Автореферат и диссертация по медицине (14.01.22) на тему:Клинико-диагностическое значение определения антител к эластину и эластазе у больных ревматоидным артритом

На правах рукописи

4853668

НЕНАШЕВА Наталья Васильевна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЭЛАСТИНУ И ЭЛАСТАЗЕ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

14.01.22 — ревматология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

О 3 023 2011

Волгоград — 2011

4853668

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор ЗБОРОВСКИЙ Александр Борисович

Официальные оппоненты:

— доктор медицинских наук, профессор Куличенко Людмила Леонидовна;

— доктор медицинских наук Яльцева Наталья Викторовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится «_» февраля 2011 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава».

Автореферат разослан «_» января 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.008.02, доктор медицинских наук

А. Р. Бабаева

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани входят в число трех наиболее распространенных среди взрослой популяции России классов заболеваний, уступая место лишь болезням системы кровообращения и органов дыхания [Мазуров В. И., 2005; Фоломеева О. М. и др., 2007].

Самым частым воспалительным ревматическим заболеванием (РЗ) признан ревматоидный артрит (РА), ключевым синдромом которого является суставной. Относительный показатель заболеваемости, рассчитанный на 100 тыс. населения, с 2001 по 2005 г. увеличился на 3,6 %, достигнув значения 204,0 на 100 тыс. Ежегодно в России у 21—23 из 100 тыс. человек впервые в жизни диагностируется РА [Фоломеева О. М. и др., 2007].

Смертность от РА находится в пределах 0,17—0,22 % от общей смертности населения [Coste J. et al., 1994]. В то же время продолжительность жизни больных РА— на 10—15 лет короче ожидаемой (популяционной), а пятилетняя выживаемость при тяжелых формах болезни сопоставима с выживаемостью больных ишемической болезнью сердца с поражением трех коронарных артерий или пациентов с III—IV стадиями болезни Ходжкина [O'Dell, 2002]. Частота смерти, обусловленной инфекционными осложнениями РА (которым больные РА подвержены в результате изменения иммунной реактивности, а также в результате применения у них иммунодепрессантов) в 9 раз, осложнениями со стороны почек— в 7 раз, со стороны желудочно-кишечного тракта (связанной, в основном, с побочными эффектами нестероидных противовоспалительных средств, необходимых больным) — в 2 раза выше популяционной. Социальную значимость РА следует оценивать как с точки зрения экономических потерь государства, так и с точки зрения боли, страдания и нарастающего ухудшения качества жизни отдельного пациента [Фоломеева О. М. и др., 2007]. Через 20 лет от начала болезни примерно 90 % пациентов в большей или меньшей степени теряют трудоспособность, а треть становится полными инвалидами [Насонов Е. П., 2002; McGonagle D. et al., 2006].

«Субклинически» текущий иммунопатологический процесс развивается задолго до появления клинически очевидных признаков артрита. По данным биопсии синовиальной оболочки суставов признаки хронического синовиита выявляются уже в самом начале болезни даже в клинически не пораженных суставах. Доказано, что предотвращение структурных повреждений на ранних стадиях заболевания

з

способствует сохранению функциональной активности пациентов в долговременной перспективе ^опэзоп Т. е1 а1., 1995; Мс6опад1е й. а а!., 2006].

Однако вопрос ранней диагностики РА всерьёз вызывает затруднения у специалистов-ревматологов. Основная причина подобных трудностей — недостаточная диагностическая значимость признаков, обнаруживаемых при физикальном осмотре, рутинных лабораторных и инструментальных исследованиях.

Основным субстратом ревматических заболеваний, в частности РА, является соединительная ткань, широко представленная в организме человека. Эластин — белковый компонент соединительной ткани, который составляет основу эластических волокон, представляющих значительную часть массы сухого вещества многих органов: это и связочный аппарат, хрящевая ткань, синовиальная оболочка, легкие, крупные кровеносные сосуды, такие как аорта, клапанный аппарат сердца, кожа.

Обмен соединительнотканных структур находится в динамическом равновесии. Так, известно, что эластин, нуждающийся в обновлении, и в норме подвергается деградации под воздействием эластазы. Изменения непосредственно в самой системе «эластин-эластаза» могут быть обусловлены как чрезмерной активностью протеолитиче-ского фермента (и тогда будет наблюдаться повышенная деструкция необходимого организму эластина), так и снижением его активности (с патологическим старением эластина, перестающего осуществлять свои функции).

Согласно современным предположениям, поражение соединительной ткани при ревматоидном артрите является следствием развивающихся иммунопатологических нарушений. Нормальный обмен эластина сопровождается образованием аутоантител к эластину и эластазе, что также, по-видимому, влияет на функционирование эластических структур соединительной ткани. При ревматических заболеваниях, возможно, включаются механизмы гиперпродукции аутоантител. Это ведет к нарушению физиологического соотношения эластина и эластазы, поскольку антитела обладают способностью блокировать ферментативную активность веществ, а также непосредственно разрушать субстрат фермента.

Надо отметить, что имеющиеся в литературе сведения по изучению аутоантител к эластину [Вако 6. е1 а1., 1987] и эластазе Ра5ка1оуа М. е! а1., 1997] у больных РА не систематизированы и единичны. В то же время имеются данные о более высокой чувствительности метода иммуноферментного анализа (ИФА) с применением

иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов (ИГАП). В связи с этим представляется актуальным комплексное исследование у больных РА выше указанных антител с исследованием корреляций между их уровнями, что позволит выяснить некоторые детали патогенеза данного заболевания, будет способствовать более точной оценке активности патологического процесса и выработке усовершенствованных способов диагностики РА и дифференциальной диагностики заболеваний суставов.

Цель исследования

Целью исследования является уточнение некоторых звеньев патогенеза, усовершенствование иммунологической диагностики, дифференциальной диагностики при ревматоидном артрите с помощью изучения антителообразования к эластину и эластазе.

Основные задачи исследования

1. Получить иммобилизированные формы эластина и эластазы, изучить их физико-химические свойства.

2. Отработать условия и технику проведения иммуноферментного анализа с использованием ИГАП на основе эластина и эластазы для определения соответствующих аутоантител.

3. Изучить распространенность и концентрацию антител к эластину и эластазе в сыворотке крови здоровых людей и определить границы нормы этих показателей.

4. На основе отработанных методик изучить содержание аутоантител к эластину и эластазе в сыворотке крови больных РА в зависимости от активности, наличия внесуставных проявлений.

5. Исследовать взаимосвязь процессов аутоантителогенеза к эластину и эластазе у больных РА.

6. Изучить содержание аутоантител к эластину и эластазе в сыворотке крови больных контрольной группы (больных подагрическим, псориатическим, реактивным артритами, анкилозирующим спондилитом) и количественно оценить эффективность изучения антител к эластину и эластазе для дифференциальной диагностики РА от других ревматических заболеваний.

Научная новизна

Впервые для иммунодиагностики воспалительных заболеваний суставов разработаны и применены иммобилизированные формы эластина и эластазы, подобраны оптимальные концентрации антигенов и определены условия проведения иммуноферментного анализа с использованием ИГАП.

В сыворотке крови больных РА обнаружены антитела к эластину и эластазе. Показано, что их уровень достоверно отличается от со-

держания данных антител в сыворотке крови здоровых лиц и больных с другими ревматическими заболеваниями, протекающими с выраженным суставным синдромом (подагрический артрит, псориати-ческий артрит, реактивный артрит, анкилозирующий спондилит). Проанализирована зависимость указанных показателей от активности ревматоидного процесса, наличия внесуставных проявлений заболевания.

Впервые при РА изучены корреляционные связи между уровнями аутоантител к эластину и эластазе, а также показана связь повышения антител с активностью патологического процесса, клиническими особенностями заболевания.

Практическое значение

Разработан доступный для применения в клинических лабораториях способ определения уровня антител к эластину и эластазе, представляющий собой модификацию иммуноферментного анализа с использованием иммобилизированных в магнитоуправляемые гранулы белков в качестве антигенов.

Исследования показали достоверные различия в содержании антител к эластину и эластазе у больных РА и больных с различными воспалительными заболеваниями суставов (подагрический артрит, псориатический артрит, реактивный артрит, анкилозирующий спондилит), что позволяет использовать данные тесты вместе с другими клинико-лабораторными показателями для дифференциальной диагностики этих заболеваний.

Уточнена взаимосвязь клинических проявлений РА, в частности поражений сосудов, сердца, крови и синовиальной оболочки, с наличием изучаемых антител.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Содержание антител к эластину и эластазе в сыворотке крови зависит от активности, наличия внесуставных проявлений РА.

2. Определение уровня аутоантител может использоваться для диагностики активности патологического процесса при РА и дифференциальной диагностики с другими ревматическими заболеваниями, сопровождающимися суставным синдромом.

3. Наиболее ценным с диагностической точки зрения является определение иммуноферментным методом с помощью иммобилизированных антигенных препаратов в сыворотке крови антител к эластазе.

Внедрение в практику

Методы определения антител к эластину и эластазе иммуноферментным методом с помощью иммобилизированных гранулирован-

ных антигенных препаратов с магнитными свойствами внедрены в практику работы муниципального учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница скорой медицинской помощи № 25» города Волгограда.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 1 — в издании, рецензируемом ВАК.

Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (2007—2010 гг.), II Меящународном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2007» (Санкт-Петербург, 2007), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2008), Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы», IV Международной конференции по иммунотерапии (Москва,

2008), симпозиуме EULAR (Копенгаген, Дания, 2009), Конференции «Актуальные проблемы современной кардиологии и терапии» (Киров,

2009). Первичная экспертиза диссертации была проведена на совместном заседании Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ Клинической и экспериментальной ревматологии РАМН и кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» 9 декабря 2010 г. (протокол № 7).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием использованных материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждений, выводов, практических рекомендаций и приложений. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 10 рисунками, 6 схемами, 5 выписками из истории болезни. Указатель литературы включает 199 источников, в том числе 58 на русском языке и 141 на иностранном.

Методы исследования

Исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Международной медицинской ассоциации (1996 г.). Соблюдение требований биоэтики подтверждено результатами экспертизы Регионального этического комитета.

Для выполнения поставленных задач были сформированы группа больных с верифицированным РА, а также контрольная группа. В состав последней были включены пациенты с ревматическими заболеваниями, которые, по общему мнению специалистов, наиболее часто вызывают затруднения при дифференциальной диагностике с РА: псориатический, подагрический, реактивный артрит, анкилозирующий спондилит [Насонова В.А., Бунчук Н.В., 1997]. Отбор в обе группы производили среди пациентов, находившихся на стационарном лечении с октября 2007 года по май 2008 года в отделении ревматологии МУЗ «Городской клинической больницы скорой медицинской помощи №25» г. Волгограда.

Верификацию диагнозов производили с помощью общепринятых критериев: для ревматоидного артрита — с использованием классификации РА Ассоциации ревматологов России (АРР) [Насонов Е. Л., 2008], диагностических критериев Международной антиревматической лиги [Насонов Е. Л., 2010], а также Американской коллегии ревматологов (АКР) [Arnett F.C. et al., 1987]; для псориатического артрита — по критериям Н. Mathies (1974), дополненным сотрудниками НИИ ревматологии АМН СССР [Агабабова Э. Р., 1989] а также критериев CASPAR (2006) [Насонов Е. Л., 2008]; для подагрического артрита — по критериям, рекомендованным международными симпози-мумами по популяционным исследованиям в Риме (1961), Нью-Йорке (1966), усовершенствованным работами сотрудников НИИ ревматологии АМН СССР [Насонова В. А., Астапенко М. Г., 1989], а также по критериям, рекомендованным ВОЗ в 2000 г. [Насонов Е. Л., 2008]; для реактивного артрита — по критериям, разработанным на 4-ом Международном рабочем совещании по реактивным артритам [Берлин, 1999], а также российские критерии (2004) [Насонов Е. Л., 2008]; для анкилозирующего спондилита — по модифицированным критериям, предложенным на международном Симпозиуме в Риме (1961) и Нью-Йорке (1969), а также по критериям НИИ ревматологии РАМН (1997) [Насонов Е. Л., 2008].

Критерии включения для больных РА

1. Возраст 18 лет (включительно) и старше.

2. Наличие информированного согласия.

3. Наличие у больного ревматоидного артрита, соответствующего критериям Международной антиревматической лиги, Американской Ревматологической Ассоциации.

4. Срок, прошедший после установления диагноза ревматоидного артрита, — не менее 6 месяцев.

Критерии исключения для больных РА

1. Беременность или лактация.

2. Алкогольная и (или) наркотическая зависимость.

3. Инфицирование вирусом иммунодефицита человека или возбудителями вирусных гепатитов В, С и D.

4. Наличие злокачественного новообразования любой локализации на момент отбора.

5. Наличие обострения хронического панкреатита или острого панкреатита в анамнезе в течение 6 месяцев до момента отбора.

6. Наличие тяжелой сопутствующей патологии: терминальная почечная недостаточность, сахарный диабет с декомпенсацией углеводного обмена, хроническая сердечная недостаточность III-IV функциональный класс, хроническая дыхательная недостаточность III степени, выраженное нарушение функции печени.

Критерии включения в контрольную группу

1. Возраст 18 лет (включительно) и старше.

2. Наличие информированного согласия.

3. Отсутствие диагностических критериев РА по классификации Международной антиревматической лиги и Американской Ревматологической Ассоциации.

4. Наличие достаточного количества диагностических критериев для верификации одного из перечисленных диагноза: подагрический, псориатический, реактивный артрит, анкилозирующий спондилит.

5. Наличие болей в суставах конечностей с их припуханием и/или покраснением (по данным анамнеза или непосредственно при обследовании).

Критерии исключения из контрольной группы совпадали с таковыми для больных РА.

Всего для исследования было отобрано 106 больных РА, контрольную группу составили 84 человека.

Для установления нормальных характеристик изучаемых лабораторных показателей использовали референтную группу, состоящую из 30 практически здоровых лиц — доноров Волгоградской областной станции переливания крови (19 женщин и 11 мужчин в возрасте от 24 до 46 лет).

Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программы SPSS 12.0 for Windows (SPSS Inc., Чикаго, США, 2003 г.). Выбор статистических методов для решения отдельных задач производили в соответствии с общепринятыми рекомендациями [Гланц С., 1998; Зайцев В.М. и соавт., 2003; Le С.Т., 2003; Власов В.В., 2004; ГринхальхТ., 2006]. При нормальном распределении признака его центральную тенденцию и вариабельность харакгеризова-

ли как «среднее арифметическое±среднее квадратическое отклонение» (М±с), в противном случае — как «медиана (первый квартиль; третий квартиль)» (Me (Qi; Q3)). Различия считали достоверными при вероятности ошибки I типа (р) менее 0,05.

Оценку эффективности диагностического теста производили путем анализа четырехпольной таблицы и вычисления общепринятых операционных характеристик — чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов, отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов [Власов В. В., 1988; Флетчер Р. и соавт., 1998]. Поиск оптимальных точек разделения, оценку общей точности отдельного диагностического теста и сравнение двух диагностических исследований осуществляли с помощью непараметрического варианта ROC-анализа [Zweig М. Н., Campbell G., 1993; Obuchowski N. А., 2005].

В ходе исследований был использованы коммерческие препараты производства фирмы «Sigma» (США):

1. Препарат эластазы панкреатической из панкреатической железы свиньи (Elastase pancreatic from porcine pancreas, Cat. № E1250), представляющий собой водную суспензию (содержание тимола ~ 0,01 %) с активностью 6,8 Ед/мг и концентрацией белка 4 мг/мл (биу-ретовый метод).

2. Препарат эластина из легкого человека (Elastin from human lung, Cat. № E7152), представляющий собой порошок, полученный методом щадящей экстракции.

Иммобилизацию эластина и эластазы производили методом эмульсионной полимеризации с включением магнитного материала в состав полиакриламидных гранул [Зборовский А. Б., Гонтарь И. П., 2001]. Концентрацию антител к эластину и эластазе определяли методом ИФА с использованием иммобилизированной формы антигенов и выражали в условных единицах оптической плотности (е.о.п.). В ходе измерения использовали найденные нами оптимальные уровни концентрации иммобилизированных эластина (1,5 мкг/мл), эластазы (2,5 мкг/мл) и рабочего разведения сыворотки (1:200). В случае превышения точки разделения 0,104 е.о.п. для антител к эластину и 0,113 е.о.п. для антител к эластазе, значения оптической плотности считали отражающими положительные значения этих показателей, в противном случае результат считали отрицательным.

Клиническая характеристика исследуемых групп

Под наблюдением находились 106 больных РА, из которых 85 (80,2 %) женщин и 21 (19,8 %) мужчин. Средний возраст больных — 53,4±12,7 года. Инвалидность по основному заболеванию (РА) уста-

новлена у 66 (62,3 %) больных. У 61,32 % (65 человек) больных РА в крови методом латекс-агглютинации был обнаружен ревматоидный фактор (РФ) класса 1дМ, что согласуется с данными литературы [Ки-рикова С. Ф., 1993]. Развернутая стадия заболевания диагностирована у 47 (44,34 %) больных, поздняя — у 59 (55,66 %) больных РА. По продолжительности заболевания больные распределились следующим образом: до 5 лет — 44 (41,5 %), 6-10 лет — 30 (28,3 %), 11—15 лет — 12 (11,3 %), 16—20 лет — 11 (10,4 %), свыше 20 лет — 9 (8,5 %) человека. Средняя продолжительность РА составила 9,19+7,31 года.

1 (низкая) активность (М ОА828=2,9) патологического процесса выявлена у 22 (20,75 %), 2 (средняя) (М ОА828=4,1) — у 75 (70,75 %) и 3 (высокая) (М ОА828=6,5) — у 9 (8,5 %) больных. Наиболее многочисленной была категория больных РА в возрасте свыше 50 лет (59,44 %). Внесуставные проявления выявлены у 49 (46,23 %) пациентов. Установлены следующие рентгенологические стадии поражения суставов: 1-я стадия — у 12 (11,3 %), Н-я — у 35 (33 %), II 1-я — у 42 (39,7 %) и 1\/-я — у 17 (16 %) больных РА. По степени функциональной недостаточности суставов распределение больных было следующим: I функциональный класс (ФК) установлен у 4 (3,8 %), П-й ФК — у 95 (89,62 %), 111-й ФК — у 7 (6,61 %), ФК — ни у одного больного РА.

В состав контрольной группы были включены 84 больных (34 мужчин и 50 женщин) с суставным синдромом как проявлением псориатиче-ского, подагрического, реактивного артритов, анкилозирующего спондилита (рис. 1).

13%

38%

К ПсА И ПА □ РеА П АС

Рис. 1. Нозологическая структура контрольной группы (ПсА — псориатический артрит, ПА — подагрический артрит, РеА — реактивный артрит, АС — анкилозирующий спондилит)

При сопоставлении больных РА и контрольной группы по основным демографическим параметрам, длительности заболевания и активности патологического процесса достоверных различий выявлено не было (табл.1).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Концентрация антител к эластину

При исследовании сывороток крови лиц референтной группы на наличие антител к эластину среднее значение экстинкции составляло 0,050+0,027 е.о.п.

Применяя точку разделения положительных и отрицательных результатов, равную 0,104 е.о.п., антитела к эластину были выявлены у 37 (34,9 %) больных РА, составляя у них в среднем 0,128 (0,118; 0,133) е.о.п.

Таблица 1

Сравнительная характеристика групп больных РЗ, включенных в исследование

Показатель 1 Больные РА (п=106) II Контрольная группа (п=84) Р

Пол, п (%) мужчины женщины 21 (19,8 %) 85 (80,2 %) 34 (40,5 %) 50 (59,5 %) р > 0,05

Средний возраст, лет, М (Бй) 53,4(12,7) 44,5(10,9) р > 0,05

Средняя длительность болезни, лет, М (50) 9,19(7,31) 9,4 (5,8) р>0,1

Активность заболевания, п ( %) низкая средняя высокая 22 (20,75 %) 75 (70,75 %) 9 (8,5 %) 20 (23,8 %) 56 (66,68 %) 8 (9,52 %) р = 0,856 р = 0,987 р = 0,778

У 7 (8,3 %) лиц контрольной группы было зафиксировано наличие положительных значений антител к эластину, концентрация которой в среднем была равна 0,067 (0,055; 0,074) е.о.п. (рис. 2). Частота обнаружения положительных значений антител к эластину у больных РА была достоверно больше (р<0,001), чем в контрольной группе; средние концентрации антител также различались (р < 0,002).

Среди ранее опубликованных исследований нами найдено небольшое количество сообщений, касающихся проблемы антител

к эластину при ревматоидном артрите. Так, Вако С. и соавт. (1987) и Со1Ьигп К. К. и соавт. (1992, 2003) указывали на повышение уровня антител к эластину у больных РА. Факт увеличения содержания антител к эластину согласуется с нашими данными. Однако количество исследуемых сывороток ограничивалось несколькими десятками, при этом не осуществлялось деление больных на группы по активности и по наличию внесуставных проявлений.

Среднестатистические показатели длительности заболевания у больных ревматоидным артритом, в сыворотке крови которых обнаружено повышенное содержание антител к эластину, составили 9,38±6,05 лет.

с о

ш

X 3 н о га с о

X

с;

о £

X

га л х ш m о

о. >

0,2 т 0,18 0,16 0,14 -0,12-0,1 -0,08 0,06 0,04 0,02 О

I

Т

i

I

Здоровые лица

Контрольная группа

Больные РА

Рис, 2. Уровень антител к эластину у больных РА по сравнению с другими исследуемыми группами (• )—M±m; —(— —M+SD)

Повышение уровня антител к эластину было установлено у 100 % (7 человек) больных РА с Ш-м и у 31,58 % (30 человек) больных со Н-м функциональным классом недостаточности суставов.

Повышенные уровни антител к эластину определялись у 7 (31,8 %) пациентов с 1-й активностью, 26 (34,7 %) — со 2-й, у 4 (44,4 %) — с 3-й активностью патологического процесса. Наибольшие значения

показателя обнаружены у больных РА со средней степенью активности и превысили нормальные более, чем в 3 раза. Значения у больных с низкой и высокой активностями оказались ниже, чем в группе больных со средней степенью. В этих группах также наблюдается увеличение значений по сравнению с результатами, полученными у доноров: в 2,1 раза и 2,5 раза соответственно. С увеличением активности, а также длительности заболевания, по-видимому, происходит срыв иммунологической толерантности. Практически снижение уровня антител к эластину и эластазе у больных РА со 2-ой степенью активности заболевания (верхние границы значений уровня антител к эластину — 0,155 е.о.п. и к эластазе — 0,166 е.о.п.) может свидетельствовать о переходе средней степени в низкую при изменении в динамике у больного концентрации антител к эластину до 0,115 е.о.п. и в высокую при изменении содержания аутоантител к эластину до 0,128 е.о.п.

В группе больных РА, находившихся под нашим наблюдением, 53,77 % (57 человек) составили больные без внесуставных проявлений заболевания. Повышенные значения антител к эластину обнаружены у 21 (36,84 %) больных данной группы. Повышение уровня антител к эластину в группе больных РА с внесуставными проявлениями обнаружены у 16 (32,65 %) пациентов. При анализе значений антител к эластину в зависимости от наличия внесуставных проявлений заболевания частота случаев повышения уровня антител в группе больных РА с внесуставными проявлениями оказалась ниже, правда, средние значения показателя практически не отличались от значений в группе больных РА без внесуставных проявлений (р>0,05).

В группе больных ревматоидным артритом без внесуставных проявлений и явлениями синовиита (50 человек) значения уровня антител к эластину достоверно (р<0,005) выше более, чем в 1,5 раза по сравнению с содержанием данных антител у больных РА той же группы, но без выраженных клинических симптомов синовиита (табл. 2). По-видимому, поражение суставов, в значительном объеме содержащих в себе эластин, патогенетически связано с повре>едающим воздействием антител к эластину на хрящевую ткань, связочный аппарат и синовиальную оболочку суставов.

Таблица 2

Уровень антител к эластину у больных РА без внесуставных проявлений и с поражением синовиальной оболочки

Контингент обследуемых п Антитела к эластину, е.о.п., М±ЭО

Здоровые 30 0,050±0,027

Больные РА без внесуставных проявлений и с поражением синовиальной оболочки 50 0,076±0,108

Больные РА без внесуставных проявлений и без выраженных клинических симптомов синовиита 7 0,050±0,032

У 22 (44 %) пациентов группы больных РА с внесуставными проявлениями диагностирован церебральный васкулит, а у 1 (2 %) больного выявлен тромбоваскулит сосудов нижних конечностей.

У больных с внесуставными проявлениями с вовлечением сосудов обнаружено достоверное увеличение содержания антител к эластину (р<0,001) по сравнению с донорами (табл. 3).

Повышение уровня антител к эластину у больных с поражением сосудов дало возможность для сравнения показателей анти-телообразования внутри группы пациентов с внесуставными проявлениями заболевания. У пациентов с поражением сосудов по сравнению с больными РА с наличием других внесуставных поражений без васкулопатий имелось превышение уровня антител более, чем в 2 раза (р <0,005).

Таблица 3

Уровень антител к эластину у больных РА с поражением сосудов

Контингент обследуемых п Антитела к эластину, е.о.п., М+БО

Здоровые 30 0,050+0,027

Больные РА с поражением сосудов 23 0,112+0,108

Больные РА с внесуставными проявлениями (без поражения сосудов) 26 0,054+0,032

Сравнение между собой групп больных РА, позитивных (37 человек) и негативных (69 человек) по антителам к эластину, продемонстрировало большую частоту поражения сосудов и сердца (р<0,05) у больных, имевших аутоантитела к эластину (табл. 4).

Таблица 4

Частота поражения внутренних органов у больных РА с различным уровнем антител к эластину

Клинические проявления Частота выявления (абсолютное количество и %) Уровень значимости, р

Позитивные по антителам к эластину (п=37; 34,9 %) Негативные по антителам к эластину (п=69; 65,1 %)

Поражение почек 2(5,41 %) 5 (7,25 %) р=0,0455

Ревматоидный васкулит 9 (24,32 %) 14(20,29 %) р=0,009

Поражение сердца 5(13,51 %) 3 (4,35 %) р=0,018

Средние значения антител к эластину у больных с таким внесуставным проявлением, как васкулит, более, чем в 2 раза были выше по сравнению с аналогичным показателем у больных РА с другими висцеральными поражениями (без сосудистой патологии), а при вовлечении в патологический процесс сердца это соотношение составило 1,27 раза. В группе больных ревматоидным артритом с повышенными значениями уровня антител к эластину поражение сосудов встречается чаще, чем в группе больных ревматоидным артритом с отрицательными значениями уровня этих антител. Аналогичное сравнение группы больных РА с поражением сердца выявило схожие закономерности и соотношение составило 3,61.

Согласно нашим данным, наличие повышенных значений антител к эластину у больных ревматоидным артритом ассоциировалось с поражением сосудов и сердца: частота выявления антител к эластину была достоверно выше при васкулитах и миокардитах, перикардитах.

Что касается сосудистого повреждения, то прослеживается четкая связь с локализацией эластина в стенках сосудов, причем именно на них приходится наибольшая распространенность эластина

в организме человека. Эластин также локализуется в коже, однако повышенные значения антител к эластину у больных с поражением кожного покрова не обнаружены. Тем не менее выявлены изменения иммунного статуса у больных с такими повреждениями кожи, как тромбоваскулиты, что, впрочем, можно расценить и как сосудистую патологию.

Поражение сердца также можно объяснить вовлечением в патологический процесс сосудов, которые в чрезвычайно большом количестве обеспечивают сердечную мышцу энергетическими и плас-тическими материалами. Кроме того, известно, что клапанный аппарат сердца обладает эластичностью и в их строму также входят эластические волокна, иммунологическое повреждение которых может привести к чрезмерной выработке аутоантител к эластину.

Невысокие показатели уровня антител к эластину у больных с иными внесуставными проявлениями объяснимы малой распространенностью эластической ткани в том или ином органе либо отсутствием участия этих органов в обмене эластина.

Концентрация антител к эластазе

При исследовании сывороток крови лиц референтной группы на наличие антител к эластазе среднее значение экстинкции составляло 0,095+0,009 е.о.п.

Применяя точку разделения положительных и отрицательных результатов, равную 0,113 е.о.п., антитела к эластазе были выявлены у 58 (54,72 %) больных РА, составляя у них в среднем 0,137 (0,103; 0,152) е.о.п. У 3 (3,57 %) лиц контрольной группы было зафиксировано наличие положительных значений антител к эластазе, концентрация которой в среднем была равна 0,097 (0,091; 0,102) е.о.п. (рис. 3). Частота обнаружения положительных значений антител к эластазе у больных РА была достоверно больше (р<0,001), чем в контрольной группе; средние концентрации антител также различались (р < 0,002).

Среди ранее опубликованных исследований нами найдено небольшое количество сообщений, касающихся проблемы антител к эластазе при ревматоидном артрите. Так, Senior R. М. и соавт. (1977) исследовали концентрацию антител к эластазе у пациентов с РА. Факт увеличения содержания антител к эластазе согласуется с нашими данными. Однако и при изучении уровня антител к эластазе количество исследуемых сывороток ограничивалось несколькими десятками, при этом так же, как и при исследовании антител к эластину, не осуществлялось деление больных на группы по степени активности и наличию внесуставных проявлений.

0,1 .......

Здоровые лица

Контрольная группа

Больные РА

Рис. 3. Уровень антител к эластазе у больных РА по сравнению с другими исследуемыми группами ( I—М+т; —|— —М+ЭР)

Отсутствие антител к эластазе у больных ревматоидным артритом, описанное в одной из работ (Savige J.A. и соавт., 1991), могло быть связано с использованием классического варианта ИФА. Применение в нашей работе ИГАП с магнитными свойствами (Зборовский А.Б., Гонтарь И.П., 2001) дало возможность за счет высокой аналитической чувствительности модифицированного ИФА установить более выгодное соотношение сигнал/шум при калибровании тест-системы.

Среднестатистические показатели длительности заболевания у больных ревматоидным артритом, в сыворотке крови которых обнаружено повышенное содержание антител к эластазе, составили 7,84±6,50 лет.

Повышенные уровни антител к эластазе определялись у 18 (81,82 %) пациентов с 1-ой активностью, 36 (48 %) — со 2-й, у 4 (44 %) — с 3-й активностью патологического процесса. Признаки возможного срыва иммунологической толерантности наблюдаем и в случае с антителами к эластазе. Наибольшие значения показателя обнаружены у больных РА со средней степенью активности и превысили нормальные более, чем в 1,5. Значения у больных с низкой и высокой активностями оказались ниже, чем в группе больных со средней активностью. Однако в этих группах также наблюдается увеличение значений

18

по сравнению с результатами, полученными у доноров: в 1,18 раза и 1,43 раза соответственно (табл. 5).

Таблица 5

Содержание антител к эластазе в сыворотке крови здоровых лиц и больных РА в зависимости от активности процесса

Контингент Число наблюдений Статистические показатели АТ к эластазе, е.о.п.

Здоровые 30 М± т У 0,095+0,002 0,009

Больные с 1 -й активностью 22 М± т У 0,112+0,003' 0,016

Больные со 2-й активностью 75 М± т У 0,163±0,003** 0,040

Больные с 3-й активностью 9 М+ т У 0,136±0,003* 0,038

* р<0,05, ** р<0,001

Практически снижение уровня антител к эластазе у больных РА со 2-ой активностью заболевания может свидетельствовать о переходе средней степени в низкую при изменении в динамике у больного концентрации антител к эластазе до 0,115 е.о.п. и в высокую при изменении содержания аутоантител к эластазе до 0,139 е.о.п..

В группе больных РА, находившихся под нашим наблюдением, 53,77 % (57 человек) составили больные без внесуставных проявлений заболевания. Повышенные значения антител к эластазе обнаружены у 27 (47,37 %) больных данной группы. Повышение уровня антител к эластазе в группе больных РА с внесуставными проявлениями обнаружены у 31 (63,3 %) пациентов. При анализе значений антител к эластазе в зависимости от наличия внесуставных проявлений частота случаев повышения уровня антител в группе больных РА с внесуставными проявлениями оказалась выше, однако средние значения показателей практически не отличались от значений в группе больных РА без внесуставных проявлений (р>0,05).

В группе больных ревматоидным артритом с явлениями васкулита (23 человека) 60,87 % (14 человек) обследуемых обнаружили увеличение уровня антител к эластазе. Поскольку уже говорилось о том, что эластин в большем объеме локализуется

в сосудистых стенках, а непременным элементом системы обмена эластина является эластаза, то увеличение антител к эластазе у больных РА с васкулитами представляется закономерным.

У 76,47 % (13 человек) больных из группы пациентов с ревматоидным артритом с анемией различной степени (17 человек) выявлено повышение концентрации антител к эластазе. Учитывая, что эластаза обладает гидролизирующей способностью по отношению к гемоглобину, можно предположить следующий механизм повышения уровня антител к эластазе. Некие факторы развития РА стимулирующе действуют на активность эластазы, которая в числе прочих возможных звеньев патогенеза аутоиммунной анемии участвует в её развитии, чрезмерно разрушая гемоглобин. Образование антител к эластазе в этом случае нужно рассматривать как защитный механизм, поскольку антитела, воздействуя на ферменты, снижают их активность либо блокируют их вовсе. Поэтому компенсаторное повышение уровня антител к эластазе у больных РА с анемией вполне объяснимо.

Средние значения антител к эластину у больных с таким внесуставным проявлением, как васкулит, были выше по сравнению с аналогичным показателем у больных РА с другими висцеральными поражениями (без сосудистой патологии), а в случае с анемией это соотношение составило 2,69 раза.

Сравнение между собой групп больных РА, позитивных (58 человек) и негативных (48 человек) по антителам к эластазе, продемонстрировало большую частоту поражения сосудов и анемии (р<0,05) у больных, имевших аутоантитела к эластазе (табл. 6).

Таблица 6

Частота поражения внутренних органов у больных РА с различным уровнем антител к эластазе

Клинические проявления Частота выявления (абсолютное количество и %) Уровень значимости, Р

Позитивные по антителам к эластазе (п=58; 54,75 %) Негативные по антителам к эластазе (п=48; 45,25 %)

Ревматоидный васкулит 14(24,14%) 9 (18,75 %) р=0,017

Анемия 13(22,41 %) 4 (8,33 %) р=0,025

Диагностическое значение антител к эластину и эластазе у больных РА

В соответствии с полученными нами результатами, в сыворотках крови большинства больных РА частота обнаружения антител к эластину и эластазе была значительно выше, чем в контрольной группе. В связи с этим была произведена количественная оценка эффективности дифференцирования РА от других ревматических заболеваний при помощи определения антител к эластину, как в отдельности, так и при сравнении с антителами к эластазе.

Характеристическая кривая содержания антител к эластину (рис. 4) ограничивала на ROC-графике площадь (AUC), равную 0,703 (95 % ДИ 0,590 — 0,797). Отличие от AUC, равной 0,5 (диагностически незначимый тест), было статистически значимым (р<0,001).

100

75

g 50

и

H

S

a

и

и £

F1

25

0 25 50 75

100-специфично с ть, %

100

Рис. 4. Характеристическая (ROC) кривая определения диагностической ценности исследования уровня антител к эластину в дифференциальной диагностике РА и других ревматических заболеваний (контрольная группа)

Характеристическая кривая пересекала ось ординат в точке с чувствительностью 58 %. В диапазоне положительных результатов теста максимальное значение отношения правдоподобия положительного результата О-ИР), равно как и минимальное значение отношения правдоподобия отрицательного результата (1_РМ),

21

наблюдалось при пороговой величине 0,112 е.о.п., соответствующей точке разделения положительных и отрицательных результатов, с учетом значений уровня антител у больных псориатическим, подагрическим, реактивным артритами и анкилозирующим спондилитом. Следовательно, при интерпретации результатов измерения использование этой точки в качестве нижней границы диапазона концентраций, характерного для РА, наиболее эффективно, так как позволяет добиться не только наибольшего прироста вероятности РА при превышении порогового значения, но и наибольшего снижения последней при отсутствии такого превышения. Операционные характеристики для этой точки указаны в таблице 7.

Таблица 7

Основные операционные характеристики определения концентрации антител к эластину при ревматоидном артрите (точка разделения 0,112 е.о.п.)

Параметр Значение 95 % ДИ

Чувствительность, % 72 62-87

Специфичность, % 50 41-64

Прогностическая ценность положительного результата, % 86,09 70,16—90,23

Прогностическая ценность отрицательного результата, % 47,26 41,43—52,35

Характеристическая кривая содержания антител к эластазе (рис. 5) ограничивала на НОС-графике площадь (А\_)С), равную 0,822 (95 % ДИ 0,675 — 0,923).

ЮО-специфичность, %

Рис. 5. Характеристическая (ROC) кривая определения диагностической ценности исследования уровня антител к эластазе в дифференциальной диагностике РА и других ревматических заболеваний (контрольная группа)

Отличие от AUC, равной 0,5, (диагностически незначимый тест) было статистически значимым (р<0,001).

Наибольшей эффективности дифференцирования больных ревматоидным артритом от пациентов с другими ревматическими заболеваниями (псориатический артрит, подагрический артрит, реактивный артрит, анкилозирующий спондилит) с использованием антител к эластазе достигали, производя выбор точки разделения при помощи отношений правдоподобия положительного (LRP) и отрицательного (LRN) результатов. В диапазоне положительных значений теста максимальное LRP и минимальное LRN наблюдалось при пороговой величине 0,115 е.о.п. Операционные характеристики для этой точки приведены в таблице 8.

Таблица 8

Основные операционные характеристики определения концентрации антител кэластазе при ревматоидном артрите (точка разделения 0,115 е.о.п.)

Параметр Значение 95 % ДИ

Чувствительность, % 77 62—87

Специфичность, % 81 59—91

Прогностическая ценность положительного результата, % 95,08 74,07-98,01

Прогностическая ценность отрицательного результата, % 37,20 29,15-42,06

Отношение правдоподобия положительного результата 4,05 -

Отношение правдоподобия отрицательного результата 0,28 -

Поскольку и эластин, и эласгаза являются частными взаимосвязанными звеньями обмена соединительной ткани, которые должны находиться в определенном равновесии, нам представилось интересным изучить взаимоотношения этих двух компонентов.

И действительно, при анализе была выявлена прямая корреляционная связь высокой силы (коэффициент Пирсона 0,866 при р<0,01) между уровнями антител к эластину и эластазе.

Определенный интерес представляла оценка полезности совместного применения исследования уровня антител к эластину и эластазе для усовершенствования диагностики ревматоидного артрита. С этой целью были сформированы два дихотомических критерия. Один из них, названный основным, принимал положительное значение в случае превышения точки разделения любым из двух видов антител — либо к эластину, либо к эластазе. В противном случае данному критерию присваивалось отрицательное значение. Другой критерий, обозначенный как контрольный, отличался от основного использованием лишь одного маркера — антитела к эластазе. Сравнение операционных характеристик полученных таким образом критериев (рис. 6) выявило достоверное увеличение чувствительности при исследовании обоих видов антител с 77 до 89 % (р=0,023) по сравнению с определением одних лишь антител к эластазе.

Сопутствовало этому некоторое уменьшение специфичности с 81 до 75 %, однако оно не было статистически достоверным (р=0,27).

Чувствительность Специфичность

■ Основной ■ Контрольный

Рис. 6. Изменение операционных характеристик при совместном исследовании концентраций антител к эластину и эластазе в диагностике ревматоидного артрита

Сравнение чувствительности методов определения антител к эластину и эластазе при раздельном и совместном использовании позволяет рекомендовать параллельное исследование этих антител с целью повышения чувствительности методов.

Наличие прямой корреляционной связи высокой силы между повышением уровней антител к эластину и эластазе предполагает тот факт, что с течением заболевания в сыворотке крови больных ревматоидным артритом будет наблюдаться увеличение содержания антител как к эластину, так и к эластазе. Это явление мы наблюдаем и у некоторых наших больных ревматоидным артритом. Однозначный ответ на вопрос, что первично — повышение уровня антител к эластину или эластазе, дать сложно, однако предположить можно. У 32 (86,49 %) больных из 37 больных ревматоидным артритом с повышенным значением антител к эластину наблюдалось увеличение содержания антител к эластазе, в то же время это количество больных (32 человека) в группе больных ревматоидным артритом с по-

вишенным значением антител к эластазе (58 человек) составило лишь 55,17 %. То есть нами наблюдалась наибольшая частота совместного повышения уровня антител и к эластину, и к эластазе в группе больных с положительными значениями антител к эластину.

Нами выяснено, что средняя длительность заболевания в группе больных ревматоидным артритом с положительными значениями антител к эластину выше, чем в группе с положительными значениями антител к эластазе. Это может свидетельствовать о следующем последовательном образовании антител к системе «эластин-эластаза».

Эластаза — фермент, обладающий достаточно высокой активностью, и активно участвующий в воспалительном процессе, — широко представлен в организме, в том числе и в кровеносном русле. Нетрудно представить, что приоритетной мишенью для иммунного ответа станет фермент, который к тому же доступен для иммунных клеток. Антитела к эластазе, либо связывая и тем самым инактивируя ее, либо разрушая фермент, снижают количество и активность эла-стазы. Эластин, обмен которого поддерживается в норме с помощью эластазы, не подвергается деградации а, следовательно, обновлению, и, старея, приобретает антигенные свойства. Измененные структуры эластина вызывают дисбаланс в иммунной системе, провоцируя образование аутоантител. Этот процесс растянут во времени и, по-видимому, обнаружение повышенных значений антител к эластину может свидетельствовать о длительном, далекозашед-шем патологическом процессе.

Показатель специфичности метода определения антител к эластину невысок по сравнению с другими применяемыми в настоящее время методами: доля отрицательных значений в группе больных псориатическим, подагрическим, реактивным артритами, анкилози-рующим спондилитом составила 50 %. Это объяснимо превалированием в клинической картине данных нозологий суставного синдрома, имеющего конкретную морфологическую структуру и связь с наличием в связочном аппарате, хряще и синовиальной оболочке эластина. То есть иммунный ответ к эластину не специфичен для ревматоидного артрита, поскольку изолированное повышение антител к эластину у больных ревматоидным артритом в большинстве случаев сопровождалось явлениями синовиита, который имеет место быть и при вышеназванных заболеваниях. Доля положительных значений в группе больных ревматоидным артритом (чувствительность) достаточна высока, что позволяет говорить о целесообразности применения метода определения антител к эластину для диагностики этого заболева-

ния. Изучение уровня антител к эластину можно использовать как в комплексе с другими общепризнанными клиническими и лабораторными методами диагностики ревматоидного артрита, так и с методом исследования содержания антител к эластазе.

Целесообразность совместного изучения антителообразования и к эластину, и к эластазе продиктована тем, что подобное сочетанное исследование повышает чувствительность метода определения антител к эластазе. Более высокая специфичность метода определения антител к эластазе позволяет использовать его для дифференцирования ревматоидного артрита от других ревматических заболеваний. Чувствительность этого метода сопоставима с чувствительностью общепризнанных в настоящее время исследований (определение антифилаггриновых антител, антител к циклическому цит-руллинированному пептиду, антител к цитруллинированному виментину, антител к цитруллинированному фибриногену) (табл, 9).

Таблица 9

Сопоставление чувствительности и специфичности диагностических тестов

Маркер Чувствительность, % Специфичность, %

РФ 50—90 80—93

Антифилаггриновые антитела 50—67 68—98

Антитела к циклическому цитруллинированному пептиду 49—91 73—99

Антитела к цитруллинированному виментину 20-75 95

Антитела к цитруллинированному фибриногену 59—80 95—99

Антитела к эластину 72 50

Антитела к эластазе 77 81

Применение гранулированных форм эластина и эластазы позволило повысить чувствительность метода ИФА и в связи с этим дало возможность уточнить некоторые аспекты патогенеза в свете изучения антителогенеза к системе «эластин-эластаза», улучшить ран-

нюю иммунодиагностику и дифференциальную диагностику ревматоидного артрита.

Выводы

1. Разработаны и апробированы способы получения иммобилизи-рованных гранулированных препаратов с магнитными свойствами на основе эластина и эластазы в качестве антигенов. Полученные нерастворимые формы антигенов стали основой для непрямого варианта иммуноферментного метода определения антител у больных РА.

2. Применение иммобилизированной гранулированной формы эластина и эластазы в иммуноферментном методе позволило увеличить частоту выявления положительных значений антител к ним по сравнению с традиционным вариантом ИФА.

3. При изучении уровня антител к эластину в сыворотке крови практически здоровых людей значение оптической плотности 0,104 е.о.п. в ЕИБА-тесте с использованием ИГАП было принято за верхнюю границу нормы, в случае с антителами к эластазе за верхнюю границу нормы принято значение оптической плотности 0,113 е.о.п. (показатели, превышающие эти значения, считались положительными).

4. Изменение значений количества антител к системе «эластин-эластаза» наиболее выражено было у больных РА со средней активностью, что сопровождалось преимущественным поражением сосудов, сердца,крови, синовиальной оболочки.

5. Уровни антител к эластину и эластазе у больных РА были выявлены достоверно более высокие по сравнению со здоровыми лицами (р<0,002 и р<0,001 соответственно) и больными псориатиче-ским, подагрическим, реактивным артритами и аншпозирующим спондилитом (р<0,005 и р<0,002 соответственно). Сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей позволил определить, что наиболее чувствительным и специфичным тестом при проведении дифференциальной диагностики РА с другими ревматическими поражениями суставов (псориатическим, подагрическим, реактивным артритами и анкилозирующим спондилитом), является определение антител к эластазе.

6. Изменение уровня антител к эластазе в группе больных РА наблюдалось в 2,5 раза чаще, чем к эластину. Прямая корреляционная связь высокой силы между уровнем антител к эластину и эластазе при более высокой частоте обнаружения антител к эластазе позволяет говорить о компенсаторном синтезе антител к эластину при нарушении иммунного ответа к эластазе. Чувствительность метода оп-

ределения антител к эластазе повышается при параллельном его применении с методом определения антител к эластину.

Практические рекомендации

1. Применение варианта непрямого иммуноферментного метода на основе ИГАП с использованием исследуемых белков в качестве антигенной матрицы для определения аутоантител к эластину и эластазе может быть рекомендовано для выявления сывороточных антител.

2. При определении аутоантител иммуноферментным методом с использованием ИГАП за границы нормы следует считать: 0,104 е.о.п. для антител к эластину и 0,113 е.о.п. для антител к эластазе.

3. Определение антител к эластину и эластазе в сыворотке крови рекомендуется применять для дифференциальной диагностики между ревматоидным артритом и другими поражениями суставов (подагрическим, псориатическим, реактивным артритами, анкилозирующим спондилитом) в комплексе с традиционными критериями диагностики. При этом точками разделения необходимо принять 0,112 е.о.п. для антител к эластину и 0,115 е.о.п. для антител к эластазе.

4. Рекомендуется использовать определение содержания антител к эластину и эластазе как дополнительный прогностический лабораторный критерий для выявления системных поражений: повышение уровня антител к эластину как маркер вовлечения в воспалительный процесс тканей сердца, сосудов и синовии, а к эластазе — сосудов и крови (развитие аутоиммунной анемии).

5. При вынесении диагностического решения с учетом результата определения антител следует руководствоваться тем, что совместное исследование уровней антител к эластину и эластазе повышает чувствительность метода определения содержания антител к эластазе с 77 % до 89 %.

Публикации

1. Перспективы изучения эластина: возможность его деградации при ревматических заболеваниях//Актуальные проблемы современной ревматологии: сб. науч. работ / под ред. акад. РАМН А.Б. Зборовского. — Вып. 24. — Волгоград: ООО «Царицынская полиграфическая компания», 2007. С. 73—74. Соавт.: Гонтарь И.П., Красильников А.Н., Емельянов Н.И., Трубенко Ю. А.

2. Гуморальный ответ организма у больных ревматическими заболеваниями на деградацию эластина // Альманах современной нау-

ки и образования. — №6 (6) 2007. — Тамбов: Изд-во «Грамота»,

2007. — С. 82—84. Соавт.: Матасова Н. А., Кочнева J1. И., Гонтарь И. П.

3. Эластин: его свойства и участие в ревматических процессах // Материалы 65-й юбилейной открытой науч.-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», 25—27 апреля

2007 г. — Волгоград: Изд-во ВолГМУ. — С.102-103. Соавт.: нет.

4. Уровень антител к эластину в сыворотке крови практически здоровых людей // Актуальные проблемы современной ревматологии: сб. науч. работ / под ред. акад. РАМН А.Б. Зборовского. — Вып. 25. — Волгоград: ООО «Царицынская полиграфическая компания»,

2008. — С. 77—78. Соавт.: Матасова Н. А., Кочнева Л. И., Сычева Г. Ф., Емельянова О.И., Зборовская И. А.

5. Проблемы диагностики хронических иммуновоспалительных заболеваний: применение иммунологических исследований для выделения субтипов ревматоидного артрита // Аллергология и иммунология. — 2008. — Т. 9. №3. — М.: Изд-во «Медицина-Здоровье». — С. 333—334. Соавт.: Александров А. В., Гонтарь И. П., Емельянов Н. Н., Новикова О. В., Маслакова Л. А., Емельянова О. И.

6. Значимость иммунологических исследований для выделении субтипов ревматоидного артрита // сб. материалов XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — М., 14-18 апреля

2008 г. — С .426-427. Соавт.: Александров А. В., Гонтарь И.П., Мна-цаканян С. Г., Парамонова О. В., Новикова О. В., Алехина И. Ю., Зборовский А. Б.

7. Возможность использования иммунологических показателей для выделения кпинико-лабораторных вариантов ревматоидного артрита II Материалы III Национального конгресса терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации». — М.: Издательство «Бионика», 2008. — С. 9—10. Соавт.: Александров А. В., Емельянов Н. И., Новиков Д. А., Емельянов Н. Н.

8. Антителообразование к эластину у практически здоровых людей // Материалы 66-й открытой науч.-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» 2008 г. — Волгоград: Изд-во ВолГМУ. — С. 105-106. Соавт.: нет.

9. Антителообразование к системе «эластин-эластаза» у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой и системной склеродермией // Актуальные проблемы современной ревматологии: сб. науч. работ / под ред. акад. РАМН А.Б. Зборовского. — Вып. 26. — Волгоград: ООО «Царицынская полиграфическая компания», 2009.

С. 57—58. Соавт.: Матасова Н.А., Кочнева Л. И., Аветисова Э. Р., Зборовский А. Б.

10. Нарушение гуморального иммунитета у больных ревматоидным артритом и аутотиреоидной патологией // Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ / Под ред. акад. РАМН А.Б. Зборовского. — Вып. 26. — Волгоград: ООО «Царицынская полиграфическая компания», 2009. С. 61—62. Соавт.: Парамонова О. В., Емельянова О.И., Зборовская И.А., Гонтарь И.П.

11. Изучение антителообразования к эластину у больных ревматоидным артритом II Вестник Российской военно-медицинской академии. Приложение (часть II), 1(25), 2009. — Санкт-Петербург: Изд-во «Литография», 2009. — С. 595-596. Соавт.: нет.

12. Гуморальный ответ на эластин и эластазу у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, системной склеродермией II Материалы конф. «Актуальные прблемы современной кардиологии и терапии». — Киров, 2009. — С. 119—121. Соавт.: Матасова Н. А., Аветисов Э. Р., Кочнева Л. И., Гонтарь И. П.

13. Клинико-диагностическое значение определения антител к эластину и эластазе у больных ревматоидным артритом // Аспирантский вестник Поволжья. №7—8, 2009. — Самара: ООО «Новая техника». — С. 47—51. Соавт.: нет.

14. Изучение антителогенеза к эластину и эластазе у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой и системной склеродермией II Материалы 67-й открытой науч.-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», 22—24 апреля 2009 г. — Волгоград: Изд-во ВолГМУ. — С.123-124. Соавт.: Матасова Н. А., Кочнева Л. И., Аветисова Э. Р.

15. Studing of the building of antielastin and antielastase antibodies in patients with rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and systemic sclerosis // Materials of Annual European Congress of Rheumatology EULAR 2009, Copenhagen, Denmark, 10 — 13 June 2009. — Ann Rheum Dis 2009;68(Suppl3):729.

16. Аутоиммунитет к эластину и эластазе у больных системной красной волчанкой и системной склеродермией // Актуальные проблемы современной ревматологии: сб. науч. работ / под ред. акад. РАМН А.Б. Зборовского. — Вып. 27. — Волгоград: ООО «Царицынская полиграфическая компания», 2010. С. 64—65. Соавт.: Матасова Н. А., Кочнева Л. И., Аветисова Э. Р.

17. Образование аутоантител к эластину и эластазе у больных ревматоидным артритом // Актуальные проблемы современной рев-

матологии: сб. науч. работ / под ред. акад. РАМН А.Б. Зборовского. — Вып. 27. — Волгоград: ООО «Царицынская полиграфическая компания», 2010. С. 73—74. Соавт.: Емельянова О.И., Трубенко Ю. А., Зборовский А. Б.

18. Образование аутоантител к эластину и эластазе у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой и системной склеродермией // Материалы 68-й открытой науч.-практ. конф. молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины», 13—15 сентября 2010 г. — Волгоград: Издательство ВолГМУ. — С.128—129. Соавт.: Матасова Н. А., Кочнева Л. И., Аветисова Э. Р.

НЕНАШЕВА НАТАЛЬЯ ВАСИЛЬЕВНА

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ЭЛАСТИНУ И ЭЛАСТАЗЕ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоградский государственный медицинский университет 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

Подписано в печать 19.12.2010 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Физ. печ. л. 1,5. Заказ № 279.

Отпечатано с готовых диапозитивов заказчика в типографии ООО «Мастер» 400087, г. Волгоград, уп. Невская, 126.

АКТУАЛЬНОСТЬ

Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани входят в число трех наиболее распространенных среди взрослой популяции России классов заболеваний, уступая место лишь болезням системы кровообращения и органов дыхания [13, 23, 42, 43, 44].

Самым частым воспалительным ревматическим заболеванием (РЗ) признан ревматоидный артрит (РА) [36, 173], ключевым синдромом которого является суставной. Относительный показатель заболеваемости, рассчитанный на 100 тыс. населения, с 2001 по 2005 год увеличился на 3,6%, достигнув значения 204,0 на 100 тыс. [54]. Ежегодно в России у 21-23 из 100 тыс. человек впервые в жизни диагностируется РА [19].

Смертность от РА находится в пределах 0,17-0,22% от общей смертности населения [65]. В то же время продолжительность жизни больных РА— на 10-15 лет короче ожидаемой (популяционной), а 5-летняя выживаемость при тяжелых формах болезни сопоставима с выживаемостью больных ишемической болезнью сердца с поражением трех коронарных артерий или пациентов с Ш-1У стадиями болезни Ходжкина [130]. Частота смерти, обусловленной инфекционными осложнениями РА (которым больные РА подвержены в результате изменения иммунной реактивности, а также в результате применения у них иммунодепрессантов) в 9 раз, осложнениями со стороны почек — в 7 раз, со стороны желудочно-кишечного тракта (связанной, в основном, с побочными эффектами нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), необходимых больным) — в 2 раза выше популяционной. Социальную значимость РА следует оценивать как с точки зрения экономических потерь государства, так и с точки зрения боли, страдания и нарастающего ухудшения качества жизни отдельного пациента [42, 43, 44].

Через 20 лет от начала болезни примерно 90% пациентов, в большей или меньшей степени теряют трудоспособность, а треть становится полными инвалидами [38, 130, 136].

Оубклинически» текущий иммунопатологический процесс развивается-задолго до появлениях клинически очевидных признаков артрита. По- данным биопсии синовиальной оболочки, суставов признаки хронического синовита выявляются уже в самом начале болезни даже в клинически не пораженных суставах. Доказано, что предотвращение структурных повреждений на ранних стадиях заболевания способствует сохранению^ функциональной активности пациентов в долговременной перспективе [118, 138].

Однако вопрос ранней диагностики РА всерьёз вызывает затруднения у специалистов-ревматологов. Основная- причина подобных трудностей — недостаточная диагностическая значимость признаков, обнаруживаемых при физикальном осмотре, рутинных лабораторных и инструментальных исследованиях.

Основным субстратом ревматических заболеваний, в частности РА, является соединительная ткань, широко представленная в организме человека. Обмен соединительнотканных структур находится в динамическом равновесии. Так, известно, что эластин, нуждающийся в обновлении, и в норме подвергается деградации под воздействием эластазы. Изменения непосредственно в самой системе «эластин-эластаза» могут быть обусловлены как чрезмерной активностью протеолитического фермента (и тогда будет наблюдаться повышенная деструкция необходимого организму эластина), так и снижением его активности (с патологическим старением эластина, перестающего осуществлять свои функции).

Согласно современным предположениям, поражение соединительной ткани при ревматоидном артрите является следствием развивающихся иммунопатологических нарушений. Нормальный обмен эластина сопровождается образованием аутоантител к эластину и эластазе, что также, по

9 л. ' . ■ . . видимому, влияет на функционирование эластических структур соединительной^ ткани: При ревматических заболеваниях, возможно, включаются« механизмы; гиперпродукции аутоантител.: Это ведет к нарушению физиологического? соотношения? эластина, и эластазы, поскольку антитела обладают способностью блокировать ферментативную; активность веществ,, а также непосредственно разрушать субстрат фермента.

Надо отметить, что имеющиеся в литературе: сведения по изучению аутоантител к; эластину [67, 80} и эластазе [84, 165]: у больных РА не систематизированы и единичны. В связи с этим представляется актуальным: комплексное исследование у больных РА выше указанных антител с исследованием корреляций между их уровнями, что позволит выяснить некоторые детали патогенеза данного заболевания, будет способствовать более точной оценке активности патологического- процесса и выработке усовершенствованных способов диагностики РА и дифференциальной диагностики заболеваний суставов. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследования* является^ уточнение некоторых- звеньев патогенеза;. усовершенствование иммунологической: диагностики, дифференциальной диагностики при ревматоидном артрите с помощью изучения антителообразования-к эластину и эластазе.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Получить иммобилизированные формы эластина и- эластазы, изучить их физико-химические свойства.

2. Отработать условия, и технику проведения иммуноферментного анализа с использованием ИГАП на основе эластина и эластазы для определения соответствующих аутоантител.

3. Изучить . распространенность и концентрацию антител к эластину и эластазе в- сыворотке крови здоровых людей и определи ть границы нормы этих показателей.

4. На' основе отработанных методик изучить, содержание аутоантител к эластину и эластазе в сыворотке крови больных РА, в зависимости от активности, наличиявнесу ставных проявлений.

5. Исследовать взаимосвязь процессов« аутоантителогенеза к, эластину и эластазе у больных РА.

6. Изучить, содержание* аутоантител к эластину и.- эластазе в сыворотке крови больных, контрольной группы (больных подагрическим, псориатическим, реактивным- артритами, анкилозирующим спондилитом)- и количественно оценить эффективность: изучения антител к эластину^ и эластазе1 для дифференциальной диагностики- РА от других ревматических заболеваний.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые* для иммунодиагностики воспалительных заболеваний, суставов-разработаны и применены иммобилизированные формы эластина и эластазы, подобраны оптимальные концентрации антигенов1' и определены условия проведения иммуноферментного анализа с использованием ИРАП.

В сыворотке крови1 больных РА обнаружены антитела^ к эластину и эластазе. Показано, что их уровень достоверно' отличается^ от содержания данных антител в сыворотке крови- здоровых лиц и- больных с другими, ревматическими заболеваниями, протекающими- с выраженным суставным синдромом (подагрический артрит, псориатический артрит, реактивный артрит, анкилозирующий спондилит). Проанализирована зависимость указанных показателей от активности ревматоидного процесса, наличия^ внесуставных проявлений заболевания.

Впервые при РА изучены корреляционные связи между уровнями аутоантител к эластину и эластазе, а также показана связь повышения, антител с активностью патологического процесса, клиническими особенностями заболевания.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Разработан доступный для применения в клинических лабораториях способ определения уровня антител к эластину и эластазе, представляющий собой модификацию иммуноферментного анализа с использованием иммобилизированных в магнитоуправляемые гранулы белков в качестве антигенов.

Исследования показали достоверные различия в содержании антител к эластину и эластазе у больных РА и больных с различными воспалительными заболеваниями суставов (подагрический артрит, псориатический артрит, реактивный артрит, анкилозируюгций спондилит), что позволяет использовать данные тесты вместе с другими клинико-лабораторными показателями для дифференциальной диагностики этих заболеваний.

Уточнена взаимосвязь клинических проявлений РА, в частности поражений сосудов, сердца, крови и синовиальной оболочки, с наличием изучаемых антител.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Содержание антител к эластину и эластазе в сыворотке крови зависит от активности и клинических особенностей РА.

2. Определение уровня аутоантител может использоваться для диагностики активности патологического процесса при РА и дифференциальной диагностики с другими ревматическими заболеваниями, сопровождающимися суставным синдромом.

3. Наиболее ценным с диагностической точки зрения является определение иммуноферментным методом с помощью иммобилизированных антигенных препаратов в сыворотке крови антител к эластазе.

ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 1 -в издании, рецензируемом ВАК.

Основные положения диссертации были представлены на итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (2007-2010 гг.), II

Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские: научные чтения-2007» (Санкт-Петербург, 2007), XV Российском национальном конгрессе. «Человек и лекарство» (Москва, 2008), Национальном конгрессе; терапевтов (Москва; 2008),. Международной конференции «Физиология* и. патология иммунной? системы», IV Международной' конференции по иммунотерапии (Москва- 2008), симпозиуме EULAR (Копенгаген, Дания, 2009), Конференции «Актуальные проблемы современной , кардиологии и терапии» (Киров; 2009). Первичная, экспертиза; диссертации была проведена, на совместном; заседании Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ Клинической и экспериментальной- ревматологии; РАМН и кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» 09 декабря 2010 года (протокол №7). ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Методы определения антител к эластину . и эластазе иммуноферментным методом;' с помощью иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов- с магнитными свойствами внедрены в практику работы муниципального учреждения здравоохранения «Городская' клиническая больница скорой медицинской помощи; №25» города Волгограда.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация; изложена на. 155 страницах машинописного : текста и состоит из введенияj обзора литературы, глав с описанием использованных материалов и методов исследования; результатов собственных исследований; их обсуждений, выводов, практических рекомендаций и приложений. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 10 рисунками, 6 схемами, 5 выписками из истории болезни. Указатель литературы включает 199 источников, в том числе 58 на русском языке и 141 на иностранном.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны и апробированы способы получения иммобилизированных гранулированных препаратов с магнитными свойствами на основе эластина и эластазы в качестве антигенов. Полученные нерастворимые формы антигенов стали основой для непрямого варианта иммуноферментного метода определения антител у больных РА.

2. Применение иммобилизированной гранулированной формы эластина и эластазы в иммуноферментном методе позволило увеличить частоту выявления положительных значений антител к ним по сравнению с традиционным вариантом ИФА.

3. При изучении уровня антител к эластину в сыворотке крови практически здоровых людей значение оптической плотности 0,104 е.о.п. в ЕЫБА-тесте с использованием ИГАП было принято за верхнюю границу нормы, в случае с антителами к эластазе за верхнюю границу нормы принято значение оптической плотности 0,113 е.о.п. (показатели, превышающие эти и значения, считались положительными).

4. Изменение значений количества антител к системе «эластин- < эластаза» наиболее выражено было у больных РА со средней активностью, что сопровождалось преимущественным поражением сосудов, сердца, крови, синовиальной оболочки.

5. Уровни антител к эластину и эластазе у больных РА были выявлены достоверно более высокие по сравнению со здоровыми лицами (р<0,002 и р<0,001 соответственно) и больными псориатическим, подагрическим, реактивным артритами и анкилозирующим спондилитом (р<0,005 и р<0,002 соответственно). Сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей позволил определить, что наиболее чувствительным и специфичным тестом при проведении дифференциальной диагностики РА с другими ревматическими поражениями суставов (псориатическим, подагрическим, реактивным артритами и анкилозирующим спондилитом), является определение антител к эластазе.

6. Изменение уровня антител к эластазе в группе больных РА наблюдалось в 2,5 раза чаще, чем к эластину. Прямая корреляционная связь высокой силы между уровнем антител к эластину и эластазе при более высокой частоте обнаружения антител к эластазе позволяет говорить о компенсаторном синтезе антител к эластину при нарушении иммунного ответа к эластазе. Чувствительность метода определения антител к эластазе повышается при параллельном его применении с методом определения антител к эластину.