Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Диагностическая и прогностическая значимость лейкоцитарного альфа-гликопротеида при операции в условиях искусственного кровообращения (клинико-лабораторное исследование)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗСТЪ

ЛЕЙКОЦИТАРНОГО АЛЬЗД-ГЛИКОПРОТВДА ПРК 'ОДЦИИ В УСЛОВИЯХ ИСКУССТВЕННОГО КРОВООЁРАс я (клинико-лабораторное исследование)

14.00.41 - трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ГБ ОД з МАП 1996

На правах рукописи

УДК [616-77:612.1]:577.112.85' и/

Чернова Анна Владимировна

Москва 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте трансплантологии и искусственных органов

Научный руководитель:

доктор медицинских наук А.Ш.Хубутия.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор О.П.Шевченко.

Официальные оппоненты:

академик АМТН РФ доктор медицинских наук,

профессор В.Е.Толпекин;

доктор медицинских наук, профессор А.А.Терентьев.

Ведущая организация - Научный Центр Хирургии Российской I

Защита диссертации состоится "2^/" цнэик 1996 г. в 14 часов на заседании специализированного совета Д.074.34 при НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ и МП РФ (123182, Москва, ул.Щукинская, д.1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ и МП РФ.

Автореферат разослан " # ьр^лЯ 1996 1\_

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Е.В.Колпаков.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Кардиохирургические операции в условиях искусственного ровообращения (ИК) часто сопровождаются возникновением общей ■оспалительной реакции организма и развитием дисфункции жизнен о важных органов, тяжесть поражения которых определяет прог-:оз и опасность летального исхода после операции на открытом :ердце (Butler J., 1993; Kawamura T., 1993; Verrier E.D., 1993; lleebaly S.A., 1994; Wilson I., 1993; Korthuls R.J.. 1994).

Согласно современным представлениям, методы экстракорпо-ального кровообращения оказывают сильное воздействие на нейт-офилы, вызывая их активацию. Активированные нейтрофилы секре-ируют в кровь специфические белки,, которые являются медиато-ами повреждения тканей (Шумаков В.И., 1986; Шевченко О.П. 993; Finn А., 1993). Процесс активации нейтрофилов и секреции плазму крови больного специфических нейтрофилъных белков вляется ведущим звеном в патогенезе острой воспалительной ре-кции организма (Moat N.E., 1993; Rinder С.S., 1994; Stefano .В., 1993; Holzheimer R.6,, 1994).

Процесс активации нейтрофилъных гранулоцитов при ИК буславливается многими факторами: контактом с чужеродными оверхностями, активацией системы свертывания крови, моноци-арно-макрофагальной и комплементарной систем. Активация гра-улоцитов сопровождается их накоплением в сосудах легкого, ад-езией на легочном эндотелии и дегрануляцией, что приводит к эвреждению альвеолярных мембран и деградации сурфактанта, наущению газообмена в альвеолах, увеличению сосудистого сопро-ивления. (Elllot M.J., 1993; Verrier Е.D., 1993; Korthuls ,J., 1994; Kanal H, , 1994). Помимо этого,, поступление в общий

Г 4 -

кровоток большого количества специфических цитоплазыатиеских гранулоцитарных белков приводит к нарушению протеиназно-ингиб торного баланса и изменению активности протеолитических каска ных систем крови (Glllinov A.M., 1994; Komai Н., 1994; Seghay М.С.,1994).

Специфические гранулоцитарные белки являются индикаторам активации нейтрофилов. К этой группе белков относятся миело-пероксидаза, зластаза гранулоцитов, лактоферрин, катепсин 6, лейкоцитарный а-гликопротеид (ЛТаГ). Роль некоторых гранулою тарных белков в развитии воспалительной реакции достаточно хс рошо охарактеризована: нейтрофильная зластаза и катепсин G являясь протеазами, способны деградировать широкий спектр бис логических субстратов; лактоферрин осуществляет регуляторнь функции (Riegel W., 1988;Faymonville М..1991; Farah В.. 1994 Jorens P.S.. 1993; Butler J.. 1993; Finn A., 1993).' В то г время, биологическая роль ЛТаГ и его клинико-диагностически значимость изучены недостаточно. Однако известно, что плазме! ные уровни ЛТаГ резко возрастают при операции в условиях ИК значительно превшая уровни нейтрофияьной зластазы, миелопе роксидазы и лактоферрина. Кроме того, уровни ЛТаГ в плаз* крови больных коррелируют с показателями активности воспап тельного процесса (Шевченко О.П., 1990; Шевченко О.П.. 1993).

Цель работ:

Изучить диагностическую и прогностическую значимость ЛТаГ щ операции в условиях ИК и его патогенетическую роль в развит! послеоперационных нарушений гомеостаза.

Задачи исследования:

1. Установить зависимость продукции ЛТаГ от условий искусственного кровообращения (длительности Ж, типа оксигенатора, качества переливаемой крови).

2. Изучить влияние препаратов кортикостероидов, инсулина, ингибиторов протеиназ на интраоперационную динамику ЛТаГ и других нейтрофильных белков. Изучить возможность использования теста на ЛТаГ для обоснования схем введения лекарственных препаратов.

3. Выявить корреляцию между ЛТаГ и основным медиатором повреждения тканей - зластазой нейтрофилов, в плазме крови больных, оперированных в условиях ИК.

4. Разработать способ выделения ЛТаГ и охарактеризовать его физико-химические свойства.

5. Изучить взаимодействие ЛТаГ с эластазой нейтрофилов в тестах "in vitro".

Научная новизна.

' Предложен новый способ оценки активации нейтрофильных гранулоцитов при операции в условиях искусственного кровообращения, основанный на определении концентрации ЛТаГ в плазме крови больных.

Впервые разработан способ выделения ЛТаГ из гнойно-некротических масс и экссудата для получения очищенного ЛТаГ (Авт. св.N 1665569). Охарактеризованы физико-химические свойства препарата ЛТаГ (мол.масса, изоэлектр.точка).

Доказано, что ЛТаГ взаимодействует с зластазой нейтрофилов и при этом не ингибирует активность фермента. Установлена положительная корреляция в динамике между ЛТаГ и нейтрофильной

эластазой при операции в условиях Ж.

Практическая значимость.

1. Определение ЛТаГ в плазме крови кардиохирургических больны) позволяет подбирать дозы и режим введения лекарственны) препаратов во время операции в условиях ИК таким образом, чтобы уменьшить отрицательное.влияние этих факторов на процесс активации гранулоцитов, сопровождающийся возникновением постоперационных осложнений.

2. Тест на ЛТаГ является наиболее информативным и приемлемых для клинической практики, в отличии от известных тестов нг нейтрофильные белки (эластазу нейтрофилов, миелопероксидаз* лактоферрин). поскольку плазменные уровни ЛТаГ в 6-10 раг превышают уровни других специфических нейтрофильных белко! при операции в условиях ИК.

3. Использование теста на ЛТаГ позволяет оценивать качестве донорской крови до операции путем определения в ней концентрации ЛТаГ и прогнозировать развитие дополнительных нарушений гомеостаза, обусловленных использованием образцов крови,с повышенным содержанием ЛТаГ.

4. При разработке оксигенаторов, гемосовместимых поверхностей и материалов использование теста на ЛТаГ позволяет осуществлять контроль"за процессом активации нейтрофилов, контактирующих с чужеродными поверхностями.

Положения, выносимые да защищу.

1. Операции в условиях искусственного кровообращения сопровождаются значительным увеличением концентрации лейкоцитарного а-гликопротеида (ЛТаГ) в плазме крови кардиохирургических

больных, отражающим процесс активации нейтрофилов. Уровни ЛТаГ в плазме крови больных зависят от длительности ИК, типа оксигенатора, качества донорской крови, фармакологических препаратов, характера основного заболевания.

2. Тест на ЛТаГ может быть использован для подбора оптимальных схем введения фармакологических препаратов (кортикостерои-дов, ингибиторов претеиназ), а также при разработке новых гемосовместимых поверхностей и оксигенаторов, при оценке качества донорской крови, с целью уменьшения степени активации нейтрофилов при операции в условиях ИК.

3. Способ выделения ЛТаГ из гнойно-некротических масс и экссудатов, позволяющий получить очищенный препарат ЛТаГ. ЛТаГ обладает способностью взаимодействовать с зластазой нейтрофилов и не ингибирует- ее активности.

Апробация работ.

Материалы диссертации были доложены на V Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике ( Москва, 1995 г.) и на 11 Европейском конгрессе по клинической химии (Хельсинки,.

1995 г.). Работа была апробирована на межлабораторной научной

%

конференции НИИТйИО (Москва. 1996 г.).

Публикации. 1

/

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, имеется авторское свидетельство на изобретение N 1665569, 1990 г.. рационализаторское предложение (Р/П 11/89, НЖГиИО,. 1989 г.).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 1ЬЬ страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Указатель литературы включает источников (^^.отечественных и зарубежных). Диссертация иллюстрирована 2С рисунками и таблицами.

СОДЕРИАНКЕ РАБОТЫ.

Материал и методы исследования.

Общее количество кардиохирургических больных,оперированных в условиях искусственного кровообращения (ИК), у* которых проводилось иммунохимическое исследование специфических нейтрофилъных белков, составило 66 человек (47 мужчин. 19 женщин).

Все кардиохирургические больные были разделены на 3 группы: 1 группа - больные с ревматическими пороками одного, двух или трех клапанов сердца, которым проводились реконструктивные операции на клапанах (27 человек); 2 группа - больные с даеми-ческой болезнью сердца (ИБС), которым проводились операции аорто- и маммарокоронарного шунтирования (29 человек); 3 группа - больные с дилятационной кардиомиопатией (ДКМП), которым проводились операции трансплантации сердца (10 человек).

Контрольная группа состояла из 89 здоровых доноров -практически здоровых мужчин и женщин в возрасте от 18 до 4.6 лет, у которых брали образцы крови для исследования.

Распределение больных по группам, возрасту, полу и тяжести исходного состояния показано в таблице:

Таблица.

КАГНОЗ . КОЛ-ВО ВОЗРАСТ ПОЛ Тяжесть исходного

больных (лет) состояния

36-45 46-60 М X ФК НК

II III IV I II III

А Б

евматиче- 27 ' 15 12 18 9 - 18 9 -681

кие пороки

ердца

ВС 29 13 16 21 8 3 21 5 4 10 7 -

К М П 10 9 1 8 2 - 2 8 - 3 5 2

В качестве материала для исследования использовали плазму, олучаемую из венозной крови здоровых доноров и кардиохирурги-еских больных, оперированных в условиях ИК.

У кардиохирургических больных проводили иммунохимическое вотирование нейтрофильных и острофазных белков в динамике -еред операцией, в начале ИК (на 5 мин.), в конце ИК, в конце перации (перед наложением кожных швов) и после операции (че-, ез 24 и 48 часов).

Количество проб крови, взятых от каждого больного при перации и в постоперационном периоде, составляло не менее б. робы подвергались иммунохимическому и биохимическому исследованию по 5 показателям (определение концентрации лейкоцитарно-о а-гликопротеида, лактоферрина, активности эластазы грануло-

цнтов, активности плазменных ингибиторов эластазы, концентра ции С-реактивного белка). Таким образом, у одного больног проводилось не менее 30 исследований . Общее количество иссле дований, проведенных у 66 кардиохирургических больных и 81 здоровых доноров, составило более 2000.

В работе были использованы биохимические и иммуно-хиыические методы исследования белков (ионообменная, адсорбци онная, аффинная хроматография, электрофорез, изозлектрофокуси рование, иммунодиффузионный и иммуноферментный анализ).

Результат исследования.

В настоящем исследовании изучена зависимость увеличена концентрации нейтрофильных белков в плазме крови больных, one рированных в условиях ПК, от следующих факторов:

- длительности ИК,

- типа используемого оксигенатора,

- качества переливаемой донорской крови,

- фармакологических препаратов, используемых во время операци (кортикостероидов, ингибиторов протеиназ, инсулина),

- характера основного заболевания.

В какдсм случае группы больных для исследования формиро вали таким образом, чтобы исключить вариабельность всех други факторов, кроме исследуемого.

При операции аорто- и маммарокоронарного шунтирования : больных ишемической болезнью сердца (ИБС)(п=22) обнаружено,чт< уровни ЛТаГ в плазме крови больных через 24 часа после опера ции при использовании мембранных оксигенаторов ("Maxima", Ита лия) достоверно"превышали плазменные уровни ЛТаГ при использо вании пузырьковых оксигенаторов ("Dldeco", Италия; "Brasile" Бразилия) и составляли соответственно 28.7+/-3.8 мг/л ;

- И -

18.3+/-3.3 мг/л (рис.1). Концентрация ЛТаГ в плазме крови обеих групп больных до операции составляла 2.8+/-0.5 мг/л, в плазме крови здоровых доноров 2.2+/-0.3 мг/л. По-видимому, более высокая концентрация ЛТаГ отражает активацию нейтрофилов на поверхности мембран при операции.

40

35

зо

25

20

15

Концентрация ЛТАГ, ыг/л (1 сутки)

10

*

* Ж

д

-А-

А д А

Пузырьковые Мембранные

Тип оксигенатора

Рис. 1. Влияние типа оксигенатора на уровни ЛТаГ в плазме крови больных после операции в условиях ИК.

При разработке и апробации материалов мембран, наименее агрессивных в отношении активации нейтрофилов, необходимо наличие теста, позволяющего адекватно оценивать этот процесс у каждого больного. С этой целью макет быть использован тест на ЛТаГ, который является быстрым, количественным и патогенетически обоснованным.

Установлено, что уровни ЛТаГ в плазме крови кардиохирур-

гических больных при операции положительно коррелируют с длительностью ИК. При длительности ИК более 120 мин.(ИБС, оксигенатор "Dideco", п=13) концентрация ЛТаГ в плазме крови больны в конце операции и через 24 ч. после операции составлял; 23.8+/-2.6 и 18.2+/-2.1 мг/л соответственно. При длительност] ИК менее 120 мин..(п=10) плазменные уровни ЛТаГ были достовер® ниже и составляли в те же временные интервалы соответствен» 9.1+/-1.6 и 11.6+/-1.4 мг/л. Увеличение концентрации ЛТаГ npi увеличении длительности ИК также свидетельствует о более интенсивной активации нейтрофилов и о возрастании риска возникновения нарушений гомеостаза и постоперационных осложнений.

Длительность ИК является вынужденным фактором. Полученны< нами результаты являются патогенетическим обоснованием необходимости использования препаратов или условий, способствующие снижению активации нейтрофилов при длительных операциях.

Операция в условиях ИК, как правило, сопровождается введ нием больному больших объемов донорской крови в составе перфу-зата. Качественный состав используемой донорской крови част« является неоднородным по причине различных условий хранения i консервации. Некоторые образцы донорской крови 1-3 суток хра нениямогут содержать большое количество гранулоцитарных белков, в частности, -ЛТаГ. На рис.2 представлена корреляци: уровней ЛТаГ У больных при операции в условиях ИК с уровням] ЛТаГ в донорской крови и перфузате. При использовании доноре кой крови с нормальным содержанием ЛТаГ (2.3+/-0.3 мг/л) концентрация этого белка в плазме крови больных в конце ИК и -: конце операции составляла 4.1+/-0.4 и 4.8+/-0.6 мг/л соответс твенно (рис.2А). Переливание донорской крови с повышенным со держанием ЛТаГ (6.9+/-0.8 мг/л) приводило к резкому увеличени уровней этого белка в плазме крови больных в конце ИК и в кон це операции до 7.7+/-1.2 и 12.9+/-2.3 мг/л соответствен»

Концентрация ЛТаГ, мг/л

Рис.2. Корреляция уровней ЛТаГ в плазме крови больных при 1ерации в условиях ИК с уровнями ЛТаГ з донорской крови (1) и зрфузат (2).

(рис.2Б). При этом исходная концентрация*ЛТаГ в плазме крови больных обеих групп до операции составляла менее 2.3 мг/л.

Определение концентрации ЛТаГ в образцах крови. . предназначенной для использования во время операции, позволяет отбирать и исключать образцы крови, которые могут иметь неблагоприятное прогностическое значение из-за возникновения дополнительных постоперационных нарушений гомеостаза.

Динамика ЛТаГ зависит от характера основного заболевания кардиохирургических больных, оперируемых в условиях ИК. Уровни ЛТаГ в плазме крови больных в конце операции были достоверно выше у больных с ИБС (20.3+/-3.5 мг/л), чем у больных с ревматическими пороками сердца (6.1+/-1.8 мг/л). Это различие мсжет быть обусловлено различной степенью активации нейтрофилов при ИБС и ревматизме. Полученные результаты показывают, что степень. активации нейтрофилов в условиях ИК определяется не только внешними факторами (чужеродными поверхностями, типом оксигенатора и длительностью ИК), но и физиологическим состоянием клеток. Вероятно, вследствие постоянных аутоиммунных атак при ревматизме изменяется состояние рецепторного аппарата нейтрофилов и снижается способность клеток реагировать на внешние сигналы. Допустимо предположить, что введение одних и тех же групп фармакологических препаратов во время операции может оказывать разный терапевтический эффект на больных с ИБС и ревматизмом. Использование теста на ЛТаГ позволяет адекватно оценить влияние различных фармакологических препаратов на процесс активации нейтрофилов у разных больных.

Использование фармакологических препаратов при операции в условиях ИК связано, как правило, с профилактикой осложнений и поддержанием гомеостаза организма. Применение препаратов кортикостероидов основано на том. что они предотвращают разви-

тие воспалительных явлений в ответ на действие различных этиологических факторов, тормозят приток нейтрофилов к месту воспаления и снижают их адгезию на эндотелии сосудов.

Кортикостероиды (метилпреднизолон, МП), -вызывают избирательную секрецию нейтрофильных белков, зависящую от дозы препарата. Так, введение МП во время ИК сопровождалось увеличением уровней ЛТаГ и увеличением активности нейтрофильной эласта-зы в плазме крови больных.

40 35 30 25 20 15 10 5 О

До опер. В iocs. ИХ Конец ИК Конец опер. 24 часе 48 часов (

Рис. 3. Влияние метилпреднизолона на динамику уровней ЛТаГ в плазме крови больных, оперированных в условиях ИК.

Как видно из рис.3, при введении во время операции МП в дозе>300 мг уровни ЛТаГ в плазме крови больных в конце операции, а также через 24 и 48 ч. достоверно превышали уровни ЛТаГ при дозах МП<300 мг и составляли 16.3+/-3.8; 21.6+/-4.2 и

Концентрация ЛТаГ, мг/ л

33.7+/-3.9 мг/л соответственно. В случае введения доз Ш<300 мг уровни ЛТаГ на тех же этапах исследования составляли 8.7+/-2.Б, 9.4+/-2.3 и 18.1+/-3.7 мг/л соответственно. Динамика уровней С-реактивного белка в плазме крови больных носила стабильный характер и не зависела от дозы МП.

Результаты настоящего исследования показывают, что использование во время операции доз МП > 300 мг приводит к значительному усилению активации нейтрофилов, аналогично тому, которое имеет место при обострении инфекционного процесса. Доза МП<300 мг является более оптимальной в этом отношении.

В результате проведенного исследования установлено,что введение инсулина во время операции в условиях ИК вызывает снижение уровней ЛТаГ после операции и уменьшение активности нейтрофильной эластазы в плазме крови больных, зависящее от дозы препарата. При введении доз инсулина <200 мг и >200 мг концентрация ЛТаГ в плазме крови больных через 24 ч. после операции составляла 16.8+/-2.5 и 11.2+/-1.8 мг/л соответственно. Эффект препарата является дозозависимым.

Эти рерульгаты следует учитывать как при подборе доз отдельных препаратов,так и при их сочетании. Однако сочетаннае влияние различных препаратов порой оценить трудно из-за отсутствия объективного критерия их влияния на гранулоциты.

Тест на ЛТаГ позволяет надежно выявлять эффект влияния фармакологических препаратов на процесс активации нейтрофилов у каждого конкретного больного, й на этой основе может осуществляться индивидуальный научно-обоснованный подбор оптимальных доз и схем введения препаратов.

Роль нейтрофилов в развитии нарушений гемостаза и дыхания при операции в условиях ИК неразрывно связана с действием нейтрофильной эластазы (НЭ) - одного из самых агрессивных ферментов человеческого организма, разрушающего легочный эндоте-

лий, компоненты свертывающей системы крови и многие другие биологические субстраты. В целях нейтрализации разрушительного действия НЭ используют различные препараты ингибиторов протеи-наз. Однако единая научно-обоснованная схема введения этих препаратов пока не разработана. В связи с этим, исследование, связанное с подбором и оптимизацией схем применения препаратов ингибиторов протеиназ при операции в условиях Ж. включало изучение активности НЭ.

Вначале были выявлены закономерности динамики активности НЭ без применения препаратов ингибиторов протеиназ при операции в условиях Ж. Активность НЭ в плазме крови кардиохирурги-ческих больных (п=5) (рис.4А) резко возрастает в интервале ИК от 16.5+/- 5.2 мкмоль/(ч*мл) до 33.4+/-6.0 мкмолъ/(ч*мл), а к концу операции постепенно снижается до 31.5+/-5.2 мкмоль/(ч*мл), что согласуется с данными, полученными другими авторами (Butler J.. 1993; Kawamura Т., 1993; Seghaye И.С., 1994).

Динамика активности плазменных ингибиторов нейтрофильной эластазы в крови больных (п=12)(рис.4Б) носит противоположный характер: активность ингибиторов существенно снижается в интервале ИК - от 8.1+/-1.7 до 4.8+/-1.4 моль/(ч*мл) и начинает увеличиваться к концу операции (5.8+/-1.5 моль/(ч*мл)).

Этот факт обменяет усиление повреждающего действия НЭ во время ИК и служит патогенетическим обоснованием применения фармакологических препаратов ингибиторов протеиназ для профилактики развития нарушений, обусловленных активацией грануло-цитов и повышенным протеолизом. Кроме того, полученные результаты могут служить объективным критерием для выбора оптимальной схемы применения препаратов ингибиторов протеиназ.

Активность НЭ, икмоль/(ч*мл)

До опер. 5 кия. ИК Конец ИК Конец опер. Активность ингибиторов НЭ, моль/(ч*мл)

24 часа

До опер. б мжн. ИК Ковец ИК Конец опер. Й4 часа

Рис. 4. Динамика активности нейтрофильной эластазы (А) и ее и: гибиторов (Б) в плазме крови больных при операции в условиях ]

ао

25

20

15

10

До опер. б ш ИК Комц ИХ Конец опер. 84 чесе

Рис. 5. Влияние препаратов ингибиторов протеиназ (Гор-докс, Трасилол, Контрикал) на динамику активности нейтрофиль-ной эластазы в плазме крови больных при операции в условиях ИК.

Как видно из рис.5. введение больным (п=10) препаратов гордоюса, трасилола или контрикала перед началом ИК было действительно эффективно и приводило к снижению активности нейтро-фильной зластазы в плазме крови больных в период ИК с 23.3+/-2.5 до 16.9+/-1.7 мкмоль/(ч*мл). Введение препаратов ингибиторов во время ИК и перед концом операции не было эффективным.

Результаты настоящей работы позволяют обосновать оптимальную схему применения препаратов ингибиторов протеиназ, которая подразумевает их введение именно перед началом ИК, т.к. в этом случае можно получить наилучший эффект в отношении снижения активности НЭ и профилактики осложнений.

Активность НЭ, ыкмоль/(ч*мл)

{уу] - период ИК

- введение ингибиторов

Однако использованный нами в данном фрагменте работы тест по определению активности НЭ является очень трудоемким, приемлемым для научных исследований и малопригодным для широкой клинической практики.

Установлено, что существует положительная корреляция ыезг-ду активностью НЭ и уровнями ЛТаГв плазме крови больных при операции в условиях ИК (рис.6).

Активность НЭ. налога/Гч*шг) Ксшцодтраша ЛТаГ. иг/л

До опер. б хин. ИК Конец ИК Конец опер. 24 часа

Рис. 6. Сравнительная динамика уровней ЛТаГ и активности нейтрофильной эластазы в плазме крови кардиохирургических больных, оперированных в условиях ИК.

Уровни ЛТаГ в интервале "начало ИК - конец операции" возрастали от 2.5+/-0.8 мг/л до 20.1+/- 4.3 мг/л. Активность НЭ увеличивалась от 22.5+/-2.3 ыкмоль/(ч*мл) до 42.3+/-3.8 мкмоль/(ч*шО. Максимальные значения обоих параметров прихо-

дятся на ганец операции - 1 сутки после операции, . что может быть обусловлено сходной кинетикой секреции обоих белков. Присутствие ЛТаГ в больших концентрациях в плазме крови больного может свидетельствовать и о наличии эластазы нейтрофилов. В то же время, тест на НЭ может быть адекватно заменен тестом на ЛТаГ, который является более простым и быстрым, но, вместе с тем, количественным и патогенетически обоснованным.

На основании полученных результатов можно с уверенностью утверждать, что тест на ЛТаГ является надежным и объективным для диагностики функционального состояния нейтрофилов, и может лбыть использован для подбора оптимальных схем лечения.

Для практического использования теста на ЛТаГ в клинических исследованиях, а также для получения физико-химической характеристики ЛТаГ и выяснения его патогенетической роли при операции в условиях ИК необходимо было получение очищенного препарата ЛТаГ.

Были разработаны способы выделения ЛТаГ из гнойно-некротических масс и экссудатов (плевральных и перитонеальных), т.к. именно в этом материале ЛТаГ присутствует в наибольшей концентрации. На рис.7, представлена схема выделения ЛТаГ из экссудатов. Посредством сочетания методов солевого осаждения, адсорбционной хроматографии, диализа и иммуносорбции был получен злектрофоретически гомогенный и иммунохимически чистый препарат ЛТаГ (рис.8). Полученный препарат представляет собой анионный белок с р1=5.2- 5.5 и молекулярной массой 90+/-5 кД.

- 22 -i. экссудат

Высаливание белков (N114)2804 60% насыщения, Центрифугирование: 8000 20 мин

Осадок

I

Диализ (0,02 М ФСБ / 0,15 М МаС1, рН 7.4)

и

II. адсорбционная хроматография (А12Оз, 0,02 М ФСБ, рН 7,2 - элющш 1,5 М Ка2НР04)

Диализ:

| ОД М Ш-ацетатный буфер / 0,15 М ИаС1, рН 4,0, рН 5,0; Центрифугирование: 8000 g, 20 мин.

Осадок

4-

Диализ (0,02 М ФСБ / 0,15 М КаС1, рН 7.2 - 7.4)

И

III. Аффинная хроматография: 1) Анти-ЛТаГ - БерЬагозе 4В; 2) Анти-ЛТаГ - МПС - ПА (колонка 12x1,0 см) 0,02 М ФСБ / 0,15 М ИаС!, рН 7.2

4.

Диализ: 0,01 М ФСБ, рН 7.4

4

Концентрирование (Полиэтиленгликоль ПЭГ - 35 000)

и

IV. Лиофилизация

и

ПРЕПАРАТ ЛТаГ.

Рис. 7. Схема выделения лейкоцитарного термостабильногс альфа-гликопротеина из экссудатов.

Б

Рис. 8. Изоэлектрофореграмма (А) и иммунозлектрофореграч-ма (Б) препарата ЖГзГ(±). ( ¿-маркеры МЭФ, рГ3,5-9,$).

Выделенный препарат ЛТаГ был использован в дальнейшем для получения моноспецифичексой сыворотки и антител против ЛТаГ. При проведении серии экспериментов на основе твердофазного им-муноферментного анализа удалось установить, что ЛТаГ может связываться с эластазой нейтрофилов. Образующаяся связь достаточно прочная, она разрушается при рН 2.4. В то же время, ЛТаГ не ингибирует активность фермента.

Полученные результаты позволяют предположить, что ЛТаГ не является ингибитором нейтральных протеиназ. С другой стороны, свойство ЛТаГ связываться с НЭ продемонстрировано нами при помощи различных методических подходов, анализ результатов которых показывает, что это свойство не является артефактом. Допустимо предположить, что ЛТаГ может оказывать регулирующее влияние на активность эластазы нейтрофилов. Возможно также.

. ■ -А

Щ-

ш

что ЛТаГ выполняет роль белка-переносчика для НЭ. Возможная патогенетическая роль ЛТаГ в развитии нарушений гомеостаза при операции в условиях ИК состоит в том, что комплексе с эласта-зой нейтрофилов ЛТаГ может принимать участие в развитии целого ряда патологических реакций, лежащих в основе патогенеза повреждения тканей и изменения активности протеолитических каскадных систем крови. ЛТаГ является надежным маркером активации нейтрофилов, поэтому изменение уровней ЛТаГ в плазме крови больного может отражать развитие системной воспалительной реакции в ответ на ИК.

Результаты настоящей работы показывают, что исследование уровней ЛТаГ в плазме крови кардиохирургических больных позволяет объективно оценивать влияние различных интраоперационных факторов на процесс активации нейтрофилов. Использование теста на ЛТаГ при разработке новых гемосовместимых поверхностей и оксигенаторов, при отборе образцов донорской крови, имеющих .неблагоприятное прогностическое значение, а также при разработке оптимальных схем введения известных и апробации новых фармакологических препаратов позволит предотвратить процесс усиления активации гранулоцитов, а, следовательно, уменьшить риск возникновения постоперационных осложнений. ЛТаГ образует комплекс с эластазой нейтрофилов, который может участвовать в патогенезе нарушений при ИК. Полученный очищенный препарат этого белка может быть использован для создания лабораторных диагностикумов, а также для более глубокого изучения биологического и патогенетического значения ЛТаГ.

ВЫВОДЫ

1. При операции в условиях ИК наблюдается значительное увеличение концентрации специфического цитоплазматического белка нейтрофилов - лейкоцитарного термостабильного а-гликоп-ротеида (ЛТаГ) в плазме крови кардиохирургических больных (от 2.5+/-0.4 до 25.8+/-3.2 мг/л), что отражает активацию нейтро-филов. Максимальные значения концентрации ЛТаГ наблюдаются в первые сутки после операции.

2. Продукция ЛТаГ в плазму крови кардиохирургических больных коррелирует с длительностью ИК и зависит от типа оксигенатора. Уровни ЛТаГ при использовании мембранных оксигенаторов выше (28.7+/-3.8 мг/л). чем при использовании пузырьковых оксигенаторов (18.3+/-3.3 мг/л), что может отражать усиление активации нейтрофилов на поверхности мембран.

3. Использование во время операции донорской крови с повышенным содержанием ЛТаГ (>5 мг/л) приводит к более значительному увеличению концентрации ЛТаГ в плазме крови больных к концу операции до 12.9+/-2.3 мг/л. чем использование образцов с концентрацией ЛТаГ <5 мг/л (6.9+/-0.8 мг/л). Тестирование донорской крови до операции на содержание ЛТаГ позволяет отбирать образцы, имеющие неблагоприятное прогностическое значение.

4. Уровень ЛТаГ в плазме крови больного зависит от влияния лекарственных препаратов, вводимых при операции. Кортикос-героиды (метилпреднизолон) вызывают дозозависимое увеличение, а введение инсулина - уменьшение концентрации ЛТаГ и активности нейтрофильной эластазы в плазме крови больных после опера-

ции. При использовании ыетилпреднизолона в дозах, превышающих 300 мг, концентрация ЛТаГ составляет 21.6+/-4.2 мг/л, а при использовании меньших доз - 9.4+/-2.3 мг/л.

5. Активность нейтрофильной зластазы в плазме крови больных, увеличивается в процессе ИК (от 16.5+/-5.2 до 33.4+/-6.0 мкмоль/(ч*мл)) при уменьшении активности естественных ингибиторов протеиназ. Использование теста на белки гранулоцитов (нейтрофильную зластазу и ЛТаГ) при операции позволяет обосновать оптимальные схемы введения препаратов ингибиторов протеиназ. Введение препаратов ингибиторов протеиназ (гордокс, тра-силол, контрикал) целесообразно и эффективно перед началом ИК.

6. Выявлена положительная корреляция между уровнями ЛТаГ и активностью нейтрофильной эластазы в плазме крови больных при операции в условиях ИК. Для оценки активации нейтрофильных гранулоцитов тест на нейтрофильную зластазу может быть заменен определением концентрации ЛТаГ в плазме крови больных во время и после ИК.

7. Разработан способ выделения ЛТаГ, позволяющий получить электрофоретически гомогенный и иммунохимически чистый препарат ЛТаГ. Выделенная фракция ЛТаГ является анионным белком с pl 5.2-5.5 и mojí.массой 90+/-5 кД.

8. Установлено, что ЛТаГ обладает способностью прочно связываться с нейтрофильной эластазой - основным медиатором повреждения тканей, в присутствии ЛТаГ не ингибируется активность фермента. Предполагается совместное участие ЛТаГ и нейтрофильной эластазы в развитии общей воспалительной реакции организма в ответ на ИК. '

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

/

- Тест на ЛТаГ рекомендуется использовать при разработке материалов для экстракорпоральной гемоперфузии и оксигенаторов, наименее агрессивных в отношении активации нейтрофилов.

- Определение ЛТаГ в плазме крови больных целесообразно • использовать при операции в условиях ИК при апробации новых и оптимизации схем введения-известных фармакологических препаратов.

- Донорскую кровь, используемую во время операции, следует предварительно тестировать на содержание ЛТаГ. Образцы крови с концентрациями ЛТаГ выше 5 мг/л использовать не рекомендуется из-за возможного возникновения дополнительных нарушений гомеостаза.

- Препараты ингибиторов протеиназ (гордокс, трасилол, контри-кал) целесообразно вводить больным перед началом ИК, т.к. в этом случае они являются эффективными в отношении замещения развивающегося при искусственном кровообращении преходящего, дефицита естественных ингибиторов протеиназ.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. ИМмунохимическая идентификация и физико-химическая характеристика специфического альфа-2-глобулина гранулоцитов человека. БЮлл.эксп.биол. и мед., 1990, N4, с. 353-355 (в соавт. с О.П. Шевченко, А.Г. Меркуловым, Ю.С. Татариновым).

2. Количественный иммуноферментный анализ (ИФА) белков гранулоцитов в плазме крови. Тезисы V Российского съезда специалистов по лабораторной диагностике. Москва, 1995, с. 307-308 (в соазт. с Т.И. Мартыновой, Д.Д. Петруниным, О.П. Шевченко).

3. Development of ELISA and measurement of plasma levels of granulocytes proteins in healthy donors and In patients with autoimmune diseases. In: Abstracts of XI IFCC European Congress of Clinical Chemistry, Tampere, 1995, p.38. (в соавт. с О.П. Шевченко, Т.Н. Мартыновой, В.И. Шумаковым).

4. Plasma concentration of main granulocyte proteins during cardiopulmonary bypass and in patients with autoimmune diseases. In: Abstracts of XVI International Congress of Clinical Chemistry, London, 1996, p.203 (в соавт. с О.П. Шевченко, Л.В. Макаровой).

5. Neutrophil activation during cardiopulmonary, bypass, the influence of the Intraoperative infusion with methylpred-nizolone. In: Abstracts of XVI International Congress of Clinical Chemistry, London. 1996, p. 139 (в соавт. с О.П. Шевченко, И.А. Козловым. А.О. Шевченко).

Способ получения лейкоцитарного термостабильного альфаг-ликопротеида. Авторское свидетельство N 1665569, 1990.

Рацяонадггзаторсзшэ прадкокэикэ

Набор реактивов "Диз-тест" и способ его применения. (Р/П

N 11/89 НШТиИО от 28.05.89).