Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Активация нейтрофилов в условиях экстракорпорального кровообращения

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

На правах рукописи УДК 616.155.34+616-77:612.1

Чиликина Галина Валерьевна

АКТИВАЦИЯ НЕЙТРОФИЛОВ В УСЛОВИЯХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ : ПРОГНОЗИРОВАНИЕ, КОРРЕКЦИЯ, МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ

14.00.41 - трансплантология и искусственные органы

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

академик АН и РАМН

В.И. Шумаков.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

О.П. Шевченко.

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................. 5

Гпава 1. Механизмы возникновения осложнений после

экстракорпоральной гемоциркуляции и пути их коррекции (Обзор литературы)........................................... 10

1.1. Нарушения гомеостаза при экстракорпоральном кровообращении

и роль нейтрофильных гранулоцитов в их возникновении............. 11

1.2. Взаимодействие клеток и белков плазмы крови с чужеродной поверхностью и влияние образующегося белкового слоя............... 20

1.3. Пути коррекции нарушений гомеостаза, связанных с экстракорпоральным кровообращением........................................... 30

1.4. Заключение......................................................................................... 37

Глава 2. Материал и методы исследования..................................... 38

2.1. Характеристика больных и исследуемого материала...................... 38

2.2. Методика определения белков, адсорбируемых на поверхности полимеров............................................................................................. 42

2.3. Определение концентрации белка..........................................................................................................43

2.4. Методы иммунохимического анализа..................................................................................................44

2.5. Определение активности НЭ..............................................................................................................................45

2.6. Методы фракционирования белков......................................................................................................46

2.7. Методика нанесения белкового слоя на поверхность ПВХ............................49

2.8. Вспомогательные реактивы и буферные смеси................................................................51

2.9. Статистическая обработка результатов исследований........................................52

Глава 3. Исследование белков плазмы и клеток при контакте крови здорового человека с поверхностью синтетических материалов................................................. 53

3.1. Оптимизация методики определения белков, адсорбируемых из крови при контакте............................................................................... 53

3.2. Изучение адсорбции белков нейтрофилов на поверхность ПВХ..... 58

3.3. Идентификация белков плазмы крови в элюатах после

взаимодействия крови здорового человека с поверхностью ПВХ... 64

Гпава 4. Исследование взаимодействия с полимерной

поверхностью белков плазмы и нейтрофилов из крови больных, оперированных в условиях искуственного кровообращения.......................................... 67

4.1. Изучение адсорбции белков плазмы и нейтрофилов из крови больных, оперированных в условиях ИК, на поверхность синтетических материалов медицинского назначения...................... 67

4.2. Изучение реактивности нейтрофилов у кардиохирургических больных до и после операции в условиях ЭК................................... 73

Гпава 5. Изучение влияния белкового покрытия поверхности

на адсорбцию белков плазмы и клеток крови................... 89

5.1. Оптимизация условий нанесения белкового покрытия на поверхность ПВХ.................................................................................. 89

5.2. Изучение взаимодействия белков нейтрофилов с иммуноглобулином в, альбумином, лактоферрином и белками молозива человека, предадсорбированными на поверхности ПВХ................. 98

5.3. Изучение влияния предадсорбированного белкового слоя на адсорбцию белков плазмы крови на поверхность ПВХ.................... 106

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................112

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................................................................................................127

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ....................................................................................................................129

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................................................130

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ик искусственное кровообращение

вк вспомогательное кровообращение

ЭК(ЭГ) - экстракорпоральное кровообращение /гемоциркуляция

пмн полиморфноядерный нейтрофильный лейкоцит

нэ нейтрофильная эластаза (эластаза нейтрофилов)

ЛФ лактоферрин

ЛТаГ - лейкоцитарный термостабильный альфа-гликопротеид

МПО - миелопероксидаза

СРВ С-реактивный белок

оиИП - а-|-ингибитор протеиназ, агантитрипсин

а2МГ а2-макроглобулин

ВМК высокомолекулярный кининоген

|дО иммуноглобулин в

|дА иммуноглобулин А

1дМ иммуноглобулин М

ИБС ишемическая болезнь сердца

ДКМП - дилятационная кардиомиопатия

нк недостаточность кровообращения

ФК функциональный класс

АКШ аортокоронарное шунтирование

мкш маммарокоронарное шунтирование

лжо - левожелудочковый обход

ФСБ фосфатно-солевой буфер

БМ фракция белков молозива человека

БК фракция казеинов молозива человека

ПВХ - поливинилхлорид

Ал-ПВХ - альбумин, иммобилизованный на поливинилхлориде

1дС-ПВХ- иммуноглобулин в, иммобилизованный на

поливинилхлориде (ПВХ)

Лф-ПВХ - лактоферрин, иммобилизованный на ПВХ

БМ-ПВХ - фракция белков молозива человека,

иммобилизованная на ПВХ

БК-ПВХ - фракция казеинов молозива человека,

иммобилизованная на ПВХ

Введение

Актуальность проблемы:

Разработка и совершенствование искусственного кровообращения (ИК) и различных вариантов вспомогательной перфузии является одним из необходимых условий развития современной кардиохирургии и трансплантологии.

При экстракорпоральной гемоциркуляции происходит секвестрация гра-нулоцитов в легких и активация нейтрофилов, сопровождающаяся выбросом цитоплазматических компонентов в плазму крови. Инициация большинства патологических реакций, развивающихся при гемодиализе и у кар-диохирургических больных, оперированных в условиях ИК, происходит при контакте крови с поверхностью чужеродных материалов (Craddock P.R., 1977, Westaby S., 1986, Moat N., 1993). Кроме того, продукты активации защитных каскадных систем организма - комплемента, коагуляции и фибрино-лиза (Kirklin J.К., 1983), активирующихся при операциях с использованием ИК, влияют на нейтрофильные гранулоциты так же, как это имеет место при острой бактериальной инфекции, массивной травме и др. (Antonsen S., 1987). В результате развивается дисфункция жизненно важных органов: легких, сердца, почек, тяжесть поражения которых может определять прогноз и опасность летального исхода после операции на открытом сердце (Hävernanп К., 1984, Hibbs М., 1984).

Активированные нейтрофилы и выделяемые ими вещества играют важную роль в развитии респираторного дистресс-синдрома у взрослых (Westaby S., 1986, McGuire W., 1987), реперфузионной аритмии, местных нарушений коагуляции (Gustafson Е., 1987), повреждений соединительной ткани (Elliott М., 1993, Korthuis R., 1994), а также в развитии синдрома, известного как "системная воспалительная реакция организма после И К" (Gallin J.I., 1984). Поэтому патогенетические факторы, действующие в условиях вспомогательного кровообращения, методы их оценки и коррекции, как

и клинические последствия этих процессов стали предметом многочисленных исследований последнего десятилетия.

Сформированная в последние годы концепция развития острой воспалительной реакции и ряда других осложнений после ИК отводит нейтро-фильным гранулоцитам одну из основных ролей в патогенезе возникающих осложнений (Wachtfogel Y., 1987, Butler J., 1993). Нейтрофилы одновременно участвуют в запуске сразу нескольких реакций. Неоспоримым фактом является взаимодействие нейтрофилов с системой комплемента, а через нее -с системой неспецифического иммунного ответа (Craddock P.R., 1977, Kirklin J.К., 1983, Antonsen S., 1987), что приводит к развитию общей воспалительной реакции на ИК. Взаимодействие активированных гранулоцитов с системой контактной активации коагуляции (Gustafson Е., Colman R., 1987) играет важную роль в поражении сердечно-сосудистой системы. Адгезия нейтрофилов на легочном эндотелии (Davies S.H/., 1993, Finn А., 1993) приводит к возникновению выгготного легочного отека, нарушениям дыхания, и, как следствие - к развитию респираторного дистресс-синдрома у взрослых.

Для уменьшения негативных последствий активации нейтрофилов при операциях в условиях ИК в клинической практике используют:

• фармакокоррекцию систем гемостаза, протеиназно-ингибиторного баланса;

• специальные фильтры для удаления лейкоцитов и агрессивных продуктов их активации из кровотока;

• контроль и селекцию донорской крови;

• модификацию синтетических полимеров в целях уменьшения реакции крови на контакт с ними.

В рамках последнего направления разрабатывается два пути. Первый из них - технологический - предполагает разработку и создание новых совместимых с кровью искусственных материалов (Leonard E.F., 1987, Bale M.D., 1989, Anderson J.M., 1990); второй - биологический - основан на модификации синтетических материалов белками человека в целях уменьшения

реакции крови на контакт с чужеродной поверхностью (Emoto И., 1987, Sevastianov V.l., 1988, Videm V., 1991, Tang L., 1993).

Однако, для успешной разработки методов коррекции повреждающего действия нейтрофилов недостаточно изучены механизмы активации этих клеток в условиях экстракорпорального кровообращения (ЭК); кроме того, недостаточно разработаны специфические лабораторные методы для количественной оценки этого сложного процесса.

Цель работы:

изучить взаимодействие белков нейтрофилов и плазмы крови с поверхностью синтетических материалов, используемых при экстракорпоральном кровообращении, и разработать способы оценки, прогнозирования и коррекции активации нейтрофилов при ЭК.

Задачи:

1. Провести сравнительный анализ взаимодействия белков плазмы и клеток

крови здорового человека с поверхностью синтетических материалов, используемых при ЭК.

2. Изучить особенности взаимодействия с чужеродной поверхностью белков

нейтрофилов и плазмы крови больных, оперированных в условиях И К.

3. Оценить динамику активации нейтрофилов при операции в условиях ИК и

при вспомогательном кровообращении.

4. Провести сравнительный анализ взаимодействия белков нейтрофилов и плазмы крови с альбумином, иммуноглобулином G, лактоферрином и белками молозива человека, предадсорбированными на поверхности ПВХ.

5. Выделить и охарактеризовать фракцию белков молозива человека, позволяющую при иммобилизации на поверхность уменьшить активацию нейтрофилов в условиях экстракорпорального кровообращения.

6. Оценить эффективность коррекции активации нейтрофилов при ЭК в зависимости от типа реактивности этих клеток.

Научная новизна работы:

Установлен факт избирательной адсорбции белков, выделяющихся при активации нейтрофилов на поверхности синтетических материалов, используемых при ЭК. Обнаружено, что активность эластазы нейтрофилов и концентрация лейкоцитарного термостабильного а-гликопротеина в элюатах с поверхности отражает способность нейтрофилов к активации при ЭК, обозначаемую в настоящей работе термином реактивность. Реактивность нейтрофилов носит индивидуальный характер: выделено две группы - с высокой и низкой реактивностью.

Тип реактивности нейтрофилов не зависит от основного заболевания и не изменяется после операции в условиях ИК. Показано, что определение типа реактивности до операции в условиях ИК позволяет прогнозировать выброс и повреждающее действие нейтрофильных компонентов в раннем (до 7 суток) послеоперационном периоде.

С использованием белковых покрытий, иммобилизованных на поверхности ПВХ, обоснован способ коррекции повреждающего действия нейтрофилов путем уменьшения активации этих клеток при контакте с синтетическими материалами, используемыми при ЭК. Выделена и охарактеризована фракция белков молозива человека, иммобилизация которой на поверхности ПВХ в наибольшей степени снижала активацию и выброс компонентов нейтрофилов на поверхности.

Установлено, что возможность уменьшения активации нейтрофилов на белковых покрытиях зависит от индивидуальной реактивности этих клеток: наиболее эффективна коррекция в группе с высокой реактивностью нейтрофилов.

Практическая значимость работы:

Определение типа реактивности нейтрофилов у больных до операции в условиях ИК позволяет прогнозировать активацию и выброс нейтрофильных компонентов после операции, что дает возможность осуществлять индивидуальный подход к профилактике и коррекции осложнений, связанных с активацией нейтрофилов при ИК.

Мониторинг реактивности нейтрофилов при длительном вспомогательном кровообращении позволяет оценивать риск возникновения осложнений, связанных с истощением нейтрофильного звена неспецифического иммунного ответа.

Определение концентрации нейтрофильных белков в элюатах после контакта крови с чужеродной поверхностью может служить объективным количественным тестом для оценки синтетических материалов, предназначенных для использования при экстракорпоральном кровообращении.

Модификация поверхности ПВХ фракцией белков молозива человека позволяет проводить превентивную коррекцию активации нейтрофилов на поверхности и снизить риск возникновения осложнений, связанных с этим феноменом.

Глава 1. Механизмы возникновения осложнений после экстракорпоральной гемоциркуляции и пути их коррекции (обзор литературы)

Методы экстракорпоральной гемоциркуляции в настоящее время получили широкое распространение в хирургической практике, разработка и совершенствование искусственного (ИК) и вспомогательного (ВК) кровообращения является одним из необходимых условий развития современной кардиохирургии и трансплантологии.

Все методы экстракорпоральной гемоперфузии оказывают сильное воздействие на нейтрофилы, вызывая их активацию. Согласно современным представлениям, при экстракорпоральной гемоциркуляции происходит секвестрация гранулоцитов в легких и активация нейтрофилов, сопровождающаяся выбросом цитоплазматических компонентов в плазму крови. Инициация патологических реакций, которые могут развиваться при гемодиализе, вспомогательном кровообращении и у кардиохирургических больных, оперированных в условиях И К, происходит при контакте крови с поверхностью чужеродных материалов (78, 195) и активации ряда важнейших каскадных процессов: активации комплемента, коагуляции и фибринолиза (132).

Процесс активации нейтрофилов и секреции в плазму крови больного специфических нейтрофильных белков является ведущим звеном в патогенезе острой воспалительной реакции организма на искусственное кровообращение (16, 28, 69, 94, 148). Следствием активации нейтрофилов может быть развитие дисфункции легких, сердца, почек, что ухудшает прогноз и повышает опасность летального исхода после операции на открытом сердце (4, 110, 114). Поэтому патогенетические факторы, методы их оценки и коррекции, стали предметом многочисленных исследований последнего десятилетия.

1.1. Нарушения гомеостаза при экстракорпоральном

кровообращении и роль нейтрофильных гранулоцитов в их возникновении

Основными клиническими проявлениями нарушений гомеостаза после экстракопорального кровообращения являются сердечно-легочная дисфункция, местные нарушения коагуляции и развитие комплексной воспалительной реакции организма на ИК.

Форма острой дыхательной недостаточности, известная как острый респираторный дистресс-синдром у взрослых, может развиваться в процессе лечения с применением гемодиализа, лейкоцитафереза на нейлоновых фильтрах, при операции в условиях искусственного кровообращения (30, 195, 200), вследствие контакта крови с синтетическими чужеродными поверхностями. Основными проявлениями являются диффузные повреждения межальвеолярных перегородок и выпотной легочный отек (21 о), причем медиаторами этого синдрома являются полинукпеарные лейкоциты (нейтрофилы) и продуцируемые ими протеолитические ферменты. Инициация воспалительной реакции происходит в результате активации нейтрофи-лов при контакте с чужеродной поверхностью и адгезии этих клеток на легочном эндотелии, приводящей к повреждению эндотелия и затем к сердечно-легочной дисфункции. Многочисленные эксперименты на животных и клинические наблюдения пациентов, оперированных в условиях ИК, подтверждают, что легочная дисфункция связана с накоплением в легких ней-трофилов (195).

В процессе экстракорпорального кровообращения в легочной сосудистой сети возникают физиологические и патофизиологические реакции на молекулярном, клеточном и органно-системном уровнях. Специфические реакции включают: системную выработку эндотелиальных эукозаноидов (простациклин, тромбоксан А2), изменение целостности легочного эндотелия, изменение сопротивления легочных сосудов, изменение газового состава капиллярно�