Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение эффектов эндогенного ингибитора Na/K-АТФ-азы на экспериментальных моделях алкогольной зависимости

На правахрукописи

КАШКИН Владимир Александрович

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТОВ ЭНДОГЕННОГО ИНГИБИТОРА NA/K-АТФазы НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 03.00.13 - физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Институте фармакологии им. А.В. Вальдмана Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, в Католическом Университете Левена (Бельгия) и Национальном институте изучения старения (Балтимор, США).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Звартау Эдвин Эдуардович доктор медицинских наук Багров Алексей Яковлевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Андреев Борис Владимирович доктор медицинских наук, профессор Егоров Алексей Юрьевич

Ведущая организация:

НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Зашита диссертации состоится 14 мая 2004 г. в 14.30 на заседании диссертационного совета Д.208.090.03 при Санкт-Петербургском Государственном медицинском университете им. акад. И.П. Павлова (197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8) в зале заседания Ученого совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова.

Автореферат разослан "_"_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного

профессор: ¿4\J/' Митрейкин Владимир Филиппович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На протяжении последних 20 лет накоплен значительный клинический и экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что различные ткани и плазма крови человека и других млекопитающих содержат эндогенные дигиталисоподобные лиганды натриевого насоса (ЭДЛНН), т.е. вещества, ингибирующие Na/K-АТФазу и обладающие ди-гиталисоподобной иммунореактивностью (De Wardener и Clarkson, 1985, Goto et alet al., 1992, Schoner, 1992).

Оубаин-чувствительная, магний-зависимая натрий-калиевая аде-нозинтрифосфатаза (Na/K-АТФаза) представляет собой уникальную регу-ляторную систему. Na/K-АТФаза является ферментом, встроенным в мембрану и осуществляющим гидролиз АТФ. Na/K-АТФаза является также и транспортной системой, осуществляющей активный трансмембранный транспорт моновалентных катионов против градиента их концентрации. Участок аминокислотной цепи альфа-субъединицы фермента, обладая эволюционной консервативностью, является специфическим рецептором для сердечных гликозидов.

Показано, что ЭДЛНН принимают участие в регуляции сократимости миокарда, водно-солевого обмена, играют важную роль в патогенезе некоторых, преимущественно объем-зависимых, форм артериальной ги-пертензии. Помимо этого, существуют предположения о возможной ней-рорегуляторной роли ЭДЛНН, в частности в отношении поведенческих реакций и участии в патогенезе психических заболеваний.

Растет количество доказательств, которые указывают на существование нескольких ЭДЛНН в центральной нервной системе млекопитающих (Yamada et al., 1992; Goto et al, 1995; Tymiak et al., 1993; De Lorez Arnaiz, 2000). ЭДЛНН представлены в различных отделах мозга (Yamada et al., 1992; Goto et al., 1995; Tymiak et al., 1993; De Lorez Arnaiz, 2000). Содержание оубаионоподобных соединений (ОПС) изменяется при эмоциональном стрессе (Goto et al., 1995), при психических заболеваниях (Grider et al., 1999). Центральное введение оубаина влияет на поведение у крыс (Li et al., 1997; Ruktanochai et al., 1998). Изменение активности натриевого насоса в различных тканях было замечено при маниакально-депрессивном психозе (Naylor et al., 1973; Rybakowski et al., 1994; El-Mallakh и Wyatt,1995).

Есть свидетельства вовлечения ЭДЛНН в контроль настроения и в развитие алкогольной зависимости. Действие этанола может быть связано как с ингибированием, так и с активацией №/К-АТФазы/Ка/К-насоса в

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ

«

БИБЛИОТЕКА СПетер ОЭ !СЭ

/

зависимости от дозы, пути введения и времени экспозиции (Nhamburo et al., 1987; Altura и Altura, 1989; Foster et al., 1989; Foley и Linnoila, 1995). Показано, что стимулирующий эффект этанола на натриевый насос (Na/K-АТФазу) в мозге крысы, возможно, связан с антагонизмом эндогенному ингибиторному лиганду (Foley и Rhoads, 1994).

Первым идентифицированным эндогенным ОПС был карденолид (Ludens et al, 1991). Далее были выявлены лиганды буфодиенолидной структуры (Goto et al., 1991; Lichtstein et al., 1993, Hilton et al., 1996; Sich et al., 1996). Стероидные соединения класса буфадиенолидов являются эндогенными ингибиторами Na/K-АТФазы, которые синтезируются в паротид-ных железах и коже амфибий (Barbier et al., 1959; Flier, 1978) и являются регуляторами чрезкожного транспорта натрия, действующими за счет влияния на активность Na/K-АТФазы. Было показано (Bagrov et al., 1993), что яд жаб Bufo marinus имеет в своём составе буфадиенолиды, среди которых нас особенно заинтересовал селективный лиганд альфа-1 изоформы натриевого насоса - маринобуфагенин (МБГ) (Bagrov et al., 1995). Позже МБГ был описан у млекопитающих (Bagrov et al., 1998, Fedorova et al., 2000). Примечательно, что экскреция МБГ у крыс под действием этанола возрастает, а активная иммунизация животных против МБГ вызывает повышение потребления этанола в условиях свободного выбора (Bagrov et al., 1999).

Таким образом, учитывая данные об эндогенной природе буфа-диенолидов, их участии в регуляции активности натриевого насоса, изменении функции данного энзима под влиянием этанола и при психопатологии, представлялось целесообразным исследовать фармакологические свойства маринобуфагенина на экспериментальных моделях аддиктивного поведения в условиях, доказывающих их центральный эффект.

Цель данной работы заключалась в изучении фармакологических эффектов ингибитора альфа-1 изоформы натриевого насоса марино-буфагенина на экспериментальных моделях, используемых для оценки аддиктивного потенциала алкоголя.

Основные задачи исследования:

1. Определить способность маринобуфагенина проникать в ЦНС и инги-

бировать Na/K-АТФазу в синаптосомах головного мозга.

2. Исследовать собственное влияние маринобуфагенина и оубаина, а также

эффект их совместного введения с этанолом на уровень нейротранс-митгерных аминокислот в прилежащем ядре перегородки головного мозга.

3. Изучить влияние маринобуфагенина и антител к нему на подкрепляю-

щие свойства этанола.

4. Изучить влияние маринобуфагенина на дискриминативные стимульные

свойства этанола. Научная новизна исследования

Впервые доказано модулирующее влияние уровня активности натриевой помпы на первично-подкрепляющие свойства этанола на основе анализа эффектов эндогенного ингибитора маринобуфагенина и антител к нему.

Впервые доказана способность маринобуфагенина проникать в мозг и ингибировать №/^АТФазу мозговой ткани.

Впервые показано, что ингибирование Na/K-АТФазы маринобуфа-генином не воспроизводит дискриминативные стимульные свойства этанола и не изменяет их при совместном введении двух веществ.

Впервые показано, что ингибирование натриевого насоса приводит к повышению внеклеточной концентрации глутамата и таурина в прилежащем ядре перегородки.

Обоснована гипотеза об уровне активности системы «^/^АТФаза — эндогенные лиганды» как факторе предрасположенности к формированию алкогольной зависимости. Научно-практическое значение работы

Теоретическая ценность работы заключается в экспериментальном доказательстве связи между активностью Na/K-АТФазы и подкрепляющими свойствами этанола, что позволяет рассматривать активность системы «Na/K-АТФаза и ее эндогенные лиганды» в качестве фактора, влияющего на предрасположенность к формированию алкогольной зависимости.

Практическая ценность работы состоит в создании нового направления поиска лекарственных средств для терапии алкогольной зависимости среди лигандов натриевого насоса. Положения, выносимые на защиту:

1. Эндогенные нейроактивные дигиталисоподобные стероиды являются модуляторами мотивационно-подкрепляющих эффектов этанола и, возможно, других аддиктивных средств.

2. Активность натриевого насоса в ткани мозга, зависящая от уровня его

эндогенных лигандов, является одним из факторов патогенеза алкогольной зависимости.

3. Эндогенный буфадиенолид маринобуфагенин вызывает диссоциацию мотивационно-подкрепляющих и дискриминативных стимульных

свойств этанола.

4. Маринобуфагенин способен повышать активность глутаматергической системы, что может отражать потенциальный нейротоксический эффект данного соединения. Одновременно маринобуфагенин вызывает компенсаторную защитную реакцию в форме повышения уровня тау-рина.

5. Экспериментально-наркологическое исследование нейроактивных аналогов эндогенных дигиталисоподобных веществ является новым направлением изыскания средств фармакотерапии в наркологии.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практику учебной и исследовательской работы СПбТМУ им. акад. И.П. Павлова, в исследовательскую работу лаборатории мембранных барьеров Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова РАН, в работу областного наркологического диспансера. Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001); СевероБалтийских курсах по нейробиологии зависимости (Турку, Финляндия, 2001); Межрегиональной научно-практической конференции «С.-Петербургские научные чтения» (С.-Петербург, 2001, 2002, 2004); IV Международной конференции «Современные проблемы наркологии» (Москва, 2002); Сессии института фармакологии им. А.В. Вальдмана СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (С.-Петербург, 2003, 2004); на научных заседаниях института фармакологии им А.В. Вальдмана и отдела психофармакологии СПбТМУ им. акад. И.П. Павлова (2001-2004).

По результатам исследования опубликовано 10 работ. Объем и структура работы

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав с результатами собственных исследований и их обсуждением, заключения, выводов и библиографического указателя (255 источников, из них 6 русскоязычных и 249 зарубежных работ). Работа иллюстрирована 16 рисунками и 6 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Экспериментальная часть работы выполнена на 80 самцах крыс линий Вистар и 260 самцах мышей линий DBA/2 и SHR (беспородные),

полученных из питомников «Рапполово» (Лен. область), «UCL» (Бельгия).

В работе использовали следующие вещества: маринобуфагенин, ди-гоксин (Институт особо чистых препаратов, С.-Петербург, Россия), оуабаин (Sigma Chemicals, USA), никотина тартрат (RBI, USA). В качестве растворителей при системных путях введения ингибиторов натриевого насоса использовали для МБГ - 22% водный раствор диметилсульфоксида (ДМСО) (завод «Химреактивкомплект», Россия) дигоксина, ОУ и этанола - изотонический раствор NaCl, никотина - фосфатный буфер (рН=1,2).

Работа была проведена с использованием 5 основных экспериментальных методов: 1 - методы определения концентраций маринобуфаге-нина и оуабаиноподобных соединений в плазме крови и тканях головного мозга (Bagrov et al, 1995, 1998), 2 - методы определения активности Na /К-АТФазы в головном мозге (Tao et al, 1996) с некоторыми модификациями (Bagrov, Fedorova, 1991), 3 - определение концентраций ней-ротрансмиттерных аминокислот при помощи микродиализной техники с последующим HPLC-ED анализом у крыс в условиях свободного поведения (Imperato и Di Chiara, 1984), 4 - Инициация и поддержание внутривенного самовведения веществ у мышей (Звартау et al., 2000), 5 - Исследование дискриминативных стимульных эффектов этанола и влияния на них ингибиторов Na/K-АТФазы (Colpaert, 1986).

В настоящую работу включены результаты обследования 9 пациентов Ленинградского областного наркологического диспансера. У всех больных выявлен алкоголизм II стадии.

Статистический анализ проводили при помощи одно-, двух- и многофакторного дисперсионного анализа (градуальный учет) и пробит-анализа (альтернативный учет), адаптированных для ситуаций с повторными измерениями и с неодинаковым размером групп. Межгрупповые сравнения: тесты/критерии Тьюки, Дункана, Дуннетта, Манн-Уитни, Вил-коксона, х-квадрат. Анализ показателей альтернативного учета проводился при помощи точного метода Фишера. Значения среднеэффективных доз (ЭД50) рассчитывали при помощи методов Литчфильда-Уилкоксона и про-бит-анализа (альтернативный учет) и регрессионного анализа (градуальный учет). Для оценки корреляции рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона.

Влияние эндогенного дигиталисоподобного фактора на аддиктивный потенциал алкоголя и никотина

Данные, полученные в настоящей работе, убедительно свидетельствуют, что ингибиторы натриевого насоса обладают способностью прони-

кать через ГЭБ и способны ингибировать №/^АТФазу в головном мозге животных.

В течение 30 минут после острого в/б введения МБГ происходило достоверное параллельное увеличение уровня МБГ как в плазме, так и в коре головного мозга. Достоверно повышалась также плазменная концентрация ОПС, в то время как мозговой уровень ОПС достоверно не изменялся.

Введение МБГ в дозах 1,25 и 2,5 мкг/кг было ассоциировано с 17% и 22% угнетением активности Na/K-АТФазы в синаптосомах коры головного мозга, соответственно.

Влияние маринобуфагенина на подкрепляющие эффекты этанола

Подкрепляющие свойства этанола исследовали на модели внутривенного самовведения у необученных мышей. Зависимость «концентрация-эффект» при выработке реакции внутривенного самовведения (РВС) этанола имела куполообразную форму, характерную для данной модели, с максимальным отличием оперантных реакций активных и пассивных мышей при концентрации этанола 2% (табл. 1).

При в/б введении МБГ (1,25-2,5 мкг/кг) не изменял показатели РВС изотонического раствора, но предупреждал выработку РВС этанола (табл. 2).

Таким образом, подавление активности натриевого насоса после введения его эндогенного ингибитора предупреждало проявление первично-подкрепляющего действия этанола.

Задача, которую попытались решить в следующем разделе, состояла в том, чтобы выяснить, способно ли отсутствие более 80% циркулирующего МБГ в организме животных активировать оперантное поведение, связанное с поиском алкоголя, и вызывать, соответственно, увеличение его потребления животными? В первой группе (самовведение изотонического солевого раствора на фоне предварительного в/в введения изотонического солевого раствора) не наблюдали отличий в пропорции оперантных реакций активных и пассивных животных. Результаты опытов со второй группой (самовведение 2% раствора этанола на фоне предварительного в/в введения изотонического солевого раствора) подтвердили ранее полученные данные о быстрой выработке РВС этанола в данной «оптимальной» концентрации (2% раствор этанола). В третьей группе (самовведение 2% раствора этанола на фоне предварительного введения антител к МБГ - в/в) отмечено достоверное увеличение величин R- и дельта- критериев, по которым оценивают выработку РВС (рис.1).

Таблица 1.

Показатели реакции в/в самовведения этанола у мышей линий

Концентрация раствора этанола, % К N4- Дельта-критерий

0 0.00±0.02 3/9 0.44±1.65

1.5 -0.07±0.08 2/6 -6.17±9.03

2 0.2110.04* 14/1 б# 13.94±4.27&

2.5 -0.09Ю.09 1/6 -9.0±7.04

Примечания: За 30 минут до опыта с реакцией внутривенного самовведения мышам вводили в/б растворитель. R - логарифм соотношения, а дельта - разница количества выглядываний «активной» и «пассивной» мышей. N+ - количество мышей с R-критерием, величина которого превышает (числитель) доверительные границы этого показателя в контрольной группе с РВС изотонического солевого раствора по отношению к общему количеству мышей в группе. Все достоверные (р<0,05) отличия представлены по отношению к контрольной группе с внутривенным самовведением изотонического солевого раствора. • - тест Даннета- # - точный метод Фишера. & -тест Манна-Уитни.

Таблица 2.

Изменение показателей в/в самовведения этанола у мышей линий

DBA/2 под влиянием маринрбуфагенина

Доза МБГ, мкг/кг Концентрация раствора этанола, % II № Дельта-критерий

0 2 02110.04 14/16 13.9414.27

1.25 0 0.00Ю.08 2/8 -2.8814.16

1.25 2 0.0510.07* 4/10# 4.8015.51

2.5 0 -0.04Ю.08 3/8 -3.7516.97

2.5 1.5 -0.0610.07 1/6 -2.7116.85

2.5 2 -0.01Ю.04** 1/8## -2.3813.55&

2.5 2.5 -0.0810.07 3/10 -4.3816.84

Примечания: Обозначения как в таблице 1. Все достоверные отличия представлены по отношению к группе с РВС 2% раствора этанола с предварительным введением растворителя. Тест Даннета: * - Р<0.05, ** -

Р<0.01. Точный метод Фишера: # - Р<0.05, ## - Р<0.001. Тест Манна-Уитни: & -Р<0.05.

Рис. 1. Эффект в/в введения антител к МБГ на РВС этанола у мышей линии

ББА/2.

Ось ординат: Я-критерий, рассчитанный по формуле: Я=Ц;(А2/Ш)-1£(А/Ш), где А1 и А2-КВ у АМ в контрольном периоде и периоде самовведений соответственно, а П1 и П2-те же показатели для ПМ. *- р<0,05 по отношению к контрольной группе (р-ль + 2% этанол).

Таким образом, было показано, что введение антител к МБГ облегчает инициацию РВС этанола.

В последующих экспериментах мы намеревались выяснить, является ли эффект МБГ в отношении первично-подкрепляющих свойств этанола специфичным и избирательным только в отношении этанола. С этой целью были выполнены опыты, в которых оценивали влияние МБГ на РВС другого наиболее распространенного аддиктивного вещества - никотина, принадлежащего к другому фармакологическому классу стимуляторов ЦНС.

Зависимость «доза-эффект» при инициации РВС никотина, так же как и при выработке РВС этанола, имела куполообразный характер, характерный для данной модели, с максимальным отличием оперантных реакций активных и пассивных мышей при разовой дозе никотина 0,32 мкг/инф. При в/в самовведении никотина в разовой дозе 0,32 мкг/инф достоверно возрастал Я- критерий. Во время второй сессии первично-подкрепляющие свойства никотина проявлялись в еще большей степени. Отмечалось достоверное увеличение как Я-критерия, так и дельта- критерия (табл. 3).

и

При предварительном в/б введении МБГ (2,5 мкг/кг) не изменял показатели РВС изотонического раствора, а также показатели РВС никотина в разовых дозах 0,16 и 0,48 мкг/инф. При использовании теста Манна-Уитни анализ групп с РВС никотина в разовой дозе 0,32 мкг/инф показал достоверное влияние МБГ по изменению К- и дельта-критериев (табл. 4).

Таблица 3

Показатели инициации реакции в/в самовведения никотина у

Разовая доза никотина, мкг/инф К-критерий Дельта-критерий

0 -0,0410,06 -1,83±9,89

0,16 -0,05±0,07 -б,92±9,66

0,32 0,2010,07* 17,8319,14*

0,48 -0,12±0,10 -25,25114,19

Примечания: Я - логарифм соотношения (см. обозначения к таблице 1), а дельта — разница количества выглядываний «активной» и «пассивной» мышей. Все достоверные (р<0,05) отличия представлены по отношению к контрольной группе с внутривенным самовведением изотонического солевого раствора. * - тест Бонфе-ронни.

Таблица 4

Изменение показателей в/в самовведения никотина у беспородных

мышей под влиянием маринобуфагенина (МБГ) в дозе 2,5 мкг/кг.

Разовая доза никотина, мкг/инф И-критерий Дельта-критерий

0 -0,1310,08 -10,5817,45

0,16 -0,0410,08 -9,25112,66

0,32 -0,11Ю,06*& -10,516,57*

0,48 -0.1410,07 -11,7516,57

Примечания: Обозначения как в таблице 1. Все достоверные отличия представлены по отношению к группе с РВС никотина в разовой дозе 0,32 мкг/инф с предварительным введением растворителя (ДМСО) в фазу поддержания. * - тест Бонфе-ронни. & - тест Манна-Уитни

Таким образом, как следует из проведенных экспериментов, модуляция активности Na/K-АТФазы влияет на «награждающие» свойства не только этанола (депрессанта ЦНС), но и никотина (психостимулянта). В фармакологии аддиктивных веществ принято считать, что подавление РВС может происходить по двум причинам. Во-первых, фармакологическое вещество-регулятор воспроизводит, имитирует свойства аддиктивного вещества и, таким образом, «замещает» его, делая последующие (са-мо)введения неэффективными и вызывая угашение оперантной реакции. Во-вторых, фармакологическое вещество может антагонизировать эффектам аддиктивного вещества, предупреждая мотивационную «привлекательность» его инъекций.

Судя по ранее проведенным в нашей лаборатории экспериментам с реакцией предпочтения места (Bagrov et al., 1999), ингибиторы натриевого насоса не обладают собственными вторично-подкрепляющими свойствами. Это указывает на то, что первый теоретический механизм действия МБГ маловероятен. Данное утверждение подкрепляется также результатами экспериментов с исследованием дискриминативных стимульных свойств МБГ в сравнении с этанолом (см. далее).

Следует полагать, что уменьшение активности натриевого насоса в структурах мозговой системы «награды» таким образом изменяет их функцию, что дискретные «оптимальные» дозы аддиктивных веществ этанола и никотина, вводимые внутривенно, на фоне премедикации МБГ не вызывают мотивационно-поведенческие эффекты в степени, достаточной для выработки и закрепления оперантной реакции поиска и самовведения этих аддиктивных веществ.

Существуют данные о том, что под влиянием этанола возможно повышение активности Na/K-АТФазы (Foster et al., 1989). Поэтому такого рода фармакологический антагонизм на уровне самого натриевого насоса теоретически допустим, хотя нельзя исключать и другие возможности взаимодействия эффектов этанола и лигандов Na/K-АТФазы в ЦНС, результатом которого будет уменьшение первично-подкрепляющих свойств этанола, никотина и, возможно, других аддиктивных веществ.

Дискриминативные стимульные свойства ЭДФ.

Исследование дискриминативных стимульных свойств ЭДФ было целесообразно для объективного ответа на вопрос, связана ли способность ингибиторов натриевого насоса блокировать подкрепляющие эффекты этанола с тем, что они способны замещать последний по своим интероцеп-тивным стимульным свойствам. В этих опытах ожидалось также получить ответ на вопрос о возможности антагонизма дискриминативным стимуль-

ным свойствам этанола.

В результате обучения и постепенной выработки дискриминативно-го поведения вероятность выбора «этанольного» отверстия после введения «тренировочной дозы» этанола (1 г/кг) достигла 100%, в то время как вероятность выбора «этанольного» отверстия после введения растворителя составляла 0%. Таким образом, удалось получить полное различение дис-криминативных стимульных свойств этанола и растворителя.

В тесте «замещения» анализируется способность воспроизведения дискриминативных стимульных свойств эталонного препарата в «тренировочной дозе» (в данном случае этанола в дозе 1 г/кг) при действии того же препарата (этанола) в иных дозах или при использовании иного вещества-«заместителя». Введение «физиологического» раствора и низких доз этанола характеризовалось преимущественным выбором «водного» отверстия. При увеличении дозы этанола вероятность «этанольного» ответа достоверно увеличивалась. Расчетное значение ЭД50, т.е. дозы этанола, после которой 50% животных демонстрируют «этанольный» ответ, составило 0,44 г/кг (доверительный интервал: 0,30-5-0,57 г/кг).

Как и ожидалось, этанол на данной модели проявил отчетливые дискриминативные стимульные свойства, и животные легко обучались реагировать на интероцептивный сигнал после введения вещества, как на условный раздражитель, сигнализирующий какого рода оперантная пище-добывательная реакция должна осуществляться. Таким образом, стимуль-ный контроль поведения благодаря этим свойствами этанола был полным.

В тестах «замещения» введение МБГ, ОУ или дигоксина не увеличивало вероятность выбора «этанольного» отверстия. Ни в одной из использованных доз исследованные вещества не проявляли «этанолоподобных» дискриминативных стимульных свойств на статистически значимом уровне. Ни для одного из исследованных веществ или комбинации веществ с этанолом не было выявлено достоверного влияния на латентный период выполнения 10 последовательных выглядываний в одно из отверстий (основной критерий выбора «этанольного» и «водного» вариантов реагирования).

Таким образом, в тестах «антагонизма» введение МБГ, ОУ или ди-гоксина в комбинации с тренировочной дозой этанола не оказывало значительного влияния на дискриминативные стимульные свойства этанола. Несмотря на введение достаточно высоких доз лигандов натриевого насоса, животные полностью воспринимали стимульные свойства тест-дозы этанола, что отражалось выполнением ассощшрованной с предварительным введением этанола оперантной реакции.

Представленные данные убедительно показывают, что ингибиторы натриевого насоса не способны замещать этанол у животных, обученных отличать инъекции этанола от инъекций «физиологического» раствора. Ни в одной из исследованных доз эти соединения не имитировали стимульные свойства этанола.

Результаты, полученные в этой главе, представляют интерес для понимания поведенческих механизмов влияния ингибиторов натриевого насоса на РВС. Как указывалось выше, можно ожидать два варианта взаимодействия ингибиторов натриевого насоса и этанола на этой модели:

1. «Заместительные» средства. Обладают аналогичными стимульными и мотивационно-подкрепляющими эффектами, что и целевое аддиктив-ное средство. Примерами реализованных в клинической практике вариантов такой фармакотерапии являются заместительное лечение опийной наркомании метадоном, ЛААМ, бупренорфином, заместительное лечение табакокурения никотином и другими Н-холиномиметиками. 2. Вещества-антагонисты. Обладают способностью предупреждать или устранять как стимульные, так и мотивационно-подкрепляющие эффекты целевых аддиктивных средств. Примерами успешной реализации такого варианта взаимодействия в клинике является терапия на-лтрексоном при опийной наркомании.

Как показали эксперименты на модели дискриминативных стимуль-ных свойств этанола, ни один из вышеуказанных вариантов взаимодействия не оказался реализованным. Все исследованные ингибиторы АТФазы не воспроизводили стимульных свойств этанола в тесте «замещения», а также оказались неспособными препятствовать «распознаванию» этанола в тесте «антагонизма».

Таким образом, выявленный вариант взаимодействия этанола и ингибиторов Na/K-АТФазы позволяет добавить третий из известных в фармакологии аддиктивных веществ вариант поведенческого механизма действия средств экспериментальной фармакотерапии аддиктивных состояний. Он состоит в модуляции мотивационно-аффективного компонента комплексного интероцептивного сигнала при введении аддиктивных средств. Такой вариант взаимодействия выявлен в настоящей работе применительно к ингибиторам Na/K-АТФазы. В этом случае вещество не изменяет дискриминативных стимульных свойств аддиктивного средства (в данном случае этанола), но понижает его первично-подрепляющий потенциал.

Влияние эндогенных дигиталисоподобных лигандов натриевого насоса на обмен аминокислот в п. accumbens у крыс

Для выявления возможных механизмов действия ЭДЛНН исследовали внеклеточную концентрацию возбуждающей (глутамат) и тормозной (таурин) аминокислот методом микродиализа в центральной структуре мозговой системы подкрепления - прилежащем ядре перегородки. Мезо-лимбическая дофаминовая система с проекциями из вентрально-тегментальной области (ВТО) среднего мозга в прилежащее ядро представляет особую значимость в развитии лекарственного и алкогольного подкрепления (Wise et aL, 1987; Di Chiara и Imperato, 1988; Koob, 1992), и поэтому наш выбор был сделан в пользу микродиализного исследования именно в прилежащем ядре.

Была проведена оценка влияния острого в/б введения этанола, МБГ и ОУ, а также их сочетаний. Отмечено повышение уровня глутамата в первые 20 минут после введения МБГ (достоверно) и ОУ (тенденция) по сравнению с эффектом растворителя (0,5% раствор ДМСО). Были также получены данные, что в/б инъекции МБГ или ОУ достоверно повышали уровень внеклеточного таурина в первые 20 минут после введения.

В дальнейшем эксперимент состоял в совместном введении МБГ, ОУ или растворителя и этанола. Было установлено, что этанол в дозе 2 г/кг массы тела вызывал наибольшее повышение внеклеточного уровня таури-на в прилежащем ядре перегородки головного мозга крысы. Совместное введение ингибиторов натриевого насоса и этанола выявило достоверное увеличение концентрации глутамата и таурина в течение первых 20 минут после введения этанола по сравнению с контрольной группой, которая при предварительном введении получала растворитель (рис. 2).

Полученные результаты подтверждают данные предыдущих исследований (Estevez et aL, 2000), в которых было показано, что ингибиторы Na/K-АТФазы повышали внеклеточную концентрацию глутамата в головном мозге in vivo. Если ингибиция Na/K-АТФазной активности вызывает блокаду обратного захвата глутамата и высвобождение внутриклеточного глутамата (Nicholls и Attwell, 1990), то можно предположить, что комбинация оуабаина и глутамата повышает риск нейротоксичности и может быть причиной ускоренной нейрональной гибели. Повышение нейротоксичности при экзогенном введении глутамата было выявлено in vivo при повреждении обратного захвата глутамата (Kohler и Schwarez, 1981).

Интересны полученные недавно данные, свидетельствующие о том, что оуабаин и эндобаин Е модулируют NMDA рецептор in vitro при помо-

щи определенных механизмов, не вовлеченных в изменения ионного градиента (Reines et al., 2001).

Выявленное в наших экспериментах повышение уровня внеклеточного таурина может рассматриваться как компенсаторная адаптивная реакция. Известно, что таурин играет важную роль в восстановлении мозгового гомеостаза после различных клеточных стрессов (Huxtable, 1989). Так, например, повышение внеклеточного таурина может способствовать снижению токсичности этанола за счет увеличения окисления первого метаболита этанола ацетальдегида, который ответственен за многие побочные свойства этанола (Eriksson, 2001). Таурин способен также поддерживать осмотическую регуляцию мозга (Baxtor et aL, 1986), что представля- ется немаловажным, поскольку этанол вызывает потерю воды клетками, инги-бируя антидиуретический гормон.

Изменение концентрациимаринобуфагенннапри алкогольном абстинентном синдроме у люд ей.

Итоговой частью настоящей работы явилось пилотное исследование содержания МБГ при алкогольном абстинентном синдроме у пациентов Ленинградского областного наркологического диспансера, поступивших в состоянии острого абстинентного синдрома1. Целью данного исследования было выяснить, как изменяется концентрация эндогенного ингибитора натриевого насоса МБГ у больных алкоголизмом в начальной острой фазе алкогольного абстинентного синдрома и после купирования острого состояния. Исследование состояло из двух частей. В первой части у пациентов, страдающих алкоголизмом, в первый день абстинентного синдрома до начала медикаментозной терапии были взяты образцы крови. Затем, во второй части исследования, у тех же пациентов был сделан повторный забор крови на следующий день после окончания терапии. Все образцы крови были центрифугированы. Концентрацию МБГ определяли в экстрактах плазмы, как было описано ранее (Bagrov et al., 1995, 1998).

По данным литературы у здоровых лиц уровень концентрации МБГ в плазме крови составляет 0,2-0,3 нмоль/л (Gonick et al., 1998; Bagrov et al., 1998). На фоне абстинентного синдрома концентрация МБГ в плазме крови существенно возрастала и составила 0,68+0,09 нмоль/л (рис.3). Парное сравнение полученных данных показало достоверное снижение

1 Автор приносит благодарность главному наркологу Ленинградской области профессору Е.М. Крупицкому и доктору А.А. Руденко за помощь в организации и проведении этого пилотного исследования.

А

Таурин

Б

Рис 2. Концентрация внеклеточного таурина в микродиализате из п. ассытЬгту крыс в первые 20 минут после острого введения МБГ или растворителя (0,1 мг/кг от массы тела, в/б), а также после острого введения этанола (2 г/кг от массы тела, в/б), которым предварительно был введен МБГ или растворитель (0,1 мг/кг от массы тела, в/б).

По оси ординат — процентное содержание аминокислоты от исходного уровня в диализате. * Р<0,05 относительно соответствующей контрольной группы. # Р<0,05 относительно трех сравниваемых групп.

значений концентрации МБГ (0,48+0,01 нмоль/л, рис.3) после медикаментозного лечения проявлений алкогольного абстинентного синдрома по сравнению с данными, полученными в первый день (р=0,02, по Манн-Уитни) (рис.3).

В состоянии острого абстинентного синдрома у больных отмечалась также артериальная гипертензия.

Факт повышения концентрации МБГ в начальной фазе алкогольного абстинентного синдрома представляет интерес в двух отношениях. Во-первых, это может быть проявлением «рикошетного» изменения (повышения) концентрации данного ЭДФ в ответ на прекращение хронической интоксикации этанолом. Такого рода эффекты характерны для аддиктив-ных состояний, к которым относится алкоголизм с выраженным синдромом толерантности и зависимости. К сожалению, у нас пока нет прямых данных, показывающих есть ли отличия в функции системы «Na/K-АТФаза - ее эндогенные лиганды», в частности в уровне МБГ, у больных алкоголизмом в сравнении с собственными показателями в периоде ремиссии или в сравнении с показателями нормальной популяции. Целесообразность такого рода исследования очевидна из настоящей пилотной работы.

Во-вторых, как отмечалось выше, МБГ уже при однократном введении способен повышать внеклеточную концентрацию глутамата в п. ас-cumbens. В исследовании, проведенном группой De Witte P. (1996), было установлено, что при хроническом введении этанола происходит повышение концентрации глугамата в различных отделах головного мозга. Наиболее характерен подобный «глутаматный выброс» именно для периода абстиненции. С учетом полученных нами данных заманчиво связать увеличение уровня МБГ с гиперактивностью глутаматергической системы при алкогольном абстинентном синдроме, которая, как известно, является основой нейротоксических эффектов возбуждающих аминокислот (excito-toxicity) с повреждением нейронов, нейрональной смертью (Dingledine и McBain, 1999), а в конечном итоге и возможной алкогольной энцефалопатией.

Было также выявлено, что на фоне абстиненции у больных развивается гипертензивный синдром, который не является неожиданным при повышении концентрации МБГ (Bagrov et al., 1996a). Полученные результаты хорошо согласуются с данными, которые показывают, что абстинентный синдром, развивающийся после прекращения употребления алкоголя, способствует развитию артериальной гипертензии (Mehta et al., 1919; Saunders et al., 1981; Gheno et al., 1984; Nardoni et al., 1986).

Данное клиническое исследование является первым шагом в изучении роли ЭДЛНН в патогенезе алкогольной зависимости.

и

до после

Лечение

Рис. 3. Показатели уровня МБГ в плазме крови при абстинентном синдроме у людей.

На оси абсцисс: показатели до начала терапии и после ее завершения. На оси ординат: Данные представлены как концентрации МБГ в плазме крови (нмоль/л) в первый день абстинентного синдрома (до) и (после) терапии. (*) -р<0,05 - достоверно по отношению к контролю (до лечения) (по Манн-Уитни).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной целью настоящего исследования было изучение фармакологических эффектов ингибитора альфа-1 изоформы натриевого насоса маринобуфагенина (МБГ) на экспериментальных моделях, используемых для оценки аддиктивного потенциала алкоголя.

Эксперименты показали, что эндогенные ингибиторы способны проникать в мозг в концентрациях, достаточных для достоверного угнетения активности №/К-АТФазы. Далее исследования показали, что, введение МБГ подавляет инициацию РВС этанола.

Задача, которую попытались решить в последующем, состояла в том, чтобы выяснить, способна ли иммунизация поликлональными кроличьими антителами против МБГ активизировать оперантное поведение, связанное с поиском алкоголя, и вызывать, соответственно, увеличение его потребления животными. Было выяснено, что отсутствие более 80% МБГ увеличивает инициацию РВС этанола в предпочитаемой концентрации.

Далее мы попытались ответить на вопрос, является ли этот эффект МБГ специфичным и избирательным только в отношении этанола. С этой целью были проведены опыты, в которых оценивалось влияние МБГ на РВС другого наиболее распространенного аддиктивного вещества - никотина. Опыты показали, что направленность эффекта МБГ (уменьшение позитивно-подкрепляюших свойств этанола) воспроизводится и при самовведении никотина - вещества, которое относится к другому фармакологическому классу стимуляторов ЦНС.

В серии экспериментов с оценкой дискриминативных стимульных эффектов этанола была сделана попытка выяснить, обладают ли ЭДФ аналогичными стимульными и мотивационно-подкрепляющими эффектами, что и этанол (т.е. являются заместителями этанола), или они являются антагонистами действия этанола (т.е. обладают способностью предупреждать или устранять как стимульные, так и мотивационно-подкрепляющие эффекты этанола).

В тестах «замещения» введение МБГ, ОУ или дигоксина не увеличивало вероятность выбора «этанольного» отверстия. Ни в одной из использованных доз исследованные вещества не проявляли этаноло-подобных дискриминативных стимульных свойств на статистически значимом уровне.

В тестах «антагонизма» введение МБГ, ОУ или дигоксина в комбинации с тренировочной дозой этанола не оказывало значимого влияния на дискриминативные стимульные свойства этанола.

Эксперименты с использованием метода микродиализа п. ассит-Ьет и измерением концентрации таурина и глутамата в диализате дали основания полагать, что в больших дозах МБГ может проявлять нейроток-сический потенциал в связи с повышением активности глутаматергической системы. Это может быть особенно существенным при остром алкогольном абстинентном синдроме у больных алкоголизмом, у которых выявлено повышение уровня МБГ в плазме. Вместе с тем, под действием МБГ параллельно происходит повышение концентрации таурина, что можно трактовать как защитно-приспособительную реакцию.

Итоговой частью настоящей работы явилось пилотное исследование содержания МБГ при алкогольном абстинентном синдроме у пациентов Ленинградского областного наркологического диспансера, поступивших в состоянии острого абстинентного синдрома. Было показано, что на фоне абстинентного синдрома концентрация МБГ в плазме крови существенно возрастала и составила 0,68±0,09 нмоль/л с последующим снижением до 0,48±0,07 нмоль/л после завершения детоксикации.

ВЫВОДЫ

1. При системном введении в фармакологически активных дозах эндогенный буфадиенолид маринобуфагенин проникает через гемато-энцефалический барьер и оказывает достоверное угнетающее действие на активность Na/K-АТФазы в синаптосомах головного мозга.

2. Изменение активности Na/K-АТФазы влияет на первично-подкрепляющие эффекты этанола, играющие ключевую роль в формировании алкогольной зависимости, что доказывается противоположным действием эндогенного ингибитора натриевого насоса маринобуфагени-на и антител к нему на модели внутривенного самовведения этанола у мышей.

3. Маринобуфагенин подавляет реакцию внутривенного самовведения никотина, что указывает на связь активности Na/K-АТФазы с мотивацион-но-подкрепляющими свойствами психоактивных средств различных фармакологических классов.

4. Маринобуфагенин обладает оригинальным профилем психофармакологического действия, подавляя мотивационно-подкрепляющий компонент комплексного интероцептивного сигнала при введении этанола и не влияя на его дискриминативные стимульные свойства.

5. В больших дозах маринобуфагенин может проявлять нейротоксический потенциал в связи с повышением активности глутаматергической системы, что особенно существенно при остром алкогольном абстинентном синдроме у больных алкоголизмом, у которых выявлено повышение уровня маринобуфагенина в плазме. Вместе с тем, под действием мари-нобуфагенина параллельно происходит повышение концентрации таури-на, что можно трактовать, как защитно-приспособительную реакцию.

6. Изменение активности системы «Na/K-АТФаза-эндогенные лиганды» может быть фактором риска алкогольной зависимости. Экспериментально-наркологическое исследование новых нейроактивных аналогов эндогенных дигиталисоподобпых веществ является новым направлением изыскания средств фармакотерапии в наркологии.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендуется продолжить изучение ингибиторов Na/K-АТФазы, в том числе селективных в отношении отдельных субъединиц энзима, на экспериментально-наркологических моделях с целью создания клинически эффективных препаратов для лечения алкогольной и лекарственной зависимости.

Рекомендуется проведение клинического исследования с измерением уровня маринобуфагенина у больных алкоголизмом и наркоманией на

разных этапах заболевания (острый абстинентный синдром, постабстинентное состояние, ремиссия) и у контрольной группы пациентов без ад-диктивной патологии.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Звартау Э.Э., Кашкин В.А., Паткина Н.А, Цой М.В. Подкрепляющий эффект этанола и никотина и потребление сахарозы мышей разных линий // Тезисы докладов, VII Российский национальный конгрессе «Человек и лекарство», Москва, -10-14 апреля 2000 - С.498.

2. Кашкин ВА., Паткина Н.А., Багров А.Я, Багров Я.Ю., Звартау Э.Э. Влияние маринобуфагенина на первично-подкрепляющий эффект этанола // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова - 2001 -Т.87(5): С.665-9.

3. Звартау Э.Э., Багров АЛО., Багров Я.Ю., Кашкин В.А., Паткина Н.А; Участие

эндогенных дигиталисо-подобных факторов в подкрепляющем эффекте этанола и его потреблении. // 3-я международная конференция <Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам>, Институт фармакологии РАМН. Суздаль, - 2001 -С.25.

4. Кашкин В.А Влияние маринобуфагенина на активность Na/K-АТФазы в синап-

тосомах головного мозга мышей и на первично-подкрепляющий эффект этанола // Сборник научных трудов кафедры фармакологии, С.-Петербургского Гос. Медицинского Университета им. акад. И.П. Павлова — 2001 - С. 96-102.

5. Zvartau E.E., Bagrov AY., Bagrov Y.Y., Kashkin V.A Endogenic Digitalis-like factors and alcohol addiction // IY International Conference <Recent Advances in Addiction Research>, Moscow, 18-20 November, -2002- P. 8.

6. Звартау Э.Э., Багров АЯ., Багров Я.Ю., Кашкин В.А <Эндогенные ингибиторы

Na/K-АТФазы и зависимость от этанола>. < Фундаментальные проблемы фармакологии // Сборник тезисов 2-го съезда Российского научного общества фармакологов (21-25 апреля 2003 года) - Москва - 2003 - 4.1 - С. 190.

7. Kashkin V.A Behavioral and biochemical effects of an endogenous digitalis-likes factor, marinobufagenin - Nordic-Baltic Course on Neurobiology of Addiction -Turku, Finland - 2001. - P.7.

8. Kashkin V.A, Bagrov AY., Fedorova O.V., Bagrov Y.Y., Agalakova N.I., Patkina N.A, Zvartau E.E. Marinobufagenin (MBG) suppression of ethanol-seeking behavior is associated with inhibition ofbrain cortex Na/K-ATPase in mice // Eur. Neuro-psychopharmacol. - 2002. - Vol.12. - P.217-23.

9. Bagrov AY., Bagrov Y.Y., Fedorova O.V., Kashkin V.A, Patkina N.A, Zvartau E.E.

Endogenous digitalis-like ligands of the sodium pump: possible involvement in mood control and ethanol addiction // Eur. Neuropsychopharmacol. - 2002. - Vol.12. -P.l-12.

10. Kashkin V.A, De Witte P. Ethanol but not acetaldehyde induced changes in brain taurine: a microdialysis study //Amino. Acids - 2004. - Vol.26. - P.117-24.

Лицензия от ИД № 00597 от 15.12.99 Подписано в печать 10.04.2004 Усл. печ. л. 1,4 Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Тираж 100 экз. Заказ 255/04 197089, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого 6/8

Издательство СПбГМУ

Актуальность проблемы. На протяжении последних 20 лет накоплен значительный клинический и экспериментальный материал, свидетельствующий о том, что различные ткани и плазма крови человека и других млекопитающих содержат эндогенные дигиталисоподобные лиганды натриевого насоса (ЭДЛНН), т.е. вещества, ингибирующие Na/K-АТФазу и обладающие дигиталисоподобной иммунореактивностью (De Wardener и Clarkson, 1985, Goto et al., 1992, Schoner, 1992).

Оуабаин-чувствительная, магний-зависимая натрий-калиевая аденозинтрифосфатаза (Na/K-АТФаза) представляет собой уникальную регуляторную систему. Na/K-АТФаза является ферментом, встроенным в мембрану и осуществляющим гидролиз АТФ. Na/K-АТФаза является также и транспортной системой, осуществляющей активный трансмембранный транспорт моновалентных катионов против градиента их концентрации. Участок аминокислотной цепи альфа-субъединицы фермента, обладая эволюционной консервативностью, является специфическим рецептором для сердечных гликозидов.

Показано, что ЭДЛНН принимают участие в регуляции сократимости миокарда, водно-солевого обмена, играют важную роль в патогенезе некоторых, преимущественно объем-зависимых, форм артериальной гипертензии. Помимо этого, существуют предположения о возможной нейрорегуляторной роли ЭДЛНН, в частности в отношении поведенческих реакций и участии в патогенезе психических заболеваний.

Растет количество доказательств, которые указывают на существование нескольких ЭДЛНН в центральной нервной системе млекопитающих (Yamada et al., 1992; Goto et al., 1995; Tymiak et al., 1993; De Lorez Arnaiz, 2000). ЭДЛНН представлены в различных отделах мозга (Yamada Н. et al, 1992; Goto et al., 1995; Tymiak et al., 1993; De Lorez Arnaiz, 2000). Содержание оубаионоподобных соединений (ОПС) изменяется при эмоциональном стрессе (Goto et al., 1995), при психических заболеваниях (Grider et al., 1999). Центральное введение оубаина влияет на поведение у крыс (Li et al., 1997; Ruktanochai et al., 1998). Изменение активности натриевого насоса в различных тканях было замечено при маниакально-депрессивном психозе (Naylor et al., 1973; Rybakowski et al., 1994; El-Mallakh и Wyatt, 1995).

Есть свидетельства вовлечения ЭДЛНН в контроль настроения и в развитие алкогольной зависимости. Действие этанола может быть связано как с ингибированием, так и с активацией Na/K-ATOa3bi/Na/K-Hacoca в зависимости от дозы, пути введения и времени экспозиции (Nhamburo et al., 1987; Altura и Altura, 1989; Foster et al., 1989; Foley и Linnoila, 1995). Показано, что стимулирующий эффект этанола на натриевый насос (Na/K-АТФазу) в мозгу крысы, возможно, связан с антагонизмом эндогенному ингибиторному лиганду (Foley и Rhoads, 1994).

Первым идентифицированным эндогенным ОПС был карденолид (Ludens et al., 1991). Далее были выявлены лиганды буфодиенолидной структуры (Goto et al., 1991; Lichtstein et al., 1993, Hilton et al., 1996; Sich et al., 1996). Стероидные соединения класса буфадиенолидов являются эндогенными ингибиторами Na/K-АТФазы, которые синтезируются в паротидных железах и коже амфибий (Barbier et al., 1959; Flier, 1978) и являются регуляторами чрезкожного транспорта натрия, действующими за счет влияния на активностьКа/К-АТФазы. Было показано (Bagrov et al., 1993), что яд жаб Bufo marinus имеет в своём составе буфадиенолиды, среди которых нас особенно заинтересовал селективный лиганд альфа-1 изоформы натриевого насоса - маринобуфагенин (МБГ) (Bagrov et al., 1995). Позже МБГ был описан у млекопитающих (Bagrov et al.,1998, Fedorova et al., 2000). Примечательно, что экскреция МБГ у крыс под действием этанола возрастает, а активная иммунизация животных против МБГ вызывает повышение потребления этанола в условиях свободного выбора (Bagrov et al., 1999).

Таким образом, учитывая данные об эндогенной природе буфадиенолидов, их участии в регуляции активности натриевого насоса, изменении функции данного энзима под влиянием этанола и при психопатологии представлялось целесообразным исследовать фармакологические свойства маринобуфагенина на экспериментальных моделях аддиктивного поведения в условиях, доказывающих их центральный эффект.

Цель исследования. Цель данной работы заключалась в изучении фармакологических эффектов ингибитора альфа-1 изоформы натриевого насоса маринобуфагенина на экспериментальных моделях, используемых для оценки аддиктивного потенциала алкоголя. Основные задачи исследования:

1. Определить способность маринобуфагенина проникать в ЦНС и ингибировать Na/K-АТФазу в синаптосомах головного мозга.

2. Исследовать собственное влияние маринобуфагенина и оубаина, а также эффект их совместного введения с этанолом на уровень нейротрансмиттерных аминокислот в прилежащем ядре перегородки головного мозга.

3. Изучить влияние маринобуфагенина и антител к нему на подкрепляющие свойства этанола.

4. Изучить влияние маринобуфагенина на дискриминативные стимульные свойства этанола.

Положения, выносимые на защиту:

1. Эндогенные нейроактивные дигиталисоподобные стероиды являются модуляторами мотивационно-подкрепляющих эффектов этанола и, возможно, других аддиктивных средств.

2. Активность натриевого насоса в ткани мозга, зависящая от уровня его эндогенных лигандов, является одним из факторов патогенеза алкогольной зависимости.

3. Эндогенный буфадиенолнд маринобуфагенин вызывает диссоциацию мотивационно-подкрепляющих и дискриминативных стимульных свойств этанола.

4. Маринобуфагенин способен повышать активность глутаматергической системы, что может отражать потенциальный нейротоксический эффект данного соединения. Одновременно маринобуфагенин вызывает компенсаторную защитную реакцию в форме повышения уровня таурина.

5. Экспериментально-наркологическое исследование нейроактивных аналогов эндогенных дигиталисоподобных веществ является новым направлением изыскания средств фармакотерапии в наркологии.

Научная новизна работы.

Впервые доказано модулирующее влияние уровня активности натриевой помпы на первично-подкрепляющие свойства этанола на основе анализа эффектов эндогенного ингибитора маринобуфагенина и антител к нему.

Впервые доказана способность маринобуфагенина проникать в мозг и ингибировать Na/K-АТФазу мозговой ткани.

Впервые показано, что ингибирование Na/K-АТФазы маринобуфагенином не воспроизводит дискриминативные стимульные свойства этанола и не изменяет их при совместном введении двух веществ.

Впервые показано, что ингибирование натриевого насоса приводит к повышению внеклеточной концентрации глутамата и таурина в прилежащем ядре перегородки.

Обоснована гипотеза об уровне активности системы «Na/K-АТФаза -эндогенные лиганды» как факторе предрасположенности к формированию алкогольной зависимости.

Научно-практическая ценность работы. Теоретическая ценность работы заключается в экспериментальном доказательстве связи между активностью Na/K-АТФазы и подкрепляющими свойствами этанола, что позволяет рассматривать активность системы «Na/K-АТФаза и ее эндогенные лиганды» в качестве фактора, влияющего на предрасположенность к формированию алкогольной зависимости.

Практическая ценность работы состоит в создании нового направления поиска лекарственных средств для терапии алкогольной зависимости среди лигандов натриевого насоса.

Реализация результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику учебной и исследовательской работы СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, в исследовательскую работу лаборатории мембранных барьеров Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова РАН; в деятельность областного наркологического диспансера.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001); Северо-Балтийских курсах по нейробиологии зависимости (Турку, Финляндия, 2001); Межрегиональной научно-практической конференции «С.-Петербургские научные чтения» (С.-Петербург, 2001, 2002, 2004); IV Международной конференции «Современные проблемы наркологии» (Москва, 2002); Сессии института фармакологии им. А.В. Вальдмана СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (С.-Петербург, 2003, 2004); на научных заседаниях института фармакологии им А.В. Вальдмана и отдела психофармакологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (2001-2004).

По результатам исследования опубликовано 10 работ.

Выводы

1. При системном введении в фармакологически активных дозах эндогенный буфадиенолид маринобуфагенин проникает через гемато-энцефалический барьер и оказывает достоверное угнетающее действие на активность Na/K-АТФазы в синаптосомах головного мозга.

2. Изменение активности Na/K-АТФазы влияет на первично-подкрепляющие эффекты этанола, играющие ключевую роль в формировании алкогольной зависимости, что доказывается противоположным действием эндогенного ингибитора натриевого насоса маринобуфагенина и антител к нему на модели внутривенного самовведения этанола у мышей.

3. Маринобуфагенин подавляет реакцию внутривенного самовведения никотина, что указывает на связь активности Na/K-АТФазы с мотивационно-подкрепляющими свойствами психоактивных средств различных фармакологических классов.

4. Маринобуфагенин обладает оригинальным профилем психофармакологического действия, подавляя мотивационно-подкрепляющий компонент комплексного интероцептивного сигнала при введении этанола и не влияя на его дискриминативные стимульные свойства.

5. В больших дозах маринобуфагенин может проявлять нейротоксический потенциал в связи с повышением активности глутаматергической системы, что особенно существенно при остром алкогольном абстинентном синдроме у больных алкоголизмом, у которых выявлено повышение уровня маринобуфагенина в плазме. Вместе с тем, под действием маринобуфагенина параллельно происходит повышение концентрации таурина, что можно трактовать, как защитно-приспособительную реакцию.

6. Изменение активности системы «Na/K-АТФаза-эндогенные лиганды» может быть фактором риска алкогольной зависимости.

Экспериментально-наркологическое исследование новых нейроактивных аналогов эндогенных дигиталисоподобных веществ является новым направлением изыскания средств фармакотерапии в наркологии.

Научно-практические рекомендации

Рекомендуется продолжить изучение ингибиторов Na/K-АТФазы, в том числе селективных в отношении отдельных субъединиц энзима, на экспериментально-наркологических моделях с целью создания клинически эффективных препаратов для лечения алкогольной и лекарственной зависимости.

Рекомендуется проведение клинического исследования с измерением уровня маринобуфагенина у больных алкоголизмом и наркоманией на разных этапах заболевания (острый абстинентный синдром, постабстинентное состояние, ремиссия) и у контрольных пациентов без аддиктивной патологии.

Заключение

Оуабаин-чувствительная, магний-зависимая Na/K-АТФаза представляет собой уникальную регуляторную систему. На протяжении последних 20 лет накоплены значительные клинические и экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что эндогенные дигиталисоподобные лиганды натриевого насоса (ЭДЛНН), т.е. вещества, ингибирующие Na/K-АТФазу и обладающие дигиталисоподобной иммунореактивностью (De Wardener и Clarkson, 1985, Goto et al., 1992, Schoner, 1992), играют значимую роль в различных процессах организма (см. главу 1). В частности, ЭДЛНН принимают участие в регуляции сократимости миокарда, водно-солевого обмена, играют важную роль в патогенезе артериальной гипертензии. Помимо этого, существуют предположения о нейрорегуляторной роли ЭДЛНН, влиянии на регуляцию центральной нервной системы, поведения, участие в патогенезе психических заболеваний (Grider et al, 1999) и алкогольной зависимости, регуляции эмоционального стресса (Goto et al, 1995).

Влияние ЭДФ на аддиктивный потенциал некоторых веществ.

Данные, полученные в настоящей работе, убедительно свидетельствуют, что ингибиторы натриевого насоса обладают способностью проникать через ГЭБ и способны ингибировать Na/K-АТФазу в головном мозге животных.

В течение 30 минут после острого в/б введения МБГ происходило достоверное параллельное увеличение уровня МБГ как в плазме, так и в коре головного мозга. Также достоверно повышалась и плазменная концентрация ОПС, в то время как мозговой уровень ОПС достоверно не изменялся.

Введение МБГ в дозах 1,25 и 2,5 мкг/кг было ассоциировано с 17% и 22% угнетением активности Na/K-АТФазы в синаптосомах коры головного мозга, соответственно.

В продолжение исследований, начатых в разделе 3.1 и 3.2, встал вопрос о возможности ЭДФ угнетать первично-поткрепляющие свойства этанола. Эти свойства были экспериментально подтверждены на модели внутривенного самовведения у необученных мышей. Зависимость «концентрация-эффект» при выработке реакции внутривенного самовведения (РВС) этанола имела куполообразную форму, характерную для данной модели, с максимальным отличием оперантных реакций активных и пассивных мышей при концентрации этанола 2%. При в/б введении МБГ (1,25-2,5 мкг/кг) не изменял показатели РВС изотонического раствора, но предупреждал выработку также РВС этанола.

Таким образом, подавление активности натриевого насоса после введения его эндогенного ингибитора предупреждало экспериментальное проявление первично-подкрепляющего действия этанола.

Задача, которую попытались решить в разделе 3.4, состояла в том, чтобы выяснить, способно ли отсутствие более 80% циркулирующего МБГ в организме животных активировать оперантное поведение, связанное с поиском алкоголя, и вызывать, соответственно, увеличение его потребления животными? В первой группе (самовведение физ. раствора и физ. раствора -в/в) не наблюдали отличий в пропорции оперантных реакций активных и пассивных животных. Результаты опытов со второй группой (самовведение 2% раствора этанола и физ. раствора - в/в) подтвердили ранее полученные данные о быстрой выработке РВС этанола в данной «оптимальной» концентрации (2% раствор этанола). В третьей группе (самовведение 2% раствора этанола и антител к МБГ - в/в) отмечено достоверное увеличение величин R- и дельта- критериев, по которым оценивают выработку РВС.

Таким образом, было показано, что введение антител к МБГ увеличивает инициацию РВС этанола.

В последующих экспериментах мы намеревались выяснить, является ли этот эффект МБГ в отношении первично-подкрепляющих свойств этанола специфичным и избирательным только в отношении этанола. С этой целью были выполнены опыты, в которых оценивали влияние МБГ на РВС другого наиболее распространенного аддиктивного вещества - никотина, принадлежащего к другому фармакологическому классу стимуляторов ЦНС (см. раздел 3.5).

В этих экспериментах эффект МБГ оценивали аналогичным образом, но с одним отличием. Сессия самовведения для этих животных была второй по порядку. В первой сессии (инициация) отмечали выработку РВС никотина при первом контакте с этим психоактивным веществом, тогда как вторая сессия (поддержание) позволяла выявить, действительно ли начальная инициация РВС отражает первично-подкрепляющий эффект никотина. При сохранении (возможно, и дальнейшем росте) положительных критериев (R- и дельта- критериев) РВС можно было полагать, что навык самовведения вещества закреплен. После первой сессии (инициация) животных специально не отбирали по принципу самовведения раствора никотина для второй сессии (поддержание). После первой сессии РВС вырабатывалась у 60% животных. Вторую сессию проводили через сутки. За 30 минут до сессии самовведения части животных в/б вводили МБГ в дозе 2,5 мкг/кг, другой группе (контроль) -растворитель (ДМСО).

Зависимость «доза-эффект» выработки инициации РВС никотина имела куполообразный характер, характерный для данной модели, с максимальным отличием оперантных реакций активных и пассивных мышей при разовой дозе никотина 0,32 мкг/инф. При в/в самовведении никотина в разовой дозе 0,32 мкг/инф достоверно возрастал R- критерий. Последующий post hoc анализ (тест Бонферонни) подтвердил данное утверждение. Во время второй сессии первично-подкрепляющие свойства никотина проявлялись в еще большей степени. Отмечалось достоверное увеличение как R-критерия, так и дельта- критерия.

При предварительном в/б введении МБГ (2,5 мкг/кг) не изменял показатели РВС изотонического раствора, а также РВС никотина в разовых дозах 0,16 и 0,48 мкг/инф. При использовании теста Манна-Уитни анализ групп с РВС никотина в разовой дозе 0,32 мкг/инф показал достоверное влияние МБГ по изменению R- и дельта- критериев.

Таким образом, как следует из проведенных экспериментов, модуляция активности Na/K-АТФазы влияет на «награждающие» свойства не только этанола (депрессанта ЦНС), но и никотина (психостимулянта). В фармакологии аддиктивных веществ принято считать, что подавление РВС может происходить по двум причинам. Во-первых, фармакологическое вещество-регулятор воспроизводит, имитирует свойства аддиктивного вещества и, таким образом, «замещает» его, делая последующие (само)введения неэффективными и вызывая угашение оперантной реакции. Во-вторых, фармакологическое вещество может антагонизировать эффектам аддиктивного вещества, предупреждая мотивационную «привлекательность» его инъекций.

Судя по ранее проведенным в нашей лаборатории экспериментам с реакцией предпочтения места (Bagrov et al.,1999), ингибиторы натриевого насоса не обладают собственными вторично-подкрепляющими свойствами. Это указывает на то, что первый теоретический механизм действия МБГ маловероятен. Данное утверждение подкрепляется также результатами экспериментов с исследованием дискриминативных стимульных свойств МБГ в сравнении с этанолом (см. главу 4).

Следует полагать, что уменьшение активности натриевого насоса в структурах мозговой системы «награды» таким образом изменяет их функцию, что дискретные «оптимальные» дозы аддиктивных веществ этанола и никотина, вводимые внутривенно, на фоне премедикации МБГ не вызывают мотивационно-поведенческие эффекты в степени, достаточной для выработки и закрепления оперантной реакции поиска и самовведения этих аддиктивных веществ.

В главе 1 приводились данные о том, что под влиянием этанола возможно повышение активности Na/K-АТФазы (Foster et al, 1989). Поэтому такого рода фармакологический антагонизм на уровне самого натриевого насоса теоретически допустим, хотя нельзя исключать и другие возможности взаимодействия эффектов этанола и лигандов Na/K-АТФазы в ЦНС, результатом которого будет уменьшение первично-подкрепляющих свойств этанола, никотина и, возможно, других аддиктивных веществ.

Дискриминативные стимульные свойства ЭДФ.

Исследование дискриминативных стимульных свойств ЭДФ было целесообразно для объективного ответа на вопрос, связана ли способность ингибиторов натриевого насоса блокировать подкрепляющие эффекты этанола с тем, что они способны замещать последний по своим интероцептивным стимульным свойствам. В этих опытах ожидалось также получить ответ на вопрос о возможности антагонизма дискриминативным стимульным свойствам этанола.

В результате обучения и постепенной выработки дискриминативного поведения вероятность выбора «этанольного» отверстия после введения «тренировочной дозы» этанола (1 г/кг) достигла 100%, в то время как вероятность выбора «этанольного» отверстия после введения растворителя составляла 0%. Таким образом, удалось получить полное различение дискриминативных стимульных свойств этанола и растворителя.

В тесте «замещения» анализируется способность воспроизведения дискриминативных стимульных свойств эталонного препарата в «тренировочной дозе» (в данном случае этанола в дозе 1 г/кг) при действии того же препарата (этанола) в иных дозах или при использовании иного вещества-«заместителя». Введение «физиологического» раствора и низких доз этанола характеризовалось преимущественным выбором «водного» отверстия. При увеличении дозы этанола вероятность «этанольного» ответа достоверно увеличивалась. Расчетное значение эд50, т.е. дозы этанола, после которой 50% животных демонстрируют «этанольный» ответ, составило 0,44 г/кг (доверительный интервал: 0,30^-0,57 г/кг).

Как и ожидалось, этанол на данной модели проявил отчетливые дискриминативные стимульные свойства, и животные легко обучались реагировать на интероцептивный сигнал после введения вещества, как на условный раздражитель, сигнализирующий какого рода оперантная пищедобывательная реакция должна осуществляться. Таким образом, стимульный контроль поведения благодаря этим свойствами этанола был полным.

В тестах «замещения» введение МБГ, ОУ или дигоксина не увеличивало вероятность выбора «этанольного» отверстия. Ни в одной из использованных доз исследованные вещества не проявляли «этанолоподобных» дискриминативных стимульных свойств на статистически значимом уровне. Ни для одного из исследованных веществ или комбинации веществ с этанолом не было выявлено достоверного влияния на латентный период выполнения 10 последовательных выглядываний в одно из отверстий (основной критерий выбора «этанольного» и «водного» вариантов реагирования).

Таким образом, в тестах «антагонизма» введение МБГ, ОУ или дигоксина в комбинации с тренировочной дозой этанола не оказывало значительного влияния на дискриминативные стимульные свойства этанола. Несмотря на введение достаточно высоких доз лигандов натриевого насоса, животные полностью воспринимали стимульные свойства тест-дозы этанола, что отражалось выполнением ассоциированной с предварительным введением этанола оперантной реакции.

Представленные данные убедительно показывают, что ингибиторы натриевого насоса не способны замещать этанол у животных, обученных отличать инъекции этанола от инъекций «физиологического» раствора. Ни в одной из исследованных доз эти соединения не имитировали стимульные свойства этанола.

Результаты, полученные в этой главе, представляют интерес для понимания поведенческих механизмов влияния ингибиторов натриевого насоса на РВС. Для понимания поведенческих механизмов этого влияния на первично-подкрепляющие свойства этанола было важно проверить, распространяется ли этот эффект на интероцептивные стимульные свойства этанола. Как выше было замечено, можно было ожидать два варианта взаимодействия ингибиторов натриевого насоса и этанола на этой модели:

1 «Заместительные» средства. Обладают аналогичными стимульными и мотивационно-подкрепляющими эффектами, что и целевое аддиктивное средство. Примерами реализованных в клинической практике вариантов такой фармакотерапии являются заместительное лечение опийной наркомании метадоном, JIAAM, бупренорфином, заместительное лечение табакокурения никотином и другими Н-холиномиметиками.

2 Вещества-антагонисты. Обладают способностью предупреждать или устранять как стимульные, так и мотивационно-подкрепляющие эффекты целевых аддиктивных средств. Примерами успешной реализации такого варианта взаимодействия в клинике является терапия налтрексоном при опийной наркомании.

Как показали эксперименты на модели дискриминативных стимульных свойств этанола, ни один из вышеуказанных вариантов взаимодействия не оказался реализованным. Все исследованные ингибиторы Na/K-АТФазы не воспроизводили стимульных свойств этанола в тесте «замещения», а также оказались неспособными препятствовать «распознаванию» этанола в тесте «антагонизма».

Таким образом, выявленный вариант взаимодействия этанола и ингибиторов Na/K-АТФазы позволяет добавить третий из известных в фармакологии аддиктивных веществ вариант поведенческого механизма действия средств экспериментальной фармакотерапии аддиктивных состояний:

3. Вещества - модуляторы мотивационно-аффективного компонента комплексного интероцептивного сигнала при введении аддиктивных средств. Такой вариант взаимодействия выявлен в настоящей работе применительно к ингибиторам Na/K-АТФазы. В этом случае вещество не изменяет дискриминативных стимульных свойств аддиктивного средства (в данном случае этанола), но понижает его первично-подрепляющий потенциал.

Влияние ЭДЛНН на обмен аминокислот в N. Accumbens у крыс.

Для выявления возможных механизмов действия ЭДЛНН исследовали внеклеточную концентрацию возбуждающей (глутамат) и тормозной (таурин) аминокислот методом микродиализа в центральной структуре мозговой системы подкрепления - прилежащем ядре перегородки. Мезолимбическая дофаминовая система с проекциями из вентрально-тегментальной области (ВТО) среднего мозга в прилежащее ядро представляет особую значимость в развитии лекарственного и алкогольного подкрепления (Wise et al., 1987; Di Chiara и Imperato, 1988; Koob, 1992), и поэтому наш выбор был сделан в пользу микродиализного исследования именно в прилежащем ядре.

Была проведена оценка влияния острого в/б введения этанола, МБГ и ОУ, а также их сочетаний.

Вначале была проведена серия экспериментов, направленная на изучение собственного эффекта стероидов на внеклеточную концентрацию нейротрансмиттерных аминокислот. Было отмечено повышение уровня глутамата в первые 20 минут после введения МБГ (достоверно) и ОУ (тенденция) по сравнению с эффектом растворителя (0,5% раствор ДМСО). Были также получены данные, что в/б инъекции МБГ или ОУ достоверно повышали уровень внеклеточного таурина в первые 20 минут после введения.

В дальнейшем эксперимент состоял в совместном введении МБГ, ОУ или растворителя и этанола. Было установлено, что этанол в дозе 2 г/кг массы тела вызывал наибольшее повышение внеклеточного уровня таурина в прилежащем ядре перегородки головного мозга крысы. Совместное введение ингибиторов натриевого насоса и этанола выявило достоверное увеличение концентрации глутамата и таурина в течение первые 20 минут после введения этанола по сравнению с контрольной группой, которая при предварительном введении получала растворитель.

Полученные результаты подтверждают данные предыдущих исследований (Estevez et al., 2000), в которых было показано, что ингибиторы Na/K-АТФазы повышали внеклеточную концентрацию глутамата в головном мозге in vivo. Если ингибиция Na/K-АТФазной активности вызывает блокаду обратного захвата глутамата и высвобождение внутриклеточного глутамата (Nicholls и Attwell, 1990), то можно предположить, что комбинация оуабаина и глутамата повышает риск нейротоксичности и может быть причиной ускоренной нейрональной гибели. Повышение нейротоксичности при экзогенном введении глутамата было выявлено in vivo при повреждении обратного захвата глутамата (Kohler и Schwarez, 1981).

Интересны полученные недавно данные, свидетельствующие о том, что оуабаин и эндобаин Е модулируют NMDA рецептор in vitro при помощи определенных механизмов, не вовлеченных в изменения ионного градиента (Reines et al., 2001).

Выявленное в наших экспериментах повышение уровня внеклеточного таурина может рассматриваться как компенсаторная адаптивная реакция. Известно, что таурин играет важную роль в восстановлении мозгового гомеостаза после различных клеточных стрессов (Huxtable, 1989). Так, например, повышение внеклеточного таурина может способствовать снижению токсичности этанола за счет увеличения окисления первого метаболита этанола ацетальдегида, который ответственен за многие побочные свойства этанола (Eriksson, 2001). Таурин способен также поддерживать осмотическую регуляцию мозга (Baxtor et al., 1986), что представляется немаловажным, поскольку этанол вызывает потерю воды клетками, ингибируя антидиуретический гормон.

Изменение концентрации маринобуфагенина при алкогольном абстинентном синдроме у людей.

Итоговой частью настоящей работы явилось пилотное исследование содержания МБГ при алкогольном абстинентном синдроме у пациентов Ленинградского областного наркологического диспансера, поступивших в состоянии острого абстинентного синдрома4. Целью данного исследования было выяснить, как изменяется концентрация эндогенного ингибитора натриевого насоса МБГ у больных алкоголизмом в начальной острой фазе алкогольного абстинентного синдрома и после купирования острого состояния. Исследование состояло из двух частей. В первой части у пациентов, страдающих алкоголизмом, в первый день абстинентного синдрома до начала медикаментозной терапии были взяты образцы крови. Затем, во второй части исследования, у тех же пациентов был сделан повторный забор крови на следующий день после окончания терапии.

Все образцы крови были центрифугированы. Концентрацию МБГ определяли в экстрактах плазмы, как было описано ранее (Bagrov et al, 1995, 1998) и подробно изложено в разделе 2.2.1.

По данным литературы у здоровых лиц уровень концентрации МБГ в плазме крови составляет 0,2-0,3 нмоль/л (Gonick et al., 1998; Bagrov et al., 1998). На фоне абстинентного синдрома концентрация МБГ в плазме крови существенно возрастала и составила 0,68±0,09 нмоль/л (табл. 1). Парное сравнение полученных данных показало достоверное снижение значений концентрации МБГ (0,48±0,07 нмоль/л, табл. 1) после медикаментозного лечения проявлений алкогольного абстинентного синдрома по сравнению с данными, полученные в первый день (р=0,02, по Манн-Уитни) (рис. 1).

В состоянии острого абстинентного синдрома у больных отмечалась также артериальная гипертензия (таблица 2).

4 Автор приносит благодарность главному наркологу Ленинградской области профессору Е.М.Крупицкому и доктору А.А. Руденко за помощь в организации и проведении этого пилотного исследования.

Факт повышения концентрации МБГ в начальной фазе алкогольного абстинентного синдрома представляет интерес в двух отношениях. Во-первых, это может быть проявлением «рикошетного» изменения (повышения) концентрации данного ЭДФ в ответ на прекращение хронической интоксикации этанолом. Такого рода эффекты характерны для аддиктивных состояний, к которым относится алкоголизм с выраженным синдромом толерантности и зависимости. К сожалению, у нас пока нет прямых данных, показывающих есть ли отличия в функции системы «Na/K-АТФаза - ее эндогенные лиганды», в частности в уровне МБГ, у больных алкоголизмом в сравнении с собственными показателями в периоде ремиссии или в сравнении с показателями нормальной популяции. Целесообразность такого рода исследования очевидна из настоящей пилотной работы.

Во-вторых, как отмечалось в главе 5, МБГ уже при однократном введении способен повышать внеклеточную концентрацию глутамата в n.accumbens. В исследовании, проведенном группой De Witte P. (1996), было установлено, что при хроническом введении этанола происходит повышение концентрации глутамата в различных отделах головного мозга. Наиболее характерен подобный «глутаматный выброс» именно для периода абстиненции. С учетом полученных нами данных заманчиво связать увеличение уровня МБГ с гиперактивностью глутаматергической системы при алкогольном абстинентном синдроме, которая, как известно, является основой нейротоксических эффектов возбуждающих аминокислот (excitotoxicity) с повреждением нейронов, нейрональной смертью (Dingledine и McBain, 1999), а в конечном итоге и возможной алкогольной энцефалопатией.

Было также выявлено, что на фоне абстиненции у больных развивается гипертензивный синдром, который не является неожиданным при повышении концентрации МБГ (Bagrov et al., 1996а). Полученные результаты хорошо согласуются с данными, которые показывают, что абстинентный синдром, развивающийся после прекращения употребления алкоголя, способствует развитию артериальной гипертензии (Mehta et al., 1979; Saunders et al., 1981; Gheno et al., 1984; Nardoni et al., 1986).

Данное клиническое исследование является первым шагом в изучении роли ЭДЛНН в патогенезе алкогольной зависимости.