптотически измененных СВ4+-лимфоцитов по связыванию аннексина-V и 7AAD, количества лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий, а также содержания лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+FoxP3-/CD4+CD25+FoxP3+ - методом проточной цитофлуориметрии;

3. Определение внутриклеточного содержания белков Bcl-2, Вах, FoxP3 и перфорина методом вестерн-блотгинга;

4. Оценка экспрессии мРНК транскрипционных факторов дифференцировки С04+-лимфоцитов (Tbet, RORc, GATA-3, FoxP3) и мРНК галектина-1 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени;

5. Оценка содержания цитокинов IFN-y, IL-13, IL-17, IL-10 в культуральных средах мононуклеарных лейкоцитов методом иммуноферментного анализа;

6. Статистический анализ результатов.

Положения, выносимые на защиту

1. Галектин-1 дозоэависимо индуцирует митохондриальный путь апоптоэа активированных CD4+-лимфоцитов.

2. Галектин-1 регулирует направленность дифференцировки CD4+-лимфоцитов, повышая количество Th2 и регуляторных Т-клеток на фоне снижения количества Th 1 - и Th 17-лимфоцитов.

3. Действие гапектина-1 на дифференцированные регуляторные Т-лимфоциты приводит к экспансии иммуносупрессорных клеток, характеризующихся С04+С025+РохРЗ+-фенотипом и повышенным содержанием фактора FoxP3 и белка перфорина.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов обеспечена достаточным объемом материала и использованием современных, высокоинформативных методов. Статистическая обработка результатов выполнена с помощью надлежащих методик доказательной медицины.

Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина -человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2011), 14-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Абакан, 2011), международной конференции «Программируемая гибель клеток в биологии и медицине» (Москва, 2012), международной конференции студентов и молодых ученых «Дни биохимии в СПбГМУ 2012» (Россия, Санкт-Петербург, 2012), Всероссийской Итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова (Томск, 2012, 2013), международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2013). Кроме того, результаты исследования положены в основу проекта «Технология генерации регуляторных Т-лимфоцитов in vitro с помощью рекомбинантного галектина-1», занявшего II место на конкурсе аспирантов «От инновационной идеи - к медицинской разработке» (Томск, 2012). Научное исследование на тему «Влияние галектина-1 на дифференцировку СВ4+-лимфоцитов при аутоиммунных заболеваниях», выполненное в рамках диссертационной работы, было поддержано по итогам конкурса на получение стипендии Президента России (СП-208.2012.4 от 21.11.2012).

Исследования реализованы в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» («Разработка технологических основ управления дифференцировкой, межклеточной кооперацией и программированной гибелью Th-лимфоцитов с использованием рекомбинантных галектинов» (ГК №16.740.11.0636); «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально-значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины» (ГК № 02.740.11.0311); «Разработка технологических основ действия мишень-направленных биологически активных молекул для коррекции нарушений пролиферации и программированной гибели опухолевых клеток» (ГК № 8302)). Кроме того, исследования были поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований «Молекулярные механизмы регуляторного влияния галектинов на дифференцировку и функциональную

активность ТЬ-лимфоцитов» (договор №12-04-31224 мол_а) и Советом по грантам Президента РФ «Идентификация молекулярных мишеней регуляции апоптоэа и дифференцировки клеток крови при патологии инфекционного и неинфекционного генеза» (№ 16.120.11.614-НШ).

Личное участие автора. Автор принимал непосредственное участие в планировании исследования и разработке его методических основ, анализе литературы. Автором проведены исследования, статистическая обработка полученных данных и интерпретация результатов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из которых — 4 в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего 288 источник, из них — 19 отечественных и 269 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 14 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты комплексного обследования 65 человек (32 мужчин и 33 женщин, средний возраст 28±5 лет). Из них — 55 относительно здоровых доноров и 10 пациентов с ревматоидным артритом (2 мужчины, 8 женщин). Критериями исключения из исследования явились: возраст - менее 18 или более 50 лет; наличие в анамнезе фактов злоупотребления алкоголем, наркотической зависимости, психических расстройств; обострение хронических соматических заболеваний, наличие инфекционных болезней, период проведения противовирусной, иммуномодулирующей, а также иной фармакотерапии. Группу здоровых доноров составили 55 практически здоровых добровольцев (30 мужчин и 25 женщин), не страдавших аутоиммунными, аллергическими и онкологическими заболеваниями и не предъявлявших на момент обследования жалоб соматического характера.

У всех обследованных лиц было получено добровольное информированное согласие на проведение необходимых манипуляций (протокол заседания этического комитета ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России от 20.12.2010 г., регистрационный № 1791).

Материалом исследования явились мононуклеарные лейкоциты, полученные из крови у здоровых доноров и пациентов с ревматоидным артритом. Взятие крови производилось утром натощак путем пунктирования локтевой вены с последующей стабилизацией КЗ-ЭДТА.

Для достижения поставленной цели в настоящей работе были выполнены экспериментальный и клинический блоки исследования.

Экспериментальный блок исследования был выполнен на мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров, культивированных в условиях активации СБ4+-лимфоцитов (модель 1) и дифференцировки в регуляторные Т-клетки (модель 2). Первая модель отражает процесс взаимодействия СЭ4+-лимфоцитов с антиген-презентирующими клетками (суть данной модели заключается в активации клеток через СЭЗ и СБ28). Вторая модель представляет собой культивирование лимфоцитов в течение 6 сут в условиях активации и направленной дифференцировки клеток в регуляторные Т-лимфоциты.

На клетках модели активации С04+-лимфоцитов было проведено исследование апоптоза и дифференцировки при действии галектина-1. Исследование апоптоза включало оценку количества апоптотически измененных СБ4+-лимфоцитов, количества клеток с деполяризованной мембраной митохондрий, определение уровня антиапоптотического белка Вс1-2 и проапоптотического белка Вах. В качестве показателей направления дифференцировки С04+-лимфоцитов были определены экспрессия мРНК транскрипционных факторов дифференцировки и продукция цитокинов С04+-лимфоцитов.

Клетки, дифференцированные в регуляторные Т-лимфоциты, явились объектом исследования действия галектина-1 на фенотип регуляторных Т-лимфоцитов и их функциональную активность. Исследование фенотипа регуляторных Т-лимфоцитов включало оценку количества С04+С025+РохРЗ~/ С04+С025+РохРЗ+-лимфоцитов. Анализ функциональной активности дифференцированных регуляторных Т-лимфоцитов основывался на определении содержания транскрипционного фактора РохРЗ и эффекторной молекулы перфорина в цельноклеточных лизатах.

Экспериментальный блок исследований выполнен на базе Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (научный руководитель - д-р мед. наук, профессор Рязанцева Н.В.).

В рамках выполнения клинического блока диссертационной работы была проведена оценка экспрессии мРНК галектина-1 в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у здоровых доноров и пациентов с ревматоидным артритом. В связи с этим было проведено обследование 10 пациентов (2 мужчин и 8 женщин, средний возраст 32±4 года) с ревматоидным артритом. Обследованные пациенты находились на лечении в Областной клинической больнице Калининградской области (главный врач - К.И. Поляков). Постановка диагноза ревматоидного артрита была выполнена согласно приказу №21 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным ревматоидным артритом» от 13 января 2006 г. Диагностические исследования включали опрос пациентов, рентгенографию, компьютерную и ЯМР-томографию суставов, выявление ревматоидного фактора и титра антител к циклическому цитрулин-содержащему пептиду, оценку скорости оседания эритроцитов и С-реактивного белка.

На основании оценки анамнеза болезни в исследование были включены пациенты, отвечающие следующим критериям:

• активность болезни - ремиссия (БА828 (визуальный калькулятор оценки активности заболевания при ревматоидном артрите) < 2,6);

• ревматоидный фактор - серопоэитивный;

• антитела к циклическому цитрулин-содержащему пептиду - серопоэитивный;

• продолжительность заболевания - не более года с момента постановки

диагноза.

Критерием исключения пациентов из исследования явилось прохождение медикаментозной терапии на момент взятия крови.

Исследования, проведенные в рамках клинического блока диссертационной работы, были выполнены на базе лаборатории иммунологии и клеточных биотехнологий инновационного парка Балтийского федерального университета

им. И. Канта (г. Калининград) (заведующая лабораторией - д-р мед. наук JI.C. Литвинова).

Мононуклеарные лейкоциты выделяли из цельной венозной крови, стабилизированной КЗ-ЭДТА, методом градиентного центрифугирования [Натвиг Дж. и соавт., 1980]. Венозную кровь в соотношении 2:1 наслаивали на градиент плотности Ficoll-Paque (р=1,077 г/смЗ) («GE Healthcare», Швеция) и центрифугировали в течение 20 мин при 300g. Кольцо клеток, образованное на границе раздела фаз, переносили в чистую центрифужную пробирку, трижды отмывали средой RPMI-1640, последовательно ресуспендируя и центрифугируя каждый раз в течение 10 мин при 300g.

Полученные мононуклеарные лейкоциты стандартизировали до г.О'Ю'/мл, культивировали в полной питательной среде RPMI-1640 (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) при 5% С02, 37°С.

С целью активации лимфоцитов в культуральную среду сразу после выделения клеток добавляли aHTH-CD3 (1 мкг/мл) и bhth-CD28 (2 мкг/мл) антитела (BD Pharmingen™, США).

Исследование апоптоза и дифференцировки СЭ4+-лимфоцитов было выполнено на клетках, культивированных с добавлением рекомбинантной формы галектина-1 (RnDSystems, США) одновременно с активирующими антителами. Использованные концентрации гапектина-1 представлены в таблице 1. Активность апоптоза была исследована при добавлении галектина-1 в диапозоне доз 0,1 - 4,0 мкг/мл. На основании результатов исследования содержания апоптотически измененных клеток для оценки влияния галектина-1 на дифференцировку CD4+-лимфоцитов были выбраны следующие дозы рекомбинантного галектина-1: 1,0 мкг/мл - максимальная, не вызывающая гибель клеток концентрация, и 2,0 мкг/мл - пограничная с минимальной проапоптотической дозой. Контрольную группу составили клетки, культивированные в отсутствии галектина-1.

Для исследования дифференцировки С04+-лимфоцитов за 4 ч до окончания инкубации к клеткам добавляли ФМА (50 нг/мл) и кальция иономицин (1 мкг/мл).

Продолжительность культивирования клеток при исследовании апоптоза составила 18 ч, при исследовании дифференцировки клеток - 72 ч (таблица 1).

С целью генерации субпопуляции регуляторных Т-лимфоцитов в культуральную среду одновременно с активирующими антителами добавляли рекомбинантные цитокины IL-2 (10 нг/мл) и TGF-pi (20 нг/мл) (RnDSystems, США). Подбор доз цитокинов был осуществлен в результате анализа фенотипа регуляторных Т-лимфоцитов, клеточности и жизнеспособности культуры при добавлении используемых цитокинов в различных комбинациях концентраций. Рекомбинантную форму галектина-1 (0,5 и 1,0 мкг/мл) добавляли одновременно с активирующими антителами и цитокинами, или через 72 ч от начала культивирования (таблица 1). Контрольную группу составили клетки, культивированные в отсутствии рекомбинантных цитокинов и галектина-1. Содержание FoxP3 и перфорина анализировали в клетках, культивированных с добавлением галектина-1 через 72 ч от начала культивирования. Общая продолжительность культивирования клеток составила 6 сут.

Таблица I

Условия культивирования мононуклеарных лейкоцитов

Условия культивирования Оцениваемый показатель

Дополнительные компоненты среды Время добавления галектина-1 Концентрация галектина-1, мкг/мл Продолжительность культивирования

Модель активации лимфоцитов

Антитела к CD3 и CD28 Сразу после выделения 0,1-4,0 18ч Активность апоптоза

2,5-4,0 Деполяризация митохондриальной мембраны

3,5 Изменение содержания белков семейства Вс1-2

Антитела к CD3 и CD28, ФМА, иономицин Сразу после выделения 0,1; 2,0 72 ч Уровень экспрессии мРНК транскрипционных факторов

Продукция цитокинов

Модель дифференцировки в регуляторные Т-лимфоциты

Антитела к CD3 и CD28, IL-2, TGFP1 Сразу после выделения 0,5; 1,0 6 сут Фенотип регуляторных Т-лимфоцитов

Через 72 часа Фенотип регуляторных Т-лимфоцитов

1,0 Внутриклеточное содержание FoxP3 и перфорина

Количество С04+-лимфоцитов в состоянии апоптоза идентифицировали методом проточной цитофлуориметрии по связыванию лимфоцитами, окрашенными aHTH-CD4-FITC антителами, аннексина-V, меченного фикоэритрином, и витального красителя 7-аминоактиномицина D (7ААД). Клетки дважды отмывали от культуральной среды фосфатно-солевым буфером, содержащим 2% ЭТС. 50 мкл клеток в количестве 1х105/мл переносили в пробирки для проточного цитометра, добавляли 5 мкл антител к CD4 (ООО «Сорбент»), конъюгированных с FITC, инкубировали 30 мин в темноте при +4°С. Отмывали клетки в холодном фосфатно-солевом буфере и ресуспендировали в 100 мкл 1хСа2+-связывающего буфера (eBioscience, США). Затем добавляли 5 мкл Аннексии-V-PE и 5 мкл 7-AAD (eBioscience, США), осторожно перемешивали и инкубировали в течение 15 мин при 25°С в темноте. Добавляли по 400 мкл 1хСа2+-связывающего буфера в каждую пробирку и проводили анализ на проточном цитофлуориметре FACSCanto™ II (BD, США) с использованием программного обеспечения FACSDiva Version 6.1.3.

Изменение трансмембранного потенциала митохондрий исследовали методом проточной цитометрии с помощью митохондриального зонда JC-1 (5,5',6,6'-тетрахлоро-1,Г,3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид). В чистую полистероловую пробирку переносили 1 мл клеточной суспензии, содержащей 1 * 10б кл/мл, и центрифугировали при 400g 5 мин при комнатной температуре. К клеточному осадку добавляли 0,5 мл свежеприготовленного раствора JC-1 (DePsipher™ Kit, Trevigen Inc., США). Клетки ресуспендировали и инкубировали

10-15 мин при 37°С в С02-инкубаторе. Затем клетки дважды отмывали буфером. Полученный осадок ресупендировали в 0,5 мл отмывочного буфера. Полученные образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCanto™ II (BD, США) с использованием программного обеспечения FACSDiva Version 6.1.3.

Содержание белков Bcl-2, Вах, FoxP3 и перфорина определяли методом вестерн-блотгинга. Для этого белки клеточных лизатов разделяли по молекулярной массе методом электрофореза в 5%-ном концентрирующем полиакриламидном геле (0,13 мМ Tris-HCl, рН=6,8 («Helikon», США)) и 10%-ном разделяющем полиакриламидном геле (375 мМ Tris-HCl, рН=8,8 («Helikon», США)) под действием электрического поля (10 В/см пути). Разделенные по молекулярной массе белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) при силе тока 45 мА. Затем нитроцеллюлозную мембрану блокировали 1 % желатином с последующей инкубацией с первичными моноклонапьными антителами к искомому белку (Bcl-2, Вах, FoxP3, перфорин) («RnDSystems», США). После трех отмывок в TTBS на мембрану наносили вторичные антитела с пероксидазной меткой («RnDSystems», США) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации мембрану трижды отмывали и производили детекцию белков путем добавления хемилюминесцентного субстрата («Invitrogen», США). Вывод о содержании исследуемого белка делали по изменению отношения величины сигнала метки искомого белка к величине сигнала с фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа («Sigma», США), используя программное обеспечение Total Lab.

Экспрессию мРНК генов FOXP3, RORC, ТВХ21, GATA-3 определяли методом RT-PCR. Выделение РНК из мононуклеарных лейкоцитов осуществляли сорбентно-колоночным методом (RNeasy Plus Mini Kit, QIAGEN, Германия). ДНК синтезировали на матрице мРНК при участии обратной транскриптазы MMuLV-RT («Promega», США). Полученный фрагмент ДНК амплифицировали методом PCR в режиме реального времени с использованием SYBR Green I на амплификаторе Mini Opticon («Bio-Rad», США). Для нормализации начального количества мРНК в образце и эффективности обратной транскрипции измерялось количество кДНК гена ß-актин, относительно равной степени экспрессирующихся во всех клетках. Относительное количество кДНК в образце рассчитывали по калибровочной кривой. Результаты выражали в условных единицах (относительное количество кДНК исследуемого гена к относительному количеству кДНК гена «домашнего хозяйства»).

Определение количества интерферона (IFN) у и интерлейкинов (IL)-13, IL-10, IL-17A в культуральных супернатантах осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» согласно протоколам фирмы-производителя («RnDSystems», США).

Содержание T-reg-лимфоцитов определяли по связыванию антител к транскрипционному фактору FoxP3 человека, меченных РЕ; анти-С025, меченных АРС; и aHTH-CD4, меченных FITC (BD Pharmingen, США) [Быковская С.Н. и др., 2013]. В работе использовался набор буферов Human FoxP3 Buffer Set (BD Pharmingen, США).

Экспрессию мРНК галектина-1 определяли методом RT-PCR. Процедуру выделения РНК проводили сорбентно-колоночным методом с помощью набора

реактивов «Axyprep multisource total RNA miniprep kit» (Eurogen) согласно протоколу производителя. ДНК синтезировали на матрице мРНК при участии обратной транскриптазы. Полученный фрагмент ДНК амплифицировали методом ПЦР в режиме реального времени с использованием SYBR Green I. Для нормализации начального количества мРНК в образце и эффективности обратной транскрипции измерялось количество кДНК гена р2-микроактина. Для определения относительного количества кДНК в образце использовался критерий dCt. Результаты выражали в условных единицах (отношение числа циклов амплификации исследуемого гена к количеству циклов амплификации гена «домашнего хозяйства»).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы SPSS 16.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Шапиро-Вилка. Для оценки достоверности различий зависимых выборок использовали непараметрический критерий Вилкоксона. Для оценки достоверности различий независимых выборок использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05. Результаты выражали в виде медианы (Me), первого (Q1) и третьего (Q3) квартилей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние галектина-1 на апоптоз активированных CD4*-лимфоцитов

На первом этапе проведенного нами исследования на модели активации клеток (модель 1) была выполнена оценка влияния галектина-1 на апоптоз CD4+-лимфоцитов. Данный этап включал определение количества апоптотически измененных С04+-лимфоцитов при добавлении рекомбинантной формы галектина-1 в дозах 0,1-4,0 мкг/мл одновременно с активирующими антителами. Добавление галектина-1 в дозе 2,5 мкг/мл значимо повышало (р<0,05) содержание С04+Аннексин+7ААД+ лимфоцитов, по сравнению со значением аналогичного показателя в контрольной группе. При этом дальнейшее увеличение дозы рекомбинантного белка сопровождалось увеличением значений данного показателя. Так в диапазоне доз галектина-1 1,0; 2,5; 3,5 и 4,0 мкг/мл количество С04+Аннексин*7ААД+ лимфоцитов достоверно (р<0,05) различалось в зависимости от добавляемой дозы (рисунок 1).

Полученные нами результаты свидетельствуют о проапоптотическом дозозависимом действии галектина-1, что подтверждается рядом работ, проведенных другими исследователями на Т-клетках человека, активированных с использованием фитогемагглютинина и IL-2, Т-клетках линий СЕМ и MOLT-4, Jurkat и Т-клетках крыс [Hahn Н.Р. et а!., 2004; Matarrese Р. et al., 2005; Brandt В., 2010].

Вероятным механизмом индукции апоптоза под действием галектина-1 является запуск митохондриального пути. Для подтверждения данной гипотезы нами выполнена оценка деполяризации митохондриальной мембраны и содержания антиапоптотического белка Вс1-2 и проапоптотического белка Вах при добавлении галектина-1 в проапоптотических дозах одновременно с антителами к

СБЗ и СБ28 (модель 1). Было зарегистрировано достоверное увеличение (р<0,05) процента клеток с деполяризованной митохондриапьной мембраной при действии галектина-1 в дозах 2,5; 3,5 и 4,0 мкг/мл, по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе. При этом значения анализируемого показателя достоверно (р<0,05) различались в зависимости от дозы рекомбинантного белка (таблица 2).

О 0Л 0,5 1 2,5 3,5 4 Концентрация галектина-1, мкг/мл

-А-аннекстш+~ААД+ -о-аннека[К+7ААД- -о-аннекглн-7ААД-

Рисунок 1. Содержание апоптотически измененных и жизнеспособных CD4+-лимфоцитов, активированных антителами к CD3 и CD28, в зависимости от концентрации рекомбинантного галектина-1 в культуральной среде: * - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями в интактной культуре лимфоцитов; ** - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями, полученными при добавлении галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл; *♦* - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями, полученными при добавлении галектина-1 в дозе 2,5 мкг/мл; **** - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями, полученными при добавлении галектина-1 в дозе 3,5 мкг/мл

Добавление рекомбинантного галектина-1 в дозе 3,5 мкг/мл приводило к достоверному снижению (р<0,05) антиапоптотического белка Вс1-2 и повышению (р<0,05) - проапоптотического белка Вах (рисунок 2). Известно, что выявленные нами изменения соотношения антиапоптотических и проапоптотических белков приводят к повышению проницаемости митохондриальной мембраны с последующим выходом цитохрома с, необходимого для активации каспазы-9, а также AIF и эндонуклеазы G [Belizärio J.E. et al., 2007]. Аналогичные результаты были получены В. Brandt et al. (2010), которые связали снижение экспрессии и фосфорилирование белка Вс1-2, увеличение экспрессии Bad и активацию каспазы-9 и -3 при действии галектина-1 с его способностью индуцировать фосфорилирование МКК4, МКК7, JNK и c-Jun киназ, а также активировать транскрипционный фактор АР-1. Кроме того, используя линию клеток Jurkat 31-13 с дефектом CD3, авторы показали, что активация АР-1 и фрагментация ДНК, индуцированная галектином-1, запускаются через CD3 [Brandt В., 2010].

Таблица 2

Количество лимфоцитов (%), окрашенных КМ в форме мономеров/агрегатов, при добавлении проапоптотических доз рекомбинантного галектина-1 в культуру клеток, активированных антителами к СЭЗ и С028, Ме ((>1-()3)

Показатель Концентрация г-галектина-1, (п = 15)

0,0 мкг/мл 2,5 мкг/мл 3,5 мкг/мл 4,0 мкг/мл

Лимфоциты, окрашенные JC-1-мономерами, % 12,55 (11,10-14,10) 27,00 (22,95-31,25) р1 < 0,05 38,80 (35,75-42,98) р, < 0,05 Р2 < 0,05 49,10 (43,83-51,43) Pi < 0,05 Р2 < 0,05 Рз< 0,05

Лимфоциты, окрашенные JC-1-агрегатами, % 79,98 (72,40-87,00) 70,35 (66,15-74,70) Pi < 0,05 58,6 (52,32-65,40) pi <0,05 Р2 < 0,05 48,7 (42,20-51,60) р, < 0,05 Р2 < 0,05 Рз < 0,05

Примечание: р/- уровень значимости различий, по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе; Р2~ по сравнению с аналогичным показателем при добавлении галектина-1 в дозе 2,5 мкг/мл; р; - по сравнению с аналогичным показателем при добавлении галектина-1 в дозе 3,5 мкг/мл

Концентрация галектина-1, мкг/мл

0,0 3,5 Концентрация галектина-1, мкг/мл

Рисунок 2. Внутриклеточное содержание антиапоптотического белка Вс1-2 и проапоптотического белка Вах в лизатах мононуклеарных лейкоцитов при действии in vitro рекомбинантного галектина-1 в условиях активации клеток с помощью антител к CD3 и CD28 ,Me(Qi-Q3).

Примечание, здесь и на рисунках 3-6: —— - медиана; Г] - 25-75% Т максимУм

LI (Qi-О.зУ, 1 _ минимум

Таким образом, механизмы, задействованные в реализации индуцированного галектином-1 апоптоза, связаны с запуском митохондриального пути, что проявляется деполяризацией митохондриальной мембраны, снижением количества антиапоптотического белка Вс1-2 и увеличением проапоптотического белка Вах.

На основании исследования, проведенного на модели активации клеток in vitro, можно сделать вывод, что индукция митохондриального пути апоптоза в С04+-лимфоцитах в процессе их активации через CD3 и CD28 является одним из механизмов иммуносупрессорного влияния галектина-1.

Влияние галектина-1 на дифференцировку активированных CD4+-лимфоцитов

Для оценки влияния галектина-1 на направление дифференцировки CD4+-лимфоцитов на модели активации клеток in vitro (модель 1) было проведено исследование экспрессии мРНК транскрипционных факторов Thl- (Tbet), Th2-(Gata-З), ТЬ17-клеток (RORc) и регуляторных Т-лимфоцитов (FoxP3). Также была исследована продукция основных цитокинов, характерных для Thl-, Th2-, Thl7- и регуляторных Т-лимфоцитов.

Ч 20-

Концентрация галектина-1, мкг/мл

Концентрация галектина-1, мкг/мл

Концентрация галектина-1, мкг/мл

0,0 1,0 2,0 Концентрация галектина-1, мкг/мл

Рисунок 3. Уровень экспрессии мРНК транскрипционных факторов дифференцировки С04+-лимфоцитов в мононуклеарных клетках при действии рекомбинантного галектина-1 в условиях активации лимфоцитов антителами к СОЗ и С028, Ме ((¿1 - ()3)

Добавление галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл приводило к значимому повышению (р<0,05) количества мРНК транскрипционных факторов Са1а-3 и РохРЗ на фоне достоверного снижения (р<0,05) уровня мРНК ТЪе1 и RORc (рисунок 3), по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе. Увеличение дозы галектина-1 до 2,0 мкг/мл сопровождалось достоверным снижением (р<0,05) количества мРНК Са1а-3 и РохРЗ, по сравнению с аналогичными показателями в культуре с добавлением галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл. Количество мРНК РохРЗ при этом значимо не отличалось от значения в контрольной группе (р 33,05), в то время как количество мРНК Оа(а-3 оставалось достоверно (р<0,05) более высоким, по сравнению со значением в контрольной группе. Количество мРНК ТЬе1 и Р(Жс при добавлении галектина-1 в дозе 2,0 мкг/мл оставалось на уровне данных показателей при действии галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл (рЗ),05) и было достоверно ниже (р<0,05) аналогичных показателей в контрольной группе. ■ Выявленное неспецифическое снижение экспрессии мРНК транскрипционных

факторов в клетках, культивированных с добавлением галектина-1 в дозе 2 мкг/мл, вероятно, связано с гибелью клеток, так как данная доза была близка к проапоптотической (2,5 мкг/мл). Примечательно, что количество мРНК Оа1а-3, хотя и снижалось по сравнению с действием галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл, но было в 4 раза выше контрольных значений.

Исследование количества цитокинов в надосадочных фракциях клеток выявило достоверное повышение (р<0,05) продукции 1Ь-13 и отсутствие значимых изменений (р 20,05) количества ШЫ-у, 1И7 и 1Ь-10 при действии галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл, по сравнению с контрольной группой (рисунок 4).

п-г

0,0 1,0 2,0 Концентрация галектина-1, мкг/мл

п-1-г

0,0 1,0 2,0 Концентрация галектина-1, мкг/мл

1-1-Г

0,0 1,0 2,0 Концентрация галектина-1, мкг/мл

"1-1-Г

0,0 1,0 2,0 Концентрация галектина-1, мкг/мл

Рисунок 4. Содержание цитокинов в надосадочных фракциях культур клеток при действии рекомбинантного галектина-1 в условиях активации антителами к СЬЗ и С028, Ме (2з).

При действии галектина-1 в дозе 2,0 мкг/мл количество 1Ь-13 достоверно снижалось (р<0,05), по сравнению со значениями данного показателя, полученными при действии галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл, оставаясь, при этом, достоверно выше данного показателя в контрольной группе. Количество 1РЫ-у достоверно повышалось (р<0,05) по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе и в группе с добавлением галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл. Содержание 1Ь-17 и 1Ь-10 при действии галектина-1 в дозе 2,0 мкг/мл было статистически значимо ниже (р<0,05) значения аналогичных показателей в контрольной группе и при добавлении галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл (рисунок 4).

Таким образом, установлено, что действие галектина-1 на СВ4+-лимфоциты в процессе их активации в дозах ниже проапоптотической приводит к преобладанию дифференцировки в направлении ТЬ2- и Tгeg-клeтoк.

На основании описанных выше результатов можно предположить, что недостаточность контроля, опосредованного гапектином-1, является звеном патогенеза заболеваний, связанных с избыточной активностью ТЫ- и ТЫ7-

лимфоцитов (например, ревматоидного артрита) [Gaffen S.L., 2009; Sarkar S. et al., 2010; Choy E., 2012]. Данное предположение подтверждается терапевтической эффективностью галектина-1, выявленной исследователями на экспериментальной модели ревматоидного артрита in vivo [Wang A.L. et al., 2010].

В результате исследования количества мРНК галектина-1 в мононуклеарных клетках было выявлено значимое снижение (р<0,05) экспрессии мРНК галектина-1 при ревматоидном артрите, по сравнению с аналогичным показателем у здоровых доноров (рисунок 5).

_ 40_

è §

S =í S к

I §20-

Ê 'fr" s

0-

Рисунок 5. Количество мРНК галектина-1 в мононуклеарных клетках здоровых доноров (1) и пациентов с ревматоидным артритом (2)

Таким образом, сниженная экспрессия мРНК галектина-1, установленная нами при ревматоидном артрите, может являться причиной дисрегуляции дифференцировки С04+-лимфоцитов и неконтролируемой экспансии Thl- и ТЫ 7-лимфоцитов, что является патогенетическим звеном аутоиммунных заболеваний.

Влияние галектина-1 на дифференцированные in vitro регуляторные СD4+-лимфоциты

Иммунорегуляторное действие галектина-1 может также реализовываться на этапе дифференцированных С04+-лимфоцитов, особый интерес среди которых, на наш взгляд, представляют регуляторные Т-лимфоциты, являющиеся основными клетками, обеспечивающими «периферические» механизмы аутотолерантности.

Нами было проведено исследование влияния галектина-1 на фенотип и функциональную активность регуляторных Т-лимфоцитов (модель 2).

На 6 сут культивирования клеток в условиях направленной дифференцировки (добавление рекомбинантных IL-2 и TGF-pi) 59,70(49,10-61,20)% лимфоцитов характеризовались фенотипом CD4+CD25+FoxP3~, 40,20(40,00-49,20)% -фенотипом CD4+CD25+FoxP3+ (таблицы 3, 4).

При добавлении галектина-1 одновременно с активирующими антителами и рекомбинантными цитокинами в дозах 0,5 и 1,0 мкг/мл количество CD4+CD25+FoxP3+ лимфоцитов составило 17,35(12,40-22,30)% и 13,35(8,50-15,60)%, соответственно, что было достоверно ниже (р<0,05) по сравнению с аналогичным показателем, полученным при добавлении рекомбинантных цитокинов без галектина-1 (таблица 3).

Добавление галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл через 72 ч от начала культивирования приводило к достоверному повышению (р<0,05) количества CD4+CD25+FoxP3+ лимфоцитов (59,10 (45,30-64,20)%) (таблица 4). При этом

введение в культуральную среду галектина-1 в дозе 0,5 мкг/мл не сопровождалось достоверным изменением (р 20,05) количества СВ4+СЮ25+РохРЗ+ лимфоцитов.

Таблица 3

Содержание субпопуляций СЭ4+-лимфоцитов при добавлении в культуру клеток рекомбинантного галектина-1 одновременно с активирующими антителами. Ме (0.1 -Оз)

Субпопуляции СЕ>4+ лимфоцитов на 6-е сут культивирования Условия культивирования

антаСБЗ/С028 антитела (контроль) (п=15) 1Ь-2, ТОР-Э,. ангиС03/С028 антитела (п- 15) 11.-2, ТСР-Р|, антиСРЗ/С028 анпггепа, галектин-1 0,5 мкг/мл (п = 15) 1Ь-2, ТОР-Р|, ангиС03/С028 антитела, галектин-1 1,0 мкг/мл (п = 15)

С025ТокРЗ", % 67,30 (57,30-74,60) 0,30 (0,10-1,70) Р1 < 0,05 4,70 (4,50-4,90) Р1 < 0,05 Р2 < 0,05 3,60 (3,40-3,60) Р1 < 0,05 Р2 < 0,05 Рз 2 0,05

С025ТохРЗ-, % 15,40 (8,40-21,70) 59,70 (49,10-61,20) Р1 < 0,05 77,90 (73,20-82,60) р, < 0,05 Р2 < 0,05 83,45 (80,80-87,90) Р1 < 0,05 Р2 < 0,05 Рз < 0,05

С025Т:охРЗ", % 17,30 (12,90-21,00) 40,20 (40,00-49,20) Р1 < 0,05 17,35 (12,40-22,30) Р1 2 0,05 Р2 < 0,05 13,35 (8,50-15,60) Р1 < 0,05 р2 < 0,05 рз < 0,05

Примечание: здесь и в таблица 4, р/ - уровень значимости различий показателей по сравнению с контрольной группой; Р2 - по сравнению с клетками, культивированными с добавлением рекомбинантных цитокинов в отсутствии галектина-1; рз - по сравнению с клетками, культивированными с добавлением рекомбинантных цитокинов и галектина-1 в дозе 0,5 мкг/мл.

Таблица 4

Содержание субпопуляций С04*-лимфоцитов при добавлении в культуру клеток

рекомбинантного галектина-1 через 72 ч от начала культивирования, Ме (01 - С?3)

Субпопуляции СЭ4+ лимфоцитов на 6-е сутки культивирования Условия культивирования

антиС03/С028 антитела (контроль), (п=15) 1Ь-2, ТСР-Р1, антиС03/С028 антитела, (п=15) 1Ь-2, ТОР-Р1, антиС03/С028 антитела, галектин-1 0,5 мкг/мл (п=15) 1Ь-2, ТОР-р1, ашиС03/С028 антитела, галектин-1 1,0 мкг/мл (п=15)

С025ТохРЗ", % 6730 (57,30-74.60) 0,30(0,10-1,70) р\ < 0,05 0,20 (0,10-1,80) р\ < 0,05 р2 2 0,05 0,30 (0,20-1,90) р\ < 0,05 р2 2 0,05 рЗ 2 0,05

СР25ТохРЗ', % 15,40 (8,40-21,70) 59,70 (49,10-61 ДО) р\ < 0,05 54,60 (44,20-62,20) р\ <0,05 р2 2 0,05 40,60 (33,90-54,60) р\ <0,05 р2 < 0,05 рЗ < 0,05

СЭгзТчэхРЗ", % 17,30 (12,90-21,00) 40,20 (40,00-49,20) р\ <0,05 45,30(37,70-54,00) р1 < 0,05 р2 2 0,05 59,10 (45,30-64,20) р1 <0,05 р2 < 0,05 рЗ < 0,05

Таким образом, добавление рекомбинантного галектина-1 одновременно с активирующими антителами ингибирует экспансию клеток с фенотипом

С04+С025"1ТохРЗ^. Добавление галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл через 72 ч культивирования клеток повышает количество клеток с фенотипом С04+СБ25+РохРЗ+.

Для оценки влияния галектина-1 на функциональную активность регуляторных Т-лимфоцитов нами было исследовано содержание белков транскрипционного фактора РохРЗ и перфорина в клетках, культивированных в условиях направленной дифференцировки в регуляторные Т-лимфоциты, при добавлении галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл через 72 ч от начала культивирования.

Добавление галектина-1 достоверно повышало (р<0,05) количество белка транскрипционного фактора РохРЗ (0,68(0,62-0,92) усл. ед.) и перфорина (4,98(3,24-7,28) усл. ед.), по сравнению с аналогичными показателями в клетках, культивированных в условиях направленной дифференцировки без добавления галектина-1 (0,32(0,24-0,40) усл. ед. - для РохРЗ; 3,13(2,21-4,67) усл. ед. - для перфорина) (рисунок 6).

1 2 3 Условия культивирования

"Г

1 2 3 Условия культивирования

Рисунок 6. Внутриклеточное содержание транскрипционного фактора FoxP3 (а) и перфорина (б) в мононуклеарных клетках на 6-е сут культивирования. Примечание: 1 -добавление активирующих антител на 1-е сут культивирования; 2 - добавление активирующих антител и цитокинов (IL-2, TGFpi) на 1-е сут культивирования; 3 -добавление активирующих антител и цитокинов (IL-2, TGFpi) на 1-е сут культивирования, добавление рекомбинангного галектина-1 через 72 ч от начала культивирования

Увеличение внутриклеточного содержания белков FoxP3 и перфорина под действием галектина-1 является важным показателем влияния галектина-1 на функциональную активность регуляторных Т-лимфоцитов. Так, контактные механизмы супрессии активности эффекторных клеток характерны для FoxP3-экспрессирующих лимфоцитов. Перфорин обеспечивает пермеабилизацию мембраны клеток-мишеней с последующим цитолизом или гранзим-индуированным апоптозом [Keefe D. et al., 2005; Cao X. et al., 2007].

Выявленные на модели in vitro повышение количества CD4+CD25+-лимфоцитов, экспрессирующих FoxP3, увеличение количества транскрипционного фактора и продукции перфорина при действии галектина-1 на дифференцированные клетки свидетельствуют о том, что иммунорегуляторное действие данного представителя семейства лектинов включает поддержание регуляторного фенотипа и повышение функциональной активности уже дифференцированных С04+-лимфоцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее диссертационное исследование, основанное на моделях активации лимфоцитов и дифференцировки в регуляторные Т-клетки, созданных in vitro, было направлено на идентификацию механизмов регуляции баланса CD4+-лимфоцитов при действии галектина-1.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что, действуя на CD4+-лимфоциты в процессе активации через CD3 и CD28, галектин-1 индуцирует митохондриальный путь реализации апоптоза и направляет дифференцировку клеток по пути Th2- и Treg-лимфоцитов (рисунок 7). Выявленные изменения направлений дифференцировки CD4+-лимфоцитов при действии галектина-1 позволяют рассматривать эффекты данного белка не только с точки зрения иммуносупрессии. Так, на основании полученных in vitro результатов можно ожидать эффекторные реакции ТЪ2-типа, т.е. запуск гуморального иммунного ответа, а также реципрокное подавление реакций Thl-типа в случае влияния галектина-1 на С04+-лимфоциты в процессе распознавания антигена. Особое значение имеет выявленное потенцирующее влияние галектина-1 на регуляторное звено иммунного ответа, заключающееся в экспансии функционально активных экспрессирующих FoxP3 регуляторных С04+-лимфоцитов, обеспечивающих поддержание аутотолерантности.

Установленные в данной диссертационной работе особенности влияния галектина-1 на апоптоз и дифференцировку С04+-лимфоцитов могут иметь как физиологическое, так и патогенетическое значение. С одной стороны, индуцируя апоптоз и направляя дифференцировку С04+-лимфоцитов по пути Th2- и Treg-клеток, галектин-1 может обеспечивать ауторегуляцию, направленную на предотвращение избыточной активации иммунных реакций и защиту здоровых тканей от иммуно-опосредованного повреждения. Следуя данной логике, нарушения галектин-1-опосредованной регуляции баланса CD4+-лимфоцитов могут представлять собой звено патогенеза аутоиммунных заболеваний. Причиной такой дисрегуляции может служить снижение экспрессии мРНК галектина-1, выявленное нами на примере ревматоидного артрита. Данное предположение подтверждается терапевтическим эффектом галектина-1, показанным на различных экспериментальных моделях заболеваний, имеющих аутоиммунный генез (миастения Гравис, энцефаломиелит, артрит, гепатит, болезнь трансплантат против хозяина, увеит и диабет). В связи с этим, генная или белковая, например в рекомбинантной форме, доставка галектина-1, а также использование его в кулыуральных условиях для получения регуляторных Т-лимфоцитов in vitro может рассматриваться в качестве основы для разработки новых подходов терапии аутоиммунных заболеваний.

С другой стороны, гибель С04+-лимфоцитов, а также экспансия регуляторных Т-лимфоцитов при действии галектина-1, секретируемого опухолевыми клетками и клетками опухолевого микроокружения, может способствовать опухолевой прогрессии в результате иммуносупрессии. Учитывая описанную в литературе способность опухолевых клеток различного происхождения (Ходжкинской лимфомы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, желудка, легких и новообразований других локализаций) секретировать галектин-1, данный лектин может рассматриваться в качестве терапевтической мишени. В этом случае

1*£РЕНЦНРОВКА

АПОПТОЗ

1Ь-17

-1

I [БюшеИ 5.11., 2008: Фмой-ап С.С., 2008]

|дМоЦап С.С.. 2008]

1Ь-4 1Ь-5

| [Мой:ап С.С.. 2008] П.-6

перфорин

Цг

-1

П.-10

ЦЛЗ

-Т1

ц, ¡1

Вс1-2 В ах

[ВгапсКВ., 2008] ^

цитохром с — -[НаЬпКР.,2004] + АП5 Эндонуклеаза в

каспаза 9

каспаза 3

+[Вгап(ИВ„ 2004]

[StoweIl 8.1*., 2008; ¡1 Мой-ап С.С., 2008]

1 Митохондриальный путь апоптоза

Элиминация патогена

Аутотолерантность

Аутоиммунные заболевания

Опухолевая прогрессия

Рисунок 7. Влияние галектина-1 на дифференцировку и апоптоз С04+-лимфоцитов по результатам собственных исследований (выделено красным цветом: 1 - результаты, полученные на модели активации лимфоцитов, 2 - результаты, полученные на модели клеток, дифференцированных в направлении регуляторных Т-лимфоцитов), а также по данным литературы.

ингибирование галектина-1, например, с помощью антител или специфических ингибиторов, позволит предотвратить гибель СГ)4+-лимфоцитов, что является необходимым компонентом противоопухолевой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Гапсктин-1 оказывает дозозависимос действие на CD3/CD28-активированные лимфоциты, повышая содержание апоптотически измененных СБ4+-лимфоцитов при добавлении в культуральную среду в концентрациях от 2,5 до 4,0 мкг/мл.

2. Апоптоз активированных лимфоцитов, индуцировашшй галектином-1, реализуется через запуск митохондриального пути: действие рекомбинантного галектина-1 в проапоптотических дозах сопровождается деполяризацией митохондриальной мембраны, снижением количества антиапоптотического белка Вс1-2 и увеличением содержания проапоптотического белка Вах.

3. Галсктин-1 при действии in vitro в дозе 1,0 мкг/мл на активированные CD44-лимфоциты направляет дифференцировку клеток по пути Th2- и Treg-лимфоцитов, что проявляется повышением экспрессии мРНК транскрипционных факторов GATA-3 и FoxP3 и увеличением продукции IL-13 на фоне снижения содержания мРНК Tbet и RORc.

4. При патологии, характеризующейся диерегуляцией дифференцировки С04+-лимфоцитов (на примере ревматоидного артрита), имеет место сниженная экспрессия мРНК галектипа-1.

5. Действие in vitro галектина-1 в дозе 1,0 мкг/мл на дифференцированные регуляторные Т-лимфоциты приводит к экспансии клеток с фенотипом CD4+CD25+FoxP3\ а также увеличению внутриклеточного содержания фактора FoxP3 и цитолитического белка перфорина, определяющих иммуносупресорные свойства данной субпопуляции клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Роль галсктина-1 в регуляции гомсостаза Т-лимфоцитов / Якушина В.Д., Васильева O.A.. Рязанцева Н.В., Новицкий В.П., Чечина O.E., Прохоренко Т.С.. Старикова Е.Г. // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. -Т.10,№ 6. - С. 93-99.

2. Исследование механизмов модуляции апоптоза Т-лимфонитов / Якушина В.Д., Белкина М.В., Марошкииа А.Н., Кайгородова Е.В., Васильева O.A. // CG. «Актуальные проблемы медицины»: материалы 14-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием. - Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н. Ф. Катанона». 2011. - С. 262-265.

3. Факторы, модулирующие апоптоз Т-лимфоцитов / Якушина В.Д.. Белкина М.В., Марошкипа А.Н., Кайгородова Е.В., Васильева O.A. // «Науки о человеке»: материалы XII Российского конгресса молодых ученых с международным участием. - Томск: СибГМУ. -2011.-С. 75-76.

4. Изучение молекулярных механизмов управления апоптозом Т-лимфоцитов / Якушина В.Д., Белкина М.В., Марошкииа А.Н., Кайгородова Е.В., Васильева O.A. // Сб. «Фундаментальная наука и клиническая медицина — Человек и его здоровье»: Тезисы XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием). — СПб.: Изл-во СПбГУ, 2011. — С. 310-311.

5. Возможности использования галектина-3 в лабораторной диагностике / Васильева O.A., Якушина В.Д., Рязанцева Н.В.. Новицкий В.В. // Кптико-лаборагорный консилиум. - 2011. -Т.38, №2.-С. 12-16.

6. Галектин-l: роль в формировании особенностей врожденного и приобретенного иммунитета / Якушина В.Д., Васильева O.A., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Савельева O.E., Прохоренко Т.С., Старикова Е.Г., Зима А.П. // Медицинская иммунология. - 2012. - Т 14 №1-2.-С. 21-32.

7. Оценка влияния галектина-1 на дифференцировку Т-регуляторных лимфоцитов in vitro / O.A. Васильева, В.Д. Якушина, Н.В. Андреева // «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» сборник трудов международной Интернет-Конференции, Казань, 12-15 марта 2012г.-С. 44-46.

8. Исследование влияния рекомбинантного галектина-1 на дифференцировку CD4+CD25+FoxP3+-лимфоцитов / O.A. Васильева, В.Д Якушина, Н.В. Андреева // Бюллетень северного государственного медицинского университета, Архангельск. - 2012. -№1.-С. 138-139

9. Апоптоэ регуляторных Т-лимфоцитов под действием галсктнна-1 / В.Д. Якушина, O.A. Васильева, И.С. Небесная, Т.Ю. Краснова // Дни биохимии в СПбГМУ: сборник тезисов международной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 115-летию СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, Санкг-петербург, 2-4 декабря 2012 г. - С. 69-70.

10. Влияние рекомбинантного галектина-1 на содержание транскрипционного фактора дифференцировки Т-регуляторных клеток in vitro / O.A. Васильева, В.Д. Якушина, Н.В. Андреева, И.С. Небесная, Т.Ю. Краснова // Дни биохимии в СПбГМУ: сборник тезисов международной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 115-летию СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, Санкг-петербург, 2-4 декабря 2012 г. - С. 12-13.

11. Apoptosis of regulatory T-cells under the treatment of galectin-1 / V.D. Yakushina, O.A. Vasil'eva, N.V. Andreeva, A.P. Zima, N.V. Ryazantseva // Программируемая гибель клеток в биологии и медицине: сборник тезисов, Москва, 4-5 июня 2012 г. - С. 66-67.

12. Регуляция экспрессии генов транскрипционных факторов дифференцировки Т-лимфоцитов CD4+ галектином-3 in vitro / Васильева O.A., Якушина В.Д., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Таширева Л.А., Старикова Е.Г., Зима А.П., Прохоренко Т.С., Краснова Т.Ю., Небесная И.С. // Молекулярная биология. - 2013 - Т.47, №6. - С. 1004-1010.

13. Влияние галектина-1 на апоптоз С154+-лимфоцитов, дифференцированных in vitro в направлении регуляторных Т- клеток / Якушина В.Д., Васильева O.A., Новицкий В.В., Андреева H B.. Старикова Е.Г., Таширева Л.А., Прохоренко Т.С., Зима А.П., Рязанцева Н.В. // Бюллетень экспериментальной биологии н медицины. - 2013 - Т. 156, №11- 616-619.

14. Апоптозиндуцирующее действие галектинов 1-го и 3-го типов на С04+-лимфоциты in vitro / O.A. Васильева, В.Д. Якушина, А.П. Зима, И.С. Небесная, Т.Ю. Краснова // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7 (16), № 2-3. - С. 138-139.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

7ААД - 7-аминоактаномицина D; АГ - антиген;

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;

ФМА - 4-форбол-12-миристат-13-ацетата

ЭДТА - этилендиаминтстраацетат

ЯМР - томография - магнитно-

резонансная томография;

АРС - аллофикоцианин;

BCR - В-клеточный рецептор;

CD - кластер дифференцировки (cluster of

differentiation);

FITC - флуоресцеин изотиоцианат; GAPDH - глицеральдегид-3-

фосфатдегццрогеназа; IFNy - интерферона-гамма, IL - интерлейкин;

JC-1 - 5,5',6,6l-тeтpaxлopo-l,Г,Э,3,-

тетрвэтилбенэимидазолилкарбоцианин

йодид;

МНС - главный комплекс

гистосовместимости;

РЕ - фикоэритрин;

RT-PCR - полимеразная цепная реакция с

обратной транскрипцией;

TCR - Т-клеточный рецептор;

TGB - трис-глициновый буфер;

TGF-pi - трансформирующий ростовой

фактор, бета-1 (Transforming growth factor

beta);

Th - Т-хелпер,

TNFa- фактор некроза опухоли альфа; Treg - регуляторные Т-лимфоциты; TTBS - раствор Трис буфера с Твин 20

1 I»- 1 0293

2014166676

Подписано в печать 01.07.2014 г. Усл. Печ. листов 0,65 Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Мос5ковский факт, 2, тел 53-04-08. Заказ № 157 Тираж 100 экземпляров

2014155875