Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Излучение влияния алкоголя на развитие иммунного ответа при патологии печени

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КУРСКИ?» ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ • МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

СМАХГШ МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АЛКОГОЛЯ НА РАЗВИТИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ПАТОЛОГИИ ПЕЧЕНИ

14.00.36. Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Курск - 1992

Работа выполнена в Курском государственном ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте.

Научный руководитель:

- доктор медицинских наук, профессор А. И. Конопля

Официальные оппоненты:

- доктор медицинскких наук, профессор К1 А. Блинков;

- кандидат медицинских наук В. Я Ишков.

Ведущее учреждение:

Институт иммунол >гии МЗ РФ , г. Москва

Защита диссертации состоится "///Г" 199$г. в " 15 "час. на заседании специализи{>оьанного совета К 084.57.01 при Курском государственном медицинском институте ( 305033, Курск, ул. К. Маркса, 3} . . .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курского государственного медицинского института ( 305033 , Курск, ул. К. Маркса, 3)

Автореферат разослан "-г " ошиоря 1992г.

Ученый секретарь специализированного совета,

Доцент . '"ЕВ. Новиков

, ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЕ Актуальность темы. Злоупотребление алкоголем и алкоголизм являются одчими из важнейших причин смертности, населения.Одновременно с каждым годом возрастает вероятность экологических катастроф и токеи- ' ческих отравлений. В реальной жизни нередко возникают ситуации, когда токсическое поражение печени осложняется употреблением пациентом алкоголе, или когда йа фоне хронического алкоголизма организм подвергается воздействию гепатотропных веществ ( химическое производство, сельскохозяйственные работы с применением пестицидов, и гербицидов, бытовые отравления).

В этих условиях изучение иммуннологической реактивности организма приобретает особую актуальность,так как она.существенно нарушается при токсических или алкогольных поражениях печени (Алексеева H.R и др. ,1991, Hldaka К. 1988, Deviere V.at al.1988, Esperza Rät al. 1988). Это связано непосредственно с жлм.чти реактивность иммунной системы на различные антигены при разнообразных фЬрмах патологии печени или в условиях алкоголизации играет существенную роль в ге организма от экэо- и эндогенной инфекции, в развитии аутоиммунных аеж -мений.в эффективности восстановительных процессов в пораиенном эргане (Мельников О. Ф. и др. ,1989, Арцимович Е Г. и др. ,1991).

Изменения иммунологической . реактивности на экзогенные и эндогенные антигены в условиях патологий' в значйтельной степени зависят эт наличия и активности гуморальных иммуномодулирущих факторов (Ко-юпля А. И. ,1989, Афанасьев В. А. ,1991). В развитии иммунього ответа три токсической гепатопатии или в условьлх потребления алкого-;я, принимают участие сывороточные-и сплен'оцнтсрные иммуномодулирую-хие факторы (Авдеева Л. С. и др. 1989, Softie К. at al.1985). •

В настоящее время не до конца изученным остается вопрос с том, гак будет изменяться иммунологическая реактивность организма при газместном поступлении в организм гепатотропных веществ и алкого-

,-.' ' "* - 2 -

ля. Огкрш'ш остается вопрос о механизмах взаимодействия иммуномоду-лирущих факторов при токсическом поражении печени на фоне алкогольной интоксикации. Не ясно, действие каких факторов окажется преобладающим в этих условиях и какими механизмами будет контролироваться их выделение,а также каким путем можно воздействовать на накопление юшуномодулирующих факторов с целью коррекции иммунного статуса организма в этих условиях.

Целью работы 'было изучение иммунного ответа, .индуцированного Т-зависимш антигеном, при сочетанном действии на организм гепатот-ропкого яда и этанола,а также поиск средств коррекции иммунного ответа при этом состоянии.

Основные аадачи работы:

1. Изучение закономерностей развития гуморального иммунного ответа (ГШ), индуцированного .эритроцитами барана (ЭБ),при воздействии этанола в условиях острого и хронического токсического поражения печени.

2. Установление особенностей формирования гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на ЭБ ,;ри сочетанном введении тетрахлормет»-на (ТХМ) и этанола. ' .

3. Изучение выделения иммуномодулирующих . факторов под влиянием этанола клетками селезенки животных с токсической гепатопатией.

4. Выяснение начичия и характера взаимосвязи между иммуномодули-ру здши факторами селезенки у аякоголйзированных крыс в условиях "оксического сражения печени.

5. Получение аш выворотки (к белкам клеток селезенки, е состав которых входят иммуносупр-'ссйрушле ф-чторы,и использование е для -»учения изменений иммунологической реактивности крыс под воздействием атанолч на ¿сие экспериментальной патчмлгии печени,

Новые научные положения.выносимые ил 'защиту. . 0

. - Сочетадное введение ТХЫ и Зтанода значительно угнетает развитие

- 3 - -

ГйО И ГЗТ на ЭБ. • '

В условиях алкогольной интоксикации и токсического поражения печем», клетки селезенки выделяют как иммуностимулирующие фа»*торы,так и иммуносупрессирущие субстанции, отличающиеся по некоторым физи- ' ко-химическим свойствам.

Прилипающие к стеклу спленоциты животных, подвергнутых воз-дейст. лю ТХМ И этанола, выделяют а над осадочную жидкость клеток се-, лезенки (НЖКС)" иммуностимулирующие факторы, а неприлипагацие-имму-' носупрессирующие. , •

Выделение иммуйостимулируюрос и иммуносупрессируюцих факторов в условиях совместного введения гепатотропного яда и этанола контролируется системой обратных отрицат:льных связей.

Введение Ас к иммуносупрессирукщм факторам КЖ нормализует иммунологическую реактивность на ЭВ животных,одновременно получавших ТХМ и этанол.

• Практическая значимость. Расширены представления о развитии различных форм иммунного ответа при сочетанном действии этанола и гепатотропного яда Получены данные о системном характере гуморальных, факторов клеток- селезенки, животных- под влиянием этанола на фоне токсического поражения печени, углубляющие' существующие представления * р механизмах сохранения иммунологического гомеостаза-в условиях патологии печени. • / . * ;

Получека Ас к фракции белков спленоцитов, в состав которых входят иммуносупрессирукщие субстанции. Обоснована целесообразность использования данной Ас для коррекции икмуно.:огь »еской реактивное^ -си . в услозиях , эксперимента при сочетанном поражении организма этанолом и гепатотропным ядом , и в качестве инградиеита по- дальнейшему изучению патогенеза заболеваний печени.. ...

'Предложены и внедрены " Способ коррекции иммунного ответа'

при алкогольной иммуноеупресеии" , "Способ коррекции иммунного ответа !.,,и токсической гепатопатии " ."Способ стимуляции гуморального иммунного от Ее та ".

Апробация работы. Основные положения "диссертации были обсуждены на конференции молодых ученых Курского государственного медицинского института!Курск,1989},на научно-практической конференции "Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии" ( Курск, 1991 ), на научно-практической кшферейдаи, посвященной 25-летию фармацевтическогс факультета Курского медицинского института (Курск, 1991 ),на итоговой научной конференции Курского государственного медицинскогс института,пссвяшэнной вопросам общей и прикладной иммунологии (Курск, 1991), на 1 Российском съезде иммунологов (Новосибирск, 1992),на совместном заседании кафедр биологической химии и бис органической химии Курского государственного медицинского института (1992).

Публикации.. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Обьем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1 и 2), материалов и методов (глава 3), результатов собственных исследований (главы 4-8), заключения, выводоз и списка литература .

Работа изложена каЛ-/ страницах машинописи. Текст включает 25 таблиц, 5 рисунков, б фотографий , указатель использованной литературы, содержащей /¿О источников отечественна 1 и ист шиков зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

ЫЛ 2РИАДЫ И МЫ ОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 1645 крысах Вистар массой 120-200 г : .на 15 беспородных кроликах массой 2,0-3,0 кг. &гектами исследовани

• - Б -

.'луж'ли сыворотка крови, »метки селезенки, ткань печени.

острую токсическую гепатопатию (ОТГ) вызывали введением БОГ раствора ТХМ в оливковом масле. Раствор вводили й мышцу бедра (меняя валки черев день) по 3 мл/кг массы тела в течение 5 дней подряд.. ' фоническое токсическое 1. о раже и не печени вызывали путем внутриуыгаеч-юго введения 50 Г раствора ТХМ по 2 мл/кг в течение 8-22 нед с ин- . •ервалом 72 ч.

40 X раствор этанола вводили внутрижелудочно через зонд екед-:евнс} в течение 10,15 либо 20 дней из расчета V мл/кг.

В качестве антигена использовали ЭБ. Крыс иммунизировали однок-

?

атио, внутрибрйшинно в виде 5Х взвеси из расчета 2*10 клеток/кг ассн тела. Интенсивность развития ГШ оценивали на 5-й день после кыунизации по количеству клеток в селезенке, образующих антитела к 5 (АОВД (Мальберг К., Зигль X ,1987) и числу клеток, образующих именные розетки с ЭБ (РОК) (Зауэр X ,1987). ГОТ у крыс индуцировали зедекием ксеногенных клеток (ЭБ) (Черноусой А. Д. и д£>,, 1979).

Донорами сыворотки служили кролики, интактные, "-травленные ТХЙ, ¡коголиаированнныа крысы, а также крысы, подг ргнутне совместному -здействию ТХМ и алкоголя. Собирали пул сыворотки от 5-6 однородных > опыту крыс и внутрмбротшно однократно'вводи, л одновременно с ан- • геном интактным аллогеяным реципиентам из расчета 5 мл/кг.

ШКС готовили по методуг разработанному Прокопенко Л. Г. и Коноп-А.Й. (1982). Слленоциты интактных и-опытных животных фракциониро-пи. по их способности прилипать к стеклу (Полуплуш З.Ф. и , 1983). Для Еоддеряакия стерильных условий ислольэовался ламинарт со ЛЕВ (СНР).ЛЬшуномодулирующую активность НЖКС определяли путем юкратного внутрибрютнного введения ее интактным аллогенным реци-ктам в дозе 5 мг белка на 1 кг массы.тела, с одновременной пмму-ацяей ЭЕ Перед введением Н8НС истощали ЭБ.

Спленоцигарные белки, находящиеся как в цельной НЖКС, так и в

НЖНС. полученных от фракций прилипающих (НЖКСП) и не прилипают»: (НККСН) к стеклу спленоцитоэ, фрат,гояировали на сефадексе 6-100. Пул ШКС предварительно концентрировали в 10-12 раз с помощью полиз-тиленгликоля с Ш 40 кД, либо путем лиофилизации и последующего растворения в определенном объеме буфера Для оценки Ш белков_ ЮС, 1ИКСН и НЖКСП, подученных прл их Фракционировании на сефадексе (3-100, определяли объем выхода белков с известной Ш (Сстерман Л А. ,1983). Для последующего разделения и очистки высокомолекулярных сплонодатарных белков, полученных после гель-хроматографии на сефадексе С-100, использовалась ионнообменная хроматография на ОЕАЕ целлюлозе. Разделение проводили путем ступенчатого злшрования буферами с воарастаадей ионной силой (Остерман Л. А. ,1983). Иммуномодулирующую активность х^оматографических фракций НЖКС, НЖКСП и ШШСН определяли аналогично цельной ШКС, доза вводимого белка аллогенным интактнык реципиентам составила 2 ыг/кг.

Для получения Ас к иммуносупрессирувдим факторам 1ЩС использовался раэработаннный ранее способ иммунизации (Конопля А. И. и др., 1983). Ас использовали для о. работки ШКС и внутривенного семикратного (с промежутком в 24 часа) введения ее здоровым и опытным живо-: ним в дозе 2,б.мл/кг.

Концентрацию белка а сыворотке определяли биуретовым методом, в НЖКС, НЖКСП, НЖУОН и их хроыатографических фракциях - по метод Б{ ¿дфорд (Шишкин С.С. ,1982).

Состоян печени оценивали по активности в сыворотке кро£ аспартат-(АсТ) и аанинаминотр нсфераа (АлТ), палочной фосФатаг (Шф), концентрации общего билирубина, бета-гпюпротеидов по Еурште< ну, общего холестерина по Ильку .выраженности показателе . тимоловс прсбн.а также по гистологическим исследованиям срезов печени.

Статистическую обработку цифрового "материала, проводили и>4'< вычисления, средних арифметичвс'ких значений ]Л их стандартных ошибо;

• - 7 -

Достоверность различий средних величин оценивали с помощь» критериев Стьедента и Вилкоксона-Манна-У:ггни. ,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСС.'ЕДОВАНИЙ. '

ВЛИЯНИЕ ЭТА1Г ЧА НА ИММУНОЛОГИЧЕСКУЮ РЕАКТИВНОСТЬ ОРГАНИЗМА

В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО И ХРОНИЧЕСКОГО ОТРАВЛЕНИЯ ТХМ.

О возникновении патологии печени «при отравлении ТХМ в наших ; опытах судили по изменению морфологический и биохимических показателей в печени и сыворотке крови. Пятидневное' введение ТХМ приводит к возникновению среднекапельной вакуольной дистрофии гепатоцитов, которая усиливаемся после 12 нед отрав-ения и сопровождается некрозами отдельных гепатоцитов. К 22 нед отравления обнаруживаются узлы регенерации и развитие прослоек соединительной ткани. В сыворотке крови через Б дней введения гепатотропного яда повышается активность АсТ, •АлТ , ЩФ , развивается гипербилирубинемия, увеличивается концентрация бе та-лнпопротеидов, повышается тимоловая проба, снижается концентрация .. холестерина. В условиях хронического травления организма ТХМ в сыворотке крови повышается активность АлТ и ВД>, наблюдается гипербилирубинемия, гиперхолеотеринеми'я и снижен.,е уровня бета-липоп- • ротеидов.В то мэ время не отмечено изменения активности АсТ,на уров-. не контроля находится тимоловая пробе..Изменения в описанных биохимических .показателях свидетельствуют о возникновении выраженных синдромов цитохиза,холестааа, печен^чно-клеточной недостаточности и воспалений как"в условиях острого,так и хроньчаского отравления организма ТХМ (Хуанов А.И, 1988). .*

_ При изучении влияния ТХМ на развитие иммунного ответа установлено, что кратковременное (в гэчекие Б дней) и длительное (в течение ! или 12 нед) введение гепатотропного' яда сопровождается усилением 1ЕЭВИТИЯ ГИО и ГЗТ, индуцированных ЗВ. Введение ТХМ в течение 22 нед,

приводящее к развитию цирроткчэсдах изменений в печени, не влияло на I,

формирование ГИО и ГЗТ.

• Введение этанола в течение 10, 15 или 20 дней приводит к развитию гипертрофии гепатсццтов, увеличению их ядер и ядрышек, повшюниа количества двуядерных гепатоцитов.что свидетельствует об активизации

■ восстановительных процессов в печени в ответ на введение этанола.

При изучении влияния алкоголя ла иммунологическую реактивность установлено, что введение этанола в течение 10, 15 или 20 дней суп-рессирует развитие ГИО, причем более выраженное ингибирующее действие алкоголь оказывает при его 15 и 20-дневном поступлении, кроме того наибольшее супр^ссируюдео влияние этанола проявляется при его поступлении в организм так до, так и после введения антигена. По всеЯ видимости зто связано с прямым токсическим действием шжох'одя

■ на кммунокомнетеятные регудяторные клетки.

Совместное введение ТХМ (5 дней) и этанола (15 дней) сопровождается более выраженным лоражннем печени, о чем свидетельствует образование участков крупнокапельной (преднекротической) жировой дистрофии гепатоцитов и появление г ш>вого числа некрозов. В сохраненных участках г ответ на введение этанола развивается гипертрофический, процесс. Морфологические исследования подтверждается биохишчески-«¡5. Так,совместное . введение этанола и ТХМ в течение 5 дней,сопровождается более выраженным повш»нием активности АлТ.АеТ уровня билирубина, бета- лияепротеидов и холестерина по сравнению с группой живот-• ных, отравленных ТЖ Также более ь. щаженное поражение печени отмечается при совместном введении крысам этанола и ТХМ в течение 8 и 12 нед. Так ,при вседении животным только ТХМ в течение этого'срока фиброй»- изменений не ^наружено.при сочетанием же введении 1Ш и этанола данное явление 1шеет место. .

■ При иаученки сочетанного воздействия ТХМ и этанола на иммунологическую реактивность установлено / ,что она а значительной степени

• - 9 - .

снижена. Наиболее выраженное иагибирование ГИО на ЭБ наблюдается при совместном введении ТХМ и этанола, есл! этанол вводится как до, так и после иммунизации. Об этом свидетельствует снижение количества АОК в этой группе в 1,7,а РОК соответственно в 2. 9 раза по сравнению с кры-' сами, которым вводилась кипяченая-вода и оливковое масло (таблица 1).

: , Таблица 1;

Влияние этанола на развитие ГИО, индуцированного ЭБ, в условиях ОТГ

N гр \, Условия опыта йОКдыс/орг. РОК, млн/орг.

1, Чммцнизация 90. 22.5 + 3.6 82.9 ± 8.3

2. Введение кипяченой вода и

оливкового масла. 26.8 + 4.9 89.5 л 8.6

3. Введение ТХН (ОТП. 71.3 4- 7,5 114.3 ± 11.8

Р1.2 < 0,001 Р1.2 < 0,05

4. Введение этанола. - ' 8.9 + 0.9 • 26.. б ± 2.5

< 0,001 Р1.2 < 0^001

5, Введение ТХМ я последцицве ввеле- 14.6 + 1.6 64.5 £ 7.2

ние этанола до и после иммунизации. Р1,'> < 0.05 Р1.2 < 0.05.

6. Последовательное введение этанола - 23,4' 4.2 99.3 + 12.1

и ТХЙ.инмднизация. РЗ < 0,05 РЗ < 0,05

7. •Совместное введение этанола и ТХМ ' 15.6 + 2.8 Е 9.1

до иммунизации. . ' . Р!,г < 0.05 РЗ < 0,05

8. Совместное введение ТХМ и этанола . 1М + 1.4 • 31.4. + 3.4

до и после иммунизации.',. . .'" Р1.2 < 0.05 Р1.2 < 0.01

йэри&гтзация ГИО наблюдается только через 30 дней после послед-:его введения этанола. Снижение количества иммунных АОК и РОК отмеча-тся также и у животных, получавеих ТХМ в■'.течение 8,12,22 нед и под-, ергнутых 15-днеаной алкоголизации. Совместное поступление в организм ганояз и ГХЫ супреесиру т не только ГИО,но и угнетает развитие ре-щт Г5Т, индуцированной ЭБ.' - /. . . .

Таким образом, как при остром, так и при хроническом отравлевш

« . ...

• - го -

ТХМ, введение этанола приводи' Л развитии выраженной иммуносуп-рессии, 1 ото рая носит стойкий характерна« как нормализация иммунологической реактивности наступает только черев 30 дней после последней инъекции этанола, .

КШУНОЮД. ЛИРУКЩЕ ФАКТОРЫ СШЕЕКОЦИТОВ КРЫС, ПОДВЕРГНУТЫХ # СОВМЕСТНОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ТХМ И ЭТАГОЛА. ¡'

Характер и направленность изменений ГИО в условиях токсического поражения печени ,равно как и при алкогольной интоксикации,в значительной степени контролируется иммуиомодулируицими^ факторами иммуно-цитоа(Конодля А.И. .Прокопенко .Л. Г. ,1988;5оГис N. аЬ а1;1985).В связи с этим представляло большой интерес изучение выделяющихся сплено-циуарных факторов в условиях совместного введения в организм этанола и ТХМ. ' ' •

Установлено, что введение ННКС крыс.отравленных гепатотропным ядом в течение 5 дней,8 и 12 лед интактным животным,сопровождается стимуляцией ГИО ла Э5. ИЖКС крыс , получавших ТХМ в течение! 22 нед, иммуномодулирующей активностью не обладает. НЖС, полученная от ал-коголиаировалныу. в течение 15 дней животных-,сулрэссирует при ' введении инуакткым аллогенным реципиентам развитие ГИО на ЗЕ.НЖКС крыс, подвергнутых совместному воздействию ТХМ и этанола .также подавляв V развитие ГИО, индуцированное ЭБ. / •

На основании полученных данных можно было предположить,что исчезновение иммуностимулирующего и появление иммунооупресс. дующего эффектов связано с выделением, спленоцитами иымуносупрессирующих • с^станций, при этой было не ясно продолжается ли в эт»х условиях вы-д^лени-- иммуностимулирующего фактора,В1 ва :оГ .введением гепатот-ролнсго яда (Коно. л. А. И. ,19894 '

, ' О .целью выяснения этих вопросов, было проведено гель-хроматогра-

фическое разделение дао на сефадексе в-100 и исследована иммукомо-' Аудирующая активность полученных фракций. При разделении НЖКС крыс, получавших этанол в темени© 15 дней , на в-100 получено три фракции.

1-я фракция,составлявшая около 60% от. общего количества белка, выходила в свободном объеме колонки и содержала бедки с Ш более 100 кД,

2-я (около 10Й белка) содержала белки с Ш 60-80 кД и 3-я (около ЗОХ белка)-белки с Ш 10-25 кД и менее. Установлено, что иммуносу.рес-гирующим эффектом обладает 1-я фракция. - 2-я и 3-я фракции не влияли 1а рааф тие ГИО, индуцированного ЗВ. .

При разделении на й-100 НЖС крые, получавших этанол и ТХМ, так-

« получено 3-й франций с тем т процентным содержанием в них бедка.

-я фракция оказывает зыражнное ишуноеупрессируюш,ее действие на

швитие ГЛ0,а 3- фракция , содеркашя белки с Ш 10-25 кД,обладает

иммуностимулирующим аффектом ( таблица 2 ). Аналогичные результаты

олучены при исследовании иммуномодулирующей активности гель-хрома-

ографичееких фракций (ГХФ) НЖКС крыс, получавших этанол и подверг-

утых хроническому отравлению ТХМ в течение 8 и 12 кед . 1-я фракция

1ШЗ . алкоголизированных крыс и" отравленных ТХМ в течение 22 нед об-

адает иммуносупрессирующим эффектом, 2-я и 3-я фракции иммуномоду-

ирувдей активностью не обладая». '» . - - -■ ' Интересно было выяйнить - какие клетки селезенки выделяют имму-

эмодулирующие факторы. Для этого спленоциты крыс с ОТГ, получавших -

салол в течение 15 дней,разделяли по'способности прилипать к стеклу

получали ШШШ и НЕКСН . Установлено, что 3-я ГХФ фракция НЖКСП

¡бдеркаиэя белки с Ш 10-25 кД и менее) обладает иммуностимулирующем

фактом,в то время как 1-я ГХФ ЙЖКСН ( содержащая белки с ММ более

О кД) обладает иммуносупрессирущей активностью.

Таким образом, при сочетанном действии на организм ТХМ и этано-

. неприлипающие к стеклу спленоциты выделяют высокомолекулярный им-

носупрессирукщй,фак?ор (факторы) с ММ более 100 кД, а прилипающие

Иммдномодулиррщая активность гель-хроматографических фракций НЯКС

крае с ОТГ.получавших этанол. ' Таблица 2.

К г;;. • Условия опыта ЙОК,тыс/орган Р'ОК, млн/орган

1, Ийицниззциа ЗБ ' • 19,6 + 2,9 83,2 ± 8,7

2. Введение буфера 24,1 ± 3,6 85,3 ± 8,3

3» Введение Н8КС интактннх крыс ' 22.8 ± 3,2 87,6 +8,3 .

4. : Введение НВКС отравленных ТХМ'крце 98,7 ± 10,8 \ 147,8 ± 18,6 ;

Р1-3 < 0,001 Р1-3 < 0,01

5. Введение,Н1КС алвоголизированных крыс 7,4 ± 1,1 54,3 +5,8

Р1-3 < 0,05 . Р1-3 < 0,05

б. Введение НШС отравленных й. алкоголизкреванных

крыс ; 12,3 1 1,8 62,4 + 1,7

Р1-3 <0,05 Р1-3 <.0,05 '

7. Введение 1-й .фракций МКС интактннх крыс - 18,6 ± 2,3 . 82,4 ± 8.1

8. Введение 2-й фракции НЖКС- интактннх крыс- * 19,8 ± 3,1 80,9 ±7,6

Введение 3-й фракции Н2КС интактннх крыс , 20,7 ± 4,1 . , 79,7 ± 8,4

so- Введение 1-й Фракции НЗКС отравленных и . ". 8,9 4 1,3 52,6 ± 6,1

il.. алкоголизированных крыс ' : . . Р1-3.7 < 0,05 Р1-3.7 < 0,05

Введение 2-й фракции Н1КС отравленных и 92,3 ± 14,6

алкоголизированнкх крыс 28.6 ± 4-,6

12. Введение.3-й фракции НЗКС отраелеиах и 114,2 ± 10,2 '

1 алкоголизированных.крнс 72,3 ± 9,1

I i — —:---—-■—ш .' о..........—,...'.;,,','— Р1-3.9 < 0,01 Р1-3.9 < 0,05

к стенду спленоцитн - . иммуностимулирующей фактор (факторы) ' с Ш 10-25 кД. Исходя из полученных и литературных данных, по ЕсеЛ видимости, низкомолекулярный иммуностимулирующий фактор является описанным ранее рябонуклеопроте'идом с Ш 10-12 кД, выделяющийся спленоци-таш в условиях токсического поражения печени ( Конопля А. И. и др. , 1985). •

Представляло большой интерес дальнейшее разделение высокомолекулярных иммуномодулирувщих субстанций КНКС. С этой целью 1-я ГХФ ШЙСП и 1-я ГХФ КЕКСН (содержащие белки с ММ более 100 кД) были подвергнуты ступенчатому фракционированию на ЙЕАЕ целлюлозе. При разделении 1-й ГХФ НЖКСП на ОЕАЕ целлюлозе. получено 4 фракции. 1-я фрак-' ция составила 10 % от общег~ количества белка и'содержала субстанции, шекщие самую высокую ¿-.соэлектрическую точку (р!) среди веек белков ВЖКСП Следуйте фракции выходили в порядке увеличения ионной силы элюентов, а, ¿ледовательно, в порядке уменьшения изоэлектричвеких точек белков, содержащихся в этих фракциях. На долю 2-й, 3-й и 4-й фракций приходилось соответственно по 10 Z, ' 20 %. и 60 £ от общего количества бедка. Дальнейшее увеличение ионной силы элюента не приводило к появлению в кем белка. Таким образом, .весь белок НйКСП был десорбироваь е колонки. Основная масса белка выходила в составе 4-й фракции, которая условно была названа нами фракцией "кислых" белков. При. разделении 1-й ГХФ ШКСН на БЕДЕ целлюлозе таге® получено 4-е фракции,с тем кэ процентным содержанием белка в них. Основная *асса бе ка (60%) выходила в составе "кислых" белког. При изучении 1Ммуномодулирущей активности полученных ионообменных фракций уста-ювлено, что 3-я ионообменная фракция ШКСП обладает иммуностимули->ующ,ей активностью на развитие ГШ, индуцированного ЭБ у штатных ;рыс, а 1-я и 4-я фракции ЩКСН обладает выраженным иммуносупресси-

а

•ующим действием. Необходимо отметить,что цельная 1-я ГХФ НЖКСП не ызывает статистически- достоверного повышения ГИО на ЗВ у интактных

крые, что, видимо, связано с присутствием в ней иммуносуяресси-руюшлх примесей, которые выделяются неприлипащими к стеклу спленоци-тами и лишь дальнейшее разделение и очистка позволяют выявить иммунс стимулирующий фактор. Полученные в тех же условиях фракции ШКО крыс с хроническим поражеяием печени ТХМ в течение 8 нед й алкогольно* интоксикацией,оказываю? те же иммуномодулирующие эффекты.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что в условиях как острого, так и хронического-отравления организм; ТХМ и введения этанола спленоцитами выделяется ряд факторов, Приче! два высокомолекулярных иммуносупресеируюадн! фактора с • ММ более Ш кД ("кислый" и "основной") выделяются неприлипающими к стеклу спл«' ноцитами. Прилипающими к стеклу клетками селезенки выделяются высоко молекулярный с ММ более 100 кД и ниакомолвкулярный с ММ 10-25- кД им муноетимулирующие факторы. Иммуносупрессорные субстанции в целом, по видимому,или более активны,или их количество преобладает, поскольк цельная НЖКС, подвергавшаяся хроматографическому разделению обладае выраженной иммуносупрессирующей активностью.

Длительное устойчивое подавление иммунного ответа, .обусловлен нее иммуносупрессорными спленоцитарными фа1СТ0рами в условиях соче тайного воздействия гепатотропного яда и этанола может привести возникновению вторичных инфекций, снижению уровня регенераторнь процессов в пораженном органе, что в целом осложнит течег :е и.исхс патологического процесса в печени.

взаимосвязь тудамодулируадих факторов сяленоцитов у жиботньс

ПОДВЕРГНУТЫХ СОЧЕТАШШУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ТХМ И.ЭТАНОЛА.

Выявление спленоцигарных иммуномодулирувдих факторов алкогощ ворованных крыс с Токсическим поражением печени, " закономерно пост! гг.-..: с. ¿рос о взаимосвязи этих-Факторов и механизмах, контролирую^ ил -.^яш. Нами было изучено влияние супресоируюших факторов (С<

(выходящих в составе 1-й ГХФ НЖКОН) и иммуностимулирующего (1ШФ) (выходяшрго в составе 3-й ГХФ НЯКСП) на развитие ГИО у крыс раадель-но или сочетаний получавших ТХМ и этанол.

Пятикратное введение крысам с ОТГ фракций НЖКС,содержащих СФ или ШФ приводит к существенному снижению ГИО у животных с ОТГ. Введение СФ алкогодизированным крысам,практически не влияло на развитие ГИО у них, показатели которого были ниже контрольных вследствие введения этанола. Введение же фракции НЖКС, содержащей НИФ.алкоголизи-рованным животным отменяло возникающую в результате введения алкоголя иммуносупрессию. *

Введение фракции,содержащей СФ, алкогслизкрованным животным с ОТГ приводило не только к от.м^не иммуиосупрессии, но и к вырашнкому повышению ГИО на ЗБ, по сравнению с контрольной группой. Введение фракции содержащей КЙФ, алкоголиаированным животным с ОТГ не отменяло иммуносупреЬсии, развивающуюся вследствие алкоголизации на фоне токсического поражения печени. Так как накопление СФ, содержащихся в НЖКС алкоголизированных и отравленных ТХМ крыс, в организме животных с ОТГ, получавших этанол не только не приводит к усилению отмечаемой в этих условиях иммуносупрессии, а, наоборот, сопровождается выраженной стимк ляцией ГИО на ЭВ, можно предполагать, что выделение им-мун^супрессируюших субстанций контролируется по механизму обратной отрицательной связи. Чем больше в организме накапливается СФ, эндогенных и экзогенных, тем меньше их синтевируется и выделяется спле-юцитами, что приводит к относительному увеличению количества выде-иемыл иммуностимудирукодх субстанций и ус», .ениъ ГИО на ЭВ. У кивот-1ых, получавшх только этанол, иммуностимулирующие субстанции не об-;аружены, поэтому введение иммуносупрессирувдих факторов,по-видкмо-1у, приводит к снижению их выработки спленоцитами, в то время как охраняется прямое токсическое действие алкоголя на иммуноциты, что известной степени объясняет отсутствие нормализации ГИО в этих

условиях.

Вероятно в условиях совместного воздействия на организм этаноле и ТХМ, выделение НКф также контролируется по механизму обратной отрицательной связи. Об атом могут свидетельствовать следующие факты: 1) Введение экзогенного НИФ в организм крью с ОТГ ингибирует у них развитие ГИО на ЭВ;?) Введение экзогенного НИФ в организм крыс с ОТГ, получавших этанол не приводит к отмене, возникающей в эти? условиях иммуносупрессии;3) Введение экзогенного НИФ алкоголизирован-' ним крысам, у которых эндогенный НИФ не выделяется,отменяет имму-косупрессию, вызванную введением этанола.

Таким образом, характер и направленность^развития ГШ в условиях сочетанного действии на организм этанола и ТХМ зависит от степени накопления иммуносупрессирующих (СФ) и иммуностимулирунщ® . (ШФ) Факторов спленоцитов. В свою очередь степень накопления в организма' и тух и других контролируется системами обратных отрицательных свя-вей. ' , • .,

ВЛИЯНИЕ АНТИСЫВОРОТКЙ К СПЛЕНОЦЙТАРНЫМ ЮШЙОСУПРЕССИРУЮОЩ

ФАКТОРАМ НА РАЗЗЙГИЕ ИЫМУННОГО ОТВЕТА У АЛКОГОЛИЗИЮВАШЫХ .

НИЭОТНЫХ С ТОКСИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ .

•После иммунизации кроликов 1-й ГХФ белков ШКСН интактных крью (АгИ; или алкоголиаированных крыс с ОТГ (АгО) получены соо^ветству»-вз;о антисьшоротки - АсИ и АсО, содержание антитела в. титрах 1:64 -1:128 (по данным реакции пассивной гемаичатгинации).

Сначала быль исследована возможность связывания СФ НККС аакого-ли~«рованных и отравленных ТХМ крью с помощью антител, содержащихся в АсО. , Установлено, что ШКО крыс с ОТГ, получавших этанол, после иккуйации с • АсО -при соотношении объемов 1:1 и 2:1 теряла свойства оуг.:>. :..:'.\т\;вать развитие ГИО у интактных крью, иммунизированных ЭБ и лр;?,: ,. л ии^остиму.пирушие свойства. В случае инкубации ННЖС

крыс с ОТГ, получавших этанол,с ЛсО в соотношении объемов 10:1 и последующего введения инкубата интакгным аллоге::ным реципиентам, установлено угнетение у них развития ГИО на ЗВ. Обработка Б^КС алко-гояизированных крьгс с ОТГ Ас И в соотношении 1:1,- 2:1, 10:1 не отменяло иммуйосупрессируюэдий эффект НЖЗ, Инкубированная ШКС здоровых животных с АсИ и АсО в соотношении 1:1, не влияла г * развитие ГШ у интактных аллогенных реципиентов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при:инкубации ШКС отравленных ТВ! и алкоголизиро-ванпых :рыс с АсО происходит связывание СФ специфическими антителами.

Интересно было выяснить, влияет ли полученная АсО на иммукомо-дулирующую активность сьязоротки крыс, получавших ТХМ и этанол. Обработка сыворотки Ас./ а соотношении 1:1 отменяет ее супреееирукяций эффект» в то время, как инкубация сыворотки с АсО в соотношении 1:2 и 1:10 не приводит к отмене ее супрессирущего эффекта. По всей видимости, более выраженный супреесирукшдай аффект сыворотки обусловлен не' только проникающими в кровь СО спленоцитов, но также и другими йммунссупрессируювдми сывороточными факторами.

Учитывая изложенное, аакономерно встает вопрос о возможности влияния полученной АсО на развитие иммунного ответа у животных,полу-1авших этанол,с экспериментальной патологией печени. С, этой целью Кследовано влияние АсО и АсИ на развитие ГИО к 33 у интактных и отеленных ТХМ крыс, получавших этанол. Установлено, что семикратное нутривенное введение АсО отменяют возникающую иммуносупрессию у рыс с ОТГ, получавших этанол. Истощение АсО фракцией, содеруэдэй сф, риводит к тому,что АсО теряет способность нормализовать у них гко. зтовдение т АсО АгИ не лишает ее способности отменять кммукос-уп-эсеию, возникающую У алчогслизированных крыс с ОТГ (таблица 3 ).

Полученные факты о5 отмене иммуносупресекрующего и появлении «муностимулируклцрго Эффектов ШКС алкоголизированных и отравленных

Вл«лние антисыворотки к иммцносупрессирдщи* факторам спяеноцитов на развитие ГКО а крыс с ОТГ, получавших этанол.

" Таблица 3.

к: гр. Зсловия опыта. ЙЙК. твс/орган РОК. илн/орган

1. Иьшдниззциа ЗБ. 13.6 ± 1,8 82.3 * 8.3

2. Введение кипяченой воды, оливкового касла и йсй. 21.8 ± 2.2 85,5 * 9,1

3. Введение кипяченой воды, оливкового пасла и ЙсО. 24,1 £ 3,1. 87,6 ± 9.4 '

4, Введение ТХМ и этанола. ; 14,1 ± 1,6 36,4> 4,3

Р1-3 < 0.05 Р1-3 < 0,05 .1.

5. Введение ТХК, этанола и йсй. , ' 12.2 ± 1,4 33.2 £ 4.2

РЛ-3 < 0,05 Р1-3 < 0,05

6. Введение ТХИ, этанола и ЙсО. . 26.8 ± 2.2 68.7 + 7.1

Р4.5 < 0,05 Р4,5 < 0,05

7. Введение ТХМ.. этанола и ЙсО,предварительно

источенной йгИ.. • 22,9 ± 2,7 71,3 ± 7.8

• - , , - - '■.'■'•. ■•-.'. Р4.5 < б.ОЭ Р4.5 < 0,05

3. Введение ТХК, этанола и ЙсО,предварительно •

источенной ЙгО. . ••.-*,* 13.8 ± 1,6 34.7 ±4,8

Р1-3.6.7 < 0,05 Р1-3.6.7 < 0,05

ТХМ крыс после обработки этой АсО, а также нормализующее влияийе ДоО на развитие ГИО у животных с ОТГ, получавших этанол позволяют предполагать существенную роль СФ спленоцитов в супрессии ГИО. индуцированного ксеногенными эритроцитами при токсическом поражении печени и алкогольной интоксикации. Нормализующее действие Ас к СФ спленоцитов может быть использовано для коррекции иммуннологической реактивности организма на Т-зависимые антигены в условиях эксперимента при сочетанием поражении этанолом и гепатотропиим ядом.

ВЫВОДЫ.

I. Введение этанола экспериментальным животным.усиливает токсичность тетрахлорметана (ТХМ! .что спровоедается более выраженным поражением печени на морфологическом и биохимическом уровнях. ¡.Отравление ТХМ усиливает развитие гуморального иммунного ответа (ГИО)- и гиперчувотвительности замедленного типа (ГЗТ), индуцированных эритроцитами барана (ЭВ). Этанол оказывает иммуносупресеор-ный эффект. Сочетанное введение гепатотропного яда и этанола угнетает развитие ГИО и ГЗТ на ЗБ.'

,Клетки селезенки крыс с острым и хроническим токсическим поражением печени ^ условиях алкогольной интоксикации выделяют в надоса-доцную жидкость клеток селезенки (НЖКС) как иммуностимулирующие факторы ( Ш 10-25 кД и более 100 кД)„ -гак и иммуносупресеиругадае субстанции ( ММ более 100 кД ),резко отличающееся по изоэлектри-ческим ■ зчкам.

Иммуностимулирующие факторы спленоцитов ,<рыс, получавших ТХМ и этанол, выделяются придипащими к стеклу клетками селезенки,а им-муносупрессируюице-неприлкпащнми.

Выделение иммуностимулирующих к иммуносупрессирующих факторов в условиях совместного введения гепатотропного яда и этанола контро-шруется системами обратных отрицательных связей.

6. Получена антисыворотка (Ас) к иммуносупрессируюцим фактора« НЖКС алкоголмаированных и отравленных ТХМ крыс. Обработка НЖКС крью, по-.аучаэших ХХМ и этанол, данной Ас приводит к отмене иммуносупресси-румщих и появлению иммуностимулирующих свойств НЖКС. Инкубация Ас с ' сывороткой отравленных и алкоголизированных крыс отменяет имму-нос у премирующие свойства этой сыворотки.

7. Введение Ас животным, одновременно получавши гепатотропный яд и, этанол, нормализует развитие ГШ,индуцированного ЭЕ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ.

1. йммуномодулирующее действие сыворотки и надосадочной жидкости с.членоцитов крыс, подвергнутых воздействию гепатотропного вда и этанола. //Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии. -Курск,

1991-с.'139-140. ' . / '' ' '

'¿. Коррекция . иммунного ответа полисахаридами растительного происхождения. //Тез. докл. научно-практической конференции, посвященной £5-летию фармацевтического факультета Курского медицинского института. Часть 2. Курск, 1991-с. 205-206 (соавт. Конопля Е. Е) ■

3. Воздействие этанола на иммунологическую реактивность в условиях токсической гедатопатии. //Тезисы докладов, - 1 съезд иммунолого! России.'-'Новосибирск, 1992-с. 443-444 (еоавт. Конопля А. И. ).

4. »Ымукошдулируюиие факторы спленоцитов крыс, подвергнуты:

Чс-тыре-х хлористого углерода и этанола. Ку;-ск. гее. мед. ин-т. - Курск, 1992- П с. Деп. в ВИНИТИ 2?. 03. 92.