Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследования по разработке нового грудного сбора и изучению его фармакологической активности

На правах рукописи №

МЕЛТОНЯН Вардуи Вартевановна

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ НОВОГО ГРУДНОГО СБОРА И ИЗУЧЕНИЮ ЕГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Старая Купавна — 2013

005539300

005539300

Работа выполнена на кафедре управления и экономики фармации с курсами ботаники, фармакогнозии, фармацевтической технологии, фармацевтической и токсикологической химии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Демидова Марина Александровна

Официальные оппоненты:

Кочкаров Владимир Исхакович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии фармацевтического факультета, профессор; Рожкова Елена Анатольевна, доктор биологических наук, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский научно-практический центр медицинской реабилитации, восстановительной и спортивной медицины» Департамента здравоохранения г. Москвы, ученый секретарь

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Смоленская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « ве&х^ия 2013 года в «Ф.ЗО часов на заседании диссертационного ссЙзета Д /17.004.01, созданного на базе ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ», 142450, Московская область, Ногинский район, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО «ВНЦ БАВ». Автореферат разослан «е/ » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Яснецов Виктор Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Распространенность патологии дыхательных путей занимает одну из лидирующих позиций в структуре заболеваемости населения. Увеличение числа больных с заболеваниями органов дыхания в первую очередь обусловлено неблагоприятной экологической обстановкой, нерациональным питанием, стрессами, а также прогрессирующим ростом резистентности возбудителей патологии к широко применяемым и относительно новым антибиотикам, возрастающей этиологической ролью условно-патогенной микрофлоры (Чучалин А. Г., 2004, 2007; Стрельцова Е. В., 2007).

В профилактике и комплексной терапии заболеваний органов дыхания широко применяют растительные средства с антимикробным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием. Значительная часть таких средств создана на основе эфирных масел, природных полифенольных соединений, терпеноидов, полисахаридов (Мирович В. М., 2010).

Несмотря на многочисленные достижения по разработке и внедрению в клиническую практику синтетических лекарств, фитотерапия по-прежнему сохраняет свою актуальность благодаря оптимальному сочетанию результативности и безопасности применения многих препаратов растительного происхождения (Мирович В. М., 2010). В настоящее время ассортимент лекарственных средств растительного происхождения, применяемых в практическом здравоохранении, составляет около 40 % (Самылина И. Н., 2000). Одним из направлений развития фитотерапии является углубленное исследование эффектов не только мало изученных, но и часто используемых по ограниченному числу показаний фармакопейных лекарственных растений, а также разработка новых рациональных многокомпонентных растительных сборов. Перспективность и развитие исследований в области разработки рецептуры многокомпонентных сборов для лечения пациентов с различными патологиями обеспечивается достаточной сырьевой базой по большинству видов лекарственных растений (Доброхотов И. В., 2011; Пупыкина К. А., 2008; Полуэктова Е. А., 2011).

Обоснованность применения растительных препаратов для профилактики и лечения заболеваний органов дыхания определяется тем, что к ним практически не наблюдается привыкания микроорганизмов, они сочетают в себе комплексы биологически активных веществ (БАВ), которые обуславливают многопрофильное действие на основные стадии патологического процесса (Мирович В. М., 2010).

Наиболее часто фитопрепараты используют в качестве муколитических, противовоспалительных, антимикробных, мочегонных, седативных средств. Фармакологическая активность растений обусловлена наличием биологически активных веществ, таких как полисахариды, флавоноиды,

фенолкарбоновые кислоты, эфирные масла, органические кислоты, каро-тиноиды, витамины, дубильные вещества (Быстрова М. Н., Демидова М. А., 2012). В разной степени данные вещества оказывают противовоспалительное, антимикробное, отхаркивающее, иммуностимулирующее действие (Сошникова О. В., 2006).

Комбинированное применение лекарственного растительного сырья в виде растительных сборов позволяет получить синергизм в действии и более широкий спектр фармакологического действия за счет влияния каждого компонента, что способствует повышению эффективности фитотерапии (Морохи-

наС. Л. исоавт., 2011).

Входящее в состав сборов лекарственное растительное сырье может корректировать лечебное действие друг друга. Сборы хорошо сочетаются с традиционными методами лечения, совместимы с другими лекарственными средствами и друг с другом, оказывают мягкое воздействие на организм, обеспечивая достижение стойкого лечебного эффекта (Морохина С. Л. и соавт., 2011, Иващенко Н. В. и соавг., 2013). При воспалительных заболеваниях органов дыхания в научной и народной медицине применяют различные виды лекарственного растительного сырья (алтея корни, аниса плоды, багульника болотного побеги, девясила корневища и корни, мать-и-мачехи листья, солодки корни, сосны почки, подорожника большого листья, синюхи корневища с корнями, фенхеля плоды и т.д.). Многие виды лекарственного растительного сырья с муколитической активностью входят в состав многокомпонентных сборов (отхаркивающий сбор и грудные сборы №1, №2, №3, №4). Вместе с тем возможна разработка новых стандартизированных грудных сборов с точной дозировкой и подтвержденным в соответствии с правилами доказательной медицины эффектом.

Исследования по разработке состава, изучению химического состава и оценке фармакологической активности новых грудных сборов направлены на расширение ассортимента стандартизированных и эффективных лекарственных средств растительного происхождения.

Цель работы — разработка нового грудного сбора для лечения воспалительных бронхолегочных заболеваний и оценка его фармакологической активности.

Для достижения указанной цели предстояло решить следующие задачи:

1. На основе анализа содержания биологически активных веществ и изучения фармакологической активности лекарственного растительного сырья, обладающего муколитической и антисептической активностью, разработать состав нового грудного сбора.

2. Провести сравнительное исследование содержания основных биологически активных веществ: полисахаридов, дубильных веществ, органических кислот, флавоноидов в водных извлечениях нового грудного сбора.

3. Определить значение ЬО50ддя водных извлечений нового грудного сбора при внутрижелудочном введении мышам.

4. Оценить безопасность курсового применения водных извлечений нового грудного сбора при внутрижелудочном введении мышам.

5. Оценить муколитическую, противовоспалительную, обезболивающую, противоаллергическую, антимикробную и антиоксидантную активности нового грудного сбора в эксперименте на лабораторных животных.

Научная новизна

Впервые на основании экспериментальных исследований получен новый грудной сбор, состоящий из растительного сырья 5 видов (тимьяна ползучего трава, солодки голой корни, алтея лекарственного корни, мать-и-мачехи листья, подорожника большого листья). Определено количественное содержание основных действующих веществ (флавоноидов, дубильных веществ, органических кислот и полисахаридов) в водных извлечениях нового грудного сбора и отдельных его компонентов.

Проведено сравнительное исследование фармакологической активности впервые полученного нового грудного сбора с эффектами водных извлечений отдельных компонентов, груд ного сбора №4 и синтетического муколитического средства ацетилцистеина. Показано, что при однократном и курсовом внутрижелудочном введении подопытным животным полученный новый грудной сбор является малотоксичным (относится к веществам IV класса токсичности). Впервые установлено, что муколитическая активность разработанного грудного сбора в среднем в 1,6 раза выше, чем у наиболее часто используемого грудного сбора №4. Полученный новый грудной сбор обладает также высокой антиоксидантной активностью. При этом суммарная антиоксидантная активность нового грудного сбора превышает расчетную величину антиоксидантной емкости, полученную по результатам определения антиоксидантной активности отдельных компонентов сбора, что, вероятно, свидетельствует о наличии синергизма в действии биологически активных веществ компонентов сбора.

Научно-практическая значимость

Результаты работы имеют как теоретическое, так и практическое значение. Показана перспективность получения нового грудного сбора дня профилактики и лечения хронических воспалительных заболеваний органов дыхания, имеющих рад преимуществ, как более эффективной лекарственной формы. Результаты по оценке безопасности применения, изучению муколитической, противовоспалительной, противоаллергической, обезболивающей, антимикробной активностей водного извлечения нового грудного сбора позволили экспериментально обосновать терапевтическую эффективность и могут быть использованы при разработке проекта инструкции по медицинскому применению в качестве муколитического средства.

Положения, выносимые на защиту

1. Наличие муколитической, противовоспалительной и обезболивающей активности у впервые полученного нового грудного сбора.

2. Более высокая муколитическая и антиоксидантная активность нового грудного сбора по сравнению с грудным сбором №4.

3. Наличие синергизма между отдельными компонентами нового грудного сбора в отношении антиоксидантной активности.

Внедрение в практику

Результаты, полученные при исследовании фармакологической активности и определении основных действующих веществ нового грудного сбора, используются в учебном процессе: в лекционном курсе и на практических занятиях по темам «Лекарственные средства, влияющие на систему органов дыхания», «Производство настоев», «Анализ лекарственного сырья, содержащего флавоноиды, полисахариды», а также в научно-исследовательской работе кафедры управления и экономики фармации Тверской государственной медицинской академии. Результаты исследований по разработке нового грудного сбора внедрены в практику лаборатории отдела контроля качества ОАО «Тверская фармацевтическая фабрика».

Связь темы диссертационного исследования с планом научных работ учреждения

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВГТО Тверская ГМА Министерства здравоохранения России. Номер государственной регистрации 01201174214.

Апробация работы

Основные положения и результаты диссертации были доложены и обсуждены на III международном медицинском конгрессе Армении «Вместе во имя здоровья» (7—9 июля 2011 г., Ереван), на международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (15—16 ноября 2011 г., Москва), на II международном конгрессе «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации» (7—9 июня 2012 г., Москва), на III научно-практической конференции с международным участием «Естественные науки: достижения нового века» (24—26 августа 2013 г., Шарджа, ОАЭ), на расширенном заседании кафедры фармации ТГМА (02 октября 2013 г., Тверь).

Личное участие автора в получении результатов

Личный вклад автора состоит в анализе отечественных и зарубежных источников по теме диссертационного исследования, разработке состава сбора и непосредственном выполнении всех экспериментальных исследований по оценке безопасности, фармакологической активности нового грудного сбо-

ра, качественного и количественного состава биологически активных веществ основных групп химическими и инструментальными методами. Исследования по определению антиоксидантной активности сбора и отдельных его компонентов были проведены совместно с кандидатом химических наук, старшим научным сотрудником лаборатории химии возобновляемого природного сырья Института органической и физической химии им. А. Е. Арбузова Казанского научного центра Российской академии наук, А А Лапиным. Исследования по оценке антимикробной активности сбора были проведены совместно с доктором медицинских наук, доцентом кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ТГМА Ю. В. Червинец. Автор лично участвовала в анализе полученных данных, их статистической обработке и интерпретации, формулировке выводов. Публикации по результатам работы подготовлены при активном участии автора (авторский вклад составляет 85 %).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 — в центральных рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы, включающего 173 источника, в том числе 20 иностранных. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 3 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования выполнены на 270 мышах (белых не-инбредных и линии Balb/c) обоего пола массой 20±2 г и 40 белых неинб-редных крысах обоего пола массой 200± 15 г. Подопытных животных содержали в условиях вивария Тверской государственной медицинской академии (с естественным режимом освещения; при температуре 22—24 °С; относительной влажности воздуха 40—50 %) с использованием стандартной диеты (ГОСТ Р 50258-92). Исследования проводили в соответствии с правилами качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ Р 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследова-

ниях (1997). Перед постановкой эксперимента животные проходили карантин в течение 10—14 дней.

Объектом изучения являлся новый грудной сбор, в состав которого входит 5 компонентов: тимьяна ползучего трава, солодки голой корни, алтея лекарственного корни, мать-и-мачехи листья, подорожника большого листья. Состав сбора разрабатывали на основании проведенного информационно-аналитического исследования. Из сбора и отдельных его компонентов получали водные вытяжки в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи. В работе проводили анализ химического состава и изучение фармакологической активности впервые полученного грудного сбора. Эффекты нового грудного сбора сравнивали с действием отдельных его компонентов и препаратов сравнения. В качестве препаратов сравнения использовали водное извлечение официнального грудного сбора №4 (ОАО «Красногорсклекс-редства», Россия) и синтетическое муколитическое средство ацетилцистеин (АЦЦ, Неха1 АО, Германия). Животные контрольной группы получали изотонический раствор натрия хлорида.

Содержание основных групп биологически активных веществ нового грудного сбора и отдельных его компонентов доказывали качественными химическими реакциями на основные группы биологически активных веществ.

Количественное содержание органических кислот и дубильных веществ оценивали титриметрическими методами в модификации (ГФ XI), полисахаридов — гравиметрическим методом. Содержание флавоноидов в новом грудном сборе и водных извлечений отдельных его компонентов определяли методом, основанным на спектрофотометрировании комплексов флавоноидов с ионами металлов. Количественное содержание флавоноидов в исследуемых образцах определяли в пересчете на кверцетин.

Значение 1Л}50 для нового грудного сбора определяли при внутрижелу-дочном введении мышам методом В. Б. Прозоровского и М. П. Прозоровской (1980). Оценку класса токсичности нового грудного сбора осуществляли по И. В. Березовской (2003).

Токсичность сбора при курсовом применении оценивали путем трехкратного ежедневного введения экспериментальным животным водного извлечения нового грудного сбора в дозе равной '/го ^Г)50 (355 мг/кг в пересчете на сухое вещество) в течение 30 дней.

Оценку муколитической активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов проводили на модели изолированной трахеи у крыс (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ).

Изучение противовоспалительной активности нового грудного сбора проводили в экспериментах на мышах на моделях химического раздражения брюшины и острого воспалительного отека лапы, вызванного введением форма-

лина (Сернов JI. H., Гацура В. В., 2000). Химическое раздражение брюшины вызывали внутрибрюшинным введением мышам-самцам 3% раствора уксусной кислоты (300 мг/кг). Эффекты исследуемых препаратов оценивали по числу специфических ноцицептивных ответов у подопытных животных (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины), развивающихся после внутрибрюшинного введения уксусной кислоты.

Острый воспалительный отек лап у мышей вызывали субплантарным введением в заднюю лапу 0,1 мл 2% водного раствора формалина. Онкомет-рию лапы проводили с помощью инженерного электронного штангенциркуля \brel 15240 (Польша) через 1, 4, 8 и 24 часа после введения исследуемых препаратов. Активность исследуемых препаратов и эталонного препарата выражали в % угнетения отека.

Противоаллергическую активность препаратов изучали на моделях активной кожной анафилаксии и аллергической реакции замедленного типа у мышей. Активную кожную анафилаксию у мышей моделировали по Г. Фриме-лю (1987) в модификации М. А. Демидовой (Демидова М. А. и др., 2006). В качестве препарата сравнения использовали глюкокортикостероид преднизо-лон (Никомед, Дания).

Оценку обезболивающей активности осуществляли с использованием модели «горячей пластинки» у мышей. Болевую реакцию вызывали помещением животного на «горячую пластинку» температурой 55 °С. Регистрировали время наступления порога болевой чувствительности. В качестве препарата сравнения в экспериментах использовали метамизол натрия (анальгин, Мик-роген, Россия) в дозе 0,1 мг/кг.

Оценку антимикробной активности водных извлечений травы тимьяна ползучего, корней солодки голой и алтея лекарственного, листьев мать-и-мачехи и подорожника большого и нового грудного сбора проводили в экспериментах in vitro методом диффузии в агар (Блинкова JI. П., 2003). В исследовании были использованы следующие тест-штаммы микроорганизмов: Staphylococcus aureus 209 из коллекции ГИСК им. А. А. Тарасевича, Streptococcus faecalis 775 из коллекции ГИСК им. А. А. Тарасевича, Candida albicans АТСС 885-653 из коллекции ГИСК им. А. А. Тарасевича.

Антиоксидантную емкость водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов определяли кулонометрическим методом с помощью электрогенерированного брома. Пробы анализировали на кулоно-метре «Эксперт-006» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия). Антиоксидантную емкость выражали в мг рутина на 100 мл извлечения.

Результаты исследования обработаны статистически с применением стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2003. Для ряда выбо-

рок вычисляли среднюю арифметическую и среднюю квадратическую ошибку. Определение нормальности распределения переменных проводили на основании гистограмм распределения, величины асимметрии и эксцессы. Для оценки достоверности различий выборок, имеющих нормальное распределение, применяли параметрический ^критерий Стьюдента (парный и непарный). За достоверное принимали различие при уровне вероятности 95 % и более (р <0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительное исследование химического состава нового грудного сбора

Анализ результатов фотохимических исследований показал, что значение рН водного извлечения нового грудного сбора составило 5,7, что соответствует требованиям, предъявляемым к данной лекарственной форме. Известно, что фармакологические эффекты фитопрепаратов связаны с комплексом биологически активных веществ, содержащихся в растительном сырье. В состав разработанного грудного сбора входит растительное сырье 5 видов (тимьяна ползучего трава, солодки голой корни, алтея лекарственного корни, мать-и-мачехи листья, подорожника большого листья), содержащее разнообразные по химической структуре биологически активные вещества.

С помощью стандартных фармакопейных реакций на присутствие биологически активных веществ основных групп в водных извлечениях нового грудного сбора и его отдельных компонентов были обнаружены дубильные вещества, полисахариды, флавоноиды, органические кислоты.

По данным сравнительного фотохимического анализа было отмечено, что содержание основных биологически активных веществ в водном извлечении нового грудного сбора было выше, чем в наиболее часто используемом в практике грудном сборе №4.

Так, исследования, проведенные гравиметрическим методом показали, что в водном извлечении нового грудного сбора содержание суммы полисахаридов составило 1,799+0,010%, что было в среднем в 3,1 раза (р<0,05) больше, чем в водном извлечении грудного сбора №4. Из компонентов сбора наибольшее содержание полисахаридов отмечалось в водных извлечениях корней алтея лекарственного и солодки голой.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в водном извлечении грудного сбора составило 0,094+0,001 %, что было в среднем в 1,9 раза (р<0,05) больше, чем в настое грудного сбора №4.

Количество свободных органических кислот в пересчете на кислоту яблочную в водном извлечении нового сбора составило 0,329+0,001 %, что

было в среднем в 2,7 раза (р<0,05) больше, чем в водном извлечении грудного сбора №4. Из компонентов сбора наибольшее содержание органических кислот отмечалось в настое листьев подорожника большого (0,342±0,008 %).

Содержание дубильных веществ в водном извлечении нового грудного сбора составило 0,431+0,009 %, что в среднем в 4,8 раза (р<0,05) больше, чем в водном извлечении грудного сбора №4. Из компонентов сбора наибольшее содержание дубильных веществ отмечалось в настое травы тимьяна ползучего (0,693+0,003 %) (табл. 1).

Таблица 1

Содержание БАВ в водных извлечениях грудного сбора №4, нового грудного сбора и отдельных его компонентов (М±т)

Серия опыта Сухой остаток, % Содержание БАВ, %

Полисахариды Флавоноиды Органические кислоты Дубильные вещества

Водное извлечение грудного сбора №4 2,34+0,07 0,577+0,015 0,050+0,010 0,121+0,003 0,088+0,002

Водное извлечете нового грудного сбора 2,29+0,05 1,799+0,010* 0,094+0,001* 0,329+0,001* 0,431+0,009*

Настой подорожника большого листьев 2,21+0,04 1,700+0,006* 0,110+0,010* 0,342±0,008* 0,051+0,002*

Настой алтея лекарственного корней 2,23+0,02 2,702+0,016* 0,081+0,001* 0,241+0,006* 0,086+0,004

Настой мать-и-мачехи листьев 1,68+0,04 0,685+0,007* 0,019+0,002 0,240+0,001* 0,097+0,013*

Настой тимьяна ползучего травы 2,08+0,06 0,238±0,003* 0,02+0,002* 0,213+0,003* 0,693+0,003

Настой солодки голой корней 2,12+0,03 2,342+0,004* 0,023+0,001* 0,297+0,010* 0,050+0,003*

Примечание: * — различия с препаратом сравнения (водное извлечение грудного сбора №4) достоверны (р<0,05).

2. Оценка безопасности водного извлечения нового грудного сбора

В эксперименте на белых неинбредных мышах обоего пола массой 20,0+0,5 г (п=40) установлено, что при однократном внутрижелудочном введении значение ЬО50 для водного извлечения нового грудного сбора составило 7100 мг/кг (в пересчете на сухое вещество), доверительный интервал при этом находился в пределах 2380—13944 мг/кг. Согласно принятой гигиенической классификации по токсичности, новый грудной сбор можно отнести к веществам IV класса (малотоксичные).

При курсовом применении водного извлечения нового грудного сбора в течение 30 дней в терапевтической дозе 1/20 1Л350 (355 мг/кг в пересчете

на сухое вещество) гибели подопытных животных не наблюдалось. Изменения массы тела в течение эксперимента и коэффициенты массы внутренних органов не отличались от показателей у животных группы контроля. Кроме того, морфологических изменений внутренних органов (сердце, печень, почки, селезенка) у экспериментальных животных при применении водных извлечений нового грудного сбора в течение месяца обнаружено не было. Следовательно, водное извлечение нового грудного сбора при курсовом применении в терапевтической дозе обладает низкой токсичностью.

Терапевтическая доза водного извлечения нового грудного сбора для человека с учетом коэффициента межвидового переноса доз с подопытных мышей на человека составляет 27 мг/кг.

3. Оценка муколитической активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов

В эксперименте с использованием модели изолированной трахеи крыс установлено, что водные извлечения нового грудного сбора и отдельных его компонентов (тимьяна ползучего травы, солодки голой и алтея лекарственного корней, мать-и-мачехи и подорожника большого листьев) достоверно улучшали функцию мерцательного эпителия трахеи крыс. Об этом свидетельствовало ускорение продвижения индикаторных частиц по изолированной трахее под влиянием исследованных водных извлечений (табл. 2).

Таблица 2

Время продвижения индикаторных частиц на 5 мм по изолированной трахее крыс (М±т) при введении ацетилцистеина, водных извлечений грудного сбора №4, нового грудного сбора и отдельных его компонентов

№ Серия опыта Время, мин Р

1 Контроль (изотонический раствор натрия хлорида) 124,0+9,1 р<0,05

2 Ацетилцистеин 82,8+6,1* р<0,05

3 Водное извлечение грудного сбора №4 87,8+7,9* р<0,05

4 Водное извлечение нового грудного сбора 54,4+1,1*' р<0,05

5 Настой подорожника большого листьев 56,8+10,1** р<0,05

6 Настой алтея лекарственного корней 67,0+7,6*' р<0,05

7 Настой мать-и-мачехи листьев 70,8+11,5*' р<0,05

8 Настой тимьяна ползучего травы 98,7+4,5** р<0,05

9 Настой солодки голой корней 107,6+10,5** р<0,05

Примечание: * — различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

# — различия с препаратом сравнения (водного извлечения грудного сбора №4) достоверны (р<0,05);

В контрольной серии опытов с использованием изотонического раствора натрия хлорида индикаторные частицы в результате работы мерцательного эпителия передвинулись по изолированной трахее крысы на 5 мм в течение 124,0+9,1 минут. В серии опытов с использованием синтетического муколитического средства ацетилцистеина скорость продвижения индикаторных частиц по изолированной трахее крысы была в среднем в 1,5 раза (р<0,05), а при применении водного извлечения грудного сбора №4 — в 1,4 раза (р<0,05) больше, чем в контроле. Полученные данные подтверждают наличие выраженной отхаркивающей активности у ацетилцистеина и грудного сбора №4, при этом различия в эффективности исследованных препаратов в этом отношении были недостоверны.

Обращает на себя внимание тот факт, что время продвижения индикаторных частиц на 5 мм по изолированной трахее крысы в серии опытов с использованием водного извлечения нового трудного сбора было соответственно в 2,3 раза (р<0,05), в 1,6 раза (р<0,05) и в 1,5 (р<0,05) раза меньше, чем в контроле (изотонический раствор натрия хлорида) и в сериях опытов с использованием ацетилцистеина и водного извлечения грудного сбора №4. Возможно, более высокая отхаркивающая активность нового грудного сбора связана с тем, что все 5 компонентов сбора обладали муколитической активностью различной степени выраженности.

Сравнительное исследование отхаркивающей активности водных извлечений отдельных компонентов сбора показало, что наиболее активным в этом отношении был настой листьев подорожника. В серии опытов с использованием водного извлечения подорожника большого листьев время продвижения индикаторных частиц по трахее было в среднем в 2,2 раза (р<0,05) меньше, чем в контроле и в 1,5 раза (р<0,05) меньше, чем в серии опытов с ацетилцистеином. Несколько слабее действовали настой корней алтея и листьев мать-и-мачехи. В серии опытов с использованием водного извлечения алтея лекарственного корней время продвижения индикаторных частиц по трахее было соответственно в 1,8 раза (р<0,05) и в 1,2 раза (р<0,05) меньше, чем в контроле и в серии опытов с ацетилцистеином. Время передвижения индикаторных частиц по трахеи крысы при использовании водного извлечения мать-и-мачехи листьев было в среднем 1,2 раза (р<0,05) меньше, чем в серии опытов с ацетилцистеином. Достоверных отличий в отхаркивающей активности водных извлечений алтея лекарственного корней и мать-и-мачехи листьев обнаружено не было.

Наименьшей отхаркивающей активностью из отдельных компонентов сбора обладали водные извлечения тимьяна ползучего травы и солодки голой корней. Было отмечено, что время продвижения индикаторных частиц в сериях опытов с использованием водных извлечений тимьяна ползучего

травы и солодки голой корней было соответственно в 1,3 раза (р<0,05) и 1,2 раза (р<0,05) меньше, чем в контроле, но соответственно в 1,2 раза (р<0,05) и 1,3 раза (р<0,05) раза больше, чем в сериях опытов с ацетилцистеином.

Таким образом, результаты экспериментального исследования, проведенные с использованием модели изолированной трахеи крысы, показали, что новый грудной сбор обладал более высокой отхаркивающей активностью, чем водные извлечения отдельных его компонентов и препараты сравнения — ацетилцистеин и грудной сбор №4. Возможно, это связано с процессами синергизма биологически активных веществ, входящих в состав растительного сырья.

4. Оценка противовоспалительной активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов

Оценку противовоспалительной активности нового грудного сбора осуществляли на модели химического раздражения брюшины у мышей. Установлено, что водные извлечения нового грудного сбора и отдельных его компонентов достоверно уменьшали количество специфических ноцицептивных ответов (корчей) на внутрибрюшинное введение уксусной кислоты. Об этом свидетельствовало уменьшение числа сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины под влиянием исследованных водных извлечений сбора и отдельных его компонентов по сравнению с контролем(табл. 3).

Таблица 3

Число специфических ноцицептивных ответов на химическое раздражение брюшины

у мышей (М±ш) при введении водных извлечений грудного сбора №4, нового грудного сбора и отдельных его компонентов

№ Серия опыта Число ноцицептивных ответов (корчей) в течение 1 часа, шт

1 Контроль (изотонический раствор натрия хлорида) 49,8+3,2

2 Водное извлечение грудного сбора №4 32,6+1,4*

3 Водное извлечение нового грудного сбора 27,4+3,1*

4 Настой тимьяна ползучего травы 39,0+1,2**

5 Настой солодки голой корней 37,2+1,3**

6 Настой алтея лекарственного корней 37,0+2,1**

7 Настой мать-и-мачехи листьев 28,0+1,0**

8 Настой подорожника большого листьев 30,8+2,5*

Примечание: * — различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

# — различия с препаратом сравнения (водное извлечение грудного сбора №4) достоверны (р<0,05).

Так, в контрольной серии опытов (животные, получавшие изотонический раствор натрия хлорида) число специфических ноцицептивных ответов при внутрибрюшинном введении уксусной кислоты составило 49,8±3,2 в течение часа, тогда как при использовании нового грудного сбора число подобных ответов было в среднем в 1,8 раза (р<0,05) меньше. В сериях опытов с использованием отдельных компонентов сбора наиболее выраженную противовоспалительную активность проявил настой листьев мать-и-мачехи. Наименьшую активность по сравнению с другими водными извлечениями проявил настой травы тимьяна ползучего. Следует отметить, что уменьшение числа специфических ноцицептивных ответов при внутрибрюшинном введении уксусной кислоты отмечалось и при использовании настоя грудного сбора №4.

Наличие противовоспалительной активности у водного извлечения нового грудного сбора подтвердили исследования, проведенные с использованием модели острого воспалительного отека лапы у мышей, индуцированного введением формалина в подушечку лапы подопытных животных (табл. 4).

Таблица 4

Выраженность «формалинового» отека лапы у мышей при введении водных извлечений грудного сбора №4, нового грудного сбора и отдельных его компонентов

№ Серия опыта Толщина лапы подопытных мышей, %

до опыта через 1 час через 4 часа через 8 часов через 24 часа

1 Контроль (изотонический раствор натрия хлорида) 100 165+13,0 182+13,4 167 +7,7 155+6,8

2 Водное извлечение грудного сбора №4 100 162 ±7,6 175+10,6 182 + 11,9 167 +5,7

3 Водное извлечение нового грудного сбора 100 122+9,5*' 114+10,4** 112+9,1*' 108+7,6*'

4 Настой тимьяна ползучего травы 100 122+9,2** 114+9,0** 113 +14,0** 112+8,3**

5 Настой солодки голой корней 100 121 +10,0*' 112+11,1*' 111 ±11,3** 111 ±10,9*'

6 Настой алтея лекарственного корней 100 109 +6,4** 110+8,6*' 110 ±9,7*' 109 ±12,7**

7 Настой мать-и-мачехи листьев 100 105 +9,4** 119+13,5** 117 ±3,5** 115 ±3,4**

8 Настой подорожника большого листьев 100 113 ±13,0*' 104+10,7*' 105 ±11,7** 101 ±10,5*'

Примечание: * — различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05);

# — различия с препаратом сравнения (настой грудного сбора №4) достоверны (р<0,05).

Анализ динамики воспалительного процесса показал, что при применении водных извлечений нового грудного сбора, тимьяна ползучего травы, солодки голой корней и подорожника большого листьев воспалительный отек лапы у подопытных животных нарастал в течение 1 часа. У подопытных животных, получавших водные извлечения алтея лекарственного корней, мать-и-мачехи листьев, грудного сбора №4 и мышей группы контроля — в течение 8-ми и 4-х часов.

5. Оценка противоаллергической активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов

Оценку противоаллергической активности нового грудного сбора проводили на моделях активной кожной анафилаксии и аллергической реакции замедленного типа у мышей.

Результаты экспериментального исследования, проведенного на модели активной кожной анафилаксии у мышей, показали, что при введении нового грудного сбора выраженность реакции активной кожной анафилаксии уменьшалась на 68,5+1,4 % (р<0,05), что было в среднем в 1,4 раза (р<0,05) меньше, чем при использовании глюкокортикостероида предни-золона (0,5 мг/кг). Достоверных различий в способности уменьшать выраженность реакции активной кожной анафилаксии у водных извлечений нового грудного сбора, отдельных его компонентов и грудного сбора №4 отмечено не было (табл. 5).

Таблица 5

Выраженность реакции активной кожной анафилаксии у мышей при введении преднизолона, водных извлечений грудного сбора №4, нового грудного сбора и отдельных его компонентов

№ Серия опыта Уменьшение площади отека, %

1 Преднизолон (0,5 мг/кг) 93,0+1,1

2 Водное извлечение грудного сбора №4 71,0+5,2*

3 Водное извлечение нового грудного сбора 68,5+6,4*

4 Настой тимьяна ползучего травы 64,0±6,0*

5 Настой солодки голой корней 66,2+4,4*

6 Настой алтея лекарственного корней 65,4+5,6*

7 Настой мать-и-мачехи листьев 67,3+6,3*

8 Настой подорожника большого листьев 67,7±4,8*

Примечание: * — различия с препаратом сравнения (преднизолон 0,5 мг/кг) достоверны (р<0,05).

Одновременно было показано, что на течение аллергической реакции замедленного типа водные извлечения нового грудного сбора и грудного

сбора №4 достоверного влияния не оказывали. Так, в сериях опытов с моделированием кожной аллергической реакции замедленного типа у мышей выраженность антиген-индуцированного аллергического отека лапы у подопытных животных, получавших водные извлечения сборов, достоверно не отличалась от контроля.

6. Оценка обезболивающей активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов

Оценку обезболивающей активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов проводили при термическом болевом раздражении у мышей на модели «горячей пластинки». Обезболивающую активность водного извлечения нового грудного сбора сравнивали с эффектами ненаркотического анальгетика метамизола натрия (0,1 мг/кг, внутрижелудочно) и водного извлечения грудного сбора №4.

Было отмечено, что у животных группы контроля выраженная болевая реакция при помещении на «горячую пластинку» температурой 55 °С проявлялась через 16,2+1,1 с. Внутрижелудочное введение изотонического раствора натрия хлорида не оказывало достоверного влияния на порог болевой чувствительности у мышей. В сериях опытов с внутрижелудочным введением метамизола натрия (0,1 мг/кг) порог болевой чувствительности у подопытных животных был в среднем в 2 раза (р<0,05) выше, чем до его применения. Одновременно было отмечено, что в сериях опытов с использованием водных извлечений нового грудного сбора и грудного сбора №4 также отмечалось повышение порога болевой чувствительности. Так, через 30 минут после внутрижелудочного введения подопытным мышам водного извлечения нового грудного сбора (355 мг/кг в пересчете на сухое вещество) порог болевой чувствительности повышался в среднем в 1,7 раза (р<0,05). Достоверных отличий в обезболивающей активности водных извлечений нового грудного сбора и грудного сбора №4 отмечено не было, при этом исследованные фитотерапевтические препараты были в среднем в 1,2 раза слабее, чем метамизол натрия. Обращает на себя внимание тот факт, что в сериях опытов с внутрижелудочным введением водных извлечений отдельных компонентов нового грудного сбора выраженной обезболивающей активности отмечено не было. Так, в сериях опытов с использованием водного извлечения подорожника листьев отмечено повышение порога болевой чувствительности в среднем в 1,2 раза (р<0,05) по сравнению с его уровнем до введения настоя. Достоверных изменений порога болевой чувствительности у подопытных мышей в тесте «горячая пластинка» при использовании водных извлечений других компонентов сбора обнаружено не было (табл. 6).

Таблица 6

Порог болевой чувствительности у мышей (М±т) в тесте «горячая пластинка» при введении метамизола натрия, водных извлечений грудного сбора №4, нового грудного сбора и отдельных его компонентов

Порог болевой чувствительности, с

№ Серия опыта до опыта через 15 минут через 30 минут через 1 час через 2 часа

1 Контроль (изотонический раствор ЫаС1) 16,2+1,1 16,1±1,9 16,7+1,6 17,0+1,1 16,3+1,8

2 Метамизол натрия (0,1мг/кг) 16,7+1,0 33,9+2,1* 30,1±2,0** 28,3+1,0* 27,6+1,1**

3 Водное извлечение грудного сбора №4 17,1+1,2 15,7+1,7 34,3+2,8 29,7±0,9 23,2+1,7

4 Водное извлечение нового грудного сбора 16,2+1,5* 17,2+1,3* 28,2+1,1** 24,6+1,3*" 23,2+0,8*

5 Настой подорожника большого листьев 14,0±1,6* 16,4±1,1 17,2±0,8* 15,4+0,7* 14,2+0,8*

6 Настой алтея лекарственного корней 13,2+2,9* 13,6+2,4* 13,6+0,6* 13,4+0,6*' 13,4+0,5**

7 Настой мать-и-мачехи листьев 15,4+2,1* 13,8+1,3* 14,4+1,1* 14,2+0,1** 14,4+0,6**

8 Настой тимьяна ползучего травы 13,0+2,2* 15,6+1,1 14,6+1,3* 14,0+0,7** 13,4+1,1**

9 Настой солодки голой корней 15,6+3,1* 15,2+1,3 16,4+1,1* 14,2+0,8** 14,2+0,8*

Примечание: * — различия с препаратом сравнения (водное извлечение грудного сбора №4) достоверны (р<0,05);

# — различия с контролем (изотонический раствор натрия хлорида) достоверны (р<0,05).

7. Оценка антимикробной активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов

В связи с тем, что в состав нового грудного сбора включали растительное сырье, содержащее фитонциды, в том числе эфирные масла, фенольные соединения и др., в настоящем исследовании проводили оценку антимикробной активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов в экспериментах т укго методом диффузии в агар. В исследова-

нии были использованы штаммы микроорганизмов — Staphylococcus aureus 209 из коллекции ГИСК им. А. А. Тарасевича, Streptococcus faecalis 775 из коллекции ГИСК им. А. А. Тарасевича, Candida albicans АТСС 885-653 из коллекции ГИСК им. А. А. Тарасевича.

Антимикробной активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов в отношении микроорганизмов использованных штаммов обнаружено не было. Вероятно, применение данных фитопрепаратов в концентрации, необходимой для достижения муколитичес-кого эффекта, не достаточно для проявления выраженного антимикробного действия.

8. Оценка антиоксидантной активности водных извлечений нового грудного сбора и отдельных его компонентов

Результаты экспериментального исследования показали, что водное извлечение нового грудного сбора обладает существенной антиоксидантной активностью (антиоксидантная емкость настоя сбора составила 1216,39+39,51 мг рутина/100 мл). Вероятно, это связано с высоким содержанием в извлечении таких биологически активных веществ как глицир-ризиновая кислота (0,52+0,01%), флавоноиды, полифенольные соединения, каротиноиды и др. Антиоксидантные свойства сбора могут иметь значение для реализации основного фармакологического эффекта при воспалительных заболеваниях органов дыхания, так как известно, что природные антиоксиданты обладают противовоспалительной, противоаллергической и иммуномодулирующей активностью.

Кулонометрический анализ водных извлечений из отдельных компонентов сбора (тимьяна ползучего травы, солодки голой и алтея лекарственного корней, мать-и-мачехи и подорожника большого листьев) показал наличие антиоксидантной активности у всех исследованных объектов.

Следует отметить, что антиоксидантная активность нового грудного сбора была в среднем в 12,3 раза (р<0,05) больше, чем у грудного сбора №4. Наибольшая антиоксидантная емкость среди отдельных компонентов сбора была отмечена у настоев корней солодки голой и травы тимьяна ползучего, а наименьшая у настоев корней алтея лекарственного и листьев подорожника большого. Обращает на себя внимание тот факт, что суммарная антиоксидантная активность водного извлечения сбора в среднем в 1,5 раза (р<0,05) превышала расчетную величину антиоксидантной емкости, полученную по результатам определения антиоксидантной активности отдельных компонентов сбора. Этот факт, вероятно, свидетельствует о наличие синергизма в действии биологически активных веществ компонентов сбора, что может иметь значение для реализации лечебных эффектов нового грудного сбора (табл.7).

Таблица 7

Антиоксидантная емкость водных извлечений грудного сбора №4, нового грудного сбора и отдельных его компонентов (М±т)

№ Серия опыта Суммарная антиоксидантная активность, мг рутина/100 мл

1 Водное извлечение грудного сбора №4 98,50+8,00

2 Водное извлечение нового грудного сбора 1216,39 + 39,51*

3 Настой тимьяна ползучего травы 1296,22 + 58,71

4 Настой солодки голой корней 1472,19 + 64,31

5 Настой алтея лекарственного корней 72,71 + 1,96*

6 Настой мать и мачехи листьев 1214,13 + 47,18

7 Настой подорожника большого листьев 120,46 + 6,38*

Примечание: *— различия с расчетной величиной антиоксидантной емкости нового грудного сбора (835,14 мг рутина / 100 мл) достоверны (р<0,05); # — различия с грудным сбором №4 достоверны (р<0,05).

Таким образом, сравнительная оценка антиоксидантной активности водных извлечений нового грудного сбора, грудного сбора №4 показала, что наиболее активным в этом отношении был настой нового грудного сбора, антиоксидантная емкость которого была достоверно выше, чем у грудного сбора №4 и превышала расчетную величину антиоксидантной емкости. Обнаруженное увеличение антиоксидантной активности нового грудного сбора позволяет рассматривать его как перспективную лекарственную форму для использования в лечении заболеваний дыхательных путей.

ВЫВОДЫ

1. В результате анализа содержания биологически активных веществ и изучения фармакологической активности водных извлечений из лекарственного растительного сырья разработан состав нового грудного сбора.

2. Содержание полисахаридов в водном извлечении нового грудного сбора составило 1,799+0,01 %, суммы флавоноидов в пересчете на рутин 0,094+0,001 %, свободных органических кислот в пересчете на кислоту яблочную — 0,329+0,001 % , дубильных веществ в перерасчете на танин - 0,431±0,009 %.

3. Установлено, что при однократном внутрижелудочном введении водного извлечения нового грудного сбора значение ЬО50 в пересчете на сухое вещество составило 7100 мг/кг (2380-13944 мг/кг), что позволило отнести его к малотоксичным веществам (IV класс токсичности). При курсовом внутрижелудочном введении подопытным мышам в дозе 1 /20

1Л}50 (355 мг/кг в пересчете на сухое вещество) токсических свойств у водного извлечения нового грудного сбора обнаружено не было.

4. Разработанный грудной сбор обладает выраженной муколитической активностью. Скорость продвижения индикаторных частиц по изолированной трахее крысы при использовании водного извлечения нового грудного сбора была соответственно в 2,3; 1,6 и 1,5 раза выше, чем в контроле и в сериях опытов с использованием ацетилцистеина и водного извлечения грудного сбора №4.

5. При внутрижелудочном введении водного извлечения нового грудного сбора (355 мг/кг) число специфических ноцицептивных ответов у мышей на внутрибрюшинное введение уксусной кислоты уменьшалось в 1,8 раза по сравнению с контролем. Противовоспалительная активность нового грудного сбора при химическом раздражении брюшины у мышей была в среднем в 1,2 раза больше, чем у грудного сбора №4.

6. Под влиянием водного извлечения нового грудного сбора (355 мг/кг) порог болевой чувствительности на термическое раздражение в тесте «горячая пластинка» у мышей повышался в среднем 1,7 раза по сравнению с контролем. Обезболивающая активность нового грудного сбора была в 1,2 раза слабее, чем у метамизола натрия и достоверно не отличалась от грудного сбора №4.

7. При внутрижелудочном введении нового грудного сбора (355 мг/кг) выраженность реакции активной кожной анафилаксии у мышей уменьшалась на 68,5+1,4 % по сравнению с контролем. Противоаллергическая активность нового грудного сбора была в 1,4 раза меньше, чем у пред-низолона (0,5 мг/кг), но достоверно не отличалась от эффектов грудного сбора №4. На течение аллергической реакции замедленного типа у мышей новый грудной сбор достоверного влияния не оказывал.

8. Антиоксидантная емкость водного извлечения нового грудного сбора составила 1216,39+39,51 мг рутина/100 мл, что в 12,3 раза выше, чем у грудного сбора №4 и в 1,5 раза превышало расчетную величину.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования позволяют рекомендовать водное извлечение нового грудного сбора для расширенных доклинических и последующих клинических испытаний в качестве муколитического и противовоспалительного средства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мелтонян, В.В. Сравнительная оценка отхаркивающей активности водных извлечений из лекарственного растительного сырья [Текст] / М.А. Демидова, В.В. Мелтонян, С.Я. Шнеур // Врач-аспирант. — 2011. - № 6.2 (49). - С. 308-313.

2. Мелтонян, В.В. Сравнительная оценка отхаркивающей активности настоев листьев подорожника и листьев мать-и-мачехи / М.А. Демидова, В.В. Мелтонян [Текст] // Вместе во имя здоровья: сборник научных трудов 3 Международного медицинского конгресса Армении (7—9 июля 2011 г.). — Ереван, 2011. — С. 386.

3. Мелтонян, В.В. Сравнительная оценка отхаркивающей активности настоев тимьяна ползучего травы, солодки голой и алтея лекарственного корней [Текст] / В.В. Мелтонян // Традиционная медицина. — 2011. — № 5. — С. 365-368.

4. Мелтонян, В.В. Оценка острой и хронической токсичности водных извлечений из лекарственного растительного сырья [Текст] / М.А. Демидова, В.В. Мелтонян // Врач-аспирант. — 2012. — № 5 (54). — С. 30-34.

5. Мелтонян, В.В. Сравнительная оценка отхаркивающей активности лекарственного растительного сбора и его компонентов [Текст] / В.В. Мелтонян, С.Я. Шнеур // Традиционная медицина. — 2012. — №5. -С. 123-127.

6. Мелтонян, В.В. Оценка антиоксидантной активности водных извлечений из лекарственного растительного сырья [Текст] / A.A. Лапин, М.А. Демидова, В.В. Мелтонян, В.Н. Зеленков // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты: сб. науч. тр. - РАЕН, Москва, 2012. - Вып. 20. — С. 21-26.

7. Мелтонян, В.В. Антиоксидантная активность отхаркивающего сбора и отдельных его компонентов [Текст] / М.А. Демидова, A.A. Лапин,

B.В. Мелтонян // Верхневолжский медицинский журнал. — 2013. — Т. 11, вып. 2.— С. 18-21.

8. Мелтонян, В.В. Оценка противоаллергической активности нового грудного сбора [Текст] / В.В. Мелтонян // Материалы III научно-практической конференции с международным участием «Естественные науки: достижения нового века» (24—26 августа 2013 г., Шарджа, ОАЭ). — Академический журнал Западной Сибири. — 2013. — Т. 9, № 4 (47). — С. 96.

9. Мелтонян, В.В. Оценка противовоспалительной активности нового грудного сбора [Текст] / В.В. Мелтонян // Материалы III научно-практической конференции с международным участием «Естественные науки: достижения нового века» (24—26 августа 2013 г., Шарджа, ОАЭ). — Академический журнал Западной Сибири. — 2013. — Т. 9, № 4 (47). —

C. 96-97.

Подписано в печать 30.10.13. Формат 60x84 х/16 Усл.печ. л. 1,0. Гарнитура NewtonC. Тираж 100. Заказ 26. Отпечатано в соответствии с предоставленным оригинал-макетом в ГОУ НПО ПЛ № 12 170023, г. Тверь, Ремесленный проезд, 5