Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль суперантигена MYCOPLASMA ARTHRITIDIS в модуляции иммуногенеза при трансплацентарном инфицировании

, С?

- .1

J На правах рукописи

ЯЛФИМОВА Елена Юрьевна

РОЛЬ СУПЕРАНТИГЕНА MYCOPLASMA ARTHRITIDIS В МОДУЛЯЦИИ ИММУНОГЕНЕЗА ПРИ ТРАНСПЛАЦЕНТАРНОМ ИНФИЦИРОВАНИИ.

Специальность: 14.0036 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1997

Работа выполнена в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Научные руководители: доктор биологических наук Пронин A.B. доктор биологических наук Раковская И.В.

Офицальные оппоненты: доктор медицинских наук Суслов. А.П. доктор медицинских наук Варгин В.В.

заседании Диссертационного Совета К 00.07.01 в НИИЭМ им. Гамалеи РАМН по адресу: 123098, Москва, ул.Гамалеи 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Ведущая организация-Российская медицинская академия последипломного образования

Защита состоится «

часов на

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.И. Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

С начала 90-х годов бактериальные суперантигены привлекают пристальное шимание исследователей (Fleischer, 1994). Это связано с их уникальной способностью симулировать Т-лимфоциты, имеющие в составе рецепторного комплекса >пределенные Vß-сегменты. Массивная активация Т-системы может приводить к >азвитию летального шока за счет продукции большого количества цитокинов, к 1ммунодепрессии или индукции аутоиммунных реакций.

Как известно, к суперантигенам относятся стафилококковые энтеротоксины, оксин синдрома токсического шока, пирогенные токсины стрептококка и продукты скрытой рамки считывания ретровирусов опухоли молочных желез мышей (MMTV). За ¡оследние 5-7 лет к суперантигенам был отнесен белковый фактор M.arthritidis (MAS), акже обладающий вышеупомянутыми свойствами.

Суперантигены способны уклоняться от защитных сил иммунной системы озяина, что способствует поддержанию персистенции микроорганизма и хронизации атологии. Изучение механизмов иммунопатологических реакций необходимо для азработки методов иммунокоррекции хронических воспалительных заболеваний, в тиологии которых предполагается роль суперантигенов.

Благодаря изучению суперантигенов удалось сделать определенные шаги в онимании механизмов центральной (тимической) и периферической толерантности ^cha-Orbea, 1991), а также патогенеза таких сложных синдромов как шок (Jupin, 1988, liethke, 1992), иммуносупрессия (Cole, 1990), аутоиммунные заболевания (Paliard, 991; Davies,1991; Cole, 1993; Kotb, 1995). Несмотря на высказанные предположения, еханизмы воздействия суперантигенов на иммунную систему хозяина остаются еясными и до конца не изучены.

Исследование специфичесиких иммунологических нарушений, протекающих на юне трансплацентарного инфицирования микоплазмой, представляет собой важное аправление, но несмотря на важность остается малоизученным.

В этой связи ЦЕЛЬЮ настоящего исследования являлось изучение ммунопатологии, ииндуцированной микоплазменным суперантигеном при эансплацентарном заражении отвечающей на MAS линии мышей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) Выделение и очистка микоплазменного суперантигена.

2) Разработка способов инфицирования M.arthritidis беременных мышей дву> пиний, оппозитных по чувствительности к микоплазменному суперантигену.

3) Оценка специфической (в отношении суперантигена) и неспецифическо£ пролиферативной активности лимфоидных клеток потомства зараженных мышей. По; "специфической" пролиферацией в работе имеется ввиду пролиферация по/] действием MAS.

4) Изучение супрессорных свойств лимфоидных клеток мышей, рожденных инфицированными микоплазмой самками.

5) Анализ продукции ряда цитокинов (интерлейкин-1, -2-подобных факторов) лимфоидными клетками у потомства инфицированных животных.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

- Впервые охарактеризовано влияние суперантигена Mycoplasma arthritidis на модуляцию иммуногенеза при трансплацентарном инфицировании мышей чувствительной линии Balb/c.

- Впервые показано, что у потомства инфицированных животных развивается иммунодефицитное состояние, выражающееся в снижении спонтанной пролиферации, отсутствии пролиферации под действием MAS, снижении продукции ИЛ-1 -подобного фактора под влиянием MAS.

- Впервые установлена аутоиммунная реактивность, что проявляется в повышении пролиферативного ответа в сингенных смешанных культурах.

Иммунологический статус мышей, инфицированных микоплазменным суперантигеном трансплацентарно, проанализирован впервые.

Выявленая в работе способность MAS индуцировать иммунодепрессию и аутоиммунную реактивность при вертикальной передаче, свидетельствующая о разнообразии взаимодействия суперантигенов с клетками иммунной системы, дает основание предположить возможность разработки иммунокоррекции на этапе развития отдельных патогенетических звеньев. Проведенная работа свидетельствует о важности дальнейшей расшифровка механизмов воздействия суперантигенов на иммунитет для понимания этиопатогенеза хронических инфекционных заболеваний, внутриутробной инфекционной патологии, аутоиммунных зоболеваний, в основе

которых предполагается роль инфекционного агента, обладающего суперантигенными свойствами.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были доложены на конференции отдела иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН в июне 1997 г.

ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации изложены в 1 опубликованной работе.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из глав, включая материалы и методы, заключения, выводы, указатель литературы, включающий 126 источников. Материалы диссертации изложены на 101страницах, содержащих 4 таблицы и 22 рисунка.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 .Животные

В работе использовали самок исамцов мышей инбредных линий C57BI/6 и Balb/c, полученных из питомника "Столбовая" РАМН. Беременных самок заражали по методике Мирчинк Е.П. От этих мышей отбиралось потомство с отставанием в росте и развитии. В <ачестве контроля использовали интактных мышей обеих линий.

2.Инфекционный агент

В работе использовалась Mycoplasma arthritidis (штамм PG6), полученную из паборатории профессора Freundt (Aarhus University, Дания). Микоплазму культивировали

з питательном бульоне. Для заражения использовали 4-суточную культуру микоплазмы с гитром 2x108 КОЕ в 1 мл. Каждому животному вводили по 0,5 мл. цельной культуры, (онтрольные мыши получали 0,5 мл. физиологического раствора.

Для частичной очистки митогенного фактора, содержащегося в супернатанте ультуры М.arthritidis (MAS), культуральную жидкость, освобожденную от микоплазм (ентрифугированием при 10.000 об/мин. (R=19 см) в течение 20 минут и последующим фильтрованием через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм., фракционировали на

колонках с TSK-гелем HW 60 (Япония) (25x2,5см), уравновешенных раствором Хенкса. Элюцию фракций производили раствором Хенкса (скорость элюции 0,3мл/мин,объем фракций 0,5 мл.) на коллекторе фракций фирмы ЛКБ (РедиРак, Швеция).

3.Получение клеточных суспензий.

Для постановки иммунологических реакций у животных забирали селезенку. Органы гомогенизировалив стеклянных гомогенизаторах. Гомогенат фильтровали через стеклянную сеточку, дважды промывали в среде для центрифугирования, состоящей из среды 199 с 5% эмбриональной телячьей сывороткой производства НИИЭМ им. Н.Ф.Гамапеи РАМН, ЮмМ буферного раствора HEPES и 50мкг/мл гентамицина. Центрифугирование проводилось при 4°С, 1500 об/мин. (д=340) на центрифуге К23 (Янецки, ГДР) в течение 10 минут.

Далее клетки подсчитывали в камере Горяева. Для этого суспензию разводили в 100 раз 3% уксусной кислотой, подкрашенной метиленовым синим. Жизнеспособность клеток определяли с помощью окраски трипановым синим.

4. Постановка реакции бласттрансформиции.

При постановке реакции были использованы Т-митоген -Конканавапин А (КонА, Sigma, США) в концентрации 2мкг/мл и В-митоген липопописахарид Escherichia coli (ЛПС, Difco, США) в концентрации 100мкг/мл.

После приготовления взвеси клеток и нужного количества митогенов, которые разводили в среде культивирования, в каждую лунку 96-луночного плоскодонного микропланшета (Nunc, Дания) вносили 250 тысяч клеток в 0,1 мл. клеточной суспензии и по 0,1 мл. раствора митогена. В ряде опытов к лимфоцитам добавляли цельную культуру микоплазмы (2х108 КОЕ/мл.) в объеме 5 мкл. на лунку ( общий объем лунки 0,2 мл.) или фильтрат этой культуры через фильтры с порами диаметром 0,1 мкм. В контрольные лунки вместо митогена вносили 0,1 мл.среды культивирования.

Заполненную микропланшету помещали в СОг-инкубатор при 37С на 65 часов. За 16 часов до окончания срока инкубации в каждую лунку вносили по 1мкКи 3Н-тимидина с удельной активностью 1Ки/мМ в объеме 5 мкл. Величину включения изотопа измеряли на счетчике Intertechnique (Франция) при комнатной температуре в течение 24 часов.

5.Определение активности ИЛ-1.

Для получения супернатанта, содержащего ИЛ-1, спленоциты стимулировали в течение 16-20 часов митогенами (ЛПС, КонА, MAS). Супернатанты хранили при -70°С. В качестве стандартного препарата ИЛ-1 был использован ИЛ-1, выделенный из культуры клеток P3S8D1, стимулированных форболмиристатацетатом.

Активность ИЛ-1 тестировали на тимоцитах. Для супернатантов, полученных после стимуляции клеток ЛПС, использовали тимоциты мышей СЗИ/HeJ, не отвечающих на Л ПС, а для супернатантов,полученных после стимуляции клеток MAS - тимоциты мышей C57BI/6, не отвечающих на этот митоген.

500 тысяч тимоцитов инкубировали в течение 3-4 суток вместе с тестируемым супернатантом и ФГА в субоптимальной дозе (0,5 мкл/мл.) За 16 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 1 гик/Ки 3Н-тимидина в объеме 5 мкл (удельная активность 1 Ки/мМ). Радиоактивность подсчитывали как описано выше.

6. Определение активности ИЛ-2.

Тестируемые клетки стимулировали КонА или другим митогенным препаратом в течение 40 часов, после чего собирали культуральный супернатант, который замораживали и хранили при -70°С.

В качестве тест-системы использовали КонА-бласты. Для их получения в течение 3-4 суток спленоциты мышей стимулировали КонА. Клетки отмывали от митогена после окончания срока культивирования.

Посредством центрифугирования (д=340) КонА-бласты освобождали от клеточного детрита, затем подсчитывали число живых клеток, разводили их СК и разливали суспензию по лункам 96-луночных планшетов (по 40 тысяч клеток на лунку). К клеткам добавляли тестируемый супернатант в различных разведениях и а-метил-маннозид (окончательная концентрация 0,1 М) для блокирования активности оставшегося КонА. Планшеты с КонА-бластами инкубировали в СОг-инкубаторе в течение 20 часов. За 4 часа до окончания инкубации в каждую лунку вносили 2-4 мкКИ 3Н-тимидина в объеме 10-20 мкл. Радиоактивность подсчитывали так же, как и при постановке РБТ.

7. Исследование активности лимфоцитов в СКЛ.

Для постановки СКЛ к 0,1 мл. суспензии лимфоцитов вместо раствора митогена добавляли 0,1 мл. суспензии стимулирующих клеток (концентрация 5млн./мл.). Для получения стимулирующих клеток спленоциты до введения в культуру облучали в дозе 1500 рад. на установке ЭКУ-50 в НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Источником гамма-излучения служил 6ЭС0 (мощность дозы 50-70 рад/мин.). Учет реакции осуществляли как в п.З.

8. Определение хелперно-супрессорной активности лимфоцитов.

У опытных животных стерильно извлекали селезенки, готовили суспензию лимфоцитов. Затем обрабатывали клетки митомицином С (Mitomycin С, Sigma, США). Для этого клетки суспендировали в растворе митомицина С в среде RPMI-1640 ("Flow", Англия) с концентрацией 50 мкг/мл. из расчета 107 клеток в 1 мл. Инкубировали 30 минут

при 37°С при постоянном перемешивании, затем отмывали в среде 199 с 10% бычьей сывороткой и 50мкг/мл. гентамицина (Flow, Англия). Определяли количество живы> клеток. Затем клетки переводили в среду для культивирования.

Супрессоры в количестве 250.000 разводили в объеме 50 мкл., затем добавляли 5С мкл. митогена или MAS, после чего вносили 100 мкл. интактных клеток сингенной nmw мышей. Активность супрессорных клеток определяли по сравнению пролиферации отвечающих клеток.

9. Статистическая обработка результатов

Достоверность числовых различий оценивали по критерию Стъюдента. Вероятность ошибки (Р) определяли по таблицам с помощью вычисленного значения t. Разницу считали статистически достоверной при р< 0,05. Доверительные интервалы рассчитывали при р=0,05. На всех графиках она обозначена тонкими вертикальными линиями или заштрихованными областями.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Очистка микоплазменного суперантигена

В литературе имеются указания на то, что супернатант M.arthritidis обладает суперантигенными свойствами. В работе опытным путем было показано, что в цельной культуре M.arthritidis могут присутствовать не только митогенные факторы, но и ингибирующие бласттрансформацию факторы. Так, липидная фракция, выделенная из M.arthritidis, обладает только ингибирующим действием. Ингибировали пролиферацию и поверхностные белки M.arthritidis, в супернатанте которых содержатся митогенные факторы. Из препарата поверхностных белков сульфатом аммония были осаждены глобулярные белки, в результате чего были получены фракция глобулярных белков и фракция супернатанта. Митогенная активность фракции супернатанта была такой же, как у исходного препарата MAS. Т.е. супресорные свойства поверхностных белков связаны с фракцией глобулярных белков, а митогенная активность с фракцией супернатанта.

"Супрессорные" компоненты МАБ.были также отделены от митогенных при хроматографии поверхностных белков M.arthritidis на TSK-геле HW-60 (рис.1). При этом фракция высокомолекулярных глобулярных поверхностных белков обладала ингибирующими свойствами, а сравнительно низкомолекулярные фракции (14-22 кД)-митогенными свойствами.

2. Оценка соматического статуса

По данным литературы влияние суперантигенов на иммунную систему при трансплацентарном инфицировании изучено недостаточно..Вместе с тем известно, что микоплазмы способны к длительной персистенции а организме чувствительного хозяина (Прозоровский, 1978).

Кроме иммунологических параметров оценивали также показатели соматического развития пренатально зараженного потомства по сравнению с интактным потомством чувствительных мышей Balb/c и нечувствительных C57BI/6. Было выявлено, что потомство мышей Balb/c, зараженных микоплазмой, имело меньшую массу тела и меньший рост по сравнению с потомством интактных мышей. Максимальная разница, равная 4,3 г., получена на 10 сутки наблюдения. Потомство нечувствительной линии мышей C57BI/6 контрольной и опытной групп по росту и массе тела не отличалось. Из этих данных видно, что антигенное воздействие на плод при трансплацентарной передаче проявляется и после рождения потомства в виде снижения массо-ростовых показателей. Учитывая специфичность такого воздействия на зараженное потомство чувствительных мышей, можно предположить у них развитие иммунопатологического процесса, вызванного суперантигеном M.arthritidis.

3. Анализ специфического и неспецифического пролиферативного ответа

Специфическая и неспецифическая пролиферация оценивались в реакции БТ при

стимуляции лимфоцитов MAS, КонА.ЛПС.

Исследования реакции БТ лимфоцитов селезенки мышей опытной группы Balb/c показали ее подавление в присутствии MAS и ЛПС и сохранность реакции в присутствии КонА (рис.2.). Неотвечаемость иммунных лимфоцитов Balb/c в реакции БТ на MAS позволяет предположить у иммунных животных развитие иммунодепрессии или иммунологической толерантности, связанной с клональной делецией отвечающих vp6+, V(38+ Т-клеток во время онтогенеза в тимусе при наличии внутриутробной инфекции. Специфичность делеции подтверждается тем, что реакция БТ на КонА у опытных лимфоцитов сохранена, что предполагает сохранность других популяций Т-клеток,

Включение 3Н-тимидина ммп/мин ШО"3

Рис.1. Очистка мшогена М.аЛ1тй(& на колонках с ТЗК-гелем Н\У-50

о - профиль злюции при 286 нм. • - митогенная активность фракции

Область ыеасду линиями - спонтанное включение 3Н-пшндина спленощпами мышей СВА.

Без митогена

кмн/мкнх 10"-

/ л

/

ш

к7

BALB/c C67BL/6

^ЗОгшт CZ3 Контрота

Липополисахарид

юлп/иккх 10

BALB/c C67BL/6

ЕЭ Опыт □ Контроль

Конканавалин А

кмп/икн X 10

BALB/c CE7BL/6

ЕЗОгшт □ Контрою

MAC

BALB/c C67BL/6

SI Опыт СЗ Контт-оя*

ш'шх 10

Рис.2 Реакция бласттрансформациипод действием конкавалина А, липополисахарида, MAC и без митогеяа.

хотя дополнительные исследования пролиферации на неродственные антигены не проводились.

Также оценивалась способность лимфоцитов опытных мышей C57BI/6 к пролиферации под влиянием митогенного и антигенного стимулов (рис.2.). Реакция БТ под влиянием КонА и ЛПС была подавлена. У мышей C57BI/6, вероятно, нарушена функция антиген-презентирующих клеток, что снижает пролиферативный ответ на митогены. Daynes(1982) и Tomai (1992) показали, что активировать Т-кпетки способны только АПК, зкспрессирующие ГКГС-II молекулы, что сами АПК должны быть метаболически активны. Пронин и соавт. (1981) показали, что функция АПК нарушается под действием M.arthritidis. Стимуляция MAS и иммунных, и интактных лимфоцитов C57BI/6 не вызывала пролиферации, т.к. линия C57BI/6 не чувствительна к MAS.

4. Выявление супрессорной активности

Многими авторами ранее подробно охарактеризовано стимулирующее действие суперантигенов на лимфоидные клетки (Bekoff,1987; Mattes,1988; Cole, 1991; M¡ethke,1995; Rink, 1996).Описан также и супрессирующий эффект суперантигенов SEA, SEB, SEE, TSST-1 на имунную реактивность хозяина (Holly, 1988;Taub, 1990; Hsiang-Ling Ни,1996). Супрессия может развиваться по двум причинам: 1) благодаря генерации ингибирующих лимфокинов (вероятнее всего простагландинов) вследствие стимуляции суперантигеном или 2) в результате активации суперантигеном антиген-специфических и/или генетически рестриктированных супрессорных клеток.

В данной работе высказано предположение о том, что суперантиген, выделяемый M.arthritidis, также может оказывать специфическое супрессирующее действие на иммунокомпетентные клетки зараженных внутриутробно мышей линии Balb/c. Для подтверждения данного положения исследовали супрессорную активность лимфоцитов селезенки иммунных животных в опытах по смешиванию клеток со спленоцитами интактных животных. Супрессорная активность оценивалась по угнетению способности клеток интактных животных к пролиферации под действием MAS, КонА и ЛПС. У мышей линии Balb/c добавление опытных предобработанных митомицином С клеток к интактным клеткам селезенки подавляло пролиферацию под действием MAS (рис.3.). Пролиферативный ответ на митогены КонА и ЛПС при этом затронут не был. Эти данные говорят о специфической супрессорной активности лимфоцитов мышей Balb/c, зараженных микоплазмой внутриутробно, т.к. неспецифическая пролиферация на КонА и ЛПС сохранена. Для нечувствительной линии C57BI/6 закономерностей специфической супрессии выявлено не было.

В А 1_ В / с ; Опытные мыши

кпт/ккн х 10 *

ивш/глккх 10-3

о*о а*к

□ БмМГ И МАС

о«к о«о о«х а.п

□ КокАЕЗ ЛПС

ВАЬВ/С

К« Х.О

; Контпольные мыши

ИЙПАлких 10 3

к*х к «о

□ БбШГ И МАС

О - Огшт, К - Контроль

□ КонАИЛП С

3

Рис 3. Хелперно-супрессорные взаимодействия лимфоцитов Ва1Ь/с при введении МАС, КонА и ЛПС

5. Исследование активности лимфоцитов в смешанной культуре

Известно, что обычные антигены и политональные стимуляторы Т-клеток стимулируют либо Th1-, либо "П12-клетки (Петров,1987; Theofilopoulos,1989; Sher,1992; Romagnani,1992; Laago-Deenadaylan,1993).Th1-KneTKH продуцируют ИФН-гамма и оказывают хелперное влияние на пролиферацию и созревание цитотоксическихТ-клеток, необходимых для клеточного иммунного ответа. ТИ2-клетки продуцируют ИЛ-4 и ИЛ-10, а эти цитокины стимулируют B-клетки к пролиферации и дифференцировке, к продукции антител, что обеспечивает гуморальный иммунный ответ. Более того, Th1- и "ТТ12-клетки и их продукты являются антагонистами. По этой причине после стимуляции антигеном или поликлональным стимулятором Т-клеток наблюдается продукция ТМ-цитокинов или продукция Th2-qmr0KHH0B (Romagnani,1992).

При аутоиммунных заболеваниях аутореакгивность связана с наличием аутореакгивных Т-клеток и/или аутоантител, при этом стимулируются и Th1- и Th2-клетки (Theofilopoulos,1989). Поданным Tumang (1991) и Stohl (1994) суперантигены стимулируют цитотоксические Т-клетки специфично по Vß-цепи ТКР и поликлонально стимулируют B-клетки. Подобный спектр индуцированных суперантигеном M.arthritidis клеток показали Kirchner (1986), Homfeld (1990),Rink (1992). Таким образом, параллельное индуцирование Th1- и ТИ2-клеток без антагонизма или при разобщении антагонистических взаимодействий специфично для суперантигенов. Это параллельное Th1- и ТИ2-индуцирование может быть первым звеном патогенеза аутоиммунных болезней, вызванных суперантигенами, так как в обычных условиях иммунная система идет по одному из путей иммунного реагирования, клеточному или гуморальному (Romagnani,1992).

В настоящей работе для установления существования аутоиммунных реакций у иммунных мышей Balb/c проводили эксперименты по смешиванию спленоцитов опытных мышей с интактными спленоцитами. Уровень пролиферации в культуре опытных и интактных лимфоцитов C57BI/6 был выше уровня пролиферации в культуре интактных клеток (рис.4), что может объясняться изменением под влиянием MAS молекул ГКГС-П на АПК. Наблюдалось существенное повышение пролиферативного ответа в культуре клеток от интактных мышей Balb/c с клетками от опытных животных. Следовательно,лимфоидные клетки мышей линии Balb/c опытной группы реагируют на антигены ГКГС на лимфоцитах здоровых мышей Balb/c как на чужеродные пролиферацией в смешанной культуре. Значит, иммунные нарушения, вызываемые MAS, сопровождаются аутоиммунными расстройствами. Данные об аутоиммунном компоненте иммунных нарушений под действием MAS, полученные в этой работе,

РЕАКЦИЯ В СКЛ

В)»В1 ВКВАЬВ В1*ВАЬВ-МА5

ВША5»В]-МА5 ВЬМАБ+ВЬ

В-1Ш*ВА1.Е

12-гТ

ВАЬВ+ВАЬВ ВА1-В-МА$+ ВАЬВ-МАЗ

ВА1.В-ЬШ +БАЬВ

Рис 4 Реакция в смешанной культуре лимфоцитов (объяснения в тексте).

соответствуют результатам исследований Kirchner (1986), Homfeld (1990) и Rink (1992). А кроме того, свойство MAS вызывать аутоиммунные нарушения сближает его с другими микробными суперантигенами (Tumang,1991;Stohl,1994;Rink,1996).

6. Анализ ИЛ-1-подобной активности

Известно, что микробные суперантигены оказывают значительное влияние на продукцию цитокинов, которые в свою очередь опосредуют межклеточные взаимодействия и регулируют иммунный ответ (Ikejima, 1984;Jupin, 1988; Parsonet, 1988; Fast, 1989; Fast,1991; Gjorloff,1991; Anderson, 1992). В работе исследовали способность иммунных и интактных клеток мышей линий С57В1/6 и Balb/c продуцировать ИЛ-1- и ИЛ-2-подобные факторы под действием митогена КонА и MAS.

Активность ИЛ-1-подобного фактора определяли на тимоцитах мышей С57В1/6 при добавлении к ним содержащего ИЛ-1 супернатанта от спленоцитов опытных или контрольных животных после стимуляции клеток КонА или MAS. Под действием КонА уровень продукции ИЛ-1 опытными клетками C57BI/6 был ниже такового для контрольных клеток. При добавлении опытных, обработанных митомицином С клеток к контрольным продукция ИЛ-1-подобного фактора под влиянием КонА существенно снижалась. И наоборот, при добавлении контрольных обработанных митомицином С клеток к опытным ИЛ-1-подобный фактор при КонА стимуляции продуцировался в значительно больших количествах (рис.5). Учитывая, что продукция ИЛ-1-подобного фактора является функцией макрофагов можно думать, что у иммунных мышей C57BI/6 нарушено функционирование антигенпрезентирующих клеток. Для иммунных лимфоцитов Balb/c можно сказать, что продукция ИЛ-1, а следовательно неспецифический пролиферативный ответ под действием КонА у них сохранены.

Стимуляция MAS приводила к более низкому уровню продукции ИЛ-1-подобного фактора у иммунных лимфоцитов Balb/c по сравнению с интактными. У лимфоцитов C57BI/6 продукция ИЛ-1-подобного фактора под действием MAS была одинаковой. У мышей Balb/c внесение иммунных клеток, обработанных митомицином С, в культуру интактных подавляло продукцию ИЛ-1-подобного фактора (рис.6). Данные о том, что иммунные лимфоциты Balb/c приводят к снижению продукции ИЛ-1 под действием MAS интактными клетками, говорят о снижении специфического пролиферативного ответа под влиянием суперантигена у чувствительной линии мышей Balb/c. У мышей C57BI/6 добавление опытных обработанных митомицином С клеток к контрольным или контрольных обработанных митомицином С клеток к опытным не влияло на продукцию ИЛ-1 при стимуляции MAS.

Рис. 5. Влияние спленоцитов потомства опытных и контрольных мышей С57В1/6 на продукцию ИЛ-1 -активности, индуцированной КонА

7. Анализ ИЛ-2-подобной активности

Уровень продукции ИЛ-2-подобного фактора под действием КонА и MAS тестировали на КонА-бпастах, полученных от контрольных мышей. У мышей Balb/с КонА стимулировал продукцию ИЛ-2-подобного фактора в контроле и опыте одинаково, а у мышей C57BI/6 сильнее в контрольной группе. Для линии Balb/с добавление опытных обработанных митомицином С клеток к контрольным не влияло на продукцию ИЛ-2-подобного фактора под действием КонА, опытные клетки C57BI/6 в подобном случае подавляли выработку ИЛ-2-подобного фактора. Стимуляция MAS не давала достоверных различий в продукции ИЛ-2-подобного фактора иммунными и интактными клетками как линии Balb/с, так и C57BI/6, что в последнем случае, по-видимому, объясняется неотвечаемостью линии C57BI/6 на суперантиген MAS.

Таким образом, продукция ИЛ-2-подобного фактора у мышей Baib/c, инфицированных M.arthritidis внутриутробно, не изменена. И следовательно ИЛ-2 также может выступать в роли эндогенного иммуномодулятора развившегося под действием MAS инфекционного процесса. В настоящее время установлено, что ИЛ-2 стимулирует пролиферацию только активированных В-лимфоцитов, так как преактивированные В-клетки содержат сравнимое с Т-лимфоцитами количество высокоаффинных рецепторов к ИЛ-2 (Кетлинский, 1992). Как было отмечено выше, MAS стимулирует ТЬ2-клетки, которые продуцируют лимфокины, способные в свою очередь активировать В-клетки. Стимулированные В-клетки, являясь антителопродуцентами, могут вносить вклад в развитие аутоиммунных реакций у инфицированных мышей Balb/c.

Кроме того установлено, что действие ИЛ-2 на определенные клоны Т-клеток в критические моменты во время стимуляции Т-кпеток может приводить к неспособности этих Т-клеток отвечать на последующую антигенную стимуляцию (Hsiang-Ling Ни,1996).

Рис. 6 Влияние спленоцигов потомства опьпных и контрольных мышей Balb/c на продукцию ИЛ-1-ахпшноста, индуцированной MAC

Выводы

1. Из цельной культуры M.arthritidis выделен и хроматографически очищен (TSK-гель, HW-60) микоплазменный суперантиген, обладающий высокой митогенной активностью и молекулярной массой 14-22 кД.

2. У отвечающих на M.arthritidis мышей Balb/c, инфицированных трансплацентарно, установлено иммунодефицитное состояние, которое выражается в снижении способности лимфоцитов к MAS-индуцированой пролиферации..

3. Иммунодефицитному состоянию сопутствует аутоиммунная реактивность, что проявляется в повышении пролифертивного ответа в сингенных смешанных культурах клеток от мышей, трансплацентарно зараженных M.arthritidis, с контрольными.

4. Одним из механизмов формирования иммунодефицитного состояния является индукция суперантиген-специфических супрессорных клеток у отвечающей линии Balb/c.

5. Активация специфических супрессорных клеток в селезенке потомства инфицированных мышей Balb/c снижает продукцию ИЛ-1-подобного фактора под действием MAS.

6. У потомства инфицированных мышей C57BI/6 снижена неспецифическая пролиферация, продукция ИЛ-1-подобного фактора под действием КонА и ЛПС, а также выражена аутоиммунная реактивность в сингенных смешанных культурах

Таким образом, показана роль MAS в модуляции иммуногенеза при трансплацентарном инфицировании, заключающаяся в индукции иммунодефицита и аутоиммунных нарушений.

Основные положения диссертации отражены в печатной работе:

Пронин A.B., Деева A.B., Зуев В.А., Мирчинк Е.П., Раковская И.В., Ялфимова Е.Ю. Иммунологические последствия врожденных персистирующих инфекций.// МРЖ- 1997.