Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Изучение активности эластазы нейтрофилов в условиях применения искусственных органов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

На правах рукописи

УДК 616.155.34:616-77

Макарова Лариса Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЭЛАСТАЗЫ НЕЙТРОФИЛОВ В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

14.00.41 - трансплантология и искусственные органы

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор М.Ш. Хубутия. Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор О.П. Шевченко.

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 5

Глава I. Эластаза нейтрофилов и ее роль в повреждении

тканей в условиях применения искусственных органов (обзор литературы).................................................... 9

1.1. Активация нейтрофильных гранулоцитов при экстракорпоральной гемоциркуляции..................... Ю

1.2. Нейтрофильные гранулоциты и их компоненты..... 17

1.3. Эластаза нейтрофилов: физико-химические свойства, биологическая роль, методы определения

и диагностическое значение..................................... 30

1.4. Роль эластазы нейтрофилов в повреждении тканей

при экстракорпоральной гемоциркуляции............................37

1.4.1. Механизм участия эластазы нейтрофилов в нарушениях коагуляции....................................................................38

1.4.2. Механизм участия эластазы нейтрофилов в повреждении соединительной ткани............................42

1.5. Заключение..................................................................................................................................47

Глава II. Материал и методы исследования ^

2.1. Характеристика больных и исследуемого материала 49

2.2. Полимерные материалы......................................................................................52

2.3. Определение активности эластазы нейтрофилов .... 55

2.4. Методы выделения белков 56

2.5. Методы иммунохимического анализа ........................................58

2.6. Статистическая обработка результатов........................................59

Глава III, Изучение активности НЭ в условиях

взаимодействия цельной крови с поверхностью

синтетических материалов медицинского

назначения............................................................... 60

3.1. Адсорбция НЭ из крови здорового человека на поверхность кремнийорганических резин медицинского назначения....................................... 60

3.2. Сравнительный анализ активности эластазы нейтрофилов в условиях взаимодействия крови с поверхностью различных материалов медицинского назначения....................................... 65

Глава IV, Изучение влияния Перфторана на активность НЭ в

тестах in vitro и при клиническом применении 69

4.1. Влияние Перфторана (ПФ) на адсорбцию эластазы нейтрофилов из цельной крови на поверхность полимеров.......................................... 69

4.2. Изучение влияния Перфторана на активность НЭ

в условиях клинического применения................... 75

Глава V. Изучение влияния интраоперационных факторов на активность эластазы нейтрофилов в плазме крови больных при операции в условиях искусственного кровообращения........................................................... 80

5.1. Динамика активности нейтрофильной эластазы в зависимости от характера основного заболевания.. 81

5.2. Влияние кортикостероидов и инсулина на активность эластазы нейтрофилов в плазме крови кардиохирургических больных.................................. 83

5.3. Динамика активности эластазы нейтрофилов при применении препаратов ингибиторов протеиназ

при операции в условиях ИК.................................... 89

Обсуждение результатов и заключение............................................................93

Выводы.................................................................................................................................105

Практические рекомендации..............................................................................................107

Список литературы.............................................................................................108

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

НЭ (ГЭ)- нейтрофильная (гранулоцитарная) эластаза МПО - миелопероксидаза ЛЦ - лизоцим ЛФ - лактоферрин

ЛТаГ - лейкоцитарный термостабильный а-гликопротеид

а\Ш1 - а1-ингибитор протеиназ, а1-антитрипсин

а2МГ - а2-макроглобулин

ВМК - высокомолекулярный кининоген

ПМН - полиморфноядерный нейтрофильный лейкоцит

ИК - искусственное кровообращение

ЭК (ЭГ) - экстракорпоральное кровообращение

/гемоциркуляция ИБС - ишемическая болезнь сердца ДКМП - дилятационная кардиомиопатия НК - недостаточность кровообращения ФК - функциональный класс ЭКГ - электрокардиограмма

Ме08ис(А1а)2РгоУа1рЫа - метоксисукцинил-диаланил-пролил-

валил-паранитроанилид ФСБ - фосфатно-солевой буфер КР - кремнийорганические резины ПВХ - поливинилхлорид ПФ - Перфторан ГД - Гемодез

ВВЕДЕНИЕ

В результате исследований, проведенных в 80-90гг., сформировалось представление о том, что активация нейтрофилов крови является неотъемлемым условием применения любых методов экстракорпоральной гемоперфузии - искусственного, вспомогательного кровообращения, гемодиализа и др., более того - этот феномен является важным звеном в патогенезе развития целого ряда осложнений, связанных с применением искусственных органов, основанных на экстракорпоральной гемоциркуляции, - системной воспалительной реакции, нарушений дыхания, местных нарушений коагуляции и др. (Butler J., 1993; Kawamura T., 1993; Verrier E.D., 1993; Eigebaly S.A., 1994; Wilson L, 1993; Korthuis R.J., 1994.).

Перераспределение крови и циркуляция ее вне организма, контакт с чужеродными материалами и механическими системами, вынужденная коррекция системы гемостаза и фибринолиза - все это приводит к активации нейтрофилов. Активация гранулоцитов сопровождается их накоплением в сосудах легкого, адгезией на легочном эндотелии и дегрануляцией, что приводит к повреждению альвеолярных мембран и деградации сурфактанта, нарушению газообмена в альвеолах, увеличению сосудистого сопротивления.

Нейтрофильная эластаза, выделяемая нейтрофилами при их активации, разрушает многие биологические субстраты, непосредственно участвует в повреждении тканей и развитии осложнений, развивающихся после операции в условиях ИК, при вспомогательном кровообращении, гемодиализе - т.е. при различных формах экстракорпоральной гемоциркуляции.

В связи с этим, выявление повышенной активности эластазы нейтрофилов в условиях применения искусственных органов полезно для

диагностики и прогноза развития осложнений, при разработке новых гемосовместимых материалов, диализаторов, фильтров, оксигенаторов, а также при подборе дозы и режима введения лекарственных препаратов во время операции в условиях искусственного кровообращения.

Для этого необходимо изучить влияние различных факторов, действующих в условиях применения искусственных органов, на процесс активации нейтрофилов. Кроме того, нельзя исключить и наличие индивидуальных особенностей реакции нейтрофилов крови на экстракорпоральное кровообращение.

Использование нейтрофильной эластазы для диагностики, прогноза, коррекции и профилактики нарушений, обусловленных экстракорпо-

V __V» _

ральнои гемоциркуляциеи, затруднено, в первую очередь, в связи с неразработанностью методических подходов, учитывающих специфику применения искусственных органов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить диагностическую и прогностическую значимость нейтрофильной эластазы при оптимизации экстракорпоральной гемоцирку-ляции и разработать тесты для оценки и прогнозирования нарушений гомеостаза в условиях применения искусственных органов.

ЗАДА ЧИ

1. Исследовать активность эластазы нейтрофилов при взаимодействии крови здорового человека с поверхностью синтетических материалов медицинского назначения и разработать методический подход для количественной оценки этого параметра.

2. Выявить зависимость активности НЭ, выделяемой нейтрофилами при контакте с поверхностью синтетических материалов, от индивидуальной реактивности крови здорового человека.

3. Провести сравнительную оценку влияния различных серий препарата Перфторан на активность НЭ в тестах in vitro.

4. Оценить влияние Перфторана на активность НЭ при его клиническом применении в 1-7 сутки после операции в условиях искусственного кровообращения.

5. Исследовать динамику активности НЭ и ее естественных ингибиторов в плазме крови больных во время и после операции в условиях ИК и изучить влияние интраоперационного введения ингибиторов протеиназ на эти параметры.

6. Изучить влияние интраоперационного введения метилпреднизолона, инсулина на активность НЭ. Оценить возможность использования теста на активность НЭ в плазме крови для обоснования схемы введения лекарственных препаратов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Новым является :

• метод оценки активности НЭ, адсорбированной из цельной крови на поверхности, отражающий процесс активации гранулоцитов;

• полученные данные об индивидуальной реактивности крови человека в условиях экстракорпорального кровообращения;

• данные о влиянии фармпрепаратов (метилпреднизолон, инсулин) на активацию нейтрофилов и активность НЭ во время и после операции в условиях ИК.

Впервые получены данные о влиянии Перфторана на нейтрофилы крови в опытах in vitro и при его клиническом применении после операции в условиях ИК, а также предложен способ объективной количественной оценки этого влияния.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предложенный и апробированный способ оценки активности НЭ может быть использован:

М о о

• для выделения группы риска - лиц с высокой индивидуальной реактивностью нейтрофилов на экстракорпоральное кровообращение - для прогнозирования и, в последующем, профилактики развития осложнений при операции в условиях искусственного кровообращения, при вспомогательной перфузии;

• для сравнительной характеристики, стандартизации и отбора различных серий Перфторана на основании объективной оценки их биологического воздействия на нейтрофильные гранулоциты крови;

• для обоснования доз и режима фармакокоррекции и контроля ее эффективности во время операции в условиях ИК. .

ГЛАВА I. ЭЛАСТАЗА НЕЙТРОФИЛОВ И ЕЕ РОЛЬ

В ПОВРЕЖДЕНИИ ТКАНЕЙ В УСЛОВИЯХ ПРИМЕНЕНИЯ ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ.

(Обзор литературы)

Методы экстракорпоральной гемоциркуляции заняли прочное место в современной медицине. Применение и совершенствование гемодиализа, искусственного и вспомогательного кровообращения являются неотъемлемой частью пересадки органов, сердечно-сосудистой хирургии и условием, в значительной степени определяющим успех операции, продление жизни больного, течение послеоперационного периода. Перераспределение крови и её циркуляция вне организма, контакт с чужеродными материалами и механическими системами, использование антикоагулянтов, донорской крови, кровезаменителей и других фармакологических препаратов - все это является обязательными компонентами методов механической перфузии и приводит к изменению функциональной активности клеточных и гуморальных систем, направленных на поддержание структурного гомеостаза организма. Активация нейтрофильных гранулоцитов является главным патогенетическим звеном ряда системно-органных нарушений: дисфункции легких, сердца, почек, тяжесть поражений которых может определять прогноз и опасность летального исхода после операции (4, 21, 145). В настоящем обзоре предпринята попытка анализа современных представлений о роли гранулоцитов и выделяемого ими главного медиатора повреждения тканей - эластазы нейтрофилов, в развитии воспаления и нарушений гомеостаза, связанных с применением искусственных органов, в первую очередь, с экстракорпоральной гемоциркуляцией.

1.1. Активация нейтрофилъных гранулоцитов при экстракорпоральной гемоциркуляции.

Любые формы эстракорпоральной гемоциркуляции оказывают выраженное воздействие на гранулоциты (132, 143), обусловленное целым рядом факторов, среди которых можно выделить: перераспределение циркулирующих клеток в процессе экстракорпорального кровообращения, изменение функциональной активности полинуклеарных лейкоцитов при контакте с чужеродными материалами.

Влияние гемоперфузии на гранулоциты является предметом интенсивного изучения, однако патогенетические факторы, методы выявления возникающих нарушений гомеостаза, пути профилактики и коррекции развивающегося при этом клинического симптомокомплекса остаются во многом неясными.

Опыт клинического применения гемодиализа в 50 - 70 гг. показал, что транзиторная лейкопения наблюдается в течение первых часов. Снижение количества циркулирующих лейкоцитов происходит за счет гранулоцитов и моноцитов (91, 111) и сопровождается нарушениями хемилюминесценци,фагоцитоза, хемотаксиса нейтрофилов (10, 44).

P.Aliyma et.al. (165), S.Teraoka et.al. (226) при микроскопическом исследовании установили, что транзиторная лейкопения, вызванная контактом с чужеродной поверхностью, является следствием внутрисо-судистой маргинализации циркулирующих нейтрофилов. Баланс между маргинальными (пристеночными) и циркулирующими полинуклеарами зависит от интенсивности, с которой клетки прилипают к эндотелию, т.е. от их функциональной активности.

Механизм возникновения лейкопении при гемодиализе связывают с активацией комплемента (98, 167, 244). Значение активации комплемента на поверхности диализных мембран подтверждает тот факт, что инфузия животным плазмы крови, инкубированной с диализными

мембранами, приводит к гранулоцито- и моноцитопении (91). Продукты активации комплемента - анафилотоксины СЗа и С5а активируют гранулоциты. В то же время, активированные гранулоциты могут стимулировать образование анафилотоксинов (200).

Степень активации гранулоцитов зависит от материала диализных мембран. Исследования A. Jacot et.al. (160) показали, что на купрофа-новых мембранах лейкопения более выражена, чем на нецеллюлозных мембранах из полиакрилонитрила. Однако более широкие исследования показали, что может иметь место диссоциация между активацией комплемента и лейкопенией при гемодиализе (167): на целлюлозных мембранах происходит значительная активация комплемента и нейтро-пения; на нецеллюлозных мембранах, более совместимых с кровью, активация комплемента выражена в меньшей степени, но наблюдалась различной степени нейтропения, более тяжелая на поликарбонатной мембране. Результаты представленной серии исследований показали, что для оценки диализных мембран помимо активации комплемента, необходимо учитывать активацию гранулоцитов на мембранах.

При активации гранулоцитов происходит увеличение секреции специфических цитоплазматических компонентов этих клеток. Интенсивность секреции зависит от материала мембран.

Эти исследования являются объективным критерием при поиске и разработке материалов мембран, наименее агрессивных в отношении активации гранулоцитов. Необходимым условием для апробации таких материалов в клинике является наличие теста для адекватной оценки функционального состояния ПМН.

При экстракорпоральной гемоциркуляции имеет место характерная динамика количества циркулирующих гранулоцитов (209, 210, 211). Изменение состава циркулирующих гранулоцитов является результатом различных процессов: маргинализации клеток, элиминации из циркуляции поврежденных гранулоцитов и поступления молодых форм гра-

нулоцитов из костного мозга. J.Wissler (243) открыл новый класс естественных лейкопоэтинов, содержащихся в гранулоцитах и выделяющихся при их разрушении. Эти вещества регулирулируют селективное рекрутирование гранулоцитов из костного мозга в кровоток, обеспечивая тем самым реакции лейкоцитоза и сдвига лейкоцитарной формулы влево.

При кардиохирургических операциях в условиях длительной перфузии необходимо решение проблем гемолиза, денатурации белков плазмы, нарушений гемокоагуляции, формирования микроэмболий (95, 134, 157, 191).

Длительность ИК и тип использованного в процессе ИК оксигенатора имеют значение для травмы клеток (85, 98, 118, 123). У всех больных, перенесших операцию в условиях ИК, происходит нарушение активации комплемента (140, 219), снижение активности и количества циркулирующих нейтрофилов, нейтрофильный лейкоцитоз (202), нарушение иммунного статуса (снижение концентрации иммуноглобулинов в плазме крови).

Активация гранулоцитов и секреция компонентов гранулоцитов в плазму крови при ИК обнаружена W. Horl et. al. (152), С.Hind et. al. (147), W. Riegel et. al. (200). В своих исследованиях M.Anque et.al. (174) демонстрируют взаимосвязь двух процессов - активации комплемента и активации гранулоцитов при контакте с чужеродными поверхностями. Ими было установлено, что присутствие полинуклеарных лейкоцитов усиливает активацию комплемента. Выброс метаболитов полинуклеарных лейкоцитов играет важную роль при развитии постишемической дисфункции миокарда, реперфузионной аритмии. Так, Y. Yokogama et al (248) показали, что при коронарном тромболизисе у больных острым инфарктом миокарда удаление лейкоцитов при помощи специального фильтра позволяет избежать развития реперфузионной аритмии. При ИК в контуре усиливается выработка анафилотоксина С5а, причем по-

крытие контура ИК ультратонким слоем анкетированного силиконового