Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изоферментный спектр лактатдегидрогеназы в Т-лимфоцитах мышей в онтогенезе и при аутоиммунном заболевании

Установлено, что разнообразие функций лимфоидных клеток реализуется спектром их субпопуляций, неоднородность которых особенно велика среди Т-лимфоцитов. т-ллшлфоциты разделяются на множество категорий, характеризующихся различиями по времени жизни, способности к регуляции, чувствительности к облучению и различным биологическим агентам, подвижностью в электрическом поле, рецепторами клеточной поверхности и, что особенно важно, антигенными и биохимическими маркерами (Б.Д.Брондз, О.В.Рохлин, 1978).

В последние годы делаются попытки найти взаимосвязь между некоторыми иммунодефицитными состояниями посредством рассмотрения "биохимической анатомии" иммунной системы человека с учетом особенностей пуринового метаболизма в различных популяциях лимфоцитов, на разных стадиях их онтогенеза и функционального развития (Ma et ai, 1983). В этом отношении перспективным является изучение ферментативного профиля популяций лимфоцитов.

В настоящее время накоплено значительное количество фактов о цитоиммунологических особенностях лимфоцитов. Они характеризуют как состояние клеточной популяции в целом (М.В.Робинсон, 1982), так и отдельных субпопуляций лимфоцитов (З.А.Бутенко, Д.Ф.Глузман, К.П.Зак и др., 1974). Кроме того, ферментативный профиль популяций лимфоцитов оценивается при выявлении одного фермента, например, по активности АТФазы ( Mulier-Hermelink,

1974), кислой фосфатазы (Lisiewiez et al., 1976), щелочной фос-фатазы (Ruuskanen, Kouvaiainen, 1974), неспецифической Гэстеразы (Mueller et al, 1976), лактатдегщфогеназы (Plum, Ringoir,

1975), так и на основании совокупного комплексного подхода по сопоставимости активностей нескольких ферментов (Р.П.Нарвдссов, Л.К.Котосова, 1971). И наконец, изучение ферментативного профиля лимфоцитов широко используется при изучении аутоиммунных, имму-нодефицитных и лимфопролиферативных заболеваний (В.А.Труфакин, 1983, Д.Ф.Глузман и др., 1982). Среди комплекса цитохимического ферментативного анализа особое место занимает изучение изофер-ментного спектра. йзоферменты, как специфические продукты определенных генов, являются хорошими маркерами: с их помощью можно определять тип клетки по молекулярному составу, что значительно точнее, чем по морфологическим признакам. Соотношение изоферментов, как правило, более надежный показатель развития, чем степень изменения абсолютной концентрации определенного фермента или других белков (К.Раидер, К.Тейлор, 1983).

При этом внимания заслуживает определение изоферментов лак-татдегидрогеназы, которое широко используется при изучении процессов дифференцировки различных тканей (Markert, Mulier, 1959; Л.И.Корочкин и др., 1977). Наряду с этим, имеются только отдельные указания, что Т- и В-чЛимфоциты периферической" крови человека (Ringoir, Plum, 1975) И селезенки мышей (Plum et al, 1978) различаются набором изоферментов лактатдегидрогеназы, что спектры изоферментов лактатдегидрогеназы характеризуют тимоциты мышей с различной степенью зрелости (Plum et al, 1978; М.В.Робинсон, и др., 1980). Указанный метод еще недостаточно применяется для анализа различных популяций как в онтогенезе, при старении, так и при изучении различных иммунодефицитных состояний.

Открытие Т и В систем иммунитета и дальнейшее разделение Т- и В-клеток по функциональным признакам на отдельные субпопуляции позволило установить, что аутоиммунные цроцессы и старение сопровождаются нарушением оптимального соотношения Т- и В-лим-фоцитов и их субпопуляций ( De Heer, Edgington,1976; Т.Макино-дан, Э.Юнис, 1980; В.П.Лозовой, С.М.Шергин, 1981). Так, с возрастом снижается клеточно-опосредованный и гуморальный иммунный ответ на чужеродные антигены, увеличивается ответ на собственные антигены. Эти дефекты могут быть отражением инволюции тимуса, нарушением баланса среди регуляторных Т-лимфоцитов и нарушением баланса между идиотипической ж антиидиотипической активностями (Weksier, 1983). Обнаружено, что аутоиммунные реакции и состояния развиваются в результате уменьшения численности популяций т-лпимфоцитов (Dacie, 1975; Kruger et ai, 1976) и дисбаланса между хелперной и супрессорной субпопуляциями Т-лимфо-цитов (Lewin, 1975; Schwartz, 1977) с уменьшением активности Т-супрессоров (Allison, 1974; Waldman et al, 1977) И последующим рассогласованием процессов взаимодействия и кооперации между Т-И В-Лимфовдтами (Сох, Keast, 1973; De Heer, Edgington, 1976). Показано, что к дисбалансу популяций лимфоцитов и развитию аутоиммунного состояния может привести рассогласование процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов (В.А.Труфакин, 1983). Однако, многие стороны популяционных перестроек и нарушений в иммунной системе в динамике развития аутоиммунного процесса, а также при старении, до сих пор не известны. В то же время использование метода определения изоферментного спектра лактат-дегидрогеназы позволит не только вскрыть некоторые особенности дифференцировки лимфоидных популяций, но и выявить популяцион-ные перестройки в иммунной системе. Тем более, что эти изофер-менты являются "чистым" результатом ферментативной дифференцировки клеток и посредством анализа изменения их спектров в течение развития могут быть обнаружены основные механизмы клеточ

НОЙ дифференцировки (Markert, Ursprung, 1962).

Цель работы.

Цель проведенных исследований заключалась в изучении перестройки популяций Т-лимфоцитов мышей в онтогенезе и при развитии аутоиммунной патологии путем исследования спектра изоферментов лактатдегидрогеназы различных стадий дифференцировки Т-клеток.

Задачи исследования.

1. Описать изоферментный спектр ЛЩГ Т-лимфоцитов в процессе дифференцировки.

2. Определить активность изоферментов ЛДГ различных лимфо-идных популяций в онтогенезе интактной линии мышей С57В1/6.

3. Выявить изменение изоферментного спектра ЛДГ различных лимфоидных популяций в онтогенезе аутоиммунных мышей swiss.

Научная новизна.

Впервые показано, что в цроцессе дифференцировки Т-^димфоци-тов, начиная от стволовой кроветворной клетки и заканчивая имму-нокомпетентными т-ллимфоцитами периферических лимфоидных органов, происходит изменение спектра изоферментов ЛДГ.

Впервые выявлены изменения спектров изоферментов ЛДГ в популяциях клеток тимуса, селезенки и лимфатических узлов в онтогенезе, включая эмбриогенез, интактной линии мышей с57В1/6 и аутоиммунных мышей swiss. Определены особенности указанных спектров изоферментов ЛДГ при развитии аутоиммунного процесса.

Впервые установлено, что спектр изоферментов ЛДГ отражает популяционные перестройки в иммунной системе.

Практическое значение работы заключается в том, что использованный метод изоферментного анализа может быть применен в экспериментальной иммунологии дяя характеристики популяционных перестроек в лимфоидных органах. Результаты и методические подходы проведенных исследований могут служить основой для дальнейшего использования изоферментного анализа периферической крови и биопсийного материала у человека с целью диагностики, црогноза и контроля за лечением аутоиммунных, иммунодефищтных и лимфо-пролиферативных заболеваний.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Дифференцировка Т-лимфоцитов

I.I. Основные этапы дифференцировки Т-лимфоцитов

Иммунологическое распознавание начинается с контакта анти. гена с соответствующими рецепторами иммунокомпетентных лимфоцитов. Однако, прежде чем стать таковыми, лимфоидные клетки проходят многоэтапный путь дифференцировки. Каждый из этих этапов протекает в определенном микроокружении того или иного лимфоид-ного органа и связан с приобретением или утратой предшественником оцределенных свойств клеточной поверхности. Последние могут служить маркерами соответствующего этапа дифференцировки (Брондз, Рохлин, 1978).

Различают три фазы развития Т-лимфоцитов: раннюю (претими-ческую), центральную (тимусную) и периферическую (посттимическую) (Mulier-Hermeiink, steinmann, 1982). Ранняя Фаза имеет место в костном мозгу или кроветворных очагах в ходе эмбрионального развития. На этой стадии происходит развитие от полипотентной кроветворной стволовой клетки до Т-коммитированной претимической клетки-цредшественника. Последние, являющиеся предшественниками всех тимусных лимфоцитов, мигрируют в тимус из печени у эмбрионов и КОСТНОГО мозга у взрослых (Moore, Owen, 1976; Le Douarin, Joterean, 1975).

В течение претимического периода лимфоидные клетки проходят два качественно различных этапа дифференцировки (Miller, 1975). На первом этапе стволовая клетка теряет полипотентность и превращается в клетку лимфоидного ряда. Этот этап не зависит от тимуса и монет осуществляться при отсутствии последнего (на-цример, у мышей "nude" ). в обеспечении следующего этапа, по-видимому, принимает участие индуктор тимического происхождения (Komuro, Boyse, 1973), который действует на клетки, предетерми-нированные к прохождению через тимус.

Однако, до настоящего времени не ясно являются ли тимусные стволовые клетки частично дифференцированными по Т-клеточному пути перед тем, как они входят в тимус, и если это так, то какой уровень созревания достигается при этоъ!? Имеют. . ли клетки на этой стадии рецепторы для распознавания антигенов? Необходимо отметить, что Т-клетки распознают антигены в комплексе с собственными молекулами, закодированными в пределах основного комплекса гистосовместимости (МНС). Следовательно, они могут иметь как один рецептор для объединенной антигенной детерминанты, так и два рецептора, один для собственных, другой для чужих антигенов (Dougherty, Zinkernagel, 1975). В настоящее время не существует единого мнения относительно указанных воцросов. Последние исследования показали, что вероятнее всего тимусные стволовые клетки частично дифференцированны, и могут иметь рецепторы для распознавания антигена на цретимусном уровне (Morrissey et ai, 1982). Присутствие предшественников цитотоксических Т-клеток у мышей nude (Loore, Kindred, 1973; Ando, Hurme, 1981) является доказательством такой возможности созревания некоторых Т-клеток в отсутствии тимуса.

Миграция претимических предшественников через тимус является необходимым этапом созревания Т-лимфоцитов (Stutman, 1977). Это так называемая центральная фаза развития Т-лимфоцитов. Она включает последовательную дифференцировку клеток-предшественников Т-хелперов, Т-супрессоров и цитотоксических Т-лимфоцитов. Иначе говоря, тимическое микроокружение и антигены главного комплекса генов гистосовместимости, присутствующие на нелимфоид-ных тимических клетках, являются необходимым сигналом для завершения дифференцировки Т-клеток (Papiernik, Bach, 1979).

Установлено, что внутри тимуса популяция лимфоидных клеток морфологически и функционально гетерогенна. Met calf, Wi-adrowski (1966) предполагают, что подобная гетерогенность зависит от одновременного обнаружения тимоцитов одной клеточной линии на различных стадиях созревания: предшественники тимоцитов кортикальные тимоциты медулярные тимоциты. Miller (1975) утверждает, что в этом органе содержатся лимфоидные клетки разных линий. После выхода из тимуса они, вероятно, также проходят несколько стадий созревания. Б результате из функциональных незрелых клетки превращаются в иммунологически компетентные. Последнее совпадает с появлением на их поверхности остатков сиаловых кислот и с приобретением свойств мигрировать в определенные органы и их зоны (Weissman et al, 1982).

Необходимо отметить, что существует множество работ, посвященных влиянию тимуса на дифференцировку Т-клеток как in vivo так и in vitro. Однако "тимология" в настоящее время вступает в новую фазу развития: поиск процессов тонкой дифференцировки и попытка приписать каждый дифференцировочный сигнал к определенному типу клеток. Наиболее трудной проблемой является анализ нелимфоидных компонентов тимуса (Papiernik et al, 1983).

Тимусная строма играет важную роль за счет контактов с дифференцирующимися лимфоидными клетками (Schrader, 1982). Независимо от того, генерируется множество рецепторов цретимиче-ски или интратимически, строма играет решающую роль в селекции рецепторов. В соответствии с гипотезой Jerne (1971) цредпола-гается, что строма может запускать процесс, приводящий к разнообразию. Клеточный состав стромы и экспрессия МНС антигенов на стромальных элементах, которые могут влиять на самораспознавание МНС и индукцию толерантности, являются вопросами, представляющими большой интерес.

Скажем только, что существует определенная последовательность взаимодействия лимфоидных и стромальных клеток при созревании в тимусе ( Kyewsky et al, 1982), в результате которой клетки приобретают способность к распознаванию "своего" ( Zinkerna-gel, 1982).

После указанного выше "курса обучения" из тимуса выходят относительно зрелые Т-клетки и заселяют периферическую лимфоид-ную ткань (Burleson, Levey, 1972). Селезенку заселяют нерецир-кулирующие короткоживущие Tj-лимфоциты с фенотипом Lyt - I, 2, 3, а Т2-лимфоциты лимфоузла являются долгоживущей рециркулиру-ющей популяцией с фенотипом Lyt - I или Lyt - 2, 3. При этом происходит дальнейшее созревание Т-клеток - совершенствование и специализация их иммунокомпетентности. Она заключается в разделении на субпопуляции, несущие различные наборы Lyt -антигенов. В одних субпопуляциях возникает способность к взаимодействию с В-^шмфоцитами и к индукции ГЗТ (Т-хелперы с фенотипом Lyt - I), а в других - к образованию киллеров и супрессоров фенотип byt - 2, 3) (Cantor, Boyse, 1975). Данная периферическая фаза имеет место в периферических лимфоидных органах и включает дифференцировку и кооперацию эффекторных клонов. Б.Д.Брондз (1978) предложил следующую схему дифференцировки Т-лимфоцитов (Рис. Г). Из приведенной схемы следует, что возможны альтернативные пути конечных этапов дифференцировки Т-лимфоцитов. Клетки-предшественники тимоцитов дифференцируются в кортикальные и медуллярные тимоциты либо последовательно (Aj), либо независимо (Ag); медуллярные тимоциты являются источником периферических Т-клеток, а кортикальные погибают внутри тимуса (Ej), или обе категории тимоцитов дают начало периферическим Т-клеткам. И наконец, как ранние Т-клетки с фенотипом Lyt - I, 2, 3 дифференцируются в "зрелые" Т-клетки с фенотипом Lyt - I и Lyt - 2, 3. Выбор между указанными путями в настоящее время не представляется возможным и какие-либо предположения по этому поводу были бы преждевременными.

Рис. I. Схема дифференцировки Т-лимфоцитов (Брондз, 1978).

1.2. Антигенные клеточные поверхностные маркеры Т-клеток

По современным представлениям созревание клетки, в том числе Т-лимфовдта, заключается в стенотипическом выражении генетически детерминированной программы. Оно осуществляется под влиянием молекул (очевидно гормонов тимуса), реагирующих с соответствующими поверхностными рецепторами детерминированных клеток (Bach et ai, 1975), и выражается в появлении антигенных клеточных поверхностных маркеров. Такие маркеры, которые являются продуктами последовательной селективной деятельности генов, и которые обнаруживаются на одном или нескольких типах клеток данной особи, называются антигенами дифференцировки (Boyse, Old, 1969).

Thy -I (8) аллоантиген представляет наибольший интерес как маркер Т-клеток, как дифференцировочный антиген, и как клеточно-поверхностный белок, который важен при межклеточном распознавании. Thy -I эксцрессируется на тимоцитах, периферических Т-клет-ках, на тканях мозга, эпидермисе и фибробластах (Raff et ai, 1975). Thy -I антиген может быть индуцирован в тканях костного мозга под действием тимусного гормона (Goldstein et ai, 1977). Его экспрессия находится под 1г -генным контролем.

Установлено, что Thy -I является гликоцротеидом и эксйрес-сируется на поверхности клеточной мембраны, но не попадает в цитоплазму (Barclay et al,I976).

Lyt-антигены. Boyse et ai (1968) впервые описал Ly антигены (в современной терминологии Lyt ) и показал, что они эксп-рессируются на тимоцитах и периферических Т- и В-лимфоцитах. Известно несколько Lyt систем: Lyt -I, Lyt -2, Lyt -3 . Незрелые кортикальные тимоциты имеют фенотип Lyt l+, 2+, 3+. В селезенке

50% таких клеток (Lyt-I+, 2+, 3+); 33$ имеют фенотип Lyt-I+ (Т-хелперы) и Т7% — Lyt-2, 3 (Т—супрессоры и цитотоксические т-лимфоциты) (Kisielow et al, 1975). Lyt-5, 6, 7, 8 - антигены, выявляемые как на Т-лимфоцитах, так и на В-лимфоцитах. Киллеры несут антигены Lyt-5 и Lyt-6.

Qa-антигены. Между D и TLa локусами главного комплекса гистосовместимости у мышей находится регион Qa, имеющий серологически определяемые локусы Qa-I, Qa-2 и Qa-З. Продукты этих субрегионов экспрессируются на поверхности субпопуляций Т-лимфоцитов. Qa-l+ фенотип ограничен специфически индуцированной супрес-сорной активностью (Stanton et al, 1978). Локус Qa-2 представлен двумя клеточными поверхностными антигенами (Michaeison et al, 1977). Один белок эксцрессирован на Т-^лимфоцитах в тимусе, лимфатических узлах и селезенке; второй - только на периферических Т-лимфоцитах. Michaeison et al (1977) указывает, что этот антиген представляет большой интерес в плане развития клетки. При отсутствии tl антигена эксцрессируется Qa-2. И если это так, то Qa-локус может кодировать фермент, участвующий в фосфо-ршгировании, гликозилировании и дегликозилировании мембраны лимфоцита, что приводит к смене одного антигена (TL) на другой (Qa).

TL-антиген. Тимусный лейкемический антиген является уникальным Т-клеточным антигеном, аллельные варианты которого ограниченно эксцресаадются на незрелых кортикальных тимоцитах (TL I, 2, 3, 4, 5) и лейкемических клетках (TL - 4), что позволяет считать ть -антиген - дифференцировочным антигеном. TLa-локус является полиморфным и некоторые линии, такие как akr , С57В1/6, gba, сзн, не эксцрессируют TL -антиген в тимусе. Ва1Ъ/с, dba/2 - являются TL - положительными линиями (Loor et al, 1975). TL отрицательные - клетки могут экспрессировать TL антиген в случае TL положительного микроокружения в тимусе, а также после инкубации с тимическим экстрактом (Komuro, Boyse, 1973).

Gjv-антиген. Gj^-антиген впервые описан stockert et al (1971) как антиген, идентичный гликоцротеиду оболочки вируса Гросса, индуцирующего лейкоз у мышей. Эксцрессируется главным образом на тимоцитах. У стареющих мышей выявляются также на Т-лимфоцитах селезенки и лимфатических узлов.

Th-B. Th-B - маркер общего лимфоидного предшественника Ти В-клеток мышей. Этот антиген найден в больших клетках субкап-сулярной зоны тимуса, в 56% кортикальных и в 3% медуллярных ти-моцитов, в В-лимфоцитах костного мозга и в 10% В-клеток селезенки. Отсутствие антигена Th-B в зрелых иммунокомпетентных Т-клетках свидетельствует о том, что он является стадноспецифическим антигеном раннего этапа дифференцировки общего предшественника Т- и В-клеток, исчезающим в ходе их созревания (stout et al, 1975).

Особый интерес представляет обнаружение в медуллярных тимо-цитах крыс специфического антигенного маркера периферических Т-клеток в "маскированной" форме - RMTA (у мышей шъа ), который сменяет антиген rbmla тимоцитов кортикальной зоны, ежа -антиген найден также в 100% Т-клеток грудного лимфатического протока и лимфоузлов, в 58-68% Т-клеток селезенки (Goldschne-ider, 1976).

Т-200. Т-200 - антиген Т-лимфоцитов. С помощью моноклональ-ных анти-Т-200 антител в большом количестве обнаружен на кортикальных тимоцитах, и в небольшом количестве - в мозговом веществе.

Изучение дифференцировки тимоцитов несомненно облегчается маркерами, которые позволяют идентифицировать и разделять клетки на различных стадиях созревания. Однако, следует иметь в виду, что при выборе антигенных маркеров необходим индивидуальный подход в каждой конкретной ситуации. Такдь антиген, обнаруживающийся на функционально незрелых субпопуляциях, экспрессиру-ется лишь у некоторых линий мышей и использование этого маркера ограничено (Flaherty, Dorf, 1981). Экспрессия других клеточных поверхностных антигенов различается количественно. Изучение структур поверхностных антигенов лимфоцитов также затруднено в силу малого количества белка, приходящегося на одну клетку. Некоторые современные методы, возможно, обеспечат существенную базу для изучения структур главного комплекса гисто-совместимости. Особую важность имеет развитие метода клеточной гибридизации, который позволяет получать большое количество моноспецифической антисыворотки (Hunter et al, 1978).

В последнее время опубликован ряд работ, посвященных изучению распределения и анатомической локализации субпопуляций Т-лимфоцитов с помощью высокоспецифичных моноклональных антител как к известным антигенным маркерам Thy - I, Т-200, Lyt Lyt2 (Ewijk et al, 1981), так и к новым дифференцировочным антигенам. Так, антигены Т6 и M24I выявляются на большей части кортикальных тимоцитов и не обнаруживаются на медуллярных тимо-вдтах мышей. Эти антигены сходны по своей структуре и являются новым типом антигенов I класса главного комплекса гистосовмести-мости мышей (Van de Rijn et al, 1983).

Sidman et al (1983) использовали моноклональные цитотокси-ческие igM антитела, обозначенные В I4-2-I4, которые реагировали с тимоцитами мышей разных линий. Т-клетки с данным маркером отсутствовали у nude мышей в селезенке, в лимфоузлах было выявлено лишь небольшое количество этих клеток. Среди тимоцитов клетки с В I4-2-I4 антигеном частично перекрывались с клетками, несущими TL антиген, а так же с клетками, реагщ>ующими с агглютинином арахиса. Цри биохимическом анализе установлено, что В I4-2-I4 антитела, анти TL-антитела и агглютинин арахиса реагируют с различными поверхностными структурами клеток тимуса. Таким образом, моноклональные антитела против.новых диф-ференцировочных антигенов Т-клеток могут быть использованы в качестве дополнительных маркеров для идентификации и выделения Т-лимфоцитов различной стадии дифференцировки.

Однако, при использовании такой высокоспецифической техники, как моноклональные антитела, существуют некоторые проблемы и возможны ошибки при идентификации клеточных популяций. Например, перекрестная реактивность с идентичными эпитопами (перекрестная реакция моноклональных антител с Т-клетками и с нейронами Пуркинье); генетический полиморфизм цри некоторых отрицательных реакциях (случаи полиморфизма антигенов ОКТ-4 на Т-хелперах); нарушение эксцрессии или снижение числа эпитопов (на опухолевых клетках), а также многочисленные технические цроблемы (Thiel, 1983).

Пролиферативный ответ in vitro. Трансформация и пролиферация Т-клеток in vitro в ответ на различные стимулы (ФГА, Кон А, аллогенные лимфоциты) могут быть использованы как маркеры Т-клеток, так как отвечают на эти стимулы только Т-лимфоциты определенной стадии дифференцировки: зрелые медуллярные тимо-циты и периферические Т-клетки.

Известно, что Т-%лимфоциты ранних стадий дифференцировки лизируются глюкокортикоидными гормонами. Многочисленные исследовання показали, что стероидные гормоны связываются глгоко-кортикоидными рецепторами и переносятся в ядро. Дальнейшие события, приводящие к лизису клетки, остаются неясными (Sibley, Yamamoto, 1979; Harmov, Thompson, 1981). Однако, С ПОМОЩЬЮ глюкокортикоидов можно выделить кортизолрезистентную, зрелую популяцию медуллярных тимоцитов. С другой стороны, медуллярные тимоциты можно выделить с помощью лектина земляного ореха (РИА - peanut agglutinin) (Reisner et al, 1976). Этот лектин специфически связывается с остатками галактозы, pna цредпочтительно агглютинируется с кортикальными клетками; но не связывается с медуллярными, поверхностные гликопротеины которых более сиализированы (Despont et al, 1975). С другой стороны, агглютинин омара LAgE (Lobster agglutinin), который специфически связывает сиаловую кислоту может быть использован для выделения кортикальных тимоцитов.

Herron et al(I983) предложили модель, объясняющую связывание LAgl и ША с тимоцитами на разных стадиях созревания. Незрелые тимоциты имеют поверхностные гликоцротеины и гликолипи-ды, которые не сиалированы. Эти клетки являются LAgl отрицательными, но РИА положительными. По мере созревания тимоцитов остатки D-галактозы экранируются сиаловыми кислотами и клетки этой промежуточной стадии дифференцировки будут как LAgE-, так и РИА положительными. Наконец, зрелые тимоциты, имеющие на своей поверхности большое количество сиаловых кислот, будут иметь фенотип LAgE+ и РИА"". Селекция по РИА положительным клеткам даст как незрелые, так и промежуточные тимоциты, LAgl отрицательные клетки будут незрелой популяцией тимоцитов. Что касается сиаловых кислот, то они играют, во-первых, рецепторную роль, и ,во-вторых, выступают в качестве антигенов дифференцировки (Schaues, 1983).

Таким образом, с помощью поверхностных антигенных маркеров могут быть охарактеризованы различные этапы дифференцировки Т-лимфоцитов. Корреляции, существующие между функциональными субпопуляциями Т-клеток и дифференциальной экспрессией поверхностных маркеров, обеспечат базу для понимания молекулярных процессов клеточной иммунологии (Hunter et al, 1978).

Таблица & I. Маркеры субпопуляций Т-клеток

Клетки Антигены про- ТИМОЦИТЫ кортикальные ТИМОЦИТЫ медуллярные ТИМОЦИТЫ " периферические Т-клетки

Thy-I (0) — + + + + +

TL — + + + — —

Н-2 + + + + + + + +

Qa — — + + + +

Lyt LytI+2T3+ + + + Lyt I+ Lyt I-хелперы Lyt 2,3-cynpec-соры и цитоток-сические клетки

GIX — + + + —

Т-200 — + + + +

Th-B + +• + + + + -

RMPA RBMLA RMTA RMTA RMTA

1.3. Биохимические маркеры Т-клеток

В процессе дифференцировки Т-клеток выявляется также существенная закономерность изменения ферментативного црофиля лимфоцитов.

С момента открытия Маркертом (Markert, Molier, 1959) изоферментов было обнаружено множество изоферментных систем, исследование которых цроводилось по многим направлениям: распределение изоферментов в тканях и клетках в норме и при патологии, роль изоферментов в обмене клеток, изменение изоферментов в различных функциональных состояниях и при патологических процессах. Наиболее широкий размах получили исследования изменений изоферментов в цроцессе онтогенеза. Изоферменты являются чистым результатом ферментативной дифференцировки клеток и посредством анализа изменений их спектров в течение развития могут быть выявлены основные механизмы клеточной дифференцировки.

Первые данные об изоферментах были получены при исследовании лактатдегидрогеназы (ЛДГ; L -лактат, НАД-оксиредуктаза, КФ.1.1.1.27), ключевого фермента гликолиза, катализирующего обратимое превращение пирувата в лактат, генетический контроль которой исследован достаточно полно. Известно, что молекула ЛДГ является тетрамером, построенным из двух типов полипептидных субъединиц А и В, синтез каждой из которых контролируется самостоятельным геном. Поскольку возможны любые сочетания субъединиц в тетрамерах, то существует 5 изоферментов ЛДГ, разделяемых с помощью электрофореза,а именно: А^ (ЛДГ-5 - медленная форма), АдВ, -^3 и " Острая форма). У мышей гены, контролирующие синтез А и В полипептидов, локализовалы в разных группах сцепления. Органоспецифические особенности и распределение изоферментов ЛДГ проявляются также и на уровне различных типов клеток (ЛДГ-1 идентифицирован в желточных пластинках, ЛДГ-2 - эпителиальных клетках яйцевода, ЛДГ-3 -в цитоплазме яйца) (Корочкин, 1977). У таких хорошо генетически изученных млекопитающих, как мыши, изменения спектра изо-ферментов ЛДГ наблюдаются в эмбриогенезе, и более отчетливо в постнатальный период жизни. Б эмбриональных тканях преобладает ЛДГ-5. Физиологически это объясняется тем, что ЛДГ-5 обладает способностью интенсивно функционировать в анаэробных условиях. Ее активность максимальна при тех концентрациях пирувата, которые ингибируют ЛДГ-4. По-видимому, преобладание ЛДГ-5 должно обеспечивать быстрое превращение пирувата в лактат (Markert, Ursprung, 1973).

По мере тканевой и клеточной дифференцировки наблюдается постепенный сдвиг в сторону ЛДГ-1, затрагивающий разные ткани в разной степени (например, в дифференцирующихся скелетных мышцах и печени - изменения незначительны, преобладает ЛДГ-5, в сердечной мышце - отчетливо наблюдается переход от ЛДГ-5 к ЛДГ-1). ЛДГ-1 в большей степени катализирует аэробное окисление накопившегося лактата в пируват, то есть обеспечивает начальный этап аэробного превращения углеводов (Markert, Ursp-rung, 1962).

Однако, анализ изоферментов еще недостаточно применяется при исследовании гистогенеза популяций лимфоцитов. Имеются отдельные указания, что Т- и В-лимфовдты периферической крови человека различаются набором изоферментов ЛДГ. Т-лимфоциты имеют большую активность ЛДГ-1, чем В-димфоциты при наличии всех 5-ти фракций, что может означать больший аэробный гликолиз в Т-клетках (Ringoir, Plum, 1975). Позднее эти же авторы оцределили ЛДГ изоферменты в и клетках в сравнении с тимоцитами и Т-лимфоцитами и Т-лимфоцитами периферической крови. Оказалось, что почти нет различий в спектрах между периферическими Т-лимфоцитами и клетками, и между тимоцитами и клетками. Авторы предполагают, что тимоциты и клетки демонстрируют незрелый спектр ТО1 по отношению к клеточной популяций ( Plum, DeSmedt, 1980).

Были изучены изоферменты ЛДГ периферических Т лимфоцитов у человека, разделенных по плотности в линейном градиенте фи-колла и установлена высокая степень корреляции между плотностью клеток и спектрами ЛДГ (Van de Griend et al, 1980). На основании полученных данных авторы утверждают, что уровень зрелости "тяжелых" Т лимфоцитов находится на промежуточной стадии между тимоцитами и зрелыми "легкими" Т-лимфоцитами. Это согласуется с результатами, полученными при разделении тимоцитов мышей (Plum et al, 1978), и является подтверждением модели Т-клеточного созревания, предложенной stutman (1977), согласно которой частичное созревание лимфоцитов происходит в циркуляции.

Matamotos et al (1982) изучали изоферменты ЛДГ Т-лимфоцитов больных первичной гипогаммаглобулинемией, Van de Griend et al (1982) - после тимэктомии и при старении.

Кроме того, имеются данные о спектрах изоферментов ЛДГ в лимфоцитах тимуса, селезенки, лимфоузлов и в разделенных Т- и В-клетках мышей (Plum et al, 1978). Оказалось (Plum et al, 19786), что выделенные популяции Т- и В-лимфоцитов характеризовались преимущественно ЛДГ-4 и ЛДГ-5 фракциями. Активность ЛДГ-5 была значительно выше в В-клетках (ЛДГ-5), чем в Т-клетках (ЛДГ-4, 5). Различные спектры фермента в Т-и В-лимфоцитах могут быть обусловлены функциональными различиями между этими клетками. Спектр ЛДГ В-лимфоцитов мыши, содержащий больше ЛДГ-5, отражает более анаэробный характер их метаболизма, чем Т-лимфоциты.

Популяции клеток лимфоузла мыши в отношении спектров ЛДГ похожи на очищенные Т-лимфоциты, тогда как популяция клеток селезенки имеет спектр, схожий со спектром В-клеток. Сказанное, по-видимому, обусловлено более высоким содержанием Т-клеток в лимфоузле и В-клеток - в селезенке (Plum et al, 1978а).

Что касается спектра фермента в тимоцитах, то присутствие ЛДГ-1 и 2 вместе с ЛДГ-3, 4, 5 позволяет четко различить тимо-циты от периферических Т лимфоцитов. Последние содержат только ЛДГ-3, 4 и 5, причем активность ЛДГ-5 значительно выше в периферических Т-лимфоцитах, чем в тимоцитах (Plum et al,I978a). Обогащение тимоцитов более зрелыми клетками привело к снижению процента активности ЛДГ-4, 5. Сказанное позволило считать, что ЛДГ-изоферментные спектры характеризуют различные степени зрелости тимоцитов (Plum et al, 19786). Клетки, полученные в результате разделения по скоростям седиментации обладают спектрами с меньшим содержанием ЛДГ-1, 2 и большим содержанием ЛДГ-4, 5, что позволяет рассматривать их как более зрелую клеточную популяцию. Указанный факт согласуется с данными, согласно которым кортизолрезистентные, а, следовательно, более зрелые тимоциты Cracobsson, Biomgren, 1972) имеют более высокую, по сравнению с кортизол-чувствительными тимоцитами, скорость седиментации fofeissman et al, 1975).

Были также исследованы изоферментные спектры претимиче-ских клеток-предшественников (Plum et al, 1979) 14-дневного эмбрионального тимуса. Эта клеточная популяция находится на более ранней стадии Т-клеточного развития, чем те, которые изучались до сих пор. Оказалось, что спектр ЛДГ-З, 4, 5 этой клеточной популяции показал более высокий цроцент активности ЛДГ-5 по сравнению с кортикальными тимоцитами.

Таким образом, выявлены спектры изоферментов лактатде-гидрогеназы отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов. Однако, динамика изоферментного профиля ЛДГ на последовательных этапах дифференцировки от стволовой кроветворной клетки до иммуно-компетентных периферических Т-лимфодатов остается пока не ясной.

Одним из первых ферментов, активность которого была прослежена на последовательных этапах дифференцировки Т-лимфоцитов, является щелочная фосфатаза (АР - alkaline phosphatase ). Наиболее подробно изучена активность щелочной фосфатазы в лим-фоидных органах морской свинки. Активность фермента была выявлена на клеточной мембране тимоцитов с помощью электронного микроскопа. Ruuskanen и Kouvalainen (1974) предложили схему изменения активности щелочной фосфатазы в течение дифференцировки тимоцитов морской свинки: стволовые клетки АР

Предполагается, что стволовые клетки АР-негативны. Кортикальные тимоциты содержат высокую активность щелочной фосфатазы, которая исчезает или значительно уменьшается в процессе созкортикальные медуллярные периферические тимоциты * тимоциты ж Т-клетки АР +++ АР +- АР - ЭЭ%

АР + 1% ревания в медуллярные тимоциты. АР-негативные тимощты обладают миграционными свойствами зрелых тимоцитов (Ruuskanen, 1975). Большинство периферических клеток АР-негативны, только 1% клеток остается АР-позитивными в процессе созревания (Ruuskanen, Kouvaiainen,I974). Возможно, что АР-позитивные тимоциты содержат две различные линии клеток: одна в процессе созревания дифференцируется в АР-негативные, а другая остается АР-позитивной и мигрирует в селезенку. Популяция Т-клеток лимфатических узлов в основном АР-негативна и состоит из зрелых медуллярных тимоцитов (Ruuskanen, 1975).

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) была открыта Boiium (I960). TdT эксцрессируется только в тимусе и в некоторых клетках костного мозга, то есть она выявляется избирательно в незрелых лимфоидных клетках, особенно Т-клетках. Показано также, что большинство TdT-позитивных клеток в 1фови молодых крыс и мышей являются посттимусными клетками, о чем свидетельствует их отсутствие у мышей nude (хотя в костном мозге мышей nu/nu их выделяют). По наличию фенотипических маркеров предполагается, что они происходят непосредственно из кортикальных тимоцитов (Goldschneider, 1982).

Эта трансфераза была найдена также в неопластических клетках при острой лимфобластической лейкемии и в различных тимус-зависимых клеточных лейкемиях и клеточных линиях лимфом у человека И МЫШИ (Gallo, 1975; McCaffrey et al, 1978), так как неопластические условия могут проявлять примитивные характеристики, относящиеся к задержке дифференцировки. TdT не оцре-делялась в нормальных и неопластических клетках, проявляющих В-зависимые клеточные характеристики. Этот фермент, выявляемый в малых лимфоцитах коры тимуса, особенно интересен, поскольку он единственный фермент среди тимощто специфических продуктов, для которого функции определены только предположительно (Baltimore, 1974; Bollum, 1974, 1978).

TdT является полимеразой, которая изготовляет ДНК без копирования матрицы. Следовательно, этот фермент может добавлять ошибочные основания или вводить длинные цромежутки негомоло-гичности в цромежуток между двойной спиралью ДНК. Такая отрегулированная в процессе развития мутагенная активность может цринимать участие в создании разнообразия' иммунологического репертуара ( Baltimore, 1974; Bollum, 1978).

Эта гипотеза зависит от предположения, что TdT -положительные клетки включают предшественников иммунных клеток-эффекторов. Конечно же, малые кортикальные тимоциты слабо реактивны в функциональных тестах и долгое время рассматривались как незрелые Т-клетки (Cantor, Weissman, 1976). Вне тимуса единственными клетками, которые эксцрессируют TdT, являются редкие тимоциты костного мозга, которые могут включать прети-мические клетки (Kung et al, 1975; Silverstone et al, 1976). Таким образом, трансфераза рассматривалась как специфический маркер молодых Т-лимфоцитов, активность которого исчезает с достижением клетками функциональной зрелости. Роль этого фермента остается спорной в силу нескольких причин. TdT-положительные малые кортикальные тимоциты индивидуально имеют низкую вероятность дать начало иммунокомпетентным клеткам. Они являются неделящимися дочерними клетками, потомками больших тимус-ных лимфобластов. Их в 10-20 раз больше, чем количество клеток, мигрирующих из тимуса. В течение нескольких дней большинство кортикальных клеток мутирует in situ или исчезает (Scoi-lay, 1980). Если некоторые TdT-положительные клетки и являются выжившими предшественниками, то их очень трудно выделить из этой популяции. Регистрация TdT-положительных клеток костного мозга позволяет предположить, что трансфераза может быть эксцрессирована стволовыми клетками перед тем, как они заселяют тимус (Kung et al, 1975; Silverstone et al, 1976). Однако до сих пор не понятно, как много TdT-положительных клеток в мозге является Т-клеточной линией; в тех случаях, когда они были изолированы в культуре, указанные клетки превращались в ранние В-клетки (Whitiock, Witte, 1982) или нулевые клетки (Schrader et al, 1979).

В настоящее время показано, что появление активности в лимфоцитах связано с прохождением клетками в процессе дифференцировки стадий цре-В- или цре-Т-лимфоцитов (Boiium, 1982; Goldschneider, 1982).

Хотя значительная часть проводимых исследований связана с изучением распределенияамт в субпопуляциях Т-клеток, до сих пор мало известно о биохимической црироде этого фермента и молекулярных механизмах, контролирующих экспрессию TdT . С помощью целлюлозной хроматографии выявлены два пика активности фермента (пик I и пик 2) у мышиных тимоцитов, которые серологически идентичны (Kung et al, 1975; Pazmino, Ihle, 1976). Однако, пока неизвестно, являются ли эти два пика активности различными ферментами или один фермент существует в двух формах. Предполагают, что оба пика связаны с различными популяциями тимоцитов и имеют межлинейные и возрастные отличия в распределении их активностей (Pazmino, ihle, 1976). Пик I наиболее тесно связан с малой популяцией тимоцитов, характеризующейся низкой плотностью и устойчивостью к гидрокортизону, определяется в различных линиях мышей и в разных возрастных периодах в сравнимых специфических неменяющихся активностях. Он также присутствует в клетках опухоли (полученных из тимуса, селезенки и лимфатических узлов) в количествах, идентичных нормальным тимоцитам. Пик 2 выявляется в большой популяции тимоцитов, характеризующейся чувствительностью к гидрокортизону и промежуточной плотностью. Он был также обнаружен в малых, но в определяемых количествах в костном мозге. Б противоположность I пику, 2 пик трансферазы имеет межлинейные и возрастные отличия. У таких линий мышей, как HIH, Swiss и akr, 2 пик активности исчезает с возрастом и к месячному возрасту составляет менее Ъ% от первоначального уровня. У мышей других линий (С57В1/6) снижение активности этого пика начинается лишь к 4-6-месячному возрасту и к 8-ми месяцам составляет 15% от исходного значения (Pazmino, ihie, 1976). Снижение активности 2 пика происходит и в неопластических образованиях. Причина этих изменений пока не известна. Возможно они связаны с изменениями внутри популяции кортизолчувствительных клеток, которые могут возникать вследствие изменений тимусного мшф о окружения или изменения тимусных факторов, требующихся для их индукции и экспрессии.

Обработка бестимусных мышей nude и тимэктомированных ' С57В1/6 тимозином (5 фракция) восстанавливала уровеньTdT в костном мозге до нормы (Pazmino et al, 1978). Это указывает на прямой гормонально-зависимый эффект экспрессии тат. Однако у "nude" мышей идет восстановление только I пика активности TdT, а у тимэктомированных мышей С57В1/6 - как I, так и 2 пика. Эти данные демонстрируют, что клеточный ответ на тимические факторы зависит от линейных различий.

20-Д,-оксистероиддегидрогеназа (20oiSDH ) - является новым ферментным маркером пре-Т и Т-лимфоцитов. 20oteDH восстанавливает прогестерон до 20 ^-оксипрогестерона. Этот фермент найден во многих лимфоидных органах. 2Qdsm обнаруживается в костномозговых цре-Т-лимфоцитах, медуллярных тимоцитах и зрелых Т-лимфоцитах. В то же время, терминальная дезоксинуклео-тидилтрансфераза выявляется в других Т~лимфоцитах - малых костномозговых клетках и в кортикальных тимоцитах. Предполагается, что медуллярные тимоциты происходят от больших костномозговых клеток, обладающих 20<*sdh - активностью, а кортикальные тимоциты - от малых костномозговых лимфоцитов, обладающих TdT активностью, но не имеющих 2CUSDH . Таким образом, TdT и 2cb(SDH положительные Т-лимфоциты относятся, по-видимому, к гистогене-тически различным субпопуляциям (Weinstein, 1982).

Предполагается, что для нормального развития лимфоцитов важны следующие ферменты, входящие в пуриновый метаболизм, а именно: аденозиндезаминаза (ADA), пуриннуклеозидфосфорилаза (enp), аденозинкиназа (АК), де зоксицитидинкиназа (dGRK) и 5' -нуклеотидаза (51 -ш?).

Фермент 5'-нуклеотидаза катализирует дефосфоролизацию нуклеозид-б'-монофосфатов. Биохимически и цитохимически было показано, что этот фермент связан с плазматическими мембранами клеток. Depierre, Karnovsk^ (1974) определили 5'-нуклеотидазу как " эктофермент" с широким спектром тканевого распределения. Предшжагают, что различная экспрессия этого фермента в лимфоидных популяциях связана с клеточной дифференцировкой. Barton и Goldschneider (1978) показали, что активность б'-нуклео-тидазы в Т-зависимых зонах лимфоузлов и в селезенке выше, чем в тимоцитах как у крыс, так и у мышей. Высокий уровень активности 5' -нуклеотидазы избирательно связан с плазматическими мембранами периферических Т-клеток. Несмотря на то, что 5'-nt не является специфическим маркером при острой лейкемии или различных лимфомах, биохимически измеряемые различия в экспрессии этого фермента служат хорошим показателем для выяснения степени зрелости лимфатических клеток цри классификации различных групп этих заболеваний у человека (Gutensohn et al, 1983).

Открытие дефектов ферментов пуринового метаболизма, аде-нозиндезаминазы и пуриннуклеозидфосфорилазы, связанных с им-мунодефицитными заболеваниями (Gibiett et al, 1972), вызвало значительный интерес в плане связи пуринового метаболизма в лимфоцитах с иммунными функциями.

ADA катализирует дезаминирование аденозина и 2'-дезокси-аденозина до инозина и дезоксиинозина соответственно. Оба субстрата для ada также фосфорилируются с помощью фермента адено-зинкиназы в дезоксиаденозинмонофосфат. Дезоксиаденозин является также субстратом для дезоксицитидинкиназы.

PNP катализирует превращение инозина, дезоксиинозина, гуанозина и дезоксигуанозина до их пуриновых оснований и рибо-зы или дезоксирибозы-1-фосфата. Из этих субстратов ШР только дезоксигуанозин фосфорилируется до дезоксигуанозинмонофосфата (dGMP ) под действием dCRK.

Дефекты этих ферментов блокируют выработку гипоксантина, цроисходит избыточное накопление АТФ в тканях, что блокирует по неизвестным причинам созревание Т-клеток (Р.В.Петров, 1982). Что касается исследований, проведенных на экспериментальных животных, то активность этих ферментов, вовлеченных в метаболизм пуриновых нуклеотидов, изучалась в мышинных тимоцитах на разных стадиях дифференцировки ( Kizaki et al, 1983). Выявлено, что активность ADA значительно снижается в течение внутри- и поеттимусного созревания Т-лимфоцитов.

Рецицрокные взаимоотношения между ada и pup обнаружены у крыс (Barton et al, 1980) и в лшфоидных тканях человека (Carson et al, 1978). В противоположность активности ada, активность PNP увеличивается в процессе созревания Т-лимфоцитов, особенно на' посттимической стадии.

Таким образом, тимоциты характеризуются высоким уровнем активности ada и dCRK с высоким отношением ada/ak и ada/pnp и низким отношением ркр/dCRK. Стадии дифференцировки Т-лим-фоцитов могут быть охарактеризованы не только абсолютным уровнем ферментов, но и их отношением. В 16-ти дневном эмбриональном титлу се активность ada ниже, а активность pnp , ак и dCRK выше, чем во взрослых тимоцитах. В течение дифференцировки эмбриональных тимоцитов активность ada увеличивалась, тогда как активность PNP иАК снижалась. Активность dCRK снижалась после рождения. В Т-лимфоцитах селезенки активность ada и dCRK ниже, a pnp в 2,5 раза выше, чем в тимоцитах.

Эти результаты позволяют цредположить, что метаболизм пу-риновых нуклеозидов различен на разных стадиях дифференцировки и созревания и, что дефицит ada илиШР может быть первоначально губителен для лимфоцитов на отдельных этапах дифференцировки. Характерное распределение ферментов, включенных в метаболизм пуриновых нуклеозидов, наблюдается в лимфоидных тканях, особенно в тимоцитах. Оно частично объясняет взаимоотношения между биохимическими отношениями в пуриновом метаболизме и нарушениями специфических иммунных функций (Kizaki et al, 1983).

Barton (1982) проследил динамику црофиля изоферментов и PNP в эмбриогенезе тимуса крысы и в неоплатических лимфо-идных популяциях. 12-ти дневная эмбриональная печень ж 16-ти дневные эмбриональные тимоциты, состоящие из больших базо-фильных клеток-цредшественников, имели единственный изофермент ada f тогда как тимоциты новорожденных и молодых взрослых особей и все периферические лимфоциты содержали как первичный, так и два вторичных изофермента ada. Напротив, изоферментный црофиль рцр был фактически идентичен во всех исследованных тканях и состоял из двух изоферментных полос. 5-ти дневная культура 16-ти дневного эмбрионального тимуса эксцрессировала как первичную, так и вторичные полосы изоферментов ada. Зто говорит о том, что вторичные изоферменты эксцрессируются в процессе дифференцировки Т-клеток, тогда как изоферменты PNP существенно не изменяются. Тимическая лимфома, индуцированная вирусом Гросса, так же как и эмбриональная печень и тимус выявляют только первичные спектры изоферментов. Это указывает на цретимическую природу неопластических цретимоцитов (Barton et al,I980).

Появление вторичных изоферментов ada в течение эмбрионального развития тимуса не является результатом введения извне клеток, содержащих полный набор изоферментов. Вторичные изоферменты эксцрессируются в дифференцированных потомках кле-ток-цредшественников, которые первоначально эксцрессировали только один изофермент ada. Биохимическая црирода вторичных изоферментов ada не ясна, но изоферменты ada могут быть использованы в качестве дополнительных биохимических характеристик цроцессов дифференцировки Т лимфоцитов (Barton, 1982).

Из приведенных выше литературных данных следует, что изучение "биохимической" анатомии лимфоцитов может быть полезным для выянения молекулярных механизмов клеточной дифференцировки и популяционных перестроек в онтогенезе и цри различных иммунодефицитных и лимфоцролиферативных заболеваниях.

Таблица & 2 ■

Биохимические маркеры субпопуляций Т-лимфоцитов

Клетки Ферменты Предшественники тимоцитов Кортикальные тимоциты Медуллярные тимоциты Периферические Т-клетки

Щелочная фосфа-таза — + + + + - —

20- об-оксистеро-иддегидрогеназа + + + — + + + + +

Терминальная дез оксинуклеотидил трансфераза + + + + + + - — б'-нуклеотидаза + - + + + + + +

Аденозиндезами-наза + + + + + + + - +

Дезоксицитидин-киназа + + + + + + + - +

Пуриннуклеозид-фосфорилаза + + + + + + +

Аденозинкиназа + + + + + + +

2. Онтогенез Т-лЛимфоцитов

Созревание Т-клеток изучается не только в экспериментах, в которых исследуются функции тимуса взрослого животного, но и цри изучении онтогенеза тимуса. Б эмбриональном периоде имеет место ряд реакций, напоминающих или црямо относящихся к иммунным реакциям. Желточный мешок зародыша является, очевидно, онтогенетически первым органом иммунной системы, так как клетки желточного межа зародыша цыпленка уже начиная с 10-го дня вызывают активность клеток-киллеров в отношении мишеней УАС-1. Зародышевая печень млекопитающих частью исследователей рассматривается как аналог фабрициевой сумки птиц, поскольку в зародышевой печени впервые выявляются В-клетки на разных стадиях зрелости. Однако, существуют данные, что в зародышевой печени могут дифференцироваться до определенной степени зрелости также Т-клетки или их предшественники. Б зародышевой печени, очевидно, впервые в онтогенезе возникают также супрессорные клетки (выявляемые на 12-ый день развития зародыша), тогда как в селезенке они выявляются не ранее 17-18-го дня, а в тимусе -не ранее 14-го дня при дополнительном культивировании in vitro или на 16-17-ый день без культивирования (Auerbach. et al, 1982).

Тимус является первым лимфоидным органом, который появляется в эмбриогенезе. У мышей зачаток тимуса выявляется у 10-ти дневных эмбрионов. В это время существует только два типа клеток: эпителиальные и мезенхимальные.

Первые лимфоциты появляются в тимусе мышей на 12-14 день эмбрионального развития в виде стволовых клеток, мигрирующих из желточного мешка или примитивных кровяных островков. Стволовые клетки дифференцируются в окружении эпителиального зачатка тимуса (Metcalf, Moore, 1971). Некоторые авторы указывают, что для лимфопоэза в тимусе требуется взаимодействие эпителиальных и стволовых клеток (Auerbach, I960; Mosier, Pierce, 1972).

Таким образом, на этой стадии эмбриогенеза тимус заселен большими недифференцированными бластами. Они лишены каких-либо признаков Т-клеток (Moore, Owen, 1967) и способны вызывать спленомегаяию (Auerbach et al, 1982). На 14-й день зародышевого развития в тимусе также выявляются nk i антигены, маркер естественных клеток-киллеров, которые к 16 дню исчезают, но появляются в печени зародыша (коо et al, 1982). Ewijk et al (1982) показали, что в этот срок впервые появляются la- позитивные ретикулярные клетки, которые вначале равномерно распределены по всему тимусу, а затем концентрируются в его центральной части.

При культивировании 13-14-дневого тимуса в органных культурах могут быть полностью воспроизведены дальнейшие этапы дифференцировки (Mandel, Kennedy, 1978).

Между 14 и 18 днями эмбриогенеза происходит экспоненциальное возрастание количества тимусных лимфоцитов главным образом за счет пролиферации больших клеток в той области тимуса, которая станет корковым веществом. На поверхности этих клеток обнаруживают ряд дифференцировочных антигенов. Lyt-i обнаруживается в центральной части тимуса, начиная с 15 дня, а с Г7 дня - на большинстве лимфоцитов (кроме лимфоцитов суб-капсулярной области). Lyt -2, 3 экспрессируется с 17 дня и к 19 дню его имеют большинство клеток коркового вещества. Н-2К позитивные ретикулярные клетки выявляются впервые на 15-й день в медуллярной области. Таким образом, в эмбриогенезе наблюдается последовательное появление Lyt -I- и Lyt-2-позитивных лимфоцитов, что подтверждает предположение о регулирующей роли комплекса Н-2 при дифференцировке Т-клеток (Ewijk et al, 1982). Клетки тимуса 16-ти дневного зародыша способны отвечать пролиферацией на Кон А, ФГА, осуществлять хелперную активность при иммунном ответе на эритроциты барана (Auerbach et al, 1982). Основной фенотип поверхностных маркеров этого субкласса Т-клеток: Thy i+ и Lyt -2,3+. Следовательно, к 18 дню эмбриогенеза тимус богат лимфоцитами, которые проявляют некоторую-функциональную активность их взрослых аналогов.

Миграция Т-клеток в периферические лимфоидные ткани начинается приблизительно во Еремя рождения мыши, при этом в лимфоузлах раньше, чем в селезенке, появляется большое количество Thy-I положительных клеток (Raff, Owen, 1971). В селезенке к моменту рождения число естественных клеток-киллеров составляет 20-30$, указанные клетки сохраняются и у молодых мышей. Но они являются незрелой популяцией естественных клеток-киллеров, у которой отсутствует литическая способность, и которая достигает пика своей активности лишь к 2-х месячному возрасту (Коо et al, 1982).

Papiernik (1976) показал на мышах линии СВА, что созревание тимуса предшествует созреванию селезенки. Ответ тимоцитов на Кон А регистрируется уже при рождении и достигает максимального уровня к концу 2-й недели жизни, тогда как в селезенке в это время он только лишь начинает повышаться. В течение 3-й недели ответ на Кон А снижается и достигает уровня, характерного для взрослого животного к 4-й неделе. В селезенке к этому времени достигается высокий уровень отвечаемости, свойственный взрослому состоянию. Сходная динамика наблюдается в случае ответа на ФГА. Интересно отметить, что Goldstein et ai (1971), изучая клеточноопосредованный иммунитет тимоцитов мышей СБА в онтогенезе, также показали, что реактивность тимуса цредшествует реактивности селезенки. С другой стороны, эксперименты stobo и Paul (1972), в которых изучался онтогенез ответа на ФГА у Baib/c мышей, показали, что ответ на ФГА в тимусе и селезенке развивается одновременно.

Таким образом, неонатальная селезенка является в основном незрелым органом, и возникает воцрос, что же является источником иммунокомпетентных Т-клеток, которые появляются в пределах первых двух недель жизни? Развиваются ли они in situ из клеток предшественников, или они мигрируют из тимуса в виде функционально зрелых Т-клеток? Результаты, полученные Papi-ernik, Bach (1979), показывают, что иммунокомпетентные Т-клетки могут развиваться in situ от предшественников, которые мигрируют в селезенку перед рождением. Функциональное созревание таких предшественников, которые имеют характеристики посттимических предшественников, описанных stutman (1977), оцределяется гуморальным влиянием тимуса, а также микроовдг-жением, в которое попадают периферические Т-клетки.

В последнее время для изучения функциональной зрелости Т-лимфоцитов селезенки и тимуса у мышей часто используются реакции смешанной культуры лимфоцитов (mlc ) :ж клеточно-опосредо-ванного лимфолизиса (СМЪ) (Howe, Manziello, 1972; Stobo, Paul, 1972; Wu et al, 1975; Pilarsky, 1977). Результаты, полученные Wu et ai£l975), показывают, что селезенка новорожденных содержит клетки, способные отвечать на аллогенные клетки в смешанной культуре лимфоцитов. Ответ селезеночных клеток в CML не определяется в течение 2 дней после рождения. Как mlc , так и cml достигают уровня взрослых животных к 30-60 дням. Тимоциты новорожденных (0-7-дневного возраста) отвечают в mlc также хорошо, как и тимоциты взрослых животных. Ответ тимоцитов в с ML определяется уже цри рождении, но проявляется слабее, чем ответ в mlc . в возрасте 6-8 недель начинается снижение клеточноопосредованного иммунитета.

Kowaiezyk et al (1981) исследовали субпопуляции Т-кле-ток в тимусе и селезенке мышей линии Baib/c в возрасте 1-9 месяцев. В обоих органах было обнаружено, что пропорция Т-клеток с высокой концентрацией поверхностного Thy-I антигена увеличивается с возрастом. Интенсивность реакции трансплантат против хозяина, индуцированной селезеночными клетками и клетками лимфоузла у гибридов, также увеличивается с возрастом. С другой стороны, ответ тимоцитов на Кон А уменьшается с возрастом. Все эти параметры могут быть возращены к уровню активности у животных 1-месячного возраста с помощью преинкубации клеток с препаратом гормона тимуса. Наблюдаемые изменения могут объясняться снижением гормональной активности тимуса между 4-7 месяцами, что может провоцировать сдвиг в популяции Т-клеток. Последнее в свою очередь может объяснить наблюдаемые изменения в иммунологической реактивности ( Goodman, Makinodan, 1975; Walters, Claman, 1975).

И, наконец, иммунный ответ на Т-зависимые антигены появляется только к 1-2 неделям после рождения. Такая иммунологическая незрелость может быть в основном обусловлена присутствием Т-супрессоров с фенотипом Lyt -2,3+. Эта, по-видимому, неспецифическая супрессорная активность достигает наивысшего уровня при рождении и постепенно уменьшается в течение первых трех недель жизни до достижения равновесия с другими функциями Т-клеток, которое устанавливается на большую часть жизни животного (Mosier, aoiuison, 1975). Способность Т-клеток новорожденного проявлять хелперную активность для Т-зависимого иммунного ответа задерживается до 4-5 недель развития. Однако хелперная активность клеток в раннем возрасте может быть замаскирована в виду преобладания супрессорной активности (Mosier, 1977 ', Ghison, Golub , 1972). Например,хелперная активность выявляется на 4-й день после рождения. Субпопуляция Т-клеток, необходимая для ежь и хелперной Т-клеточной активности, имеет фенотип Lyt -I+ (Mosier, 1977).

Изменения иммунного статуса, связанные с возрастом, обычно характеризуются приобретением или потерей одной или нескольких клеточных функций. Хотя многие исследователи приходят к выводу, что клеточноопосредованный иммунитет уменьшается при старении (Goodman, Makinodan, 1975), эти данные трудно свести в единую картину, главным образом в силу того, что разные авторы использовали различные линии мышей, измеряли различные параметры и проводили исследования на мышах разных возрастов. Б тех случаях, когда группа молодых мышей, пик иммунологического развития которых не достигался к 2-3 месяцам, была сравнена с группой старых мышей (Walters, Claman, 1975), были получены результаты, которые в настоящее время нуждаются в пере осмысливании. В случае Т-зависимых реакций, которые в основном являются результатом сложных взаимодействий между несколькими Т-клеточными субпопуляциями, необходимо подробное изучение процесса развития этих индивидуальных субпопуляций в зависимости от возраста, которое может пролить новый свет на их специфический вклад в указанную реакцию.

3. Старение и аутоиммунитет

С возрастом в иммунной системе цроисходят глубокие изменения. Клеточные и гуморальные реакции по отношению к чужеродным антигенам угнетаются, а реакции по отношению к собственным аутологичным антигенам усиливаются. Следствием этого является нарушение постоянства антигенного состава организма. Оно способствует, с одной стороны, персистенции в старом организме несвойственного ему антигенного материала (экзогенного или видоизмененного своего), с другой - возникновению ряда аутоиммунных явлений, что в конечном итоге, обуславливает его повышенную ранимость и сниженную приспособляемость к неблагоприятным условиям (Бутенко, 1983). Основной дефект в иммунной системе заключается в функциональной неполноценности Т-лшлфовдтов и обычно связан с инволюцией тимуса, нарушением баланса между регуляторными Т-лимфоцитами и расстройством равновесия между идиотипическими и антиидиотшшческими активностями (Weksler, 1983).

Механизмы, способствующие развитию аутореактивности цри старении, еще не выяснены до конца. Существует множество гипотез, объясняющих появление этой аутореактивности у стареющего организма. Среди них могут быть выделены следующие:

1) активация "запрещенных" клонов согласно клонально-се-лекционной теории Бернета;

2) срыв толерантности к собственным тканям;

3) утрата супрессорной функции Т-клеток (Pournier, Char-reire, 1983).

Г«МДЕР"И=ааЯ r/stuJWOTEKA

С с с Р

Изменения, происходящие в тимусе человека и мышей в онтогенезе, имеют сходный характер (Shisa, Nishizuka, 1971). Начало полового созревания совпадает с нарастанием процессов инволюции в тимусе. С возрастом у мышей возникает гипертрофия медуллярного слоя тимуса цри истощении или полном исчезновении кортикального слоя. Ретикуло-эпителиальные клетки сохраняются. В тимусе выявляется значительное количество плазмо-бластов и плазматических клеток. С помощью меченых фпуорохро-мами специфических антител выяснено, что в тимусе старых мышей снижается количество клеток, несущих много Thy-I и Lyt-2 антигенов, но увеличивается число клеток, несущих мало Thyi антигена. Уровень Lyt-I-позитивных клеток сначала снижается, а затем вновь увеличивается. Кроме того, в титлу се старых мышей накапливается до 25-30$ клеток, несущих поверхностные иммуноглобулины, а также Lyt -2-негативные клетки. Меченые клетки лимфоузлов молодых и старых мышей, вводимые внутривенно молодым самкам, мигрируют в лимфоузлы. При введении этих клеток старым мышам, наряду с миграцией в лимфоузлы, цроисходит миграция также и в тимус. Авторы (Dumont et al, 1982) делают вывод, что у старых мышей, очевидно, нарушается гемато-тими-ческий барьер, что приводит к оседанию в тимусе клеток из кровотока и гипертрофии тимуса.

В последнее время получены црямые доказательства того, что цри старении тимус теряет свои функциональные свойства. С возрастом снижается реакция гиперчувствительности замедленного типа (Mackay,1972; Filchuer, Bach, 1974), снижается активность Т-клеток, способных вызывать реакцию "трансплантат против хозяина" (Stutman, Yunis, 1968; league et al, 1970), падает способность отвечать на широко распространенные антигены (кандидат, туберкулин и др.) (g?ho et al, 1973; Dwiievic-Trojaczck, 1981).

Показано, что с возрастом как у человека, так и у грызунов уменьшается способность Т-клеток к пролиферации в ответ на ФГА, Кон А и на аллогенные клетки-мишени (Goodwin et al, 1982). Это уменьшение особенно выражено у мышей (Fixa, 1975; Morgan et al, 1981). Данные по влиянию возраста на реакцию смешанной культуры лимфоцитов противоречивы. Некоторые исследователи отмечали снижение ответа с возрастом ( Adier et al, 1971), другие получали результаты с одинаковой (или даже большей) эффективностью старых и молодых клеток ^al"ters> Claman, 1975). Данные по синергическому взаимодействию субпопуляций лимфоцитов в mlc -реакции, а также анализ распределения клеток по плотности в БСА позволяют считать, что с возрастом наблюдается уменьшение числа более зрелых Т2-клеток лимфоузлов с одновременным увеличением количества незрелых Tj-клеток селезенки $rakinodan, Adler, 1975; Doria et al, 1982). Все это свидетельствует о том, что с возрастом Т-клетки црекра-щают отвечать на тимические факторы. Последнее возможно связано с недостаточным уровнем гормонов тимуса, либо с уменьшением клеток, реагирующих на действие гормонов ( Goldstein et al, 1974).

Известно, что распознование собственных эритроцитов является характерной особенностью субпопуляций незрелых Т-клеток. Сывороточный тимусный фактор принимает участие в созревании Т-клеток и поэтому приводит к снижению аутологичного розетко-образования и сингенной цитотоксичности. По-видимому, незрелые Т-клетки по мере созревания под влиянием тимусного сывороточного фактора теряют способность распознавать сингенные эритроциты. Показано (Bach, Charreire, 1979), что у аутоиммунных линий мышей, таких как hzb, b/w, Swan и mrl уровень циркулирующего тимусного фактора резко снижен. Введение его этим мышам предотвращает развитие патологических иммунных реакций, по-видимому за счет генерации супрессорных Т-клеток, активность которых у этих мышей резко снижена.

Было также показано существование подавляющего эффекта на цроцессы дифференцировки со стороны стромы лимфоидных органов старого животного (Кау, 1978), в большей степени у аутоиммунных мышей nzb ( Minoda, Horiuchi, 1983). В случаях инкубации предшественников Т-лимфоцитов мышей nzb с нормальными ретикуло-эндотелиальными клетками (РЭК) получена эксцрессия Т-клеточного маркера (Thy-1,2). Клетки приобретали функциональные свойства (ответ в mlc f на ФГА и Кон А) так же, как и в опытах с нормальными предшественниками Т-клеток и нормальными РЭК. Нарушение дифференцировки нормальных предшественников Т-клеток получено цри инкубации их с РЭК мышей nzb . Авторы заключают, что у мышей nzb нарушены функции РЭК тимуса.

Известно, что иммунный потенциал снижается с возрастом и что стареющие животные оказываются неспособными развивать адекватные клеточноопосредованные иммунные реакции. 7 престарелых особей также снижается продукция лимфокина-интерлей-кина-2 (ИЯ-2) в ответ на Т-клеточный митоген Кон А или алло-генную стимуляцию. При добавлении этого лимфокина к клеткам стареющих животных в значительной степени усиливается реакция в мъс , клеточноопосредованный лимфолизис и антиген-ин-дуцированная Т-клеточная пролиферация (Thoman, Weigie, 1982). Интерлейкин-2 также восстанавливает способность к генерации клеток-супрессоров у старых мышей (Thoman, Weigie, 1983).

Существует возрастная потеря способности "нуль"-клеток дифференцироваться в Т-клетки у человека и мышей (Twomey et ai, 1982), наряду с изменениями в составе "нуль"-клеток у аутоиммунных мышей. Kouttab, Twomey (1983) изучали субпопуляции клеток, входящих в состав популяции "нуль"-клеток мышей разных линий. Показано, что у мышей с малой продолжительностью жизни (MRL/1) аномалии развиваются раньше, чем у дол-гоживущих мышей ( nzb ). По-видимому, у аутоиммунных мышей нарушения лимфопоэза осуществляются на уровне самих ранних лимфоидных предшественников, что, возможно, контролируется генетическими факторами.

С возрастом происходит значительное перераспределение между другими классами лимфоцитов - уменьшается количество естественных киллеров (Коо et ai, 1982). У старых (12-14-месячных мышей) ж -1-позитивные клетки выявляются в селезенке и в крови, но их активность снижена по сравнению с активностью ж -1-позитивных клеток 2-х месячных мышей, где она достигает пика. Интерферон увеличивал количество ж -1-позитивных клеток у старых мышей и нормализовал их литическую ^функцию.

При старении и тесно связанным с ним аутоиммунном процессе изменяется соотношение между отдельными функциональными субпопуляциями Т-клеток. Этому придают большое значение в механизме изменения иммунитета при старении. Полагают, что в основе старения системы иммунитета лежат не количественные изменения Т- и В-цредшественников, а изменение соотношения хелперов и супрессоров в сторону уменьшения последних (Blank-water, 1978). Хелперная функция Т-клеток у всех линий мышей снижается с возрастом. Это было показано на интактных животных И В опытах in vitro (Price, Makinodan, 1972; Hardin et al, 1973). В противоположность этому аутоиммунные заболевания характеризуются снижением активности супрессорных механизмов и (или) повышением хелперных реакций (Mouiias,I983). У мышей mrl спонтанно развивается лимфопролиферативное заболевание с характерными признаками системной красной волчанки, сопровождающееся массивной пролиферацией субпопуляции Lyt -1+ Т-клеток и отсутствием Lyt -1,2,3+. Неонатальная тимэктомия приводила к замедлению лимфоцролиферации, снижению концентрации аутоантител, улучшению функции почек и увеличению продолжительности жизни, способствовала специфической элиминации субпопуляции Т-клеток, вовлеченной в лимфопролиферативный процесс. Полученные данные свидетельствуют о том, что иммунологическое созревание в тимусе Т-клеток с аллогенными характеристиками субпопуляции хелперов может способствовать значительной лимфоцролиферации с развитием тяжелого аутоиммунного заболевания у мышей (Wolsy et al, 1982).

В отношении клеток-супрессоров получены несогласующиеся данные. Имеются межлинейные различия в экспрессии супрессор-ной активности. У короткоживущих мышей наблюдается падение супрессорной активности (Кау,1979). Данные, касающиеся долго-живущих линий мышей противоречивы. Это, вероятно, связано с тем, что тестируются разные субклассы Т-супрессоров: антиген-специфические, антигеннеспецифические, регулирующие аутоиммунные реакции или аллоиммунитет (Бутенко, 1983). Различные субпопуляции Т-супрессоров, вероятно, по-разному изменяются при старении. Наиболее доказанным у долгоживущих линий мышей следует считать факт увеличения с возрастом антигеннеспецифических Т-суцрессоров (Caiiard, 1980).

Таким образом, с одной стороны, обнаружено увеличение активности Т-суцрессоров, с чем связывают возрастное падение уровня иммунного ответа. С другой стороны, определение супрес-соров, появляющихся в первые дни иммунизации или супрессии, индуцированной Кон А, указывают на значительное падение активности Т-супрессоров у старых индивидумов и этим пытаются объяснить появление аутоиммунности.

Следует также отметить, что общее содержание Т- и В-лимфо-цитов, плазматических клеток, активность макрофагов, уровень иммуноглобулинов изменены незначительно и не могут объяснить падение иммунного ответа и нарастание аутоиммунных реакций, которые характеризуют старение. Гораздо больше информации позволяет получить исследование различных клеточных субпопуляций: зрелых и незрелых лимфоцитов, хелперов и супрессоров, иммуноло-гически активных и клеток памяти, долгоживущих и короткоживущих лимфоцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы самки мышей линии С57В1/6 и Swiss на различных этапах онтогенеза, включая эмбриогенез. Мыши были получены из питомника "Столбовая" АМН СССР и вивария ИКИ СО АМН СССР.

Мыши линии С57В1/6 характеризуются низкой частотой опухолей разных типов даже в возрасте старше 18 месяцев, резистентны к облучению. Нередко возникают спонтанные аномалии (дефекты глаз, скелетные аномалии). Максимальная продолжительность жизни у самок 1200 дней, средняя продолжительность жизни у самок 692 - 15,7 дня. Мыши линии С57В1/6 являются наиболее распространенной инбредной линией, использующейся практически во всех медицинских и биологических исследованиях. Указанная линия применяется в качестве эталона для сравнения с особенностями других инбредных линий.

Для мышей Swiss характерно появление с возрастом аутоиммунного гломерулонефрита, что позволяет использовать их в качестве природной модели аутоиммунного заболевания. В возрасте 4-5 месяцев у мышей начинается образование антинуклеарных ауто-антител, наблюдаются нарушения в.почках (гломерулонефрит), лим-фоидная инфильтрация многих органов.

Т-клетки на различных этапах дифференцировки: стволовые кроветворные клетки (СКК), предшественники тимоцитов (ПТ), кортикальные тимоциты (КТ), медуллярные тимоциты (МТ) и периферические Т-лимфоциты (Т-л), получены следующим образом:

СКК: Для получения обогащенной популяции стволовых кроветворных клеток применялась методика центрифугирования костного мозга в ступенчатом градиенте БСА. Стандартные растворы БСА концентраций 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35$ приготавливались по методике, описанной Дики (Dicke et al, 1968). Сухой бычий сывороточный альбумин (БСА; фракция V , Coll Biochem ) растворялся в 0,155М трис-буфере ( ph - 7,2) при комнатной температуре. Конечная ph. раствора 5,3, осмолярность 330m Osm . Растворы последующих концентраций были получены из исходного 35$ раствора с помощью 0,I54M NaCi , 0,01 Na фосфатного буфера ph 7,2 под контролем показателей на рефрактометре. Ступенчатый градиент создавался последовательным наслаиванием по 0,6 мл соответствующих растворов в центрифужную пробирку с внутренним диаметром 0,8 см. Самая легкая фракция (17$) объема с

1,5 мл вместе с клетками костного мозга (500 х 10 ) наслаивалась последней. Центрифугирование проводилось при 2000g в течение 30 минут при температуре -кШ°С в центрифуге с горизонтальным ротором. После разделения клетки забирались из каждой фракции в отдельные пробирки, дважды промывались в среде-199, затем производился их подсчет в камере Горяева и проверялась жизнеспособность с помощью 0,16$ раствора трипанового синего (Chemapol ). Клетки из 3-й фракции (21-23$) по морфологическим характеристикам и функциональным тестам (экзогенное колониеоб-разование) являются обогащенной популяцией стволовых кроветворных клеток (Dicke et al, 1968).

ПТ: В качестве цредшественников тимоцитов были взяты клетки зачатков тимусов 13-14 - дневных эмбрионов мышей. Возраст последних определялся по появлению влагалищных пробок (нулевой день эмбрионального развития).

Для отделения кортикальных тимоцитов от медуллярных тимоцитов применялась методика разделения тимоцитов в ступенчатом градиенте БСА (30$ Sigma Chemical Co.). Стандартные растворы БСА 17, 19, 21, 23, 25 и 27$ приготавливались согласно описанной выше методике Дики (Dicke et ai, 1968) в модификации (Prit-chard et al, 1975).

KT: В тяжелых фракциях БСА (23-25$, 25-27$) располагались кортикальные тимоциты, в легких фракциях (17-19$, 19-21$) располагались медуллярные тимоциты.

Ж: Кроме того, медуллярные тимоциты, как резистентные к гидрокортизону, были получены введением гормона (гидрокортизон, "РИХТЕР", Венгрия) животным из расчета 2,5 мг на мышь внутрибрюшинно. Через 48 часов проводился забой животных и забор клеток тимуса.

Медуллярные тимоциты, как радиорезистентные, были также получены на 5 сутки после облучения в дозе 1,17 х 10~%л/кг.

Т-лимюоциты селезенки и лимфатических узлов были получены методом специфического лизиса с анти В-сывороткой (И.М.Доз-моров, Т.Б.Руднева, 1977). Метод специфического лизиса основан на обработке клеток in vitro антисывороткой к специфическим антигенным детерминантам на поверхности В-лимфоцитов. Антисыворотка в присутствии комплемента лизирует только определенный класс лимфоцитов. Специфический лизис проводился с анти-В-сы-вороткой, полученной по методу, предложенному Н.А.Краскиной (1977), Анти-В сыворотку получали методом двуЕфатной иммунизации кроликов 500 х 10^ клеток селезенки от В-мышей. Для получения В-мышей животных тимэктомировали, облучали через две недели в дозе 2,21 х Ю~*Кл/кг и вводили клетки костного мозга в с дозе 10° клеток на мышь. Анти-Т сыворотку получали путем двукратной иммунизации кроликов 500 х 10° клеток тимуса мышей. Кровь для сыворотки забирали через 7 дней после последней иммунизаиди. Сыворотку инактивировали при 56°С в течение 30 минут, а затем адсорбировали клетками печени, крысиными и мышиными эритроцитами, Т-клетками или Б-клетками.

Сыворотку последовательно разводили и проверяли в цито-токсическом тесте с лимфоидными клетками в концентрации 5 х 10® и комплементом морской свинки в разведении 1:5. Цитотоксиче-ский тест проводили на мшфотитраторе "ТАКАЧИ". Анти-Т сыворотка убивала в разведении 1:16 90-95$ клеток тимуса, 30-35$ клеток селезенки, 60-65$ клеток лимфатических узлов. Анти-В сыворотка убивала в разведении 1:8 0-3$ клеток тимуса, 35-40$ клеток селезенки, 30-35$ клеток лимфатических узлов. Разведения, цредшествующие указанным, считались рабочими, и все дальнейшие действия проводили с ними. Были поставлены контрольные эксперименты: клетки только с сывороткой или клетки только с комплементом морской свинки. Количество мертвых клеток в суспензиях в данных случаях не превышало 8-10$. Жизнеспособность клеток определяли при помощи опаски 0,16$ раствором трипаново-го синего. 100 клеток сразу после окраски подсчитывали . в камере Горяева, вычисляли цитотоксический индекс: $ мертвых клеток в опыте - $ мертвых клеток ЦИ =в контроле х 100

100 - $ мертвых клеток в контроле

Для получения популяции Т-клеток селезенки и лимфатических узлов инкубировали равные объемы (0,3 мл) суспензий клеток, комплемента и анти-В сыворотки в течение 45 минут при 37°С. После инкубации с антисывороткой из суспензий удаляли мертвые клетки В Градиенте фиколл-верографин (Davidson, Parish, 1975). о

Для этого I мл суспензии клеток, содержащей не более I х 10° клеток, наслаивали на 1,5 мл смеси, состоящей из 12 частей 14$ фиколла (Pharmacia Pine Chemicals, Швеция) И 5 частей 32,6$ верографина (Spofa, Чехословакия). Клетки центрифугировали цри комнатной температуре при 2000 g в течение 15 минут. Лимфоциты извлекали из интерфазы и отмывали в среде. Выход живых клеток составлял 90-96$. Морфологический анализ показал, что эритроциты и нелимфоидные клетки удалялись из суспензии на 95-98$. При постановке цитотоксического теста с анти-Т сывороткой в обогащенной суспензии Т-клеток селезенки и лимфатических узлов получали 85-90$ Т-лимфоцитов.

Суспензии клеток из органов (тимус, селезенка, лимфатические узлы) приготавливались общепринятым способом: выдавливанием клеток из стромы органа в стеклянном гомогенизаторе в оцределенном объеме среды 199 с последующим фильтрованием через металлическую сеточку.

Для онтогенетических исследований были выбраны следующие сроки индивидуального развития: 13 - дневные, 16 - дневные и 19 - дневные эмбрионы, новорожденные, I - дневные, 3 - дневные, 7-, I0-, 14-, 21 - дневные, I месячные, 3-, 6-, 9-, I2-, I8-, 24 - месячные мыши. У животных каздой возрастной группы исследовали тимус, селезенку и лимфатические узлы, их вес и общее количество ядросодержащих клеток, содержание Т- и В-клеток с помощью соответствующих антйсывороток. В селезенке и лимфатических узлах выделяли Т-лимфоциты с помощью специфического лизиса с анти-В сывороткой и последующего очищения на фиколле суспензии от мертвых клеток, эритроцитов и нелимфоидных элементов. В суспензии селезенки избавлялись от эритроцитов с помощью гемолиза, вызываемого дистиллированной водой (Х.Фри-мель, 1979). К 2 мл суспензии добавляли 6 мл дистиллированной воды. В гипотонической среде эритроциты разрушались. Через 30 секунд изотоничность раствора восстанавливалась добавлением 2 мл 3,5% раствора Naci . Жизнеспособность лимфоидных клеток сохранялась.

Тимусы 3-дневных, месячных, 4-месячных, 12-месячных и 24-месячных самок мышей С57В1/6 разделяли в БСА на субпопуляции по вышеописанной методике. У мышей Swiss для разделения тимуса в БСА были взяты также 3-дневные и 4-месячные мыши, а начиная с 5-месячного возраста до 2 лет (5 мес., 9 мес., 12 мес., 18 мес., 24 мес.) в БСА разделяли тимусы мышей с отсутствием антинуклеарных антител и с высоким титром ( 1оё2= 5-6), определяемых для контроля аутоиммунного состояния непрямым методом Кунса (Б.В.Шехонин, 1975) в сыворотке периферической крови у мышей Swiss, Кровь забирали из хвоста в количестве 0,1 мл в 0,1 мл забуференного физиологического раствора (ph -7,4). Сыворотку (разведение 1:2) отделяли центрифугированием цри 1000 g в течение 10 минут. В качестве субстратов использовались отпечатки печени крысыWistar ( 100 г весом), фиксированные в 96° этаноле в течение 3 минут. Исследуемую сыворотку наливали на отпечатки и инкубировали во влажной камере при +37°С в течение 30 минут. Затем препараты промывали 3 раза фосфатным забуференным физиологическим раствором по 5 минут и инкубировали с люминисцентной антииммуноглобужновой сывороткой SWAM-FITC (кроличий антимышиный глобулин, меченый ФИТЦ, ИЭМ АМН СССР) в разведении 1:8 в течение 30 минут цри 37°С. После инкубации препараты промывали забуференным физиологическим раствором, высушивали и исследовали под люминисцентным микроскопом. Отмечались различные типы свечения ядер: диффузный, кольцевидный, крапчатый, флуоресценция ядрышек. Результаты регистрировались в виде титров антинуклеарных антител (от I до 6), которые соответствовали степени разведения исследуемой сыворотки, при которой наблюдалось свечение ядер печеночных клеток, с адсорбированными на них антителами.

Т-лимфоциты различных стадий дифференцировки (клетки тимуса, клетки селезенки, лимфатических узлов и Т-димфоциты этих органов), взятые от животных в разные сроки онтогенеза, подвергали анализу на содержание изоферментов лактатдегидрогеназы. При исследовании изоферментов основным методом являлся электрофорез белковых экстрактов из тканей или различных популяций клеток с последующей специфической гистохимической окраской с целью выявления зон, обладающих ферментативной активностью. Основные достоинства метода заключаются в следующем: анализируется сложная смесь белков, и, благодаря специфичности метода гистохимического окрашивания отпадает необходимость предварительного их окрашивания; исследуется свеже экстрагированный материал разных клеточных популяций, что позволяет иметь дело с на-тивными формами ферментов, которые характерны для состояния in vivo ; простота анализа ( Л.И.Корочкин и др., 1977). В представленной работе использовался электрофорез в агарозном геле.

Экстрагирование ферментов из тканей связано с разрушением клеток. Для этого свежеприготовленную жизнеспособную суспензию клеток осадцали центрифугированием (2000s в течение 10 минут), а осадок гомогенизировали в дистиллированной воде при 0°С в стеклянном гомогенизаторе из расчета 5 х 10 клеток в 25 мл воды с последующим трехкратным замораживанием-размораживанием. В этом случае исследуются водорастворимые формы фермента. В тех случаях, когда фермент предполагали связанным с внутриклеточными мембранами, использовали мягкие детергенты типа неионного детергента тритона Х-100. Гомогенизацию проводили в 1% растворе детергента. Гомогенаты тканей центрифугировали при 0°С и ускорении 2000ё в течение 30 минут.

Для алектрофоретического анализа использовались гомогенаты клеток из соответствующих органов от индивидуальной мыши. Электрофорез проводился по методике фирмы lkb ( Agarose gel electrophoresis with lkb 2117 Multiphor ). Образцы в объеме по

3 мкл через трафарет наносились на пластины агарозного геля (размер пластин 84 х 94 мм). На одной пластине размещалось 8 стартовых полос, электрофорез проводился одновременно на трех пластинах (24 образца). На каждую пластину выливалось по 12 мл расплавленной цри 90°С 1% агарозы (Agarose-M,LKB) в гелевом буфере (0,0095М фосфат 0,0012М лимонной кислоты, ph 7,0). Гель формировался в течение суток цри температуре +4°С.

В качестве электродного буфера использовался 0Д67М фосфат 0,027М лимонная кислота, ph7,0.

Электрофорез проводился на горизонтальных пластинах агарозного геля в камере Multiphor ( LKB-2II7-20I) с циркулирующей охлаждающей жидкостью в течение 2,5 часов при напряженности поля 8 В/см. После окончания электрофореза гелевые пластины помещали в инкубационную смесь, содержащую 20 мг никотинамид адениндинуклеотида (nad, DPiVReanai" ), 30 мг тетранитро синего тетразоля (тетраНСТ, "Chemapol" ), 2 мг фенозинметасульфата,

4 мл I м раствора лактата натрия ph 7,0, и 100 мл 0,1М фосфатного буфера ( ph 7,4) при 37°С до появления полос в местах локализации фермента (Л.И.Корочкин и др., 1977). Затем гелевые пластины отмывали в дистиллированной воде и высушивали.

С целью определения количественных соотношений между различными изоферментами в спектре и между отдельными спектрами электрофореграммы были просканированы на микроденситометре

Марк-4". Результаты измерения оптической плотности геля (пропорциональной количеству окрашенного изофермента) вводились в ЭВМ, с помощью которой проводилась дальнейшая обработка данных. Абсолютной активностью определенного изофермента, выраженной в условных единицах (усл.ед.), называется интеграл оптической плотности по площади геля, занятой указанным изоферментом. Отношение абсолютной активности определенного изофермента к суммарной абсолютной активности всех изоферментов в спектре, выраженное в процентах, называется относительной активностью указанного изофермента. Необходимо отметить, что для получения каждого спектра изоферментов в представленной работе использовалось одно и то же количество клеток, а процедура огфашивания была стандартной, следовательно, полученная абсолютная активность изоферментов пропорциональна истинному количеству изоферментов, причем во всех экспериментах коэффициент цропорцио-нальности один и тот же, в силу чего корректно сравнение абсолютных активностей изоферментов, полученных в различных экспериментах.

Из литературы (Markert, Ursprung, 1962) известно, что изо-ферменты ДЩ? состоят из субъединиц А и В, причем известен и состав отдельных изоферментов: ДДГ-1 - 4В ЛДГ-2 - ЗВ + А ЛДГ-З - 2В + 2А ЛДГ-4 - В + ЗА ДДГ-5 - 4А.

Следовательно, соотношение субъедишщ А и В определяется формулой:

А/В =

ЛДГ-5 + 3/4ЛДГ-4 + 1/2ЛДГ-3 + 1/4ЛДГ-2 ЛДГ-1 + 3/4ДДГ-2 + 1/2ДДГ-3 + 1/4ЛДГ-4 ' где ЛДГ-i - количество i-того изофермента в спектре. Все использованные в представленной работе методы, статистической обработки данных описаны в "Биометрии" (Г.Лакин, 1980).

Для каждой выборки объема п подсчитывалось среднее арифметическое М = X, средняя ошибка среднего арифметического и коэффициент вариации Су = ф- * 100% , характеризующий степень варьирования признака.

Проверка нормальности распределений проводилась с помощью показателей асимметрии As и эксцесса Ex t определяемых соотношениями: а - s: Ui -х) - п S$ 9 г х- пS*

Ошибки репрезентативности определялись по соотношениям:

Ах - VTTTF > = .

Распределение считалось нормальным, если выполнялись условия:

Выборочная проверка экспериглентальных данных показала нормальность полученных распределений.

Статистическая достоверность различий полученных экспериментальных данных при сравнении оценивалась по критерию Стьюден-та при трех уровнях значимости (Р = 0,05, Р = 0,01 и Р = 0,001). Сопряженность между двумя переменными величинами х и у оценивалась с помощью эмпирического коэффициента корреляции Гку , который определялся по формуле:

Оценка достоверности коэффициентов корреляции проводилась с помощью таблиц критериев Стьюдента цри вышеуказанных значениях уровней значимости Р. Обычно полагают, что при ^ 0,3 существует слабая связь, при 0,3 < ^ 0,5 связь признается умеренная. Если же 0,5 0,7, то корреляция считается значительной, цри 0,7 < ty < 0,9 корреляция считается сильной и цри Гху ^0,9 очень сильной, близкой к функциональной связи. Линейная регрессия, то есть определение параметров прямой: ас + а,х, наилучшим образом проходящей через п пар экспериментальных точек [(^it^i) j i = I, 2, проводилась с помощью метода наименьших квадратов. В каждом случае определялся коэффициент качества регрессии Г2 , изменяющийся в пределах от 0 до I, при I прямая идеально соответствует набору экспериментальных точек. Определялись также стандартная ошибка оценки значения у , обозначенная fyx , и стандартные ошибки определения коэффициентов регрессии &0 и <2, , обозначенные &0ж соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЫВОДЫ

1. В процессе дифференцировки Т-лимфоцитов изменяется изоферментный спектр лактатдегидрогеназы. Обогащенная популяция стволовых кроветворных клеток содержит изоферменты ЛДГ-3, 4 и 5. Изоферментный спектр предшественников тимоцитов состоит из ЛДГ-2, 3, 4, 5. В кортикальных тимоцитах выявлена активность всех пяти изоферментов лактатдегидрогеназы. Для медуллярных тимоцитов характерно присутствие изоферментов ЛДГ-3, 4, 5. Т-лимфоциты периферических лимфоидных органов содержат в основном ЛДГ-5 и в следовых количествах ЛДГ-4.

2. С возрастом у мышей линии С57В1/6 в тимусе снижается число ядросодержащих клеток за счет уменьшения количества кортикальных тимоцитов, падает абсолютная активность всех изоферментов лактатдегидрогеназы цри одновременном уменьшении доли быстрых и увеличении доли медленных фракций. В селезенке и лимфоузлах уменьшается число ядросодержащих клеток и Т-лимфоцитов, не изменяется абсолютная активность изоферментов и спектр изоферментов лактатдегидрогеназы.

3. У мышей Swiss с возрастом развивается генетически запрограммированное аутоиммунное заболевание сопровождающееся более интенсивным по сравнению с мышами линии С57В1/6 сокращением числа клеток в тимусе, в том числе кортикальных тимоцитов, снижением абсолютной активности всех изоферментов лактатдегидрогеназы, в большей степени ЛДГ-1, 2; увеличением количества ядросодержащих клеток и Т-лимфоцитов в селезенке и лимфоузлах и более значительной вариабельностью перечисленных показателей, уменьшением абсолютной активности лактатдегидрогеназы и сохранением без изменений изоферментного спектра ЛДГ в периферических Т-лимфоцитах.

4. Между клеточным составом тимуса и спектром изоферментов лактатдегидрогеназы в тимоцитах существует функциональная связь, что позволяет на основании данных об активности последних определять соотношение популяций кортикальных и медуллярных тимоцитов.

5. В Т-клетках лимфоузлов 24-месячных мышей линии С57В1/6 и 5-месячных "больных" мышей Swiss появляется дополнительный с отрицательным зарядом изофермент ЛДГ, активность которого составляет 10$ от общей активности лактатдегидрогеназы.