Автореферат и диссертация по медицине (14.01.02) на тему:Клинико-патогенетические особенности медленно прогрессирующего аутоиммунного сахарного диабета у взрослых

На правах рукописи

Лазаренко Феликс Эдуардович

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МЕДЛЕННО ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО АУТОИММУННОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА У ВЗРОСЛЫХ

14.01.02 - эндокринология 14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005058419

16 МАЯ 2013

Томск-2013

005058419

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой

эндокринологии лечебного факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский

университет» Минздрава России

доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией

молекулярно-клеточных механизмов терапевтических заболеваний ФГБУ «НИИ терапии» СО РАМН

Ворожцова Ирина Николаевна

Рязанцева Наталья Владимировна

Бондарь Ирина Аркадьевна

Душкин Михаил Иванович

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «31» мая 2013 г. в_часов на заседании диссертационного

совета Д 001.029.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт терапии» СО РАМН (630089, Новосибирск, ул. Бориса Богаткова, 175/1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ терапии» СО РАМН

Автореферат разослан «_» апреля 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Кузнецов Александр Александрович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Социальная острога проблемы сахарного диабета (СД) связана с кумулятивным характером заболеваемости, высокой инвалидизацией пациентов, а также с существенными финансовыми издержками, обусловленными ведением этих пациентов [Национальная группа по изучению секреции инсулина, 2006]. На протяжении последних десятилетий во всех возрастных и этнических группах отмечается неуклонный рост заболеваемости СД [Mokdad А.Н. et al., 2000]. По данным Международной диабетической федерации (International diabetes federation), в 2011 году в мире зарегистрировано 366 млн. человек, страдающих СД [IDF, 2011].

Известно, что не у всех больных СД одинаково быстро формируется потребность в инсулине, и развиваются поздние осложнения. Это прежде всего определяется степенью повреждения ß-клеток поджелудочной железы. В настоящее время в качестве ключевых звеньев патогенеза повреждения ß-клеток рассматриваются аутоиммунные механизмы, глюкозо- и липотоксичность, а также системный окислительный стресс и цитокиновый дисбаланс [Hohmeier Н.Е. et al., 2003]. Нет никаких сомнений в том, что простое подразделение СД на 1 и 2 типы является упрощенным. Если дебют заболевания приходится на период от 30 до 55 лет, могут иметь место различные патогенетические варианты СД, требующие дифференцированной терапевтической тактики [Смирнова О.М. и соавт., 2008].

Сравнительно недавно среди клинических форм СД был выделен медленно прогрессирующий аутоиммунный диабет взрослых (LADA) [Groop L. et al., 1986]. Имеющиеся в литературе данные позволяют считать, что медленное повреждение ß-клеток при LADA не является случайным, а отражает патогенетические особенности функционирования Т-звена иммунитета, отличные от механизмов развития СД1 [Tsiavou A. et al., 2004]. Однако конкретные механизмы нарушения цитокиновой регуляции при различных патогенетических вариантах СД все еще остаются невыясненными.

До настоящего времени в классификации сахарного диабета LADA отдельно не выделяется [ВОЗ, 1999], его иммунологическая диагностика рутинно не проводится. Зачастую, больные LADA не получают инсулинотерапию, которая считается патогенетически адекватным методом лечения при данном варианте СД [ Stenström G. et al., 2005]. Относительно использования у пациентов с LADA метформина и таизолидиндионов данные литературы противоречивы [Zhou Z. et al., 2005; Brophy S. et al., 2008]. Одним из перспективных путей патогенетического лечения пациентов с LADA является иммуноинтервенция [Leslie R.D. et al., 2006].

В целом, уточнение роли иммунологических нарушений в прогрессировании повреждения ß-клеток островков Лангерганса при LADA целесообразно для разработки новых стратегий диагностики и лечения не только этого заболевания, но и СД1 с классическим дебютом

Цель исследования: установить клинико-патогенетические особенности медленно прогрессирующего аутоиммунного сахарного диабета взрослых; оптимизировать алгоритм диагностики LADA.

Задачами настоящего исследования являлись:

1. Выявить клинические и метаболические особенности LADA у больных с учетом возраста дебюта, индекса массы тела, наличия осложнений сахарного диабета и потребности в инсулине в соответствии со стажем заболевания.

2. Установить диагностически значимые закономерности изменений профиля аутоантител к антигенам островков Лангерганса у больных LADA по сравнению с таковыми у пациентов с сахарным диабетом I типа.

3. Оценить изменения субпопуляционного состава лимфоцитов крови, общие закономерности и особенности изменения концентрации цитокинов (IL-2, -4, -10, TNF-a, IFN-y) в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови и количества лимфоцитов, несущих комплементарные им рецепторы (IL-2Ra; TNF-Rl; IL-4Ra; IL-10R; IL-12R), а также системы Fas/Fas-L/sFas-L у больных LADA, сахарным диабетом 1 и 2 типа.

4. Оптимизировать и внедрить в клиническую практику патогенетически обоснованный алгоритм идентификации LADA у пациентов с клиническим фенотипом сахарного диабета 2 типа.

Научная новизна. Получены новые данные о клинических проявлениях (абдоминальное ожирение, артериальная гипертензия и наличие микроангиопатий) и метаболических нарушениях (гиперхолестеринемия и снижения секреции С-пептида) у больных LADA в зависимости от длительности заболевания. Впервые доказано, что дифференциальная диагностика LADA на основании клинических и метаболических признаков эффективна только при стаже заболевания более четырех лет.

Впервые установлена высокая частота ассоциации LADA с аутоиммунным тиреоидитом (32,3%).

Получены новые данные об изменении субпопуляционного состава лимфоцитов крови, изменении цитокинпродуцирующей способности мононуклеарных лейкоцитов и количестве лимфоцитов, несущих комплементарные цитокинам рецепторы, в крови у пациентов с LADA. Установлено, что у больных LADA имеет место повышение содержания в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов IL-2, IFN-y и IL-10 при неизмененном количестве в крови лимфоцитов, несущих комплементарные им рецепторы, аналогичное таковому у пациентов с СД1 и СД2. При LADA имеет место повышение концентрации IL-4 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов и количества IL-4Ra+-flm^04HT0B в крови, по сравнению с таковым у здоровых лиц. Впервые показано, что при декомпенсации углеводного обмена имеет место увеличение ФГА-стимулированной концентрации IL-2 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов, а при формировании микрососудистых осложнений СД - повышение количества IL-2Ra+-лимфoцитoв в крови. Установлено, что при раннем развитии микрососудистых осложнений LADA имеет место повышение концентрации IL-2, IL-4 и TNF-a в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов.

Получены новые данные о дисбалансе в системе индукторов апоптоза лимфоцитов при LADA, характеризующемся увеличением количества TNF-R1+- и Рая-Ь+-лимфоцитов в крови и снижением содержания в супернатантах клеточных культур sTNF-Rl, по сравнению с таковым у больных СД1, что может обусловливать особенности течения аутоиммунного инсулита.

Предложен патогенетически обоснованный алгоритм диагностики LADA, включающий иммунологический скрининг при стаже заболевания до 4 лет и клинико-метаболическую идентификацию при большем стаже заболевания.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в ходе исследования фактические данные уточняют значимость клинических признаков (абдоминального ожирения, артериальной гипертензии, формирования инсулинопотребности и микроангиопатий) и метаболических нарушений (гиперхолестеринемии и снижения секреции С-пептида) в дифференциальной диагностике LADA в зависимости от длительности болезни. На основании результатов исследования оптимизирован алгоритм диагностики LADA с учетом стажа заболевания, включающий рекомендации по одновременной идентификации в сыворотке крови двух типов аутоантител (ICA и GADAb), проведению динамической оценки остаточной секреции инсулина и скрининг аутоиммунных тиреопатий, а также по раннему назначению инсулинотерапии с целью сохранения секреции инсулина.

Результаты исследования могут служить основанием для дальнейшей оценки молекулярных и клеточных механизмов формирования LADA, разработки на основе полученных фактических данных патогенетически обоснованных подходов к диагностике и лечению больных LADA посредством идентификации специфичных молекулярных диагностических маркеров и фармакологических мишеней.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клинические признаки (меньшая частота абдоминального ожирения и артериальной гипертензии, по сравнению с таковыми у больных классическим СД2, а также наличие микроангиопатий), снижение секреторного резерва С-пептида и формирование потребности в инсулинотерапии позволяют формировать группы скрининга LADA лишь среди пациентов с клиническим фенотипом СД2 с длительностью болезни более четырех лет. С целью верификации LADA при меньшем стаже заболевания целесообразна одновременная идентификация GADAb и ICA в сыворотке крови у всех больных, позволяющая выявлять LADA с высокой чувствительностью (90,3%).

2. LADA ассоциируется с аутоиммунным тиреоидитом чаще (32,3%), чем СД1 (5,4%) и СД2 (10,4%), что обуславливает целесообразность ежегодного скрининга аутоиммунных тиреопатий у данной группы пациентов.

3. У больных LADA имеют место изменения субпопуляционного состава лимфоцитов крови (повышение количества СОЗ+-лимфоцитов и снижение числа CD16+CD56+-KneroK, по сравнению с таковым у здоровых лиц и больных СД2), системы цитокинов и комплементарных им рецепторов (повышение концентрации IL-2, IFN-y, IL-10 и IL-4 в супернатантах культур

мононуклеарных лейкоцитов и числа 1Ь-4Яа+-лимфоцитов, по сравнению с таковым у здоровых лиц), а также дисбаланс в системе рецепторопосредованного апоптоза лимфоцитов (увеличение количества TNF-R1+- и Раз-Ь+-лимфоцитов в крови и уменьшение содержания в супернатантах клеточных культур sTNF-Rl, по сравнению с таковым у больных СД1).

4. Раннее развитие микрососудистых осложнений LADA характеризуется выраженными метаболическими (резкое падение секреции С-пептида после 4-го года заболевания) и иммунологическими изменениями (высокий уровень IL-2, IL-4 и TNF-a в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов).

Апробация и реализация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на научной конференции «Пейро гуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем в норме и при патологии» (Томск, 2009), конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2010), межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010), XI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010), V Всероссийском диабетологическом конгрессе (Москва, 2010), II Съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2010), конференциях «Актуальные вопросы эндокринологии» (Томск, 2010 и 2011), всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Сахарный диабет, метаболический синдром и сердечно-сосудистые заболевания» (Томск, 2012) и на заседаниях общества эндокринологов (Томск, 2009-2012).

Исследование выполнено в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20092013 годы (проект «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины», ГК № 02.740.11.0311) и проекта «Молекулярные механизмы цитокин-опосредованной дисрегуляции апоптоза лимфоцитов при поляризации иммунного ответа по Thl- или ТЬ2-пути» (ГК № 02.120.11.3 842-М Д), поддержанного Советом по грантам при Президенте Российской Федерации.

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедрах эндокринологии и диабетологии, патофизиологии по направлению «Патофизиология обмена веществ», молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики по направлению «Лабораторная диагностика эндокринопатий», а также в лечебный процесс в эндокринологической клинике и исследовательскую деятельность Научно-образовательного центра молекулярной медицины ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из которых 6 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 226 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов; иллюстрированы 29 таблицами и 21 рисунками), выводов и списка литературы, включающего 645 источника, из них 33 - отечественных и 612 - зарубежных.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ ГРУПП И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 135 человек в возрасте от 19 до 63 лет (средний возраст - 41,1±1,0 год), включая 37 пациентов с СД 1, 67 пациентов с СД2 и 31 больного LADA. Контрольную группу составили здоровые лица, сопоставимые по возрасту и полу (30 человек).

Диагноз СД и его осложнений устанавливали после детального клинико-инструментального обследования в условиях эндокринологического отделения ОГУЗ ТОКБ и эндокринологической клиники ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России на основании критериев классификации СД, принятой ВОЗ (1999), «Алгоритмов специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом», а также согласно Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем, 10-го пересмотра, принятой Всемирной организацией здравоохранения в Женеве в 1995 году (по МКБ-10 рубрики ЕЮ, El 1 и Е13).

Все обследованные пациенты были разделены на три группы: основная группа - больные LADA, группы сравнения - больные СД1 и пациенты с СД2.

Верификация диагноза LADA осуществлялась путем выявления в сыворотке крови циркулирующих антител к клеткам панкреатических островков с помощью иммуноферментного анализа (EL1SA). Диагноз LADA считался верифицированным при повышении титра аутоантител хотя бы одного типа.

Материалом для проведения иммунологического исследования служила венозная кровь, взятая утром натощак из локтевой вены - 2 образца по 10 мл. Первый - стабилизировали гепарином (25 Ед/мл), второй - использовали для отделения сыворотки.

Для реализации предпринятого нами исследования были выделены клинический и иммунологический блоки. Основу клинического блока исследования составили следующие методы:

• Сбор жалоб, анамнеза, объективное и параклиническое обследование

• Определение уровня глюкозы глюкозооксидазным методом в капиллярной крови

• Определение концентрации в крови гликогемоглобина А)с с помощью анализатора «NycoCard READER И» («AXIS-SHIELD pic», Великобритания).

• Определение содержания в сыворотке С-пептида (базального и стимулированного на 120 мин ТТСП) при помощи ELISA по

инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («АссиВтс1», США).

Иммунологический блок исследования включал (табл. 1):

Таблица 1

Распределение обследованных лиц в соответствии с использованными иммунологическими методами исследования

Иммунологические методы исследования LADA СД1 СД2 Здоровые доноры

Исследование содержания в сыворотке крови GAD65Ab, ICA и IAA методом ELISA 31 37 67 30

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов крови (CD3, CD16CD56, CD45, CD4, CD 19, CD 8) методом проточной цитометрии 21 20 35 22

Исследование содержания в супернатантах цитокинов (IL-2, -4, -10, IFN-y, TNF-a) и sTNF-R1 методом ELISA 21 20 35 22

Исследование содержания в супернатантах sFas-L методом ELISA 21 20 22 -

Оценка количества лимфоцитов крови, несущих IL-2Ra, IL-4Ra, TNF-R1 методом проточной цитометрии 21 20 35 22

Оценка количества лимфоцитов крови, несущих IL-12R, IL-10R, Fas, Fas-L методом проточной цитометрии 21 20 22 -

• Выявление содержания в сыворотке GADAb, ICA и IAA при помощи ELISA по инструкции, предлагаемой производителями тест-систем («Biomerica» и «Orgentec», Германия).

• Выделение мононуклеарных лейкоцитов на градиенте плотности фиколл-верографин по методу Дж. Натвиг и соавт. [1997]. Для получения супернатантов выделенные мононуклеары ресуспендировали в полной питательной среде, стандартизировали количество клеток в суспензии до 2,0x10б/мл. Для стимуляции секреторных способностей лимфоцитов в пробы вносили фитогемагглютинин («Difco», Германия) с дальнейшей инкубацией клеточных суспензий [Хаитов P.M. и соавт., 1995].

• Определение базальной и фитогемагглютинин-индуцированной концентрации цитокинов (TNF-a, IL-2,4,10, IFN-y), растворимую форму sFas-L и sTNF-Rl в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови при помощи ELISA по инструкциям, предлагаемым производителями («ВекторБест», Новосибирск и «Bender MedSystems GmbH», Австрия). Учет результатов иммуноферментого анализа производили с помощью фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 нм.

Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочной кривой. Данные выражали в пг/мл.

• Идентификация субпопуляционного содержания лимфоцитов крови (CD3, CD16CD56, CD45, CD4, CD19, CD8) проводилась с помощью тест-системы BD Multitest 6-color TBNK Reagent на лазерном проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II с помощью программы BD FACSCanto согласно инструкции ее производителя («Becton, Dickinson and Со.», США).

• Оценка количества лимфоцитов крови, несущих рецепторы HHTOKHHOB(IL-2Ra, IL-4Ra, IL-10R, IL-12R, TNF-R1), Fas и мембранную форму Fas-L осуществлялась с помощью программы BD FACSDiva («Becton, Dickinson and Со.», США) на лазерном проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II в соотвегсгвии с инструкциями, предлагаемыми производителями тест систем («Beckman Coulter», США и «Invitrogen», США).

Завершающим этапом исследования являлась статистическая обработка результатов. Результаты исследования оценивали с использованием пакета программ «Statistica for Windows» (2008, версия 8.0) [Боровиков В.В., 2001, Реброва О.Ю., 2002] фирмы «Statsoft Inc» и пакета программ «Microsoft Excel» (2007). Оценку полученных данных проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез [Кремер Н.Ш., 2004]. Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения количественных показателей (по критерию Колмогорова-Смирнова). Для признаков, подчиняющихся закону нормального распределения, вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. Проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием вариационного анализа (ANOVA) и расчета критерия Ныомена-Кейлса. Для оценки достоверности различий признаков, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрический критерий Краскелла-Уоллиса (для нескольких независимых выборок). Для каждой выборки определяли медиану (Me), первый и третий квартили (Q1 и Q3). Для показателей, характеризующих качественные признаки, указывали абсолютное число и относительную величину в процентах. При анализе распределения качественных признаков использовался двусторонний вариант точного критерия Фишера. Для выявления функциональных взаимосвязей между изученными параметрами проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена(г) [Гланц С., 1998]. Для сопоставления показателей, измеренных в разных условиях у пациентов одной клинической группы, использовался критерий Уилкоксона. Анализ различия времени до наступления исхода проводился методом Каплана-Майера. Завершенными считали наблюдения, в которых изучаемый исход наступил на момент обследования больного [Реброва О.Ю., 2002]. При сравнении применялся F-критерий Кокса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно нашим данным, частота манифестации LADA во всех возрастных группах была сопоставимой (до 30 лет - 21%, от 30 до 50 лет —26%, после 50 лет - 13%, р<0,05), в то время как СД1 достоверно чаще развивался у пациентов в возрасте до 30 лет, а СД2, напротив, в старшей возрастной группе (50-60 лет). Таким образом, пациенты с LADA в среднем по возрасту занимали промежуточное положение относительно больных СД1 и СД2. Согласно нашим данным, по весу, ИМТ и окружности талии пациенты с LADA достоверно отличались от группы обследованных с СД2. Кроме того, при LADA значимо реже выявлялась артериальная гипертензия. Данные факты сближали группу пациентов с LADA и обследованных с СД1, что согласуется с данными литературы [Jonsdottir A.M. et а!., 2005; Fourlanos S. et al., 2006; Hawa M.I. et al., 2009; Brophy S. et al., 2010].

При анализе зависимости распространенности нефропатии и ретинопатии от патогенетического варианта заболевания было установлено, что микрососудистые осложнения встречались в обследованных клинических группах примерно с одинаковой частотой. Данный результат является вполне закономерным, поскольку включенные в исследование клинические группы были сопоставимы как по стажу заболевания, так и по уровню гликированного гемоглобина. Следует отметить, что в настоящее исследование были включены пациенты с небольшим стажем диабета (в среднем - 3 года), в то время как авторы, наблюдавшие более частое развитие микроангиопатий при LADA по сравнению с пациентами с СД2, обследовали пациентов с большей длительностью болезни [Bouhanick В. et al., 2002; Szepietowska В. et al., 2004; Arikan E. et al., 2005; Radtke M.A. et al., 2009].

В результате сопоставления данных о наличии микрососудистых осложнений, сроке их развития и функциональном состоянии ß-клеток поджелудочной железы было установлено, что снижение продукции С-пептида в крови после 4-го года заболевания при LADA ассоциировано с наличием диабетических микроангиопатий. Согласно данным ряда авторов, С-пептид обладает ангиопротективными свойствами [Maciejwska-Jeske М. et al., 2011], реализующимися через предупреждение глюкозоиндуцированного апоптоза и стимуляцию пролиферации клеток [Li Z. et al., 2003, Vasic D. et al. 2012].

Согласно данным ряда авторов, LADA может являться компонентом аутоиммунного полигландулярного синдрома [Jin Р et al., 2004; Krysiak R. et al., 2005]. Исходя из этого, нами был проведен анализ распространенности хронического аутоиммунного тиреоидита среди пациентов обследованных клинических групп. Данный подход позволил установить, что в группе обследованных лиц с LADA, тиреоидит Хасимото встречался чаще, чем при СД2 и при СД1. Таким образом, вероятно, LADA связан с аутоиммунным полигландулярным синдромом патогенетически, и пациенты с данным вариантом СД требуют активного динамического наблюдения с целью своевременного выявления развивающихся аутоиммунных эндокринопатий.

Нами было предпринято исследование нарушений липидного и углеводного обмена при LADA по сравнению с указанными патогенетическими вариантами СД. Следует отметить, что по уровню гликированного гемоглобина в крови клинические группы, включенные в исследование, были сопоставимы. Уровень общего холестерина, холестерина ЛПНП и коэффициент атерогенности в сыворотке крови у больных LADA достоверно отличались от аналогичных показателей в сыворотке крови у пациентов с СД2. Данный факт, вероятно, объясняется тем, что при формировании атерогенной гиперхолестеринемии основное значение имеет инсулинорезистентность, которая чаще регистрировалась у пациентов с СД2. Уровни ТГ и холестерина ЛПОНП в сыворотке крови у пациентов с LADA, напротив, были сопоставимы с аналогичными показателями у больных СД2. Весьма вероятно, что этот феномен объясняется высокой чувствительностью вышеуказанных показателей к минимальным нарушениям чувствительности к инсулину при СД2 и LADA, несмотря на сходное состояние компенсации углеводного обмена, определяемой по величине гликированного гемоглобина.

При дальнейшем анализе было установлено, что два и более признака метаболического синдрома (согласно критериям ATP 111 - Adult treatment panel, third report) среди пациентов с LADA встречались в 48,4%, что было достоверно чаще, чем при СД1, но реже, чем при СД2. Доля пациентов с LADA среди обследованных пациентов с метаболическим синдромом составляла 21%.

Исследования последнего времени показывают, что метаболический синдром не является фактором, исключающим наличие LADA [Gottsater A. et al., 1994; Humphrey A.R. et al., 1998; Lohmann T. et al., 2001; Jonsdottir A.M. et al., 2005; Хамнуева Л.Ю., 2006]. Согласно данным литературы, он наблюдается у 23-47% пациентов с LADA, а среди пациентов с клиническим фенотипом СД2 с метаболическим синдромом LADA диагностируется в 10% случаев [Gottsater A. et al., 1994; Li X. et al., 2003]. Существует точка зрения, что LADA является гетерогенным состоянием. Ряд авторов выделяет «LADA тип 2», ассоциированный с клиническим и метаболическим фенотипом СД2 и наличием одного типа аутоантител, и «LADA тип 1» при наличии GADAb и 1СА в высоком титре и дефицита инсулина [Lohmann T. et al., 2001; Palmer J.R., Hirsh I.B., 2003]. Согласно данным О.М. Смирновой и И.В. Кононенко, при одинаковом возрасте дебюта и стаже заболевания LADA и СД2 клинически мало различаются [Кононенко И.В., Смирнова О.М., 2003]. Таким образом, симптомы заболевания, взятые изолированно, не позволяют достоверно дифференцировать LADA от СД2. Обязательным для диагностики LADA является исследование лабораторных маркеров аутоиммунного процесса, направленного против ß-клеток.

Учитывая тот факт, что скорость прогрессирования заболевания и особенности его течения во многом определяются остаточной секрецией эндогенного инсулина, нами была проведена оценка уровня С-пептида натощак и на 120-й мин ТТСП. В ходе исследования зависимости уровня С-пептида в сыворотке крови у пациентов обследованных клинических групп от стажа заболевания было установлено, что при длительности заболевания до 4 лет

базальная и стимулированная секреция С-пептида в группе пациентов с LADA и СД2 достоверно не различаются, однако темп снижения базальной секреции С-пептида, определяемый с помощью метода Каплана-Майера, при LADA значимо выше, чем при СД2. Указанная динамика снижения секреции эндогенного инсулина при LADA согласуется с данными литературы [Kobayashi T. et al., 1993; Carlsson A. et al., 2000; Stenström G. et al., 2005]. При LADA скорость снижения секреторного ответа ß-клеток на 120-й мин ТТСП возрастает к четвертому году болезни, приближаясь к скорости падения секреции С-пептида при СД1 с классическим дебютом. С патогенетических позиций, данный факт следует рассматривать как свидетельство того, что при LADA, как и при СД1, ведущую роль в снижении функции ß-клеток играют именно иммунные механизмы, реализующиеся в сжатые сроки при СД1 и растянутые во времени при LADA. Тем не менее, следует отметить, что вплоть до 4 года болезни величины показателей секреции С-пептида не позволяют достоверно выделить пациентов с LADA из группы лиц с клиническим фенотипом СД2. Вероятно, более информативным является исследование секреторного ответа С-пептида в динамике.

LADA был подтвержден серологически у 26% пациентов, у которых его подозревали на основании клинических критериев, предложенных группой S. Fourlanos (манифестация в возрасте от 30 до 50 лет без развития кетоацидоза, ИМТ менее 25 кг/м2, отсутствие признаков метаболического синдрома, личный и семейный анамнез аутоиммунных заболеваний) [Fourlanos S. et al., 2006], и y 10% пациентов, не удовлетворяющих этим критериям. По нашим данным, чувствительность и специфичность клинических критериев LADA составили 70 и 57% (р<0,05), соответственно. Следовательно, использование только клинических критериев, без определения аутоантител к антигенам клеток островков, не позволяет достоверно отличить пациентов с LADA от больных с СД2 при стаже заболевания до четырех лет.

GADAb считаются наиболее специфичными для LADA и, согласно данным литературы, обнаруживаются у 50% пациентов с LADA [Lernmark А., 1996]. Согласно данным литературы, продукция GAD65Ab сохраняется многие годы после манифестации СД [Borg H. et al., 2002]. Согласно нашим данным, GADAb при LADA определялись в 38,7%, т.е. чаще и в достоверно более высоких концентрациях, чем при СД1. Согласно данным литературы, IAA более специфичны для СД1 с манифестаций в детском и подростковом возрасте, чем для LADA [Durinovic Bello I. et al., 1996]. Согласно полученным в настоящем исследовании данным, IAA при LADA определяются в 9,7% случаев, т.е. достоверно реже, чем при СД1. Определение антител к островковым клеткам (ICA) является вторым по частоте использования методом диагностики LADA. Согласно данным литературы, ICA определяются у 40-50% пациентов с LADA [Groop L. et al., 1986]. У обследованных нами пациентов с LADA ICA определялись у 70%, т.е. достоверно с более высокой частотой и в более высокой концентрации, чем при СД1.

Согласно нашим данным, одновременно два типа аутоантител присутствовали лишь у 17,6% пациентов с аутоиммунным СД (в объединенной

группе пациентов с СД1 и LADA). Согласно данным литературы, при LADA чаще всего определяется один тип аутоантител [Rowley M.J. et al., 1992; Zavala A.V. et al., 1992; Turner R. et al., 1997; Juneja R. et al., 2001; Hosszufalusi N. et al., 2003]. Исходя из этого, с целью верификации диагноза LADA мы считаем целесообразным рекомендовать определение в сыворотке крови двух типов аутоантител (ICA и GADAb); в этом случае чувствительность лабораторной диагностики LADA достигает 90,3%.

При исследовании структуры сахароснижающей терапии в обследованных клинических группах было установлено, что доля пациентов, получающих препараты инсулина, в группе LADA была выше, чем при СД2. Этот факт свидетельствует в пользу того, что, принимая терапевтические решения на основании анализа клинической картины заболевания, при LADA эндокринологи назначали инсулинотерапию чаще, чем ТСП. Тем не менее, 10 % пациентов с LADA не получали патогенетически обоснованной терапии инсулином. Эти результаты согласуются с данными научной литературы [Хамнуева Л.Ю., 2006]. Нами было установлено, что при LADA необходимость в назначении препаратов инсулина для компенсации углеводного обмена возникает достоверно раньше, чем при СД2. Данный факт является отражением более быстрого прогрессирования дисфункции ß-клеток при LADA, что также согласуется с данными литературы [Kobayashi T. et al., 1993; Carlsson A. et al., 2000].

По итогам проведенного исследования нами был разработан алгоритм скрининга и терапии LADA (рис. 1).

К настоящему времени утвердилось мнение многих исследователей об исключительной роли нарушений иммунорегуляции в механизмах формирования аутоиммунного сахарного диабета [Calcinaro F. et al., 1992; Lampeter E.B. et al., 1993; Petersen J.S. et a!., 1993; Rossini A.A. et al., 1993; Vialettes B. etal., 1993].

По данным проведенных нами исследований, количество CD3+-лимфоцитов в крови у пациентов с LADA было выше, чем у больных СД2 и у лиц контрольной группы (табл. 2). Данный факт, вероятно, связан с перманентным состоянием стимуляции иммунной системы вследствие хронически текущего аутоиммунного процесса. Количество CD4+- и CD8+-лимфоцитов в крови у пациентов с LADA достоверно не отличались от такового у здоровых доноров, а также больных СД1 и СД2 (табл. 2). Количество Сй16+С056+-клеток в крови у больных LADA было ниже, чем у лиц контрольной группы и у пациентов с СД2 (табл. 2). Данный факт свидетельствует в пользу относительной недостаточности количества CD16+CD56+-iciieTOK при активации СОЗ+-клеточного звена иммунитета в условиях аутоиммунного процесса. Количество С019+-лимфоцитов в крови у пациентов с LADA не отличалось от аналогичного показателя у больных СД1 и СД2 (табл. 2).

Рис. 1. Алгоритм скрининга и терапии LADA (по данным S. Fourlanos, 2006 и результатам собственных исследований - выделено серым)

Согласно существующим в настоящее время представлениям, именно состав инфильтрирующих островки мононуклеарных лейкоцитов и их межклеточные цитокинопосредованные взаимодействия определяют, будет ли инсулит деструктивным, или процесс примет самоограничивающийся, доброкачественный характер [Rabinovitch А., 2003]. Не имея возможности исследовать клеточный состав и межклеточные взаимодействия внутри островкового инфильтрата, многие авторы изучали нарушения функций Т-лимфоцитов периферической крови пациентов с СД1 [Al-Sakkaf L. et al., 1989; Buschard К. et at., 1990; Peakman M. et al., 1993; Smerdon R.A. et al., 1993; Atkinson M.A., Maclaren N.K., 1994; Petersen L.D. et al., 1996; Roep B.O., 1999]. Основываясь на этих предпосылках, в настоящем исследовании было проанализировано состояние клеточного звена иммунной системы при LADA посредством оценки концентрации цитокинов в супернатантах культур

мононуклеарных лейкоцитов и экспрессии лимфоцитами комплиментарных им рецепторов.

Таблица 2

Субпопуляционный состав лимфоцитов в крови у больных СД (Ме [25%; 75%])

Показатели Здоровые (п=22) LADA(n=21) СД1 (п=20) СД2 (п=35)

CD3+-лимфоциты, % 69,7 [65,9; 70,91 76,1 [72,7; 79,8] р,<0,01 72,9 [70,5; 75,1] Pi=0,04 р2=0,10 71,4 [66,2; 75,1] Pi>0,05; Р2=0,02; рз=0,35

CD4+-лимфоциты, % 44,3 [34,2; 45,8] 45,8 [39,7; 51,0] Pi=0,33 45,0 [40,0; 48,3] pi=0,15; р2=0,74 45,8 [40,1; 50,2] Pi=0,17; Р2=0,87; рз=0,76

CD8+-лимфоциты, % 24,3 [23,9; 29,5] 25,7 [20,2; 31,3] Pi>0,05 25,7 [22,4; 27,9] Pi>0,05; р2=1,00 22,7 [18,0; 26,3] р1>0,05;р2=0,18;рз=0,10

CD16+CD564-лимфоциты, % 17,2 [16,2; 19,9] 12,3[8,8;17,5] р,<0,01 12,2[10,7;15,8] pi=0,03; р2=0,95 17,6[13,5;21,2] pi>0,05; р2=0,03; рз=0,03

CD19+-лимфоциты, % 10,8 [8,1; 14,2] 10,0[8,0;12,1] pi>0,05 12,6[9,5;14,0] Pi>0,05; р2=0,08 9,4[7,1;12,2] р1>0,05;р2=0,91;рз<0,01

Примечание: pi - уровень статистической значимости отличия значений показателей по сравнению с таковыми у здоровых доноров, р2 - у больных LADA, р3 - у пациентов с СД1

IL-2 играет исключительную роль в. механизмах реализации иммунного ответа. Наиболее изученное действие IL-2 — усиление пролиферации Т-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию, включая генерацию CD8+ -лимфоцитов [Smith К.А., 1989]. Воздействие IL-2 вызывает экспрессию IL-2Ra на клетках [Barclay A.N. et al., 1997]. Следует отметить, что IL-2 является необходимым фактором созревания и реализации цитотоксических функций NK-клеток, а также регуляторных функций NKT-клеток. Кроме того, одновременное присутствие CD25 и Foxp3 является маркером Treg [D'Cruz L.M., Klein L., 2005; Fontenot J. D. et al., 2005; Knoechel B. et al., 2005; Lio C.W., Hsieh C.S., 2008; Malek T.R., 2008; Duarte J.H. et al., 2009].

В соответствии с нашими данными, значения концентрации IL-2 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с LADA были достоверно выше, чем у здоровых доноров, что, вероятно, обусловлено Thl-поляризацией иммунного ответа при данном патогенетическом варианте СД. Значения данного показателя у пациентов с LADA не отличались от содержания данного цитокина в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у больных СД1 и СД2 (табл. 3). По результатам настоящего исследования, количество IL-2Ra+-лимфoцитoв при LADA достоверно не отличалось от такового у здоровых доноров, а также у больных СД1 и СД2 (табл. 3).

Таблица 3

Концентрация 1Ь-2 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов и количество 1Ь-2Ка+-лимфоцитов в крови у больных СД (Ме [25%; 75%])

Показатели Здоровые (22) LADA (21) СД1 (20) СД2(35)

■Базальная концентрация IL-2, пг/мл 16,3 [7,8; 22,0] оо V о. 105,1 [0,0; 124,1] р,<0,01 оо оо 44,5 [9,1;145,3] Pi=0,03 р2=0,68 СЧ о" II £Х 99,6 [18,2;123,5] Pi<0,01; р2=0,84 Рз=0,51 >0 ? о.

ФГА-стим. концентрация IL-2, пг/мл 19,2 [7,8; 24,8] 98,4 [85,2; 149,6] р,<0,01 V о. 84,3 [0,0; 176,2] pi<0,01 Р2=0,59 96,5 [0,0; 123,8] Pi<0,01; Р2=0,33 Рз=0,80

IL-2Ra+-лимфоциты, % 23,9 [21,6; 29,2] 24,5 [18,7; 31,6] pi=0,80 23,3[19,1;30,3] р,=0,63 р2=0,97 29,5[25,8; 34,3] Pi=0,19; Р2=0,09 рз=0,07

Примечание: здесь и в табл. 3-8: р - уровень статистической значимости отличия значений базалыюй и ФГА-стимулированной концентрации, р! -уровень статистической значимости отличия значений показателей по сравнению с таковыми у здоровых доноров, р2 - у больных LADA, р3 - у пациентов с СД1

IFN-y секретируется активированными CD4+(ThO и Thl)-, CD8+- и NK-лимфоцитами. IFN-y играет ключевую роль во всех стадиях иммунного ответа, активации NK-клеток и повышает экспрессию молекул HLA [Barclay A.N. et al., 1997; Billiau A. et al., 1998]. IFN-y одновременно стимулирует клеточный иммунный ответ посредством дифференцировки Thl-лимфоцитов и ингибирует реализацию гуморального иммунного ответа путем блокады экспансии Th2-клеток. Согласно полученным нами данным, базальная концентрация IFN-y в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у больных LADA была достоверно выше таковой у здоровых доноров, в то время как ФГА-стимулированная концентрация данного цитокина, напротив, была ниже таковой у здоровых доноров (табл. 4). Данный факт, вероятно, связан с Thl-поляризацией иммунного ответа при LADA с истощением секреторного ответа IFN-y на стимуляцию. Как базальная, так и концентрация IFN-y в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов при ФГА стимуляции у больных LADA достоверно не отличалась от таковой у больных СД 1 и СД2 (табл. 4).

Воздействие IL-12 на Т-клетки включает пролиферацию, запуск секреции IFN-y и отклонение в сторону Thl-ответа [Barclay A.N. et al., 1997]. Согласно полученным нами данным, количество Ш-12К+-лимфоцитов в крови у пациентов с LADA было сопоставимым с таковым у больных СД1 и СД2 (9,0; 5,5 и 6,4%, соответственно; р>0,05).

Таблица 4

Концентрация IFN-y в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у больных СД (Me [25%; 75%])

Показатели Здоровые(22) LADA (21) СД1 (20) СД2 (35)

Базальная концентрация IFN-y, пг/мл 0,0 [0,0,20,0] т 33,6 [31,9;36,2] pi<0,01 Г--SO 32,3 [30,1;44,1] р,<0,01 р2=0,86 о" II о. 35,5 [32,6;56,2] pi<0,01 Р2=0,27 Рз=0,33 а\

ФГА-стим. концентрация IFN-y, пг/мл 820,0 [130,0; 5350,0] II а. 33,2 [32,6;37,0] р,<0,01 V о. 34,1 [29,1;48,7] р,<0,01 р2=1,00 35,6 [31,7;53,4] Pi<0,01 р2=0,61 Рз=0,46 У о.

IL-4 секретируется активированными ТЬ2-лимфоцитами, NKT-клетками, тучными клетками и эозинофилами. In vitro IL-4 стимулирует созревание Th2- и B-клеток, регулирует индукцию ТЬ2-ответа, продукцию IgGl и IgE, ингибирует Thl-клетки [Barclay A.N. et al., 1997]. IL-4 подавляет продукцию цитокинов Thl-клетками и пролиферацию Thl-клеток под действием IL-2. Согласно полученным нами данным, базальная концентрации IL-4 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у больных LADA была достоверно выше, чем у здоровых доноров. Стимулированная концентрация IL-4 в супернатантах культур клеткок крови у пациентов с LADA была значимо выше, чем у больных СД1 (табл. 5), что согласуется с основной массой литературных данных и является подтверждением более выраженной Thl-поляризации иммунного ответа при СД1. Количество лимфоцитов, несущих IL-4Ra, в крови у пациентов с LADA было достоверно выше, чем у здоровых доноров. Количество IL-4Ru+-k:iütok было значимо ниже у пациентов с LADA, чем у больных СД1 (табл. 5), что, вероятно, обусловлено компенсаторной ир-регуляцией на фоне снижения его продукции мононуклеарными лейкоцитами при СД1.

Таблица 5

Концентрация IL-4 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов и количество П.-4Ка+-лимфоцитов в крови у больных СД (Me [25%; 75%])

Показатели Здоровые(22) LADA (21) СД1 (20) СД2 (35)

Базальная концентрация IL-4, пг/мл 16,1 [14,9; 17,7] оо о" II о. 32,1 [25,6;36,7] pi=0,04 о II о. 14,0 [0,0;71,6] Pi=0,72 р2=0,30 Г", сТ II О. 34,5 [17,9;40,4] pi=0,02;p2=0,93 рз=0,40 о" V а

ФГА-стим. концентрация IL-4, пг/мл 16,6 [15,6; 18,0] 29,4 [14,8;32,8] р,=0,14 9,0 [7,7; 17,9] pi=0,22 р2=0,04 29,5 [17,7;38,3] pi=0,03;p2=0,82 Рз=0,06

IL-4Ra+-лимфоциты, % 4,2 [2,1; 4,5] 7,6[6,1; 8,6] pi<0,01 10,9[7,8; 15,7] Pi<0,01 Р2=0,04 10,6[6,3; 12,5] Pi<0,01;p2=0,26 Рз=0,47

IL-10 считается ингибитором продукции ряда цитокинов. Согласно результатам проведенного нами исследования, концентрация IL-10 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у больных LADA была достоверно выше, чем у лиц контрольной группы. Содержание данного цитокина в супернатантах культур клеток крови у больных разными патогенетическими вариантами СД достоверно не различалась (табл. 6). Количество IL-10R+-лимфоцитов в крови у обследованных нами пациентов с LADA достоверно не отличалось от такового у больных СД1 и СД2 (табл. 6).

Таблица 6

Концентрация ^-10 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов и число ^-10Я+-лимфоцитов в крови у больных СД (Ме [25%; 75%])

Показатели Базальная концентраци я IL-10, пг/мл Здоровые(22) LADA (21) СД1 (20) СД2(22)

6,0 [0,0; 50,0] р=0,04 383,1 [50,0;733,1] р,<0,01 оо о" II Ö. 100,0 [0,0; 1837,7] р,<0,01 р2=0,85 ю о" II о. 605,1 [194,9;2077,0] Pi<0,01; Р2=0,43 Рз=0,35 р=0,11

ФГА-стим. концентраци я IL-10, пг/мл 40,0 [7,0; 130,0] 194,9 [50,0;1183,4] р,<0,01 100,0 [0,0; 1408,4] р,<0,01 Р2=0,92 400,0 [0,0; 1014,0] pi<0,01; Р2=0,73 Рз=0,67

IL-10R+- лимфоциты, % не исследовано 8,7 [7,3; 9,6] 7,3 [7,0; 8,7] р2=0,63 7,6 [6,1; 7,9] р2=0^7;рз=0,47

Процессы иммунорегуляции и деструкция ß-клеток модулируются факторами некроза опухолей а и ß. Ha клетках-мишенях они связываются с двумя типами рецепторов TNF-Rl (CD 120а) и TNF-R2 (CD120b), приводя к экспрессии NF-кВ [Pimentel-Muinos F.X. et al., 1994; Banerjee D. et al., 2005]. К эффектам активации TNF-Rl относят повышение экспрессии молекул адгезии и молекул HLA-I, увеличение продукции цитокинов и пролиферации клеток. TNF-R2 приписывают роль «передатчика» молекул TNF-a на TNF-Rl за счет его быстрого высвобождения. Согласно полученным нами данным, концентрация TNF-a в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у больных LADA не отличалась от таковой у лиц контрольной группы, больных СД1 и СД2 (табл. 7).

Имеются данные о том, что TNF-агонистические антитела вызывают селективную гибель аутореактивных активированных С08+-клеток крови пациентов с СД1 [Ban L. et al., 2008]. По итогам проведенного нами исследования, содержание Т^^1+-лимфоцитов в крови у пациентов с LADA было выше, чем у здоровых доноров, но достоверно не отличалось от такового у больных другими патогенетическими вариантами СД (табл. 7). Известно, что важным регулятором цитокиновой активности является sTNF-Rl [MacEwan D.J., 2002]. Установлена его способность препятствовать взаимодействию TNF-

а с мембранными рецепторами, что ограничивает цитотоксическое влияние цитокина на клетки [Кричевская O.A. и соавт., 2005; Wajant Н. et al., 2003]. При определении концентрации sTNF-Rl нами было установлено, что у пациентов с LADA его содержание в супернатантах клеточных культур было ниже, чем у здоровых доноров. Значения данного показателя у пациентов с LADA были повышены по отношению к таковым у больных СД1 (табл. 7). Основываясь на полученных в ходе настоящего исследования данных, можно предположить, что у больных СД в условиях сниженной концентрации sTNF-Rl воздействие TNF-a на клетки-мишени усиливается, несмотря на то, что концентрация самого цитокина не увеличена. Нарушения формирования комплексов TNF-a-sTNF-Rl при сниженной концентрации sTNF-Rl может приводить к усилению и пролонгации действия цитокина [Locksley R.M. et al., 2001].

Таблица 7

Концентрация TNF-a и sTNF-Rl в супернатантах культур моноиуклеарных лейкоцитов и количество Пч1Р^1+-лимфоцитов в крови у больных СД (Ме [25%; 75%])

Показатели Здоровые(22) LADA (21) СД1 (20) СД2 (35)

Базальная концентрация TNF-a, пг/мл 47,1 [31,1; 206,4] Г-1 Y о. 7,7 [3,3;370,5] pi=0,64 ОО Гу" о. 13,6 [3,5;28,7] р,=0,08 Р2=0,87 ст> ОО V а. 18,9 [5,0;222,5] Pi=0,37; Р2=0,89 р3=0,46 о О II О

ФГА-стим. концентрация TNF-a, пг/мл 73,0 [11,1; 194,1] 9,9 [3,8,323,4] pi=l,00 11,5 [3,0;25,8] р 1=0,39 Р2=0,81 75,3 [5,9;286,1] Pi=0,87; р2=0,60 р3=0,24

TNF-R1+-лимфоциты, % 7,4 [6,4; 7,6] 9,2 [8,2; 12,9] Pi<0,01 9,3 [4,5; 12,5] pi=0,46 Р2=0,42 12,1 [7,1; 15,6] pi=0,04; р2=0,59 рз=0,15

Базальная концентрация sTNF-Rl, нг/мл 2,67 [1,47; 4,16] 1,33 [1,31;1,40] pi<0,01 1,27[1,24;1,29] р,<0,01 р2<0,01 1,35[1,33;1,38] Pi<0,01; р2=0,75 р3<0,01

Fas (CD95) экспрессируется активированными лимфоцитами, моноцитами, нейтрофилами, эпителиальными клетками и фибробластами [Kennedy N.J. et al., 1990; Alderson M.R. et al., 1993]. Согласно полученным нами данным, значения содержания Ра.ч+-лимфоцитои в крови у больных LADA не отличались от таковых у пациентов с другими патогенетическими вариантами СД (табл. 8).

К настоящему времени утвердилось мнение, что, помимо функции апоптоз-индуцирующего лиганда, Fas-L выполняет и рецепторные функции. Известно, что для того, чтобы Т-киллеры полностью реализовали свой пролиферативный и цитотоксический потенциал необходим обратный сигнал

от Fas-L. Напротив, в отношении С04+-лимфоцитов обратный сигнал от Fas-L является ингибирующим и приводит к остановке клеточного цикла, предупреждающей клональную экспансию. Таким образом, «стимуляция» Fas-L является потенциально противовоспалительным и специфичным в отношении С04+-лимфоцитов [Barclay A.N. et al., 1997]. Согласно полученным нами результатам, доля несущих Fas-L (CD95L) лимфоцитов в крови у пациентов с LADA была выше таковой у больных СД1 (табл. 8). По относительному количеству в крови CD4+- и С08+-лимфоцитов, несущих мембранную форму Fas-L, пациенты с LADA не отличались от больных СД1 и СД2.

Таблица 8

Количество Fas+- и Fas-L+- лимфоцитов и концентрация sFas-L в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у больных СД

(Me [25%; 75%])

Показатели LADA (п = 21) СД1 (п = 20) СД2 (п = 22)

Fas+- лимфоциты, % 13,3 [9,1; 19,8] 9,8 [5,3; 11,2] Р2=0,07 11,0 [6,3; 15,6] р2=0,13 -рз=0,48

Fas-L+- лимфоциты, % 89,7 [86,2; 92,9] 70,0 [66,4; 85,7] р2<0,05 81,8 [72,4; 90,0] р2=0,30; рз=0,28

Базальная концентрация sFas-L, нг/мл 0,22 [0,22; 0,26] ст> VO 0,16 [0,11; 0,35] р2=0,45 о о 0,13 [0,13; 0,18] р2=0,02; р3=0,68 о <ч

ФГА-стим. концентрация sFas-L, нг/мл 0,22 [0,18; 0,25] II Q. 0,20 [0,11; 0,21] р2=0,30 ¥ CL 0,14 [0,12; 0,17] р2=0,04; р3=0,74 V о.

Растворимая форма Fas-L (sFas-L) конкурирует с мембранной формой Fas-L за рецепторное связывание и таким образом, выступает ее антагонистом [Schneider Р. et al., 1998; Tanaka М. et al., 1998], с другой стороны, sFas-L может выступать агонистом Fas при связывании с компонентами внеклеточного матрикса [Aoki К. et al., 2001]. Концентрация sFas-L в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов была максимальной у больных LADA (табл. 8), что может указывать на ингибирование Fas-опосредованного апоптоза аутореактивных Thl -клеток, Treg, а также ß-клеток при LADA.

Нами показано, что развитие микрососудистых осложнений при LADA происходит на фоне повышенного содержания цитокинов с регуляторными и цитотоксическими свойствами (IL2, IL4, TNFa) (табл. 9). Данный факт в сочетании с резким снижением секреции С-пептида после 4-го года заболевания указывает на существование при LADA комплекса иммунометаболических особенностей, определяющих темпы формирования и клиническую выраженность микрососудистых осложнений. При анализе зависимости иммунологических параметров от степени компенсации диабета была отмечена корреляционная зависимость между увеличением базальной концентрации IL-2 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови

и уровнем гликированного гемоглобина HbAle (г=0,36, р=0,05). Также было установлено, что для пациентов с компенсацией заболевания характерен более низкий уровень ФГА-стимулированной концентрации IL-2 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов, по сравнению с таковой у «декомпенсированных» пациентов, что, вероятно, свидетельствует в пользу того, что гипергликемия, приводящая к повышенной нагрузке на сохранившиеся р-клетки и увеличению экспрессии ими аутоантигенов, приводит к Thl-поляризации иммунного ответа. Известно, что в условиях гипергликемии активируются сигнальные системы, регулирующие экспрессию генов провоспалительных цитокинов [Evans J.L. et al., 2003]. Данное наблюдение подчеркивает значимость достижения компенсации углеводного обмена для замедления прогрессирования диабета.

Таблица 9

Базальная концентрация цитокинов IL-2,1L-4, TNF-a в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов у больных СД в зависимости от наличия микроангиопатий (Me [25%; 75%])

Показатель 1L-2, пг/мл IL-4, пг/мл TNF-a, пг/мл

Здоровые(п=22) 16,31 [7,8; 22,0] 16,1 [14,9; 17,7] 47,1 [31,1; 206,4]

I LADA (21)1 Без осложнений (9) 76,3 [0,2; 123,0] Pi=0,01 28,1 [12,3; 32,2] pi>0,05 ч- о" II О. 6,3 [3,0; 225,9] Pi >0,05 m о о II р.

С микро-ангиопатиями (п=12) 110,9 [96,2; 228,9] Pi=0,01 о" и о. 77,6 [0,3; 161,2] р,=0,03 370,5 [250,12; 462,8] pi =0,02

о ГЧ Без осложнений (9) 140,8 [0,1; 281,5] pi=0,04; Р2>0,05 VI 71,6 [0,1; 143,3] Pi>0,05; Р2>0,05 р>0,05 28,4 [13,6; 28,7] pi>0,05; Р2>0,05 «о о о.

5 и С микро-ангиопатиями (п=11) 44,5 [18,2; 114,3] Pi =0,04; р,>0,05 о" Л о. 5,0 [0,2; 17,9] Pi>0,05; рг>0,05 6,5 [2,9; 70,1] Pi>0,05; p2>0,05

U-1 т II £ Без осложнений (п=9) 97,2 [18,2; 113,4] pi=0,01; р2>0,05 рз>0,05 "О сэ о" 30,4 [10,5; 37,7] pi=0,03; р2>0,05 Рз>0,05 «о о о" 14,2 [4,8; 34,9] pi>0,05; Р2>0,05 Рз>0,05 1/"> о 5? a

rs Ч и С микро-ангиопатиями (п=26) 117,1 [18,2; 149,9] р 1=0,01; р2>0,05 Рз>0,05 Л £Х 17,9 [0,7; 53,7] Pi>0,05; Р2>0,05 рз>0,05 Л о. 43,7 [6,30; 291,5] pi>0,05; Р2>0,05 Рз>0,05

Примечание: р - уровень статистической значимости отличия значений показателей в подгруппах пациентов без микрососудистых осложнений от таковых в подгруппах больных при наличии микроангиопатий, pi - уровень статистической значимости отличия значений показателей по сравнению с таковыми у здоровых доноров, р2 - у больных LADA, р3 - у пациентов с СД1

Таким образом, в результате комплексного исследования клинико-метаболических и иммунологических характеристик наиболее распространенных патогенетических вариантов СД (LADA, СД1 и СД2) нами было показано, что LADA характеризуется сочетанием аутоиммунного процесса с инсулинорезистентностью (рис. 2).

Сахарный диабет, тип 2 LADA Сахарный диабет, тип 1 с классическим дебютом

1 ^

Наследственная предрасположенность: рецептор сульфонилмочевины (АВСС8), кальпаин 10 (CAPN10), рецептор глюкагона (GCGR), - глкжокиназа (GCK), транспортер глюкозы GLUT2, инсулин (INS), транскрипционный фактор HNF4A, рецептор инсулина (INSR), калиевый канал KCNJI1, липопротеинлипаза, транскрипционный фактор PPARG, регуляторная субъединица фосфорилазы (PIK3R1)_

Факторы среды: переедание и низкий уровень физической активности

IZI

Наследственная предрасположенность: -HLA (IDDM1)

■ инсулин (INS)

■ IDDM3-IDDM18

■ ген CTLA4

Факторы среды: кесарево сечение, высокий вес при рождении, искусственное вскармливание, дефицит витамина Р, вирусные инфекции, ожирение

Гиперлипидемия

Ожирение

X

X

~7_

Нарушение иммунологической _толерантности_

Повышение

уровня адипокинов

(лептин, TNF-a, IL-6)

Инсулино-резистентность

Инсулит

Дисфункция ß-клеток, гиперпродукция проинсупина и амилоида

I

Повышенная метаболическая

нагрузка, окислительный стресс

Локальная продукция цитокинов (IL-1)

'Усиление аутофагии

т

Повышение продукции цитокинов (IL-1, IFN-Y, TNF-a/ß)

.......г*

Экспансия эффекторных

клеток, несущих Fas-L

Апоптоз и некроз ß-клеток

Снижение массы р-клеток

X

Манифестация диабета

при снижении массы р-клеток на 60-70% при СД 1, на 20-40% при СД2 [Е15епЬайН С Э., 2005]

Хроническая гипергликемия

Поздние осложнения

Рис. 2. Схема формирования разных патогенетических вариантов СД (по данным G.S. Eisenbarth, 2005; M.Y. Donath et al., 2008 и результатам собственных исследований [выделено серым])

ВЫВОДЫ

1. Течение медленно прогрессирующего аутоиммунного диабета взрослых (LADA) характеризуется отсутствием специфичных клинических признаков до четвертого года заболевания, сопоставимой частотой манифестации заболевания в разных возрастных группах (19-30, 30-50 и 50-63 лет) и отсутствием достоверных различий по частоте возникновения диабетических микроангиопатий, по сравнению с СД1 и СД2.

2. Регистрируемые у пациентов с клиническим фенотипом СД2 при стаже заболевания более четырех лет клинические признаки (меньшая частота абдоминального ожирения, артериальной гипертензии и гиперхолестеринемии), а также сравнительно быстрое формирование инсулинопотребности и микроангиопатий, вызванное снижением стимулированной секреции С-пептида, позволяют формировать группы скрининга LADA.

3. Спектр аутоантител в сыворотке крови у больных LADA характеризуется превалированием антител к островковым клеткам (71%), антител к глутаматдекарбоксилазе (38,7%) и меньшей частотой встречаемости в сыворотке крови антител к инсулину (9,7%), по сравнению с их уровнем у пациентов с СД1 (8,1; 24,3 и 37,8%, соответственно). Одновременная идентификация антител к островковым клеткам и антител к глутаматдекарбоксилазе позволяет диагностировать LADA в 90,3% случаев.

4. LADA ассоциируется с хроническим аутоиммунным тиреоидитом статистически значимо чаще (32,3%), чем СД1 (5,4%) и СД2 (10,4%).

5. При СД аутоиммунного генеза (LADA и СД1) имеют место изменения субпопуляционного состава лимфоцитов крови, которые характеризуются повышением числа СОЗ+-лимфоцитов и снижением количества CD16+CD56 t-клеток-, по сравнению со значениями соответствующих показателей у здоровых доноров и больных СД2.

6. К общим закономерностям изменений системы цитокинов и комплементарных им рецепторов у больных LADA, СД1 и СД2 относится повышение концентрации IL-2, IFN-y и IL-10 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови при неизмененном количестве лимфоцитов, несущих комплементарные им рецепторы. При LADA имеет место повышение содержания в супернатантах культур клеток IL-4 и количества ^-4Ка+-лимфоцитов в крови, по сравнению с таковыми у здоровых доноров. При выраженной декомпенсации углеводного обмена (HbAlc выше 10%) отмечается увеличение ФГА-стимулированной концентрации IL-2 в супернатантах. LADA также характеризуется дисбалансом системы рецепторопосредованного апоптоза с увеличением количества TNF-RI+- и Fas-L+'Лимфоцитов и снижением содержания sTNF-R1 в супернатантах клеточных культур, по сравнению с таковым у больных СД1-

7. Раннее развитие микрососудистых осложнений LADA характеризуется выраженными метаболическими (резкое падение секреции С-пептида после 4-го года заболевания) и иммунологическими изменениями (высокий

уровень IL-2, IL-4 и TNF-a в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью верификации диагноза LADA целесообразно одновременно идентифицировать присутствие в сыворотке крови двух типов аутоантител (ICA и GADAb).

2. Для ранней диагностики инсулиновой недостаточности у больных LADA следует с периодичностью в 6 мес определять в сыворотке крови уровни С-пептида натощак и на 120-й мин ТТСП.

3. Пациенты с LADA требуют проведения ежегодного скрининга с целью своевременного выявления аутоиммунных тиреопатий, включающего проведение ультразвукового исследования щитовидной железы, определение в сыворотке крови уровня тиреотропного гормона и антител к тиреопероксидазе.

4. С целью сохранения остаточной секреции инсулина при LADA показано раннее назначение инсулинотерапии в средних дозах 0,5 ЕД на килограмм массы тела с отменой производных сульфонилмочевины.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кравец Е. Б., Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Прохоренко Т.С., Рязанцева Н.В. Роль цитокинов в патогенезе аутоиммунного диабета, вопросы иммуноинтервенции // Бюллетень сибирской медицины. 2010. № 1. С. 76-83.

2. Лазаренко Ф.Э. Роль системы Fas и FasL в иммуноопосредованных механизмах развития медленно прогрессирующего аутоиммунного сахарного диабета у взрослых (LADA) // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Сахарный диабет, метаболический синдром и сердечно-сосудистые заболевания : Современные подходы к диагностике и лечению». Томск, 24-26 октября 2012. С. 103-104.

3. Прохоренко Т.С., Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Рязанцева Н.В. Дисбаланс Thl/Th2 - иммунного ответа при аутоиммунном сахарном диабете // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2010. №.10. С. 76-78

4. Прохоренко Т.С., Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Рязанцева Н.В. Роль ТЫ/ТЬ2-поляризации иммунного ответа в реализации клинического фенотипа аутоиммунного сахарного диабета // Материалы конференции с международным участием «Актуальные проблемы медицины». Абакан, 4-5 мая 2010. С. 368-371.

5. Прохоренко Т.С., Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Рязанцева Н.В., Ворожцова И.Н., Новицкий В.В. Система фактора некроза опухолей а в патогенезе аутоиммунного сахарного диабета // Бюллетень сибирской медицины. 2011. Т. 10, №. 1.С. 64-69.

6. Прохоренко Т.С., Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э. Гетерогенность сахарного диабета с позиции ТЫ/Пй-дисбаланса иммунного ответа // Материалы

межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». С-Петербург, 21-22 апреля 2010. С. 148-150.

7. Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Прохоренко Т.С. Особенности спонтанной и ФГА-стимулированной продукции интерлейкина-2 и -4 мононуклеарами крови при аутоиммунном диабете // Материалы V Всероссийского диабетологического конгресса. Москва, 23-26 мая 2010. С.87-89.

8. Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Прохоренко Т.С. Цитокинопосредованные механизмы детерминации клинического фенотипа аутоиммунного диабета // Сборник статей по материалам XI конгресса молодых ученых и специалистов. Томск, 27-28 мая 2010. С.15-17.

9. Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Прохоренко Т.С., Рязанцева Н.В. Показатели базальной и ФГА-стимулированной продукции интерлейкинов 2 и 4 мононуклеарами при аутоиммунном диабете // Материалы научной конференции, посвященной 120-летию кафедры нормальной физиологии СибГМУ (ТМИ) и кафедры физиологии ТГУ «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем в норме и при патологии». Томск, 22-23 октября 2009. С. 211-213.

10.Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Прохоренко Т.С., Рязанцева Н.В., Ворожцова И.Н. Особенности продукции цитокинов ТЫ/ТЬ2-профиля у пациентов с различными клиническими вариантами аутоиммунного сахарного диабета // Цитокины и воспаление. 2012. Т. 11, №2. С. 51-57.

11.Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Прохоренко Т.С., Рязанцева Н.В., Ворожцова И.Н. Роль Thl/Th2 дисбаланса иммунного ответа в детерминации клинических особенностей аутоиммунного сахарного диабета взрослых // Сахарный диабет. 2011. №2. С. 12-17.

12.Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Прохоренко Т.С., Рязанцева Н.В., Новицкий

B.В., Ворожцова И.Н., Завгородская К.О. Особенности продукции и рецепции интерлейкина-2 мононуклеарными лейкоцитами крови при аутоиммунном сахарном диабете // Сибирский медицинский журнал. 2011. Т. 26, № 4, Вып. 2.

C. 65-70.

13.Саприна Т.В., Лазаренко Ф.Э., Прохоренко Т.С., Столярова В.А., Рязанцева Н.В. Особенности базальной и стимулированной секреции интерлейкинов 2 и 4 моноклеарами крови при аутоиммунном диабете // Сибирский медицинский журнал. 2010. № 1. С. 41-44.

14.Саприна Т.В., Прохоренко Т.С., Лазаренко Ф.Э., Зима А.П., Васильева O.A., Рязанцева Н.В., Ворожцова И.Н. Роль системы Fas и FasL в иммуноопосредованных механизмах развития медленно прогрессирующего аутоиммунного сахарного диабета у взрослых (LADA) // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2012. Т. 32, №4. С. 59-65.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

AICD - индуцированная активацией клеточная гибель

ANOVA - вариационный анализ (analysis of variance)

ATP111 - третий отчет экспертной панели по обнаружению, оценке и лечению гиперхолестеринемии у взрослых

ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ

GAD65Ab - антитела к глутаматдекарбоксилазе

HbAlc - гликированный гемоглобин Ale

HLA - антигены главного комплекса гистосовместимости

IAA - антитела к инсулину

ICA - антитела к островковым клеткам

IFN-y - интерферон у

IL - интерлейкин

LADA - латентный аутоиммунный диабет взрослых

NF-kB - ядерный фактор кВ (nuclear factor-кВ)

NKT - естественные Т-киллеры

Thl-лимфоциты - Т-лимфоциты «хелперы» 1 типа

ТЬ2-лимфоциты - Т-лимфоциты «хелперы» 2 типа

TNF -а - фактор некроза опухолей сс

TNF-R1 - рецептор фактора некроза опухолей 1 типа

Treg - регуляторные Т-клетки

АД - артериальное давление

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

ОТ - окружность талии

СД - сахарный диабет

СД1 - сахарный диабет, тип 1

СД2 - сахарный диабет, тип 2

ТТСП - тест толерантности к смешанной пище

ФГА - фитогемагглютинин

Подписано в печать2£Г.О^ 2015 г. Усл.печ.листов | _ ^ Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ № Л # Тираж | ООэкземпляров