Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Цитокины il-2, il-4, tnfа и их рецепторы как патогенетические факторы эндокринопатий аутоиммунного генеза

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

Прохоренко Татьяна Сергеевна

ЦИТОКИНЫ 1Ь-2,1Ь-4, Т№а И ИХ РЕЦЕПТОРЫ КАК ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ЭНДОКРИНОПАТИЙ АУТОИММУННОГО ГЕНЕЗА

14.03.03 - патологическая физиология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

00

часа со

см

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

СО

о Научные руководители:

Сч| доктор медицинских наук,

04 т— профессор Н.В. Рязанцева;

со профессор, академик РАМН,

Заслуженный деятель науки РФ

В.В. Новицкий

Томск-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений....................................................6

Введение.......................................................................................8

Глава 1. Обзор литературы...............................................................15

1.1 Современные представления об этиологии и патогенезе аутоиммунных эндокринопатий............................................15

1.2 Роль цитокинов и их рецепторов в патогенезе аутоиммунного воспаления.......................................................................27

1.3 Цитокинопосредованные механизмы развития аутоиммунных заболеваний щитовидной и поджелудочной желез....................36

Глава 2. Материал и методы исследования..........................................45

2.1 Общая характеристика обследованных лиц..............................45

2.1.1 Клиническая характеристика пациентов с сахарным диабетом.........................................................................47

2.1.2 Клиническая характеристика пациентов с аутоиммунными тиреопатиями....................................................................53

2.2 Методы исследования........................................................55

2.2.1 Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов крови........56

2.2.2 Выделение мононуклеарных лейкоцитов крови..................58

2.2.3 Культивирование мононуклеарных лейкоцитов крови..........59

2.2.4 Методы оценки системы цитокинов 1Ь-2,1Ь-4, ТКРа..........59

2.2.4.1 Определение концентрации цитокинов 1Ь-2,1Ь-4, ТКРа в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови......59

2.2.4.2 Определение концентрации растворимого рецептора к ПЧРа в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови...................................................................................................60

2.2.4.3 Определение количества лимфоцитов, презентирующих рецепторы к 1Ь-2,1Ь-4 и ТОТа......................................... 61

2.2.5 Оценка концентрации органоспецифических антител к поджелудочной и щитовидной железам...................................62

2.2.5.1 Оценка концентрации аутоантител к инсулярному аппарату поджелудочной железы........................................62

2.2.5.2 Оценка концентрации аутоантител к фолликулярному эпителию щитовидной железы..........................................63

2.2.6 Статистический анализ результатов исследования...............65

Глава 3. Результаты собственных исследований....................................66

3.1 Фенотипическая характеристика лимфоцитов крови у пациентов с аутоиммунными эндокринопатиями...........................................66

3.1.1 Субпопуляционный состав лимфоцитов крови у пациентов с сахарным диабетом аутоиммунного генеза...............................66

3.1.2 Субпопуляционный состав лимфоцитов крови у пациентов с аутоиммунными тиреопатиями.............................................70

3.2 Концентрация аутоантител к поджелудочной и щитовидной железам в сыворотке крови у пациентов с аутоиммунными эндокринопатиями.................................................................75

3.2.1 Концентрация органоспецифических антител в сыворотке крови больных сахарным диабетом аутоиммунного генеза..........75

3.2.2 Концентрация аутоантител к фолликулярному эпителию щитовидной железы в сыворотке крови у пациентов с аутоиммунными тиреопатиями........................................................................76

3.3 Состояние системы цитокинов 1Ь-2,1Ь-4, ПЧРа и их рецепторов у пациентов с аутоиммунными эндокринопатиями.................................78

3.3.1 Система 1Ь-2,1Ь-4, ТМБа и комплементарных им рецепторов в лимфоцитах крови у пациентов с сахарным диабетом

аутоиммунного генеза........................................................78

3.3.1.1 Содержание 1Ь-2 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови и количество лимфоцитов

крови, презентирующих рецепторы к 1Ь-2, у пациентов с

сахарным диабетом аутоиммунного генеза.........................

3.3.1.2 Содержание 1Ь-4 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови и количество лимфоцитов крови, презентирующих рецепторы к 1Ь-4, у пациентов с сахарным диабетом аутоиммунного генеза.........................

81

3.3.1.3 Содержание Т№а и растворимой формы рецептора к ТМ^а в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови, количество лимфоцитов крови, презентирующих рецептор к Т]ЧРа, у пациентов с сахарным диабетом аутоиммунного

генеза

84

3.3.2 Система 1Ь-2,1Ь-4, ТОТа и комплементарных им рецепторов в лимфоцитах крови у пациентов с аутоиммунными тиреопатиями...88

3.3.2.1 Содержание 1Ь-2 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови и количество лимфоцитов крови, презентирующих рецепторы к 1Ь-2, у пациентов с аутоиммунными тиреопатиями..........................................88

3.3.2.2 Содержание 1Ь-4 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови и количество лимфоцитов крови, презентирующих рецепторы к 1Ь-4, у пациентов с аутоиммунными тиреопатиями...........................................90

3.3.2.3 Содержание Т№а и растворимой формы рецептора к ТИРа в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови, количество лимфоцитов крови, презентирующих рецептор к Т№чх, у пациентов с аутоиммунными тиреопатиями............91

3.4 Комплексное сравнение иммунологических параметров у пациентов

с аутоиммунными эндокринопатиями.........................................95

Глава 4. Обсуждение результатов......................................................100

4.1 Роль системы цитокинов 1Ь-2,1Ь-4 и ТОТа в механизмах развития аутоиммунного сахарного диабета............................................100

4.2 Роль системы цитокинов IL-2, IL-4 и TNFa в механизмах развития аутоиммунных тиреопатий......................................................109

4.3 Общие закономерности и особенности цитокинопосредованных механизмов дизрегуляции иммунной системы при эндокринопатиях аутоиммунного генеза............................................................118

Выводы.....................................................................................125

Список литературы.......................................................................127

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АИТ - аутоиммунный тиреоидит

БГ - болезнь Грейвса

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

рТТГ - рецептор тиреотропного гормона

СД - сахарный диабет

СД1 - сахарный диабет 1 типа

СД2 - сахарный диабет 2 типа

Т3 - трийодтиронин

Т4 - тироксин

ТГ - тиреоглобулин

ТПО - тиреоидная пероксидаза

ТТГ - тиреотропный гормон

ФГА - фитогемагглютинин

ЩЖ - щитовидная железа

CD - (cluster of differentiation) кластер дифференцировки GAD - (glutamic acid decarboxylase) декарбоксилаза глутаминовой кислоты HLA - (human leukocyte antigen) антигены тканевой совместимости IAA - (insulin autoantibody) антитела к инсулину

ICA - (islet-cell antibodies) антитела к поверхностному антигену (3-клетки IFN - (interferon) интерферон LL - (interleukin) интерлейкин

JAK - (Janus-associated kinase) киназа семейства Janus

JNK - (Jun N-terminal kinase) киназа, фосфорилирующая фактор c-jun

LADA - (latent autoimmune diabetes of adults) латентный аутоиммунный

диабет взрослых

MAP - (mitogen-activated protein) митоген-активируемая протеинкиназа NF-kB - (nuclear factor kB) транскрипционный фактор kappa В

NIS - (Na/I-simporter) натрий-йодный симпортер NK - (natural killer) лимфоциты натуральные киллеры NO - оксид азота

SOCS - (suppressor of cytokine signaling) регулятор цитокинового сигнала sTNF-Rl - (soluble tumor necrosis factor a receptor) растворимый рецептор фактора некроза опухолей a первого типа

TGFJ3 - (transforming growth factor |3) трансформирующий фактор роста Р Th - (T-helper) Т-хелпер

TNFa - (tumor necrosis factor а) фактор некроза опухолей a

TNFaRl - (tumor necrosis factor a receptor) рецептор фактора некроза

опухолей a первого типа

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Идентификация механизмов формирования и развития аутоиммунных заболеваний эндокринной системы на протяжении долгого времени не теряет своей актуальности, что связано с прогрессирующим ростом числа пациентов с эндокринопатиями аутоиммунного генеза [Балаболкин М.И., 2008; Кандрор В.И., 2008; Stefan M. et al., 2011; Eschler D.C. et al., 2011], a также существенным ухудшением качества жизни пациентов при нарушении функций эндокринных желез [Сарвилина И.В. и соавт., 2007; Заводник И.Б. и соавт., 2011].

Согласно современным представлениям, развитие аутоиммунного сахарного диабета (сахарного диабета 1 типа, латентного аутоиммунного диабета взрослых) и аутоиммунных тиреопатий (аутоиммунного тиреоидита и болезни Грейвса) связано с продукцией органоспецифических аутоантител, инфильтрацией железы различными субпопуляциями лимфоцитов и продукцией ими широкого спектра цитокинов [Кандрор В.И., 2006, 2008; Pugliese А., 2010; Maruyama T. et al., 2011; Li H., Wang T., 2013].

Цитокинам принадлежит особая роль в индукции и поддержании аутоиммунного воспаления. Они способны регулировать миграцию иммунных клеток в очаг воспаления, процессы пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток и клеток эндокринных желез, а, следовательно, влиять на функциональную активность гормон-продуцирующих клеток и клиническое течение заболевания [Weetman А.Р., 2004; Дедов И.И. и соавт., 2005; Fang Y. et al., 2008; Poncin S. et al., 2008; Stojanovic J., 2009; Padgett L.E. et al., 2013]. В частности, IL-2 и IL-4 являются иммунорегуляторными цитокинами, ростовыми и стимулирующими факторами для различных субпопуляций лимфоцитов (Т-, В-лимфоцитов, NK-клеток) [Симбирцев A.C., 2004; Лебедев Л.Р. и соавт., 2007; Grinberg-Bleyer Y. et al., 2010]. Являясь провоспалительным цитокином, TNFa активирует лимфоциты и моноциты, регулирует их апоптоз и процессы коммуникации иммунокомпетентных клеток в очаге воспаления [Пальцев М.А. и соавт., 2003; Vujanovic N.L.,

2011]. TNFa способен оказывать цитотоксическое влияние на Р-клетки островков Лангерганса поджелудочной железы и фолликулярный эпителий щитовидной железы [Bruun С. et а1., 2005; Chen М. et а1., 2005; Nakahara М. et al., 2009; Varanasi V. et al., 2012; Padgett L.E. et al., 2013].

Существующие в настоящее время клинические и экспериментальные данные относительно участия цитокинов в патогенезе аутоиммунных эндокринопатий достаточно противоречивы. С одной стороны, существует гипотеза о том, что сахарный диабет 1 типа и аутоиммунный тиреоидит протекают по Thl-типу иммунного ответа [Кандрор В.И., 2008; Dardalhon V., 2008; Poncin S. et al., 2008], тогда как для латентного аутоиммунного диабета взрослых и болезни Грейвса свойственно усиление в патогенезе роли Th2-пути иммунного ответа [Кандрор В.И., 2008; Gianoukakis A.G. et al., 2008; Zhang Y. et al., 2010]. С другой стороны, в литературе приводятся данные о том, что модель строгой поляризации иммунного ответа и ее связи с клиническим течением эндокринопатий аутоиммунного генеза требует значительного расширения. Указывается на необходимость уточнения роли в развитии аутоиммунных эндокринопатий баланса продукции цитокинов с про- и противовоспалительными функциями (таких как EL-2, IL-4 и TNFa) [Rabinovitch А., 2003; Atkinson М.А., 2005; Gianoukakis A.G. et al., 2008; Fang Y. et al., 2008; Culina S., Mallone R., 2011]. В связи с этим, исследования, направленные на изучение состояния цитокин-рецепторной системы IL-2, IL-4 и TNFa, дополнят существующие представления о механизмах развития аутоиммунного повреждения эндокринных желез, а полученные знания могут способствовать совершенствованию методов диагностики заболеваний и обоснованию новых подходов эффективного терапевтического воздействия.

Цель исследования: установить общие закономерности и особенности состояния цитокин-рецепторной системы IL-2, IL-4 и TNFa при сахарном диабете и тиреопатиях аутоиммунного генеза.

Задачи исследования:

1. Установить общие закономерности и особенности субпопуляционного состава лимфоцитов (СБЗ+-, СВ4\ СБ8+-, СБ16+СП56,тЧ С019+-клетки) в крови у больных сахарным диабетом аутоиммунного генеза, а также у пациентов с аутоиммунными тиреопатиями в зависимости от клинической формы заболевания.

2. Дать характеристику спектру аутоантител (к поверхностному антигену Р-клетки, декарбоксилазе глутаминовой кислоты, инсулину) при сахарном диабете 1 типа, латентном аутоиммунном диабете взрослых в зависимости от наличия микроангиопатий (нефро- или ретинопатии), а также аутоантител (к тиреоидной пероксидазе и рецептору тиреотропного гормона) при аутоиммунном тиреоидите и болезни Грейвса в зависимости от функционального состояния щитовидной железы.

3. Оценить продукцию цитокинов 1Ь-2, 1Ь-4 мононуклеарными лейкоцитами крови и количество лимфоцитов в крови, презентирующих рецепторы к ним, у больных сахарным диабетом аутоиммунного генеза, а также у пациентов с аутоиммунными тиреопатиями в зависимости от клинической формы заболевания.

4. Оценить состояние системы ТИБа (цитокин, мембраносвязанная и растворимая формы рецепторов) в мононуклеарных лейкоцитах крови у больных сахарным диабетом 1 типа, латентным аутоиммунным диабетом взрослых в зависимости от наличия микроангиопатий, аутоиммунным тиреоидитом и болезнью Грейвса при различных функциональных состояниях щитовидной железы.

Научная новизна. Впервые представлен комплекс данных о нарушениях в системе цитокинов 1Ь-2, 1Ь-4, ТТЧРа и их рецепторов у пациентов с различными клиническими вариантами аутоиммунного повреждения поджелудочной и щитовидной желез. Установлено, что в механизмы развития сахарного диабета аутоиммунного генеза и

аутоиммунных тиреопатий вовлечены цитокины как ТЫ- (1Ь-2, ТИБа), так и ТЬ2-профиля (1Ь-4).

Определено, что закономерным для пациентов с аутоиммунными тиреопатиями, латентным аутоиммунным диабетом взрослых без микроангиопатий и сахарным диабетом 1 типа является увеличение количества лимфоцитов в крови, несущих рецепторы к 1Ь-4, при отсутствии изменений концентрации 1Ь-4 в культуре мононуклеарных лейкоцитов крови, повышение продукции 1Ь-2 мононуклеарными лейкоцитами крови и снижение концентрации растворимой формы рецептора к Т№а в супернатантах клеточных культур. Показано, что для аутоиммунных тиреопатий характерно снижение концентрации ТЫБа в супернатантах клеточных культур и количества СЭ120-позитивных лимфоцитов в крови, независимо от функционального состояния щитовидной железы, а также снижение количества СБ25-презентурующих лимфоцитов в крови у пациентов с болезнью Грейвса при эутиреозе и гипертиреозе. В совокупности с данными о повышении концентрации органоспецифических аутоантител, увеличении содержания СБЗ-позитивных лимфоцитов при снижении количества СО 16+С056|СПУ-клеток в крови у пациентов с сахарным диабетом аутоиммунного генеза независимо от наличия микроангиопатий, а также у больных аутоиммунными тиреопатиями в состоянии эутиреоза, гипертиреоза, указанные изменения в системе цитокинов 1Ь-2,1Ь-4, ТМ^а и их рецепторов могут рассматриваться как факторы, способствующие поддержанию аутоиммунного воспаления.

Приведены новые данные, указывающие на связь изменений в системе цитокинов 1Ь-2, 1Ь-4, Т1ЧРа и их рецепторов с выраженностью гормонально-метаболических нарушений, что подтверждается следующими результатами: повышенной продукцией мононуклеарными лейкоцитами 1Ь-2, 1Ь-4, Т1ЧРа и увеличенным количеством лимфоцитов в крови, несущих комплементарные им рецепторы, у пациентов с латентным аутоиммунным диабетом взрослых, имеющих микроангиопатии; сниженной продукцией мононуклеарными

лейкоцитами 1Ь-2 - при гипотиреозе и повышенной его концентрацией в культуре мононуклеарных лейкоцитов - при гипертиреозе у больных аутоиммунными тиреопатиями.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют фундаментальные знания о характере нарушений в системе цитокинов 1Ь-2, 1Ь-4, ТМ^а и их рецепторов при различных вариантах сахарного диабета аутоиммунного генеза и аутоиммунных тиреопатий с учетом особенностей их клинического течения. На основе полученных данных могут быть определены диагностические маркеры и потенциальные мишени новых, патогенетически обоснованных подходов направленной коррекции аутоиммунного повреждения поджелудочной и щитовидной желез. В дальнейшем целесообразным представляется моделирование эффектов блокады действия 1Ь-2 и ТИБа у больных аутоиммунным сахарным диабетом, а также коррекции дефицита СО 16+С0561<ж-клеток и угнетения системы ТКРа при аутоиммунных тиреопатиях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменения в клеточном и гуморальном звеньях иммунной системы при аутоиммунном сахарном диабете и аутоиммунных тиреопатиях являются однонаправленными; функциональная активность лимфоцитов и выраженность нарушений в системе цитокинов ТЫ- (1Ь-2, ТЫБа) и ТЪ2-профиля (1Ь-4) зависит от особенностей клинического течения заболеваний.

2. У больных латентным аутоиммунным диабетом взрослых без микроангиопатий, сахарным диабетом 1 типа (независимо от наличия нефро- или ретинопатии), а также у пациентов с болезнью Грейвса в фазе гипертиреоза повышенная продукция 1Ь-2 мононуклеарными лейкоцитами крови сочетается с увеличением в крови количества лимфоцитов, презентирующих рецептор к 1Ь-4, при неизменной продукции 1Ь-4.

3. Латентный аутоиммунный диабет взрослых, отягощенный нефро- или рет�